多肽EN-9在制备治疗痤疮的产品中的应用

多肽en-9在制备治疗痤疮的产品中的应用
技术领域
1.本发明属于小分子多肽应用技术领域，尤其涉及多肽en-9在制备治疗痤疮的产品中的应用。


背景技术：

2.痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，目前治疗痤疮的药物主要有维a酸类药物、抗菌药物、激素类药物。然而这些药物都存在种种不足，例如：抗生素容易被滥用，这导致了越来越多的细菌耐药现象的发生。同时，口服抗生素要注意药物不良反应的发生，如胃肠道反应、药疹、肝损害、光敏反应、色素沉着和菌群失调。而异维a酸也常常有头痛、恶心呕吐、甚至致畸等不良反应发生。激素类药物容易使患者产生依赖性。因此，痤疮患者亟需更为安全有效的相应治疗药物。
3.痤疮丙酸杆菌(cutibacterium acnes，简称ca菌)通常存在于皮脂丰富的皮肤区域，它的过度增殖一直被认为是导致痤疮的原因。当皮脂分泌旺盛导致毛囊堵塞时，缺氧的环境使痤疮丙酸杆菌大量繁殖，对免疫系统产生强烈刺激，造成寻常痤疮的爆发。痤疮丙酸杆菌在痤疮的发病机制中发挥着重要作用，痤疮的严重程度和痤疮丙酸杆菌的相对丰度密切有关。由此可见，在治疗痤疮的过程中，对痤疮丙酸杆菌的生长进行抑制属于关键的一环。此外，在抑制痤疮丙酸杆菌生长的同时，减少痤疮部位炎症的发生和发展，对阻止痤疮的进一步恶化也是至关重要的。
4.小分子多肽又称寡肽或低聚肽，一般由2-10个氨基酸组成。小分子肽拥有很多独特的生物活性，是蛋白质结构的功能片断，在生物体内具有重要的生理功能。许多小分子多肽可介导细胞与细胞、蛋白质与蛋白质、细胞与蛋白质及其他非肽类药物、蛋白调控因子与基因表达之间的相互作用。此外，小分子多肽还具有分子量小、组织穿透力强、溶解性好、稳定性高、可大量制备和免疫原性较低等特点，由此常作为新型药物的候选化合物。
5.基于此，本发明希望寻找和开发得到一种既具有抑制痤疮丙酸杆菌生长，还具备良好抗炎功效的多肽化合物，从而更好地应用于痤疮的治疗。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出多肽en-9在制备治疗痤疮的产品中的应用。本发明指出，多肽en-9具有抑制痤疮丙酸杆菌生长的作用，还具有良好的抗炎活性，在制备治疗痤疮的产品中体现出很好的应用前景。
7.本发明提供了多肽en-9在制备治疗痤疮的产品中的应用，所述多肽en-9的氨基酸序列为：endpravaf(seq id no：1)。
8.优选地，所述多肽en-9的制备方法，包括以下步骤：
9.将乳杆菌接种至液体发酵培养基中进行发酵后，得到含多肽en-9的溶液；所述乳杆菌包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少一种。
10.更优选地，所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌。
11.更优选地，所述接种的量为1-5％。
12.更优选地，所述液体发酵培养基为mrs培养基。
13.更优选地，所述发酵的时间为24-48h。
14.更优选地，所述方法还包括对所述含多肽en-9的溶液进行分离、纯化的步骤。
15.进一步优选地，所述分离的步骤为：采用乙酸乙酯对所述含多肽en-9的溶液进行萃取，再采用层析柱进行分离。
16.再进一步优选地，所述层析柱为葡聚糖凝胶层析柱。
17.进一步优选地，所述纯化的步骤为：采用高效液相色谱进行纯化，所述高效液相色谱所用流动相为乙腈水溶液。
18.再进一步优选地，所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比约为9：1。
19.本发明提供了一种治疗痤疮的药物，包括多肽en-9和/或其在药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
20.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
21.本发明指出，乳杆菌的发酵产物中含有既能抑制痤疮丙酸杆菌生长，还体现出良好抗炎活性的多肽en-9。此外本发明还提供了制备多肽en-9方法，并通过试验表明多肽en-9具有良好的耐热性和蛋白酶稳定性，可大量制备，在痤疮的治疗上具有较广阔的应用前景，可用于制备治疗痤疮的产品(如药物或化妆品)。
附图说明
22.图1为干酪乳杆菌的发酵上清对痤疮丙酸杆菌的抑制率；
23.图2为罗伊氏乳杆菌的发酵上清对痤疮丙酸杆菌的抑制率；
24.图3为植物乳杆菌的发酵上清对痤疮丙酸杆菌的抑制率；
25.图4为嗜酸乳杆菌的发酵上清对痤疮丙酸杆菌的抑制率；
26.图5为干酪乳杆菌发酵上清乙酸乙酯萃取液对痤疮丙酸杆菌的抑制率；
27.图6为植物乳杆菌发酵上清乙酸乙酯萃取液对痤疮丙酸杆菌的抑制率；
28.图7为嗜酸乳杆菌发酵上清乙酸乙酯萃取液对痤疮丙酸杆菌的抑制率；
29.图8为mrs培养基乙酸乙酯萃取液对痤疮丙酸杆菌的抑制率；
30.图9为嗜酸乳杆菌cip 76.13的生长曲线；
31.图10为嗜酸乳杆菌cip 76.13的抑菌能力曲线；
32.图11为嗜酸乳杆菌cip 76.3以不同培养时间、不同接种量所得发酵上清液的抑菌能力；
33.图12为不同温度作用下发酵上清液抑菌能力；
34.图13为不同ph作用下发酵上清液的抑菌能力；
35.图14为不同蛋白酶作用下发酵上清液的抑菌能力；
36.图15为实施例6中经层析分离后各管的蛋白质浓度；
37.图16为实施例6中层析分离后各管的抑菌率；
38.图17为实施例6中最佳馏分的高效液相色谱图；
39.图18为不同处理条件下thp-1细胞中il-1β的基因相对表达量；
40.图19为不同处理条件下raw 264.7细胞中tnf-α的基因相对表达量；
41.图20为嗜酸乳杆菌抑菌抗炎多肽(多肽en-9)的lc-ms/ms一级质谱图；
42.图21为嗜酸乳杆菌抑菌抗炎多肽(多肽en-9)的lc-ms/ms二级质谱图。
具体实施方式
43.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
44.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
45.实施例1：不同乳杆菌的发酵上清的抑菌效果
46.1.菌株的复苏与培养
47.取出在-80℃中保藏的罗伊氏乳杆菌jcm 1112、干酪乳杆菌atcc 393、植物乳杆菌dsm10667和嗜酸乳杆菌cip 76.13，菌液经37℃水浴解冻后，分别以5％的接种量接种到已灭菌的mrs肉汤培养基中，放入无氧环境中，37℃恒温培养，当生长至对数生长期时(菌液开始变浑浊)，从该已活化的菌液中取3％的接种量转接到新的无菌mrs培养基，继续培养48小时，得到相应4种菌液。
48.2.发酵上清的抑菌试验
49.将上述4种菌液分别在4000转速下离心5分钟，取上清液适量，上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，得到4种相应发酵上清液，在4℃保存备用。
50.3.稀释肉汤法抑菌试验
51.(1)将甘油保藏的痤疮丙酸杆菌用哥伦比亚血平板复苏后，用平板划线法培养单菌落，挑取适量的痤疮丙酸杆菌单菌落于灭菌后的液体硫乙醇酸盐培养基(ft培养基)中，在37℃下培养1-2天，使痤疮丙酸杆菌处于对数生长期(od600值约为0.26)，将该菌液稀释10倍后置于-4℃冰箱中作为工作液备用。
52.(2)取上述制得的4种发酵上清液作为试验组，并增设阴性对照组、阳性对照组。在无菌96孔板每孔加100μl的无菌ft培养基后，试验组第一列中加入未经稀释的发酵上清100μl，逐次倍比稀释到第三列，阴性对照组和阳性对照组添加100μl的ft培养基。最后试验组每孔加入上述痤疮丙酸杆菌工作菌液100μl，阴性对照组添加100μl的ft培养基，此时每孔液体的终体积为200μl，4种发酵上清液均分别设置有25％、12.5％、6.3％的浓度，因而共有12个试验组、1个阴性对照组和1个阳性对照组。每组设置三个重复，平行设置两个板，一个板加完药液后，用酶标仪测吸光值，作为背景吸光值；另一块96孔板放入无氧环境中，37℃恒温培养2-3天后，用酶标仪测各个孔的吸光度。抑菌率的计算公式为：抑菌率＝(
△
阳性对照组od值
‑△
试验组od值)/(
△
阳性对照组od值
‑△
阴性对照组od值)，
△
od值＝od值(培养后)-od值(背景)。具体试验结果如图1-4所示。
53.由图1-4可知，当发酵上清液浓度达到12.5％及以上时，干酪乳杆菌、植物乳杆菌的发酵上清已具有90％以上的抑痤疮丙酸杆菌活性；当浓度达到25％时，嗜酸乳杆菌的发酵上清也具有90％以上的抑菌活性；而罗伊氏乳杆菌的发酵上清在6.3％-25％的浓度范围内均不具有抑痤疮丙酸杆菌活性，甚至起到促进痤疮丙酸杆菌生长的作用。以上结果显示，
并非所有种类乳杆菌的发酵上清对于痤疮丙酸杆菌都有抑制作用。
54.实施例2
55.取实施例1中抑菌效果较好的干酪乳杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的发酵上清各200ml，用同体积的乙酸乙酯(色谱纯)分4次萃取发酵上清，取上层有机相，有机相用超声仪振荡30分钟，再经4000r/min的转速离心5min以减少萃取中产生的乳化层，去除底部的白色絮状物后，澄清的有机相用旋转蒸发仪蒸发干乙酸乙酯，最后加入10ml的超纯水重新溶解底物，获得3种发酵上清乙酸乙酯萃取液，以无菌mrs的乙酸乙酯萃取液为对照组，按实施例1中的方法进行抑菌试验，具体实验结果如图5-8所示。
56.由图5-8可知，嗜酸乳杆菌的发酵上清乙酸乙酯萃取液的抑制效果最好，在浓度3.1％的时候即达到对痤疮丙酸杆菌50％以上的抑制率。同时，mrs乙酸乙酯萃取物无抑制痤疮丙酸杆菌的作用，可证明发酵上清中的抑菌成分是由菌株所分泌产生的。以上结果表明，在干酪乳杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌三种菌株中，嗜酸乳杆菌为最优选菌株。
57.实施例3：嗜酸乳杆菌cip 76.13的生长曲线和发酵上清液抑菌能力曲线测定
58.将活化好的嗜酸乳杆菌cip 76.13以3％的接种量接种于无菌mrs液体培养基中，37℃静置培养，每隔3h取样，分别测定菌株在发酵过程中发酵液ph、od600和发酵上清液抑菌能力，测试结果如图9-10所示。
59.根据图9中嗜酸乳杆菌cip 76.13的生长曲线可知，发酵液的ph值和od600在6-18h内的变化最大，36小时后趋于平缓。这说明菌在发酵6-18h内是处于对数生长期，36h后，菌逐渐进入衰老期。
60.根据图10中嗜酸乳杆菌cip 76.13抑菌能力曲线可知，发酵上清液的抑菌能力在发酵48h后达到最大值。
61.实施例4：嗜酸乳杆菌发酵条件优化
62.本实施例对嗜酸乳杆菌cip 76.13的发酵条件进行优化。设置三个梯度的发酵时间，分别为24、36、48小时；设置三个梯度的接种量，分别为1％、2％、4％；共组成9组不同发酵时间和接种量的发酵条件。培养结束后，以25％的发酵上清液浓度，按照实施例1中的稀释肉汤法进行抑菌试验，试验结果如图4所示。
63.由图11可知，嗜酸乳杆菌cip 76.13的较优发酵条件为：接种量为1％，发酵时间为48小时。
64.实施例5：不同处理对嗜酸乳杆菌发酵上清抑菌能力的影响
65.1.取实施例1中嗜酸乳杆菌发酵上清液，均分为5份。其中1份不作处理，常温下放置30min；其余4组分别置于60、80、100、121℃下处理30分钟，采用实施例1中的抑菌试验方法比较不同温度下发酵上清液的抑菌效果，结果如图12所示。
66.由图12可知，嗜酸乳杆菌发酵上清液的热稳定性良好，抑菌活性在121℃的高温作用下无显著变化。
67.2.用4m的无菌naoh调节嗜酸乳杆菌发酵上清液ph分别至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后用实施例1中的抑菌试验方法比较不同ph下上清液的抑菌效果，结果如图13所示。
68.由图13可知，将嗜酸乳杆菌发酵上清液碱化会降低和破坏其抑菌能力。
69.分别用无菌pbs缓冲液(ph 7.0)将胃蛋白酶，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶k和中性蛋白酶配制成50mg/ml的母液，将各蛋白酶分别加入到嗜酸乳杆菌发酵上清中，使胃蛋白
酶终浓度为2mg/ml，37℃反应2h，采用实施例1中的抑菌试验方法比较不同温度下发酵上清液的抑菌效果，结果如图14所示。
70.由图14可知，胰蛋白酶和蛋白酶k能破坏嗜酸乳杆菌发酵上清的抑菌能力，其他种类的蛋白酶对嗜酸乳杆菌发酵上清抑菌能力的影响无显著性差异。
71.实施例6：嗜酸乳杆菌发酵上清乙酸乙酯萃取液的进一步分离纯化
72.1.以实施例2中嗜酸乳杆菌的发酵上清乙酸乙酯萃取液为材料，利用丙烯葡聚糖凝胶s-300hr层析柱分离，每10min收集一管，每管4ml，共收集60管。用bca试剂盒测量奇数管的蛋白浓度；三管的馏分合并成一管，浓缩6倍后，采用实施例1中的抑菌试验方法比较不同管馏分的抑菌效果，测试结果如图15-16所示，由图15可知，嗜酸乳杆菌发酵上清乙酸乙酯萃取液经过丙烯葡聚糖凝胶s-300hr分离，得到了含蛋白质的馏分。由图16可知，蛋白浓度高的几管馏分具有显著的抑菌作用，因此证明了该方法可成功分离纯化具有抑菌活性的氨基酸类化合物。
73.2.取抑菌效果最好的最佳馏分(第42管馏分)，用高效液相色谱检测液体的纯度并分离得到主要抑菌成分，色谱条件如下：a相为超纯水，b相为乙腈；色谱柱型号为waters-symmetry c18 5μm。时间程序为：90％乙腈在低压梯度下洗脱20分钟，流速为1ml/min。测试结果如图17和表1所示。
74.表1抑菌馏分的高效液相色谱测试结果
75.峰号保留时间(min)面积高度11.30310154118621.69673568415432.40715597635824112415.168689711074516.7033521053315总计 16102434833841
76.由图17及表1可知，在该色谱条件下已成功分离出抑菌馏分的主要抑菌成分(保留时间为2.407min)，其液体纯度高。
77.实施例7：抑菌成分的抗炎活性验证
78.人单核细胞thp-1细胞和巨噬细胞raw 264.7细胞是常用的造炎症模型细胞，这两种细胞培养至对数生长期时(细胞密度约为5.0
×
105个/ml)，将细胞接种于12孔板中，每孔1.5ml的细胞培养液，放置37℃恒温的二氧化碳培养箱中，培养24小时后，细胞密度达到70-80％。设置空白对照组、模型组、0.5mg/ml(以蛋白浓度计)给药组、0.25mg/ml给药组(以蛋白浓度计)，每组三个平行。给予给药组各终浓度为0.5mg/ml和0.25mg/ml的供试品(实施例6中分离得到的主要抑菌成分)，空白对照组和模型组给予等量的细胞培养基。细胞与供试品共孵育8小时后，模型组、给药组给予6μl的处于对数生长期的ca菌(od600约为0.26)，用于刺激细胞促炎因子的释放；空白对照组给予等量的细胞培养基，轻轻摇匀，将孔板放置于37℃恒温的二氧化碳培养箱中，静置培养24小时。
79.分别提取各孔thp-1细胞和raw 264.7细胞的总rna，根据逆转录试剂盒和实时荧光定量pcr试剂盒的说明书，测定各组thp-1细胞中il-1β基因和raw 264.7细胞中的tnf-α基因的相对表达量，结果如图18-19所示。
80.由图18-19可知，当供试品浓度为0.5mg/ml的时候，能够显著抑制thp-1细胞中il-1β炎症因子，以及raw 264.7细胞中tnf-α炎症因子的基因相对表达量，提示其具有明显抗炎作用。
81.实施例8：lc-ms/ms分析抑菌成分的氨基酸序列和测定分子质量
82.1.样品前处理-还原烷基化
83.(1)在适量实施例6所分离的主要抑菌成分中加入二硫苏糖醇(dtt)，使其终浓度为10mmol/l，于56℃水浴中处理1h。
84.(2)继续加入碘乙酰胺(iaa)溶液使其终浓度为50mmol/l，避光反应40min。
85.(3)使用c18脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。
86.2.lc-ms/ms检测
87.(1)毛细管液相色谱条件：
88.预柱：300μm i.d.
×
5mm，填充有acclaim pepmap rplc c18，5μm，
89.分析柱：150μm i.d.
×
150mm，填充有acclaim pepmap rplc c18，1.9μm，
90.流动相a：0.1％甲酸；
91.流动相b：0.1％甲酸，80％acn(乙腈)；
92.流速：600nl/min；
93.每个组分分析时间：66min；
94.梯度洗脱条件如表2所示：
95.表2梯度洗脱条件
96.时间(min)b相04％28％4528％5540％5695％6695％
97.(2)质谱条件
98.一级质谱参数：
99.resolution：70,000
100.agctarget：3e6
101.maximumit：100ms
102.scanrange：100-1500m/z
103.二级质谱参数：
104.resolution：17,500
105.agctarget：1e5
106.maximumit：50ms
107.topn：20
108.nce/steppednce：28。
109.3.数据库检索
110.根据如图20-21所示的lc-ms/ms检测结果，使用byonic检索目标蛋白数据库，鉴定得到该抑菌成分为多肽，其氨基酸序列为：endpravaf(seq id no：1)，分子量是1019.5da。
111.上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。