锰纳米花-适配体探针的制备方法及其应用

1.本发明涉及食品安全检测技术领域，特别涉及一种锰纳米花-适配体探针的制备方法及其应用。


背景技术：

2.赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)是一种真菌毒素，主要存在于谷物、坚果、大豆、牛奶、果汁、葡萄酒、啤酒和食用油等食品中，污染范围广。由于ota的致癌、致畸、致突变和免疫抑制特性，过量摄入ota可能导致急性或慢性疾病发作，甚至死亡。因此，需要严格控制和检测农业产品、食品中赭曲霉毒素a的含量。
3.目前，常见的ota检测技术包括高效液相色谱法、质谱法、荧光光谱法、电化学法和拉曼增强光谱法等等。这些方法大多存在操作繁琐、耗时长且价格昂贵等问题，不能广泛应用于ota的快速现场检测，故开发快速、简单、灵敏、低成本的检测技术越来越受到研究者们的关注。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提出一种锰纳米花-适配体探针的制备方法及其应用，旨在提供一种锰纳米花-适配体探针，该锰纳米花-适配体探针有助于赭曲霉毒素a的快速检测。
5.为实现上述目的，本发明提出一种锰纳米花-适配体探针的制备方法，包括以下步骤：
6.向高锰酸钾溶液中加入油酸，进行氧化还原反应，纯化得到锰纳米花；
7.将所述锰纳米花分散在水中，加入赭曲霉毒素a适配体溶液、氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液以及水，混匀后进行孵育，得到锰纳米花-适配体探针。
8.可选地，向高锰酸钾溶液中加入油酸，进行氧化还原反应，纯化得到锰纳米花的步骤中，每克高锰酸钾对应加入8～15ml油酸。
9.可选地，向高锰酸钾溶液中加入油酸，进行氧化还原反应，纯化得到锰纳米花的步骤中，氧化还原反应的时间为40～55h。
10.可选地，向高锰酸钾溶液中加入油酸，进行氧化还原反应，纯化得到锰纳米花的步骤包括：
11.向高锰酸钾溶液中加入油酸，进行氧化还原反应，得到反应溶液；
12.将所述反应溶液离心，收集沉淀物，用超纯水和乙醇洗涤，得到锰纳米花。
13.可选地，将所述锰纳米花分散在水中，加入赭曲霉毒素a适配体溶液、氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液以及水，混匀后进行孵育，得到锰纳米花-适配体探针的步骤中，所述赭曲霉毒素a适配体溶液的浓度为0.8～1.2μmol/l。
14.可选地，每克高锰酸钾对应加入2.2～2.8l所述赭曲霉毒素a适配体溶液。
15.可选地，将所述锰纳米花分散在水中，加入赭曲霉毒素a适配体溶液、氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液以及水，混匀后进行孵育，得到锰纳米花-适配体探针的步骤中，孵育的时间
为0.8～1.2h。
16.此外，本发明还提出一种如上文所述的锰纳米花-适配体探针的制备方法制得的锰纳米花-适配体探针在检测赭曲霉毒素a中的应用。
17.本发明提供的技术方案中，以高锰酸钾作为锰前体制备了蜂窝状的锰纳米花材料，然后将赭曲霉毒素a适配体吸附在锰纳米花的表面，制备出一种具有高特异性的探针，该探针对显色底物3，3
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四甲基联苯胺(tmb)具有较强的催化活性，能够快速催化该显色底物氧化并产生颜色变化，因此，能够使用该显色底物，通过比色或紫外吸光光度法检测赭曲霉毒素a，使用该方法能够进一步提高赭曲霉毒素a的检测准确率和检测效率。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
19.图1为实施例1中制得的mn-nfs材料的透射电镜图；
20.图2为实施例1中制得的mn-ota-apt探针的元素mapping分析图；
21.图3为实施例1中制得的mn-nfs材料在不同时间下催化显色底物的紫外光谱对比图；
22.图4为实施例1中制得的mn-nfs材料在不同温度下催化显色底物的紫外光谱对比图；
23.图5为实施例1中制得的mn-nfs材料在不同浓度下催化显色底物的紫外光谱对比图；
24.图6为实施例1中制得的mn-nfs材料的粒径分布图；
25.图7为实施例1中制得的mn-ota-apt探针的粒径分布图；
26.图8为ota-apt、实施例1中制得的mn-nfs材料以及mn-ota-apt探针的电势对比图；
27.图9为ota-apt、实施例1中制得的mn-nfs材料以及mn-ota-apt探针的紫外光谱图；
28.图10为使用实施例1中制得的mn-ota-apt探针检测六种样品中ota的比色分析对比图。
29.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
30.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
31.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没
有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.pvd(physical vapor deposition)是指物理气相沉积，具体是指在真空条件下，用物理方法使材料沉积在被镀工件上的薄膜制备技术。pvd操作时可选取不同的金属蒸发，电离成电子态，利用电偏压将离子引领到工件上，沉积成薄膜。在离子沉积到工件前，也可与其他离子作出反应结合，生成复合式薄膜，在硬度、光亮度、摩擦系数、颜色等发生变化。pvd膜层赋予了产品表面金属质感和丰富的颜色，并能改善耐磨、耐腐蚀性，延长寿命，已广泛应用到手机壳、钟表、五金3c行业装饰镀。
33.蓝黑色工艺被广泛应用到传统装饰镀的五金、首饰、钟表等方面，特别是近几年，3c电子产品手机外壳等方面蓝黑色pvd镀膜深受欢迎。目前，通常采用以氮气和乙炔为工作气体，tial靶溅射形成tialcn镀层的处理方法，来获得色彩鲜艳、华丽的蓝黑色效果。但这种方法存在镀膜颜色稳定性差的缺陷。
34.鉴于此，为实现上述目的，本发明提出一种锰纳米花-适配体探针的制备方法，包括以下步骤：
35.步骤s10，向高锰酸钾溶液中加入油酸，进行氧化还原反应，纯化得到锰纳米花。
36.本发明以高锰酸钾(kmno4)为锰前体来制备锰纳米花(manganese nano flower，mn-nfs)，制得的锰纳米花呈蜂窝状，具有良好的生物相容性、易降解、高的纳米酶活性和高比表面积，可快速催化显色底物的氧化并产生颜色变化。以显色底物3，3
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四甲基联苯胺(tmb)为例，本发明制得的mn-nfs能够催化tmb发生显色反应，变蓝，且显色后的溶液在600～700nm波段有明显的紫外吸收峰，基于此，能够通过紫外吸收分光光度法检测该波段的吸光度，进而依据标准曲线计算出其中的tmb含量。其采用的紫外定量检测方法具体可以参考本领域常规的紫外计量方法，在此不做详述。
37.具体来说，高锰酸钾溶液可以自行制备。在一些实施例中，称取一定量的高锰酸钾，溶于水(可以是蒸馏水)中，快速搅拌，使充分溶解，制得高锰酸钾溶液。本实施例通过kmno4和油酸(oa)之间的氧化还原反应在油/水界面产生二氧化锰核，然后，mno2核不断生长成层状mno2片晶，最终形成mn-nfs。
38.本实施例中，两种原料的添加量遵循以下比例：每克高锰酸钾对应加入8～15ml油酸；氧化还原反应的时间为40～55h。如此，能够确保反应充分进行，保证高锰酸钾被充分还原，形成大小均一且呈蜂窝状的mn-nfs。
39.进一步地，实际操作时，上述步骤s10可以按照如下步骤进行：
40.步骤s11，向高锰酸钾溶液中加入油酸，进行氧化还原反应，得到反应溶液；
41.步骤s12，将所述反应溶液离心，收集沉淀物，用超纯水和乙醇洗涤，得到锰纳米花。
42.步骤s20，将所述锰纳米花分散在水中，加入赭曲霉毒素a适配体溶液、氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液以及水，混匀后进行孵育，得到锰纳米花-适配体探针。
43.本发明采用简单孵育的方法，在锰纳米花的表面吸附赭曲霉毒素a适配体(ota-apt)，制得表面吸附有适配体的锰纳米花(mn-ota-apt)，该材料不仅相较锰纳米花具有更强的催化活性，加速、增强对tmb的催化显色，而且在接触到ota时，其上吸附的适配体(ota-apt)能够与ota结合，脱离探针材料，使得材料对tmb的催化活性下降，进而导致显色变浅，如此，通过观察样品溶液的颜色变化，即可判断样品中是否含有ota。具体地，与不含ota的
空白对照进行对比，样品颜色较浅则说明样品中含有ota，颜色一致则说明样品中不含ota；进一步地，含有ota的样品颜色对比时，颜色更浅的样品中含有的ota含量更高。如此，即可实现对ota的定性检测。基于此，再配合紫外分光光度法，即可通过检测显色溶液的吸光度，计算得到ota的含量，实现对ota的定量检测。本发明制得的mn-ota-apt对ota的检测限为0.0102ng/ml，检测范围为0.079～37.62ng/ml。
44.具体来说，上述步骤s20中，赭曲霉毒素a适配体是指赭曲霉毒素a的核酸适配体，可以在市面上购得。所述赭曲霉毒素a适配体溶液的浓度为0.8～1.2μmol/l。基于该浓度范围的赭曲霉毒素a适配体溶液，其添加量应当为：每克高锰酸钾对应加入2.2～2.8l所述赭曲霉毒素a适配体溶液。考虑到需要添加的赭曲霉毒素a适配体溶液的量较大，实际操作时，可以只取少量锰纳米花的分散液进行后续的吸附步骤。例如，基于0.5g高锰酸钾制得的锰纳米花，能够制得得到250ml的分散液，为减少赭曲霉毒素a适配体溶液的消耗，可以只取2μl分散液与10μl赭曲霉毒素a适配体溶液进行孵育。
45.其中，孵育的温度优选为37℃，孵育时需要配制适宜的体系环境，本实施例中，加入50μl nacl(1m)溶液、10μl pbs(500mm，ph 7.5)溶液以及28μl的超纯水以进行孵育。孵育的时间为0.8～1.2h。
46.本发明提供的技术方案中，以高锰酸钾作为锰前体制备了蜂窝状的锰纳米花材料，然后将赭曲霉毒素a适配体吸附在锰纳米花的表面，制备出一种具有高特异性的探针，该探针对显色底物3，3
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，5，5
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四甲基联苯胺(tmb)具有较强的催化活性，能够快速催化该显色底物氧化并产生颜色变化，因此，能够使用该显色底物，通过比色或紫外吸光光度法检测赭曲霉毒素a，使用该方法能够进一步提高赭曲霉毒素a的检测准确率和检测效率。
47.基于mn-ota-apt的上述优势，本发明还提出一种如上文所述的锰纳米花-适配体探针的制备方法制得的锰纳米花-适配体探针在检测赭曲霉毒素a中的应用。
48.具体来说，mn-ota-apt不仅相较锰纳米花(mn-nfs)具有更强的催化活性，加速、增强对tmb的催化显色，而且在接触到ota时，其上吸附的适配体(ota-apt)能够与ota结合，脱离探针材料，使得材料对tmb的催化活性下降，进而导致显色变浅。基于此，在检测样品时，可以将样品配制成液体样品，然后加入mn-ota-apt，于37℃环境下孵育2h后，加入tmb进行显色，同时，配制空白对照(即不含ota的纯样品)。如此，通过观察样品溶液的颜色变化，即可判断样品中是否含有ota。具体地，与不含ota的空白对照进行对比，样品颜色较浅则说明样品中含有ota，颜色一致则说明样品中不含ota；进一步地，含有ota的样品颜色对比时，颜色更浅的样品中含有的ota含量更高。如此，即可实现对ota的定性检测。
49.进一步地，再配合紫外分光光度法，即可通过检测显色溶液的吸光度，计算得到ota的含量，实现对ota的定量检测。具体地，可以先配制ota的不同浓度的标准溶液组，加入mn-ota-apt孵育后，加入tmb显色，并检测吸光度，建立ota浓度-吸光度的标准曲线。然后，检测样品的显色溶液的吸光度，代入标准曲线计算得到样品中ota的含量。
50.本发明制得的mn-ota-apt对ota的检测限为0.0102ng/ml，检测范围为0.079～37.62ng/ml。
51.以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
52.实施例1
ota溶液呈无色，通过比色可以看出，加入mn-ota-apt后，含有ota的样品显色更浅，说明mn-ota-apt与样品中的ota发生了反应，通过这种颜色对比，能够快速确定样品中是否含有ota。
70.实施例2
71.称取0.5g kmno4溶解在250ml蒸馏水中，并将混合物快速搅拌约0.5h，制成高锰酸钾溶液。然后加入4.0ml的oa，反应40h。通过离心收集粗棕黑色产物，用超纯水和乙醇洗涤数次以除去残留的反应物，得到蜂窝状锰纳米花材料(mn-nfs)。将纯化的mn-nfs重新分散在250ml的超纯水中，得到锰纳米花分散液。
72.将赭曲霉毒素a适配体(ota-apt)离心，加入超纯水并涡旋约1min，配制成1μmol/l的赭曲霉毒素a适配体溶液，备用。
73.取2μl上述步骤所制得的锰纳米花分散液取于离心管中，加入10μl的赭曲霉毒素a适配体溶液，再加入50μl的1mol/lnacl溶液、10μl的pbs溶液(ph7.5)以及28μl的超纯水。将所得的混合液进行涡旋混匀，放入恒温水浴锅37℃孵育0.8h后，得到锰纳米花-适配体探针(mn-ota-apt)。
74.实施例3
75.称取0.5g kmno4溶解在250ml蒸馏水中，并将混合物快速搅拌约0.5h，制成高锰酸钾溶液。然后加入6.0ml的oa，反应45h。通过离心收集粗棕黑色产物，用超纯水和乙醇洗涤数次以除去残留的反应物，得到蜂窝状锰纳米花材料(mn-nfs)。将纯化的mn-nfs重新分散在250ml的超纯水中，得到锰纳米花分散液。
76.将赭曲霉毒素a适配体(ota-apt)离心，加入超纯水并涡旋约1min，配制成0.8μmol/l的赭曲霉毒素a适配体溶液，备用。
77.取2μl上述步骤所制得的锰纳米花分散液取于离心管中，加入11.2μl的赭曲霉毒素a适配体溶液，再加入50μl的1mol/lnacl溶液、10μl的pbs溶液(ph7.5)以及28μl的超纯水。将所得的混合液进行涡旋混匀，放入恒温水浴锅37℃孵育1.2h后，得到锰纳米花-适配体探针(mn-ota-apt)。
78.实施例4
79.称取0.5g kmno4溶解在250ml蒸馏水中，并将混合物快速搅拌约0.5h，制成高锰酸钾溶液。然后加入7.5ml的oa，反应55h。通过离心收集粗棕黑色产物，用超纯水和乙醇洗涤数次以除去残留的反应物，得到蜂窝状锰纳米花材料(mn-nfs)。将纯化的mn-nfs重新分散在250ml的超纯水中，得到锰纳米花分散液。
80.将赭曲霉毒素a适配体(ota-apt)离心，加入超纯水并涡旋约1min，配制成1.2μmol/l的赭曲霉毒素a适配体溶液，备用。
81.取2μl上述步骤所制得的锰纳米花分散液取于离心管中，加入8.8μl的赭曲霉毒素a适配体溶液，再加入50μl的1mol/lnacl溶液、10μl的pbs溶液(ph7.5)以及28μl的超纯水。将所得的混合液进行涡旋混匀，放入恒温水浴锅37℃孵育1h后，得到锰纳米花-适配体探针(mn-ota-apt)。
82.综上所述，可以看出本发明方法能够制备出大小均一、比表面积高，具有高纳米酶活性的锰纳米花，并能够在其表面成功吸附ota-apt，进一步提高锰纳米花催化活性，使其能够快速催化tmb氧化，使其变色；此外，本发明方法制备的mn-ota-apt对ota具有高特异
性，在加入含有ota的样品中时，样品中的ota能够与探针中的ota-apt特异性结合，使其从mn-nfs材料上脱落，从而使mn-nfs材料对显色底物(tmb)的催化成蓝色物质(oxtmb)的活性降低，颜色越浅表明检测的ota浓度越高，使得检测人员通过比色或者紫外分光光度法即可快速定性或定量检测样品中的ota，检测效率高、准确性高。
83.以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。