一种用于粮食和/或粮油中真菌毒素净化前处理的试剂盒及其使用方法与流程

1.本发明涉及真菌毒素净化前处理技术领域。更具体地，涉及一种用于粮食和/或粮油中真菌毒素净化前处理的试剂盒及其使用方法。


背景技术：

2.真菌毒素是真菌在生长繁殖过程中产生的次级代谢产物,广泛存在于农作物及其制品中，对人体健康具有极大的危害。粮油因油料作物生长、收获及油脂精炼、储存过程中受到气候、环境和运输条件等因素影响造成的真菌污染而容易产生有害的真菌毒素。目前，粮食及粮油中真菌毒素的检测的方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等。其中薄层色谱法由于溶剂消耗量大、重现性差等原因被其他方法逐渐取代，酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法一般用于快速检测和大批量样品的初筛，容易出现假阴性和假阳性结果，不能进行准确定量，而高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法灵敏度和准确度高，能够准确定量，但检测前需要进行样品前处理。
3.样品前处理是粮食及粮油中真菌毒素检测分析方法的重要步骤，通过样品前处理过程富集和浓缩目标物，降低基质效应和干扰组分，因此前处理方法会显著影响测试结果的准确度和精确度。常用的前处理方法不仅步骤复杂，耗时耗力，而且产生大量有机废液污染环境。基于免疫磁珠的前处理方法可以避免许多传统方法的弊端，操作步骤更加简化，近年来受到广泛的研究。但是基于免疫磁珠的前处理过程仍需要预先用10-20ml的乙腈、甲醇等有机溶剂进行毒素的提取，提取过程一般是先用振荡器涡旋振荡20-30min，然后再离心5-7min，这个过程步骤至少产生10-20ml有机废液，至少耗时30min。这种耗时耗力的提取过程不仅为实现全自动前处理技术增加了难度，而且产生有机废液造成污染。
4.因此，开发一种免提取且绿色环保的粮食和/或粮油前处理的试剂盒及其使用方法是一个亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种用于粮食和/或粮油中真菌毒素净化前处理的试剂盒。
6.本发明的第二个目的在于提供一种上述的试剂盒用于粮食和/或粮油中真菌毒素净化前处理的方法。该方法相较于传统净化前处理工艺，无需进行提取、离心、过滤等步骤，不仅极大缩短了前处理时间，简化了前处理工艺，而且避免产生大量有机废液，降低了处理成本。因此，本发明的方法较于传统工艺具有更高的经济价值和社会价值。
7.为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了一种用于粮食和/或粮油中真菌毒素净化前处理的试剂盒，所述试剂盒包括深孔板试剂条，所述深孔板试剂条包括多个并排设置的真菌毒素免疫
磁珠试剂条，所述真菌毒素免疫磁珠试剂条包括依次排列的反应孔、清洗孔、洗脱孔和磁珠保存孔；所述反应孔中含有反应液和真菌毒素免疫磁珠；
9.所述反应液为包含0.01％-5.0％(v:v)的tween-20或triton-100的pbst缓冲液、包含0.01％-2.0％(v:v)的tween-20或triton-100的tbst缓冲液、包含0.01-2.0％(v:v)的tween-20或triton-100的去离子水、包含0.01％-5.0％(v:v)的peg的pbs缓冲液中的一种。
10.需要说明的是，粮油或粮食粉末中的毒素因受基质影响一般难以与磁珠上的抗体直接结合，而本发明直接将一定体积的粮油或粮食粉末和反应液加入试剂盒孔中，利用反应液的作用，借助全自动净化仪的振荡/超声等辅助条件作用下，实现分配定律的动态平衡作用，使样品中毒素与磁珠表面抗体结合，进而实现无需提取、离心、过滤等步骤即可完成样品中毒素的磁珠高效富集。
11.优选地，所述清洗孔可根据需要设置多个孔位，进行多次清洗，防止杂质进入洗脱孔。
12.进一步，所述peg为peg-200、peg-300、peg-400、peg-600、peg-800、peg-1000、peg-1500、peg-2000、peg-4000、peg-8000中的一种。其中，所述peg为聚乙二醇。
13.进一步，所述清洗孔包括第一清洗孔和第二清洗孔；所述第一清洗孔和第二清洗孔中分别含有清洗液；其中，第一清洗孔中的清洗液为包含0.01％-2.0％的tween-20或triton-100的pbst缓冲液、包含0.01％-2.0％的tween-20或triton-100的tbst缓冲液、包含0.01％-2.0％的tween-20或triton-100的去离子水中的一种；所述第二清洗孔中的清洗液为pbs缓冲液或pbst缓冲液。其中，所述第一清洗孔或第二清洗孔可根据需要设置多个孔位，例如，第一清洗孔1、第一清洗孔2、第一清洗孔3等。
14.进一步，所述洗脱孔中含有洗脱液；所述洗脱液为甲醇、乙腈、含有乙酸或甲酸的甲醇、含有乙酸或甲酸的乙腈、含有水的甲醇、含有水的乙腈中的一种。
15.进一步，所述磁珠保存孔包括去离子水。所述去离子水用于保存洗脱后的磁珠。
16.进一步，所述真菌毒素免疫磁珠的制备方法，包括如下步骤：
17.将重组蛋白a或重组蛋白g溶于100mm的mes缓冲液中，获得浓度为1-50mg/ml的重组蛋白a或重组蛋白g的溶液；
18.将所述重组蛋白a或重组蛋白g的溶液与清洗后的nhs磁珠混合，孵育1-5小时，获得偶联重组蛋白a免疫磁珠或偶联重组蛋白g免疫磁珠；
19.将真菌毒素抗体与所述偶联重组蛋白a免疫磁珠或与所述偶联重组蛋白g免疫磁珠混合，孵育1-5小时，获得真菌毒素免疫磁珠。
20.根据本发明的具体实施方案，所述nhs磁珠的规格为20％(v:v)，10-30μm。所述清洗后的nhs磁珠是经无水乙醇清洗后的nhs磁珠。
21.根据本发明的具体实施方案，获得真菌毒素免疫磁珠之后还包括：磁分离弃去上层液，使用pbst和pbs清洗磁珠的步骤。
22.进一步，所述重组蛋白a或重组蛋白g与所述nhs磁珠的比例为1-10mg:1ml。
23.进一步，所述真菌毒素抗体与所述偶联重组蛋白a免疫磁珠或偶联重组蛋白g免疫磁珠的比例为1-10mg:1ml。
24.进一步，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素、赭曲霉毒素a、t-2毒素中的一种。
25.进一步，所述粮食包括玉米、小麦、大豆、糙米中的一种；所述粮油包括花生油、玉米油、大豆油、菜籽油、葵花籽油、油菜籽油、芝麻油、橄榄油中的一种。
26.进一步，所述试剂盒还包括有磁棒套。
27.进一步，所述多个并排设置的真菌毒素免疫磁珠试剂条还分别覆盖有可移除的密封保护膜，用于将所述反应孔、清洗孔、洗脱孔和磁珠保存孔密封。
28.第二方面，本发明提供了一种上述的试剂盒用于粮食和/或粮油中真菌毒素净化前处理的方法，包括如下步骤：
29.将待测的粮食粉末和/或粮油置于所述反应孔中，将所述深孔板试剂条置于真菌毒素全自动净化仪中；
30.将所述磁棒套安装在真菌毒素全自动净化仪上，设置全自动净化程序并运行程序，所述磁棒套依次通过所述反应孔、清洗孔、洗脱孔和磁珠保存孔，借助自动净化仪的振荡/超声条件，实现真菌毒素的净化前处理。
31.其中，待测的粮食粉末和/或粮油置于所述反应孔中，粮食粉末和/或粮油中的真菌毒素与真菌毒素免疫磁珠中的真菌毒素抗体结合，获得带有真菌毒素的磁珠；待磁棒套通过所述反应孔时，磁棒套吸附带有真菌毒素的磁珠，并将其转移到清洗孔中进行清洗，随后转移到洗脱孔中，真菌毒素被洗脱到该孔内，最后磁珠被转移到磁珠保存孔内。
32.另外，如无特殊说明，本发明中所用原料均可通过市售商购获得，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。所述百分比如无特殊说明均为质量百分比，所述溶液若无特殊说明均为水溶液。
33.本发明的有益效果如下：
34.本发明提供的真菌毒素净化前处理方法直接将一定体积的粮油或粮食粉末加入试剂盒反应孔中，在反应液作用下，并借助全自动净化仪的振荡/超声等辅助条件，实现分配定律的动态平衡，使样品中毒素与磁珠表面抗体结合，进而实现无需提取、离心、过滤等操作即可完成样品中毒素的磁珠高效富集。
35.本发明提供的真菌毒素净化前处理方法不仅缩短了前处理时间，简化了前处理过程，而且避免产生大量有机废液，实现了全自动、高通量、绿色环保的粮油前处理过程。
36.本发明提供的真菌毒素净化前处理方法因前处理工艺的简化，使得实验人员的手动操作环节较少，因此，检测毒素结果的相对误差更小。
37.本发明提供的试剂盒原料廉价易得，工艺简单，适合大规模生产应用。
附图说明
38.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
39.图1示出本发明实施例7所用的试剂盒的结构示意图；其中，附图标记为：1、样品孔；2、反应孔；3、第一清洗孔；4、第一清洗孔；5、第二清洗孔；6、洗脱孔；7、磁珠保存孔。
40.图2示出实施例12处理后的样品、伏马毒素标准溶液和空白溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
41.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
42.其中，以下实施例及对比例中，
43.重组蛋白g购自上海碧云天生物技术有限公司；
44.nhs磁珠购自苏州海狸生物医学工程有限公司；
45.伏马毒素抗体、黄曲霉毒素抗体、赤霉烯酮抗体、呕吐毒素抗体均购自无锡创普生物技术有限公司。
46.实施例1
47.真菌毒素免疫磁珠的制备
48.(1)重组蛋白g用ph＝6.0，100mm的mes缓冲液溶解，得到浓度为10mg/ml重组蛋白g溶液。
49.(2)取4ml的nhs磁珠(20％(v:v)，10-30μm)，使用无水乙醇将磁珠清洗2次。按照6mg重组蛋白g与1ml nhs磁珠的偶联比例，向nhs磁珠中加入重组蛋白g溶液，再补充一定量的mes缓冲液，使整个体系在mes缓冲液中进行，在室温下，缓慢混合，孵育2小时。
50.(3)孵育结束后，使用0.1％pbst、pbs溶液清洗磁珠，各两次，用pbs溶液定容，制备得到重组蛋白g免疫磁珠。
51.(4)用mes缓冲液稀释伏马毒素抗体，制备伏马毒素抗体稀释液。按照6mg抗体伏马毒素与1ml重组蛋白g免疫磁珠的比例，向重组蛋白g免疫磁珠中加入抗体稀释液，补充一定的pbs，使整个体系在pbs缓冲液中进行在室温下，缓慢混合，孵育2小时。
52.(5)孵育结束后，磁分离弃去上层液，使用pbst和pbs清洗磁珠，各2次，用磁珠保护液定容至4ml，4℃保存伏马毒素免疫磁珠。
53.(6)测试制备的伏马毒素免疫磁珠的加标回收率，结果为：伏马毒素的组成成分fb1、fb2、fb3的加标回收率分别为94.1％、98.0％和92.7％，rsd＜2.3％；100μl伏马毒素免疫磁珠的容量为1753ng。相比于相同抗体与磁珠的偶联比的edc/nhs法得到的免疫磁珠，柱容量提高49.8％。
54.实施例2-6
55.同实施例1，区别仅在于，将步骤(4)中的伏马毒素抗体分别替换为黄曲霉毒素抗体、玉米赤霉烯酮抗体、呕吐毒素抗体、伏马毒素抗体，分别获得黄曲霉毒素免疫磁珠、玉米赤霉烯酮免疫磁珠、呕吐毒素免疫磁珠、伏马毒素免疫磁珠。
56.实施例7
57.1)提供一种黄曲霉毒素净化前处理的试剂盒及其使用方法
58.所述试剂盒包括样品孔1、反应孔2、清洗孔(第一清洗孔3、4和第二清洗孔5)、洗脱孔6和磁珠保存孔7。
59.取50μl实施例2制得的混合均匀的黄曲霉毒素免疫磁珠溶液、0.25ml花生油质控样品、0.45ml 0.5％pbst缓冲液(含0.5％tween-20)置于试剂盒反应孔2中；取1ml 0.5％pbst缓冲液(含0.5％tween-20)于第一清洗孔3和第一清洗孔4中，取1ml pbs溶液于第二清洗孔5中；取0.5ml甲醇于洗脱孔6中。取0.5ml去离子水于磁珠保存孔7中。
60.将试剂盒置于真菌毒素全自动净化仪中。将磁棒套安装在真菌毒素全自动净化仪上。设置全自动净化程序，并运行程序，磁棒套依次经过所述试剂盒的反应孔、清洗孔、洗脱孔和磁珠保存孔。
61.程序运行结束，向洗脱孔6中加入0.5ml去离子水，混匀后用0.22μm滤膜过滤至2ml进样瓶中，得到前处理后的样品。
62.2)黄曲霉毒素的检测
63.重复操作本例的步骤1)3次，得到3组处理后的样品，使用高效液相色谱按照gb5009.22—2016中的条件对处理后的样品中的黄曲霉毒素分别进行分析测试，结果为黄曲毒素的平均回收率为92.6％，相对标准偏差为4.6％。
64.实施例8
65.1)提供一种黄曲霉毒素净化前处理的试剂盒及其使用方法
66.所述试剂盒包括样品孔1、反应孔2、清洗孔(第一清洗孔3、4和第二清洗孔5)、洗脱孔6和磁珠保存孔7。
67.取50μl实施例2制得的混合均匀的黄曲霉毒素免疫磁珠溶液、0.25ml花生油质控样品、0.45ml 1.5％peg-pbs(含1.5％peg-200)置于试剂盒反应孔2中；取1ml 0.5％pbst溶液(含0.5％tween-20)于第一清洗孔3和第一清洗孔4中，取1mlpbs溶液于第二清洗孔5中；取0.5ml甲醇于洗脱孔6中。取0.5ml去离子水于磁珠保存孔7孔位中。
68.将试剂盒置于真菌毒素全自动净化仪中。将磁棒套安装在真菌毒素全自动净化仪上。设置全自动净化程序，并运行程序，磁棒套依次经过所述试剂盒的反应孔、清洗孔、洗脱孔和磁珠保存孔。
69.程序运行结束，向洗脱孔6中加入0.5ml去离子水，混匀后用0.22μm滤膜过滤至2ml进样瓶中，得到前处理后的样品。
70.2)黄曲霉毒素的检测
71.重复操作本例的步骤1)3次，得到3组处理后的样品，使用高效液相色谱按照gb5009.22—2016中的条件对处理后的样品中的黄曲霉毒素分别进行分析测试，结果为黄曲毒素的平均回收率为98.4％，相对标准偏差为6.3％。
72.实施例9
73.1)提供一种玉米赤霉烯酮净化前处理的试剂盒及其使用方法
74.所述试剂盒包括样品孔1、反应孔2、清洗孔(第一清洗孔3、4和第二清洗孔5、6)、洗脱孔7和磁珠保存孔8。
75.取100μl实施例3制得的玉米赤霉烯酮免疫磁珠溶液、0.25ml玉米油质控样品、0.5ml 3％pbst(含3％triton-100)置于试剂盒反应孔2中；取1ml 0.5％pbst溶液(含0.5％tween-20)于第一清洗孔3和第一清洗孔4中，取1ml pbs溶液于第二清洗孔5和第二清洗孔6中。取0.5ml甲醇于洗脱孔7中。取1ml去离子水于试剂盒磁珠保存孔8中。
76.将试剂盒置于真菌毒素全自动净化仪中。将磁棒套安装在真菌毒素全自动净化仪上。设置全自动净化程序，并运行程序，磁棒套依次经过所述试剂盒的反应孔、清洗孔、洗脱孔和磁珠保存孔。
77.程序运行结束，向洗脱孔8中加入0.5ml去离子水，混匀后用0.22μm滤膜过滤至2ml进样瓶中，得到前处理后的样品。
78.2)玉米赤霉烯酮的检测
79.重复操作本例的步骤1)3次，得到3组处理后的样品，使用高效液相色谱按照gb5009.209—2016中的条件对处理后的样品中的玉米赤霉烯酮分别进行分析测试，结果为玉米赤霉烯酮的平均回收率为95.2％，相对标准偏差为3.5％。
80.实施例10
81.1)提供一种玉米赤霉烯酮净化前处理的试剂盒及其使用方法
82.所述试剂盒包括样品孔1、反应孔2、清洗孔(第一清洗孔3、4和第二清洗孔5、6)、洗脱孔7和磁珠保存孔8。
83.取100μl实施例3制得的玉米赤霉烯酮免疫磁珠溶液、0.25ml玉米油质控样品、0.5ml 5％peg-pbs(含5％peg-8000)置于试剂盒反应孔2中；取1ml0.5％pbst溶液(含0.5％tween-20)于第一清洗孔3和第一清洗孔4中，取1mlpbs溶液于第二清洗孔5和第二清洗孔6中。取0.5ml甲醇于洗脱孔7中；取1ml去离子水于试剂盒磁珠保存孔8中。
84.将试剂盒置于真菌毒素全自动净化仪中。将磁棒套安装在真菌毒素全自动净化仪上。设置全自动净化程序，并运行程序，磁棒套依次经过所述试剂盒的反应孔、清洗孔、洗脱孔和磁珠保存孔。
85.程序运行结束，向洗脱孔7中加入0.5ml去离子水，混匀后用0.22μm滤膜过滤至2ml进样瓶中，得到前处理后的样品。
86.2)玉米赤霉烯酮的检测
87.重复操作本例的步骤1)3次，得到3组处理后的样品，使用高效液相色谱按照gb5009.209—2016中的条件对步骤1)处理后的样品中的玉米赤霉烯酮分别进行分析测试，结果为玉米赤霉烯酮的平均回收率为97.6％，相对标准偏差为5.2％。
88.实施例11
89.1)提供一种呕吐毒素净化前处理的试剂盒及其使用方法
90.所述试剂盒包括样品孔1、反应孔2、清洗孔(第一清洗孔3、4和第二清洗孔5)、洗脱孔6和磁珠保存孔7。
91.取200μl混合均匀的呕吐毒素免疫磁珠溶液、0.25g玉米质控样品、，0.5ml 3％peg-pbs(含3％peg-2000)置于试剂盒反应孔2中；取1ml0.1％pbst溶液(含0.1％tween-20)于第一清洗孔3和第一清洗孔4中，取1mlpbs溶液于第二清洗孔5孔位中。取0.5ml甲醇于洗脱孔6中。取0.5ml去离子水于试剂盒磁珠保存孔7中。
92.将试剂盒置于真菌毒素全自动净化仪中。将磁棒套安装在真菌毒素全自动净化仪上。设置全自动净化程序，并运行程序，磁棒套依次经过所述试剂盒的反应孔、清洗孔、洗脱孔和磁珠保存孔。
93.程序运行结束，取洗脱孔6中加入0.5ml去离子水，混匀后用0.22μm滤膜过滤至2ml进样瓶中，得到前处理后的样品。
94.2)呕吐毒素的检测
95.重复操作本例的步骤1)3次，得到3组处理后的样品，使用高效液相色谱按照gb5009.111—2016中的条件对处理后的样品中的呕吐毒素进行分别分析测试，结果为呕吐毒素的平均回收率为97.9％，相对标准偏差为4.5％。
96.实施例12
97.1)提供一种伏马毒素净化前处理的试剂盒及其使用方法
98.所述试剂盒包括样品孔1、反应孔2、清洗孔(第一清洗孔3和第二清洗孔4)、洗脱孔5和磁珠保存孔6。
99.取200μl混合均匀的伏马毒素免疫磁珠溶液、0.5g糙米质控样品、0.6ml1.0％tbst(含1.0％triton-100)置于试剂盒反应孔2中；取1ml0.1％pbst溶液(含0.1％tween-20)于第一清洗孔3孔位中，取1mlpbs溶液于第二清洗孔4中；取0.5ml甲醇于洗脱孔5中。取1ml去离子水于试剂盒磁珠保存孔6中。
100.将试剂盒置于真菌毒素全自动净化仪中。将磁棒套安装在真菌毒素全自动净化仪上。设置全自动净化程序，并运行程序，磁棒套依次经过所述试剂盒的反应孔、清洗孔、洗脱孔和磁珠保存孔。
101.程序运行结束，向洗脱孔5中加入0.5ml去离子水，混匀后用0.22μm滤膜过滤至2ml进样瓶中，得到前处理后的样品。
102.2)伏马毒素的检测
103.重复操作本例的步骤1)3次，得到3组处理后的样品，使用高效液相色谱按照gb5009.240—2016中的条件对步骤1)处理后的样品中的伏马毒素进行分别分析测试，结果为伏马毒素的平均回收率为95.1％，相对标准偏差为0.9％。
104.对比例1
105.1)提供一种黄曲霉毒素净化前处理的试剂盒及其使用方法
106.所述试剂盒包括样品孔1、反应孔2、清洗孔3、4、5、洗脱孔6和磁珠保存孔7。
107.(1)称取2g花生油样品，加入20ml的离心管中，加入84％乙腈水10ml，然后放置在振荡器中涡旋20分钟，然后离心5分钟，取上清液，即为样品提取液。
108.(2)取1ml样品提取液加到试剂盒样品孔1中，再加入4.5ml0.5％pbst溶液(含0.5％tween-20)。取200μl混合均匀的黄曲霉毒素免疫磁珠于反应孔2中，取1ml0.5％pbst溶液(含0.5％tween-20)于清洗孔3和清洗孔4中，取1ml pbs清洗液于清洗孔5孔位中。取0.5ml甲醇于洗脱孔6中。取0.5ml去离子水于试剂盒磁珠保存孔7中。
109.(3)将试剂盒置于真菌毒素全自动净化仪中。将磁棒套安装在真菌毒素全自动净化仪上。设置全自动净化程序，并运行程序。
110.(4)程序运行结束，向洗脱孔6中加入0.5ml去离子水，混匀后用0.22μm滤膜过滤至2ml进样瓶中，得到前处理后的样品。
111.2)重复操作本例的步骤1)3次，得到3组处理后的样品，使用高效液相色谱按照gb5009.22—2016中的条件对得到的样品中的黄曲霉毒素进行分析测试，结果为黄曲霉毒素的平均回收率为90.8％，相对标准偏差为8.3％。由此可知，该例提供的方法进行了毒素的前提取步骤，该步骤为人工操作，因此导致数据的偏差误差较大。
112.对比例2
113.1)提供一种赤霉烯酮净化前处理的试剂盒及其使用方法
114.所述试剂盒包括样品孔1、反应孔2、清洗孔3、4、5、洗脱孔6和磁珠保存孔7。
115.(1)称取2g玉米粉末样品，加入20ml的离心管中，加入90％乙腈水10ml，然后放置在振荡器中涡旋30分钟，然后离心5分钟，取上清液，即为样品提取液。
116.(2)取1ml样品提取液加到试剂盒样品1中，再加入4.5ml 0.5％pbst溶液(含0.5％
tween-20)。取200μl混合均匀的玉米赤霉烯酮免疫磁珠于反应孔2中，取1ml 0.5％pbst溶液(含0.5％tween-20)于清洗孔3和清洗孔4中，取1mlpbs清洗液于清洗孔5中。取0.5ml甲醇于洗脱孔6中。取0.5ml去离子水于试剂盒磁珠保存孔7位中
117.(3)将试剂盒置于真菌毒素全自动净化仪中。将磁棒套安装在真菌毒素全自动净化仪上。设置全自动净化程序，并运行程序。
118.(4)程序运行结束，向洗脱孔6中加入0.5ml去离子水，混匀后用0.22μm滤膜过滤至2ml进样瓶中，得到前处理后的样品。
119.2)重复操作本例的步骤1)3次，得到3组处理后的样品，使用高效液相色谱按照gb5009.209—2016中的条件对得到的样品中的玉米赤霉烯酮进行分析测试，结果为赤霉烯酮的平均回收率为94.9％，相对标准偏差为10.3％。由此可知，该例提供的方法进行了毒素的前提取步骤，该步骤为人工操作，因此导致数据的偏差误差较大。
120.对比例3
121.称取2g花生油置于50ml离心管中。向离心管中加入10ml 84％乙腈水，并在振荡器上涡旋20分钟。然后离心5分钟，取上清液，即为样品提取液。
122.按照国家标准gb5009.22-2016并进行稍微修改，用免疫亲和柱对样品提取液进行净化富集。首先用25ml 0.1％pbst溶液稀释2ml样品提取液。然后将稀释后的溶液以每秒1-2滴的速度通过黄曲霉毒素的免疫亲和柱，然后用10ml pbs溶液淋洗两次，最后用2ml甲醇用于洗脱。将洗脱液在50℃进行氮吹，并用1ml 50％甲醇水复溶，得到前处理后的样品。
123.2)黄曲霉毒素的检测
124.重复操作本例的步骤1)3次，得到3组处理后的样品，使用高效液相色谱按照gb5009.22—2016中的条件对处理后的样品中的黄曲霉毒素分别进行分析测试，结果为黄曲毒素的平均回收率为98.6％，相对标准偏差为9.6％。
125.试验例1
126.对比实施例12处理后的样品、伏马毒素标准溶液和空白溶液的高效液相色谱图。具体见图2所示。
127.由图2可知，本发明提供的方法可以有效净化富集糙米中的伏马毒素。
128.试验例2
129.对比实施例7-12与对比例1-3提供的试剂盒使用过程中用到的有机试剂的总量及总处理时间，并将结果总结于表1。
130.表1：
[0131][0132]
由表1可知，实施例7-12相较于对比例1-3的净化前处理过程，有机溶剂使用量减少了10-46.5ml，整体处理时长减少了25-117min。因此，可以得出：本发明利用反应液，并借助全自动净化仪的振荡/超声等辅助条件，实现了粮油或粮食粉末中的真菌毒素的快速净化富集，与传统方法相比，本发明无需进行前处理操作，不仅缩短了前处理时间，简化了前处理工艺，而且更加绿色环保的结论。
[0133]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。