一种鹿蹄草的组培快繁育苗方法与流程

1.本发明属于中药材及组织培养领域，特别涉及鹿蹄草的组培育苗方法。


背景技术：

2.鹿蹄草（pyrola calliantha）又名美华鹿蹄草、鹿含草、罗汉茶、常绿茶等，生长于海拔700~4100米的山地针叶林、针阔叶混交林或阔叶林下，主要分布于云南、四川、贵州、西藏、陕西、青海、甘肃、山西、山东、河北、河南、安徽、江苏、浙江、福建、湖北、湖南及江西。以全草入药，有祛风湿，强筋骨，止血，止咳的功效，主要用于风湿痹痛，肾虚腰痛，腰膝无力，月经过多，久咳劳嗽等症。
3.鹿蹄草内含水晶兰苷、鹿蹄草苷、鹿蹄草素、高熊果苷、金丝桃苷、槲皮素、羟基肾叶鹿蹄草苷、没食子酸等数十种活性成分，其中以水晶草苷最具代表性，其含量是《中国药典》2020版鹿蹄草药材质量检测的最重要指标。现代医药研究表明，鹿蹄草具抗菌和抗炎作用，抗肿瘤作用，改善心脑血管循环作用，降压和扩血管作用，强心作用等，临床上主要治疗心血管疾病、颈椎病、慢性痢疾等细菌性感染、风湿性关节炎、肺结核咳血、慢性支气管炎、骨质增收及坐骨神经痛等。目前以鹿蹄草为原料药的中药制剂有止眩安神颗粒、颈康片、抗骨质增生片、乳核散结胶囊等近三十种。
4.随着中医药大健康的发展，以鹿蹄草饮片以及以其为原料药的中药制剂需求量日益增长，野生资源被无尽采挖，使得野生资源蕴藏量极具下降。近年来，云南、河北等省市开展了鹿蹄草野生资源的引种驯化，但由于其种子存在休眠，现有技术条件下不能发芽，而分株繁殖1株仅能分2~3株，且繁殖周期至少为1年，存在繁殖系数低、繁殖周期长等缺点。赵耀发表的（《鹿蹄草引种研究》[d].保定市：河北农业大学，2005：10~13）硕士论文以及王维、卢建涛等发表的（《鹿蹄草组织培养研究》[j]，河北农业科技，2008：48）均提出了鹿蹄草的组织培养研究，但均仅限于消毒技术的研究，未对初代诱导、继代增殖以及生根培养进行系列的研究及报道。
[0005]
针对鹿蹄草现有技术的不足，特发明了一种包括外植体选择、外植体消毒、初代丛生芽诱导培养、继代增殖培养以及生根培养的鹿蹄草组织培养技术。


技术实现要素：

[0006]
本发明的主要目的是提供一种鹿蹄草的组培快繁育苗方法以解决背景技术中存在的问题。
[0007]
本发明是通过以下方案实现的：1、外植体的选择：将鹿蹄草移栽于室内，返青后用75%多菌灵1000倍液喷施茎叶，每隔7天喷施一次，连续喷施3次，后挖取全株，去土表下根以及叶，以具腋芽茎段及基部腋芽为外植体。
[0008]
2、外植体的清洁：用毛刷蘸取饱和肥皂水溶液，反复刷洗表面至无泥土残留，后在烧杯中加适量水并滴加2~3滴吐温-80，震摇10~15min，自来水冲淋60~70min。
[0009]
3、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒10~15s，无菌水涮洗2~3次，饱和漂白粉溶液消毒10~15nin，无菌水涮洗3~4次，8%双氧水溶液消毒4~5min，无菌水涮洗3~4次，滴加2滴吐温-80的0.025%升汞溶液消毒4~6min，无菌水涮洗6~8次。
[0010]
4、初代丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于ms 2,4-d 0.02~0.05mg/l cppu 0.4~0.5mg/l 2-ip 0.1~0.3mg/l 硝酸银 0.1~0.2μg/l 活性炭 0.5g/l的丛生芽诱导培养基中，在温度25
±
2℃下暗培养7天，后温度不变，每日照光10h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养60~70天。
[0011]
5、丛生芽的继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，接种于ms naa 0.05~0.1mg/l cppu 0.5~0.8mg/l tiba 0.01~0.02mg/l 香蕉泥50~60g/l的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25
±
2℃，每日照光10h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养30~40天。
[0012]
6、丛生芽的生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成单芽，接种在1/2ms naa 0.2~0.4mg/l iba 0.6~0.8mg/l kt 0.2~0.5mg/l 香蕉泥 50~60g/l 活性炭0.5g/l的丛生芽生根培养基中，在在温度25
±
2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养30~40天。
[0013]
本发明的有益效果在于1、本发明是利用组培技术进行鹿蹄草种苗的生产，属于现代生物技术，是在人工可控环境下进行的工厂育苗，不受气候、季节的限制，可在短期内大量提供相关品质稳定的种苗。
[0014]
2、鹿蹄草药材以水晶兰苷含量为其检测的核心指标，部分企业同时以鹿蹄草苷、鹿蹄草素等活性物质的含量为其品质指标，确定其是否达到《中国药典》或企业内部药材采购标准。而不同产区或同一产区不同居群甚至同一居群，其各成分含量均有较大差异，在进行人工驯化栽培引种时可根据各评价指标筛选出各类型的优质种质。而本发明是利用鹿蹄草腋芽为外植体进行组培快繁，是利用母本体细胞进行繁殖，属于无性繁殖范畴，其能最大程度的保证母本性状的稳定遗传，可生产出遗传性状稳定的优质种质的种苗。
[0015]
3、一般而言，0.1%升汞溶液是外植体消毒的最佳消毒剂，但鹿蹄草腋芽极其幼嫩，0.1%升汞溶液消毒时间短时，不能达到消毒目的，而消毒时间延长，消毒污染率下降，但会造成外植体大量死亡，而未死亡的外植体褐化严重，不能诱导出丛生芽。本发明在消毒时采用了75%酒精、饱和漂白粉溶液、8%双氧水溶液进行前期的消毒，可将外植体中的微生物量大部分消杀，同时再配合超低浓度的升汞溶液，可基本将外植体携带的微生物基本杀灭，使污染率降低到最低，同时不会引起外植体的死亡，降低了外植体的褐化率。
[0016]
4、鹿蹄草外植体极难诱导丛生芽，一方面受制于消毒技术，另一方面受制于培养基配方。本发明采用低浓度的2,4-d与超高活性的cppu和2-ip低浓度组合，能有效诱导丛生芽的发生，同时添加适量浓度的硝酸银，可有效抑制外植体的褐化而不影响丛生芽的生长。
[0017]
5、采用丛生芽诱导培养基进行鹿蹄草丛生芽继代增殖时，存在生长速度慢、丛生芽率低、丛生芽节间短等情况，且2-ip价格极高。本发明在丛生芽继代增殖培养时，在丛生芽诱导培养基的基础上，将生长素改为naa，细胞分裂素去掉了价格极高的2-ip，调整了cppu浓度，并创造性的添加了价格适中且能很好调节鹿蹄草增殖的tiba，同时添加了一定浓度的香蕉泥，可使短期内产生大量丛生芽，提高了增殖系数，亦能使丛生芽节间增长而不
会引起苗瘦弱。
附图说明
[0018]
图1实施例1技术方案下初代丛生芽的诱导显示图；图2实施例1方案下丛生芽的增殖情况图；图3实施例1方案下消毒技术未引起外植体的死亡、褐化，能有效诱导丛生芽的一种显示图；图4实施例1消毒技术未引起外植体的死亡、褐化，能有效诱导丛生芽的另一种显示图。
具体实施方式
[0019]
下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的说明，本发明中的2-ip（异戊烯腺嘌呤）、cppu（氯吡脲）、tiba（三碘苯甲酸）等植物生长调节激素均可以从市场进行购买。
[0020]
实施例11、外植体的选择：将鹿蹄草移栽于室内，返青后用75%多菌灵1000倍液喷施茎叶，每隔7天喷施一次，连续喷施3次，后挖取全株，去土表下根以及叶，以具腋芽茎段及基部腋芽为外植体。
[0021]
2、外植体的清洁：用毛刷蘸取饱和肥皂水溶液，反复刷洗表面至无泥土残留，后在烧杯中加适量水并滴加3滴吐温-80，震摇10min，自来水冲淋60min。
[0022]
3、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒10s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒10nin，无菌水涮洗3次，8%双氧水溶液消毒4min，无菌水涮洗3次，滴加2滴吐温-80的0.025%升汞溶液消毒4min，无菌水涮洗8次，消毒污染率为14.9%，未出现消毒死亡。
[0023]
4、初代丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于ms 2,4-d 0.02mg/l cppu 0.4mg/l 2-ip 0.2mg/l 硝酸银 0.1μg/l 活性炭 0.5g/l的丛生芽诱导培养基中，在温度25
±
2℃下暗培养7天，后温度不变，每日照光10h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养60天，能有效诱导丛生芽，诱导情况如图1所示，诱导率为48.9%，褐化率为13.7%，且褐化不会影响丛生芽的生长，具体如图3或图4所示，即便愈伤有褐化现象，依旧长出丛生芽。
[0024]
5、丛生芽的继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，接种于ms naa 0.05mg/l cppu 0.5mg/l tiba 0.01mg/l 香蕉泥50g/l的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25
±
2℃，每日照光10h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养30天，增殖系数为4.1，增殖情况如图2所示。
[0025]
6、丛生芽的生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成单芽，接种在1/2ms naa 0.2mg/l iba 0.6mg/l kt 0.2mg/l 香蕉泥 50g/l 活性炭0.5g/l的丛生芽生根培养基中，在在温度25
±
2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养30天，生根率为97.6%。
[0026]
实施例21、外植体的选择：将鹿蹄草移栽于室内，返青后用75%多菌灵1000倍液喷施茎叶，每隔7天喷施一次，连续喷施3次，后挖取全株，去土表下根以及叶，以具腋芽茎段及基部腋
芽为外植体。
[0027]
2、外植体的清洁：用毛刷蘸取饱和肥皂水溶液，反复刷洗表面至无泥土残留，后在烧杯中加适量水并滴加3滴吐温-80，震摇13min，自来水冲淋65min。
[0028]
3、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒13s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒13nin，无菌水涮洗4次，8%双氧水溶液消毒5min，无菌水涮洗4次，滴加2滴吐温-80的0.025%升汞溶液消毒5min，无菌水涮洗8次，消毒污染率为13.1%，消毒死亡率为1.2%。
[0029]
4、初代丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于ms 2,4-d 0.03mg/l cppu 0.5mg/l 2-ip 0.3mg/l 硝酸银 0.2μg/l 活性炭 0.5g/l的丛生芽诱导培养基中，在温度25
±
2℃下暗培养7天，后温度不变，每日照光10h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养65天，诱导率为50.8%，褐化率为15.9%，且褐化不会影响丛生芽的生长。
[0030]
5、丛生芽的继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，接种于ms naa 0.08mg/l cppu 0.5~0.8mg/l tiba 0.02mg/l 香蕉泥55g/l的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25
±
2℃，每日照光10h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养40天，增殖系数为4.6。
[0031]
6、丛生芽的生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成单芽，接种在1/2ms naa 0.3mg/l iba 0.7mg/l kt 0.4mg/l 香蕉泥 55g/l 活性炭0.5g/l的丛生芽生根培养基中，在在温度25
±
2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养35天，生根率为98.4%。
[0032]
实施例31、外植体的选择：将鹿蹄草移栽于室内，返青后用75%多菌灵1000倍液喷施茎叶，每隔7天喷施一次，连续喷施3次，后挖取全株，去土表下根以及叶，以具腋芽茎段及基部腋芽为外植体。
[0033]
2、外植体的清洁：用毛刷蘸取饱和肥皂水溶液，反复刷洗表面至无泥土残留，后在烧杯中加适量水并滴加3滴吐温-80，震摇15min，自来水冲淋70min。
[0034]
3、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒15s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒15nin，无菌水涮洗4次，8%双氧水溶液消毒5min，无菌水涮洗4次，滴加2滴吐温-80的0.025%升汞溶液消毒6min，无菌水涮洗8次，消毒污染率为10.6%，消毒死亡率为2.1%。
[0035]
4、初代丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于ms 2,4-d 0.05mg/l cppu 0.5mg/l 2-ip 0.1mg/l 硝酸银 0.2μg/l 活性炭 0.5g/l的丛生芽诱导培养基中，在温度25
±
2℃下暗培养7天，后温度不变，每日照光10h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养70天，诱导率为47.3%，褐化率为17.7%，且褐化不会影响丛生芽的生长。
[0036]
5、丛生芽的继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，接种于ms naa 0.1mg/l cppu 0.8mg/l tiba 0.02mg/l 香蕉泥60g/l的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25
±
2℃，每日照光10h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养40天，增殖系数为4.7。
[0037]
6、丛生芽的生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成单芽，接种在1/2ms naa 0.4mg/l iba 0.8mg/l kt 0.5mg/l 香蕉泥 60g/l 活性炭0.5g/l的丛生芽生根培养基中，在在温度25
±
2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养40天，生根率为98.2%。
[0038]
鹿蹄草试验数据一、消毒处理对消毒污染率、消毒死亡率及褐化率的影响进行以下消毒处理后接种于ms 2,4-d 0.02mg/l cppu 0.5mg/l 2-ip 0.1mg/l 硝酸银 0.1μg/l 活性炭 0.5g/l的丛生芽诱导培养基中，统计消毒污染率、消毒死亡率以及褐化率。
[0039]
二、初代诱导培养按照常规的naa或iba或2,4-d与6-ba、kt、cppu、zt、tdz、tiba或2-ip等细胞分裂素单独组合，均不能诱导出丛生芽，后继续进行各类生长素与各类细胞分裂素的复合组合，发
现仅在低浓度的2,4-d与低浓度的cppu以及2-ip组合时，能有一定的诱导成功率，后进行多次重复的2,4-d与cppu、2-ip复合组合，才调整出最佳的种类及浓度搭配，能有效诱导鹿蹄草丛芽，其后期的搭配试验数据如下表3所示。
[0040]
本试验时按照75%酒精15s 饱和漂白粉溶液消毒10min 8%双氧水消毒5min 0.025%升汞5min消毒后，接种到添加的 0.1~0.2μg/l硝酸银的ms培养基中，各培养基添加不同浓度2,4-d、cppu及2-ip，部分试验数据如下表3：