一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法

1.本发明涉及微生物电化学技术领域，特别涉及一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法。


背景技术：

2.水污染已经成为当今环境领域的三大问题之一，制约着社会经济的发展。研究人员都高度关注水污染问题，但由于传统的水质监测手段大都依赖复杂的大型仪器，物化分析手段无法实现水质的实时在线监测，因此，建立简单、高效、稳定、灵敏的水质监测方法，对促进人类社会健康发展至关重要。
3.微生物电化学传感器作为一种新型的传感技术，能够直接将环境变化引起的微生物活性变化转化为电信号，从而实现对环境变化的监测，具有操作简单、成本低廉、实时在线监测等优点，越来越受到科研工作者们关注。电活性生物膜作为微生物电化学传感器的敏感元件，其性能直接影响传感器的稳定性和灵敏度。
4.自然条件下从污水或是活性污泥驯化的生物膜存在启动时间长、功率低、稳定性差以及可重复性差等问题，难以实现普适性应用，因此，亟待发展快速高效形成稳定性优异、高电活性生物膜的方法，实现水质检测简便、高效、稳定、实时在线监测，具有重要的研究价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对上述存在的问题，提供一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法，采用悬浮纯菌预消氧模式，结合控制电路电压变化的方式，以及调控体系微氧环境等方式，实现快速高效地形成致密的、稳定性优异的、内核和外壳分层可控的高电活性生物膜。
6.本发明的技术方案是一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法，具体包括以下步骤：
7.1.一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
8.1)悬浮纯菌预消氧
9.反应体系由反应器、工作电极、对电极以及碳酸盐缓冲溶液的电解液构成。反应器中加入未曝氮气处理的电解液，并加入定量的悬浮纯菌，进行预消氧过程；
10.2)控制电压先后形成内外层生物膜
11.先向反应体系中接种电活性微生物，通过调控电压的梯度变化形成电活性生物膜内核；再向反应体系中接种混菌，并设定恒电压形成生物膜外壳；
12.3)调控微氧环境
13.向反应体系中充入微量的空气，继续设定恒电压进行微生物的培养，制得分层结构的高电活性微生物膜。
14.2.步骤1)中所述的悬浮纯菌(大肠杆菌、醋酸菌等)消氧替代了曝氮气过程；接种过程分为两步，消氧菌与产电菌不共存；密闭性良好的容器可以作为反应器(厌氧瓶，血清瓶等)，碳基材料可以作为工作电极(石墨棒、石墨片以及其他复合材料等)，耐腐蚀的金属材料可以作为对电极(铂片、不锈钢网等)，根据反应器容积的不同可以选择面积不同的工作电极和对电极，可操作性更强，应用性更广。
15.3.步骤2)中所述的控制电压先后形成内外层生物膜过程，选用电活性优异的纯菌作为内层的理想菌种(包括geobacter anodireducens、geobacter sulfurreducens、geobacter metallireducens、geobacter lovleyi)，并严格控制菌种的接种时间(悬浮菌消氧5-10小时后)以及菌种的接种顺序(先接种电活性微生物形成电活性生物膜内核，再接种混菌形成杂菌生物膜外壳)，形成的内外层结构分明的生物膜不仅提高了电活性性能，还增强了生物膜对环境的耐受能力，应用前景更加广泛。
16.4.步骤2)中所述的控制电压先后形成内外层生物膜过程，针对接种菌种的不同顺序，控制电路并设置不同的培养电压，设定电压从-0.8v～-0.2v梯度变化形成电活性生物膜内核，设定恒电位0v(ag/agcl参比)形成生物膜外壳，通过控制电路电压，高效地形成生物膜的内外层。
17.5.步骤3)中所述的调控微氧环境过程，利用微量氧气自动匹配外层辅助产电的非电活性菌层，微量的空气能够促进好氧菌协助内层电活性微生物进行电子传递，形成致密的高电活性分层混合生物膜。
18.本发明的优点和有益效果：
19.本发明与现有技术相比，通过结合悬浮纯菌预消氧模式、分层控制电路电压、以及调控体系微氧环境等方式，实现快速高效地形成致密的、稳定性优异的、内核和外壳分层可控的高电活性生物膜。
附图说明
20.图1为本发明形成高电活性分层混合生物膜的电流密度图。悬浮纯菌为大肠杆菌、电活性微生物为geobacter anodireducens、混菌为生活污水。
21.图2为本发明形成高电活性分层混合生物膜的电流密度图。悬浮纯菌为大肠杆菌、电活性微生物为geobacter sulfurreducens、混菌为生活污水。
22.图3为本发明形成高电活性分层混合生物膜的电流密度图。悬浮纯菌为大肠杆菌、电活性微生物为geobacter metallireducens、混菌为生活污水。
23.图4为本发明形成高电活性分层混合生物膜的电流密度图。悬浮纯菌为大肠杆菌、电活性微生物为geobacter lovleyi、混菌为生活污水。
24.图5为bod浓度与变化电流的关系图。bod浓度分别为10mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、300mg/l、500mg/l。
25.图6为甲醛浓度与衰减电流的关系图。甲醛浓度分别为0ppm、1ppm、5ppm、10ppm、20ppm、50ppm。
具体实施方式
26.为了深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，值得注意的是，本
发明中悬浮纯菌不局限于所使用的大肠杆菌，反应器不局限于所使用的厌氧瓶，电活性微生物不局限于所使用的菌株，工作电极不局限于所使用的碳基材料，对电极不局限于所使用的不锈钢网，同时本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体的实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。
27.实施例1
28.本实施例提供一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法
29.反应体系由厌氧瓶为反应器、石墨棒为工作电极、不锈钢网为对电极以及碳酸盐缓冲溶液为电解液构成，反应器中加入未曝氮气处理的电解液，并加入定量的大肠杆菌，进行预消氧过程，5-10小时后，向反应器中接种电活性微生物geobacter anodireducens，设定电压从-0.8v～-0.2v梯度变化形成电活性生物膜内核，再向反应体系中接种生活污水，设定恒电位0v(ag/agcl参比)形成生物膜外壳，如图1所示，从实验的电流密度曲线图可以明显看出，采用本发明的方法能够快速高效地形成稳定性优异的、内核和外壳分层可控的高电活性生物膜。
30.实施例2
31.本实施例提供一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法
32.反应体系由厌氧瓶为反应器、石墨棒为工作电极、不锈钢网为对电极以及碳酸盐缓冲溶液为电解液构成，反应器中加入未曝氮气处理的电解液，并加入定量的大肠杆菌，进行预消氧过程，5-10小时后，向反应器中接种电活性微生物geobacter sulfurreducens，设定电压从-0.8v～-0.2v梯度变化形成电活性生物膜内核，再向反应体系中接种生活污水，设定恒电位0v(ag/agcl参比)形成生物膜外壳，如图2所示，从实验的电流密度曲线图可以明显看出，采用本发明的方法能够快速高效地形成稳定性优异的、内核和外壳分层可控的高电活性生物膜。
33.实施例3
34.本实施例提供一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法
35.反应体系由厌氧瓶为反应器、石墨棒为工作电极、不锈钢网为对电极以及碳酸盐缓冲溶液为电解液构成，反应器中加入未曝氮气处理的电解液，并加入定量的大肠杆菌，进行预消氧过程，5-10小时后，向反应器中接种电活性微生物geobacter metallireducens，设定电压从-0.8v～-0.2v梯度变化形成电活性生物膜内核，再向反应体系中接种生活污水，设定恒电位0v(ag/agcl参比)形成生物膜外壳，如图3所示，从实验的电流密度曲线图可以明显看出，采用本发明的方法能够快速高效地形成稳定性优异的、内核和外壳分层可控的高电活性生物膜。
36.实施例4
37.本实施例提供一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法
38.反应体系由厌氧瓶为反应器、石墨棒为工作电极、不锈钢网为对电极以及碳酸盐缓冲溶液为电解液构成，反应器中加入未曝氮气处理的电解液，并加入定量的大肠杆菌，进行预消氧过程，5-10小时后，向反应器中接种电活性微生物geobacter lovleyi，设定电压从-0.8v～-0.2v梯度变化形成电活性生物膜内核，再向反应体系中接种生活污水，设定恒电位0v(ag/agcl参比)形成生物膜外壳，如图4所示，从实验的电流密度曲线图可以明显看出，采用本发明的方法能够快速高效地形成稳定性优异的、内核和外壳分层可控的高电活
性生物膜。
39.实施例5
40.本实施例提供一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法，及其在实验室模拟污水中bod传感的应用
41.反应体系由厌氧瓶为反应器、石墨棒为工作电极、不锈钢网为对电极以及碳酸盐缓冲溶液为电解液构成，反应器中加入未曝氮气处理的电解液，并加入定量的大肠杆菌，进行预消氧过程，5-10小时后，向反应器中接种电活性微生物geobacter anodireducens，设定电压从-0.8v～-0.2v梯度变化形成电活性生物膜内核，再向反应体系中接种生活污水，设定恒电位0v(ag/agcl参比)形成生物膜外壳，并构建以内核和外壳分层可控的高电活性生物膜为核心元件的微生物电化学传感器。用不同浓度的乙酸钠溶液模拟实际污水，加入到平行运行的微生物电化学传感器中，记录变化电流并根据库仑法计算得到bod值，得到bod值与变化电流的线性关系，如图5所示，采用本发明的方法构建的微生物电化学传感器能够在bod为10～500mg/l范围内有较好的响应。
42.实施例6
43.本实施例提供一种分层设计的高电活性生物膜可控形成方法，及其在实际污水毒性传感监测中的应用
44.反应体系由厌氧瓶为反应器、石墨棒为工作电极、不锈钢网为对电极以及碳酸盐缓冲溶液为电解液构成，反应器中加入未曝氮气处理的电解液，并加入定量的大肠杆菌，进行预消氧过程，5-10小时后，向反应器中接种电活性微生物geobacter anodireducens，设定电压从-0.8v～-0.2v梯度变化形成电活性生物膜内核，再向反应体系中接种生活污水，设定恒电位0v(ag/agcl参比)形成生物膜外壳，并构建以内核和外壳分层可控的高电活性生物膜为核心元件的微生物电化学传感器。用不同浓度的甲醛溶液模拟实际毒物，加入到平行运行的微生物电化学传感器中，记录衰减电流，得到甲醛浓度与衰减电流的线性关系，如图6所示，采用本发明的方法构建的微生物电化学传感器能够在甲醛浓度为0～50ppm范围内有较好的响应。