一种酪氨酸酶活性抑制剂及具有增效美白作用的护肤品的制作方法

1.本发明属于护肤品技术领域，尤其涉及一种酪氨酸酶活性抑制剂及具有增效美白作用的护肤品。


背景技术：

2.所谓“一白遮百丑”，美白一直是亚洲女性所追求的。随着人民生活水平和审美标准的提高，白皙和洁净的肌肤更是越来越被推崇。在护肤品市场上，各类美白产品层出不穷，美白市场已成为国内外各大品牌争相发力的细分领域。如何安全且有效美白，是护肤品市场一个重中之重的话题。
3.皮肤颜色的深浅受多种因素调控，但主要仍取决于黑色素的含量和分布。黑色素是由黑色素细胞产生的，黑素细胞以1:36比例与角质形成细胞构成一个表皮单位，存在于表皮基底层。它通过合成黑色素决定皮肤颜色深浅，同时可吸收紫外线，使机体免遭紫外线的损害。当皮肤受到过量外界紫外线照射，皮肤细胞内自由基爆发、炎症因子大量积累时，会刺激角质形成细胞发出信号，刺激黑色素细胞分裂增殖，并产生内部应激反应，内部酪氨酸酶活性被激活，将体内的酪氨酸转化为多巴，进一步转化为多巴醌，多巴醌继续氧化脱羧，形成二羟吲哚后，转变为黑色素。形成的黑色素一部分在皮肤内分解、溶解吸收，经血液和肾脏排泄通过。一部分通过树状突起运输到角质层细胞内，日积月累沉积形成暗沉，即黑色素的沉积，最终随着表皮细胞脱落而清除。若此时角质层代谢不足或异常，则表现为皮肤斑点或者肤色暗沉，皮肤变黑。
4.随着人们对黑色素形成机理的全面、深入的了解和认识，想要抑制黑色素形成，除了防晒外，首要就是抑制黑色素合成的主要限速酶——酪氨酸酶的活性，阻断黑素生成过程中的信号转导通路；此外，还可以通过黑色素还原、促进黑色素代谢等方式来控制黑色素沉积，从而实现美白淡斑的效果。
5.针对黑色素产生生命周期的各个环节，人们设计开发了不同作用机制的美白成分，有酪氨酸酶抑制剂和角质形成细胞与黑色素细胞信息传递阻断剂等，如熊果苷，曲酸及其衍生物，抗坏血酸、烟酰胺、甘草黄酮，对苯二酚，维a酸，果酸，壬二酸及各种植物提取物等。目前，最有效的美白皮肤的活性物之一是氢醌，但是氢醌分子量小，破坏黑色素细胞，而且可能诱发炎症。所以，氢醌被禁止用作化妆品组分。l-抗坏血酸(维生素c)虽然具有抗氧化清除自由基、还原黑色素中间体以及抑制酪氨酸酶活性的作用，然而其稳定性不佳，自身易被氧化、被光照破坏而解并且变色；曲酸具有一定刺激性，同时也可能削弱皮肤屏障，不适用于敏感肌肤；植物提取物通常含有多酚黄酮类成分，但因其成分复杂，作用不明显，也会产生过敏或刺激反应。
6.由此可知，以上成分虽然都具有美白功效，但其机理、效果各有差异，单独使用也各有优缺点。在美白产品的设计中，除了从抑制酪氨酸酶的活性入手，还需要对黑色素形成的因素进行全面考虑，不然产品的美白效果有限。尽管市面上已有不少多重美白成分复配的美白产品，但基本停留于同机理成分简单叠加，没有科学严谨的评价体系进行同一机理
下美白效果的优选，并且缺乏明显的协同增效效果。由于黑色素形成的原因是多方面的，要使产品美白效果显著，必须全面综合考虑黑色素形成的原因，要从黑色素形成的全生命周期考虑，有必要开发一种高效、安全、低刺激的美白配方，从根源上美白祛斑。


技术实现要素：

7.基于上述技术问题，本发明提供了一种酪氨酸酶活性抑制剂及具有增效美白作用的护肤品，该酪氨酸酶活性抑制剂可以协同提高对酪氨酸酶的活性抑制效果；包含该抑制剂的护肤品不仅可以从源头上抑制黑色素的生成，而且可以复配其他组分，利用抑制酪氨酸酶活性、抗氧化、清除自由基、还原黑色素中间体、抑制黑色素转移、加速黑色素代谢等多种机理，达到高效、低刺激且具有协同增效作用的美白效果。
8.本发明提出的一种酪氨酸酶活性抑制剂，包括聚谷氨酸和协同增效抑制剂，所述协同增效抑制剂为4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽或烟酰胺中的至少一种。
9.聚谷氨酸又称纳豆胶、多聚谷氨酸，它是一种水溶性，生物降解，不含毒性，使用微生物发酵法制得的生物高分子，其保湿锁水功效是透明质酸的500倍；聚谷氨酸(γ-pga)能在化妆品领域上广泛应用除了由于比品质性能更优以外，还有一个更直接、重要的原因是γ-pga的性价比明显更优越：众所周知透明质酸主要是由鸡禽的鸡冠萃取而制成，而胶原蛋白是由牛、羊、猪组织萃取而制成，因而，这二种制品都由动物原料制成，都属动物胶原，由于其制作工艺较复杂，原材料较贵，所以成本高，售价贵；而γ-pga采用公认安全级(gras)的纳豆菌，以麸酸及葡萄糖为原料、发酵生产而制成，因而属植物胶原，其对人体的安全性已得到美国、日本、加拿大等许多国家的卫生监督部门的确认，γ-pga的确是相当安全的“非动物性”皮肤护理、化妆品之原料，消费者完全可放心使用。其作用机理包括：在表层肌肤上形成一道水网膜，减少水分子的散失，同时深入内层，提升天然保湿因子含量，以达到高效保水的目的，并在灵动调理下，使肌肤的含水量达到饱足的状态；抑制黑色素，美白肌肤；抑制微生物生长，起到抗菌作用，缓慢的生物分解性，使皮肤表面不易滋生微生物。
10.正丁基间苯二酚是良好的酪氨酸酶抑制剂，由于“身材”娇小，容易渗透进入皮肤，容易钻进酪氨酸酶的活性中心，发挥强大的抑制活性；在间苯二酚衍生物中，4-丁基间苯二酚在体外和体内研究中是最有效的；有研究数据显示，4-丁基间苯二酚比苯乙基间苯二酚377还要强6倍多，比曲酸要强24倍，比熊果苷强310倍；在治疗老年斑方面，4-丁基间苯二酚效果明显优于己基间苯二酚和苯乙基间苯二酚，4-正丁基间苯二酚也是很强的抗氧化剂；在黑色素合成过程中，4-丁基间苯二酚不仅对酪氨酸酶活性有较强的抑制作用，同时在美白过程中起协同作用；其作用机理包括：酪氨酸酶和trp1酶的竞争性抑制剂，减少黑色素的合成；黑色素合成后，提高酪氨酸酶降解、抑制黑素体到角化细胞的转移；卓越的抗氧化效果。
11.本发明中，聚谷氨酸和4-正丁基间苯二酚同时使用具有协同作用，酪氨酸酶活性抑制作用更强，美白效果也更加显著。
12.谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的，含有疏基的三肽，存在于几乎身体的每一个细胞；谷胱甘肽是一种小分子肽，分子量为307道尔顿(大于500道尔顿的分子无法穿越肌肤屏障)，因此涂抹在皮肤上的谷胱甘肽是可以被皮肤有效吸收的；在美白过程中，谷胱甘肽同时具有“抗氧化”和”抑制”的双重作用。其作用机理包括：直接抑制酪氨酸酶
活性，还能水解成半胱氨酸，干扰黑色素合成，促进合成褐黑色素而非真黑色素；扫除大量的氧化自由基，阻止自由基激活酪氨酸酶；谷胱甘肽还有螯合重金属的作用，且对重金属中毒的皮肤有解毒作用。
13.本发明中，聚谷氨酸和谷胱甘肽同时使用具有协同作用，酪氨酸酶活性抑制作用更强，美白效果也更加显著。
14.烟酰胺也被称为维生素b3和烟酸，具有美白保湿，皮肤屏障修复和抗老化等功效。其作用机理包括：抑制黑色素颗粒的形成；有效抑制黑色素向角质细胞传递；加速皮肤细胞的更新速度促进含黑素的细胞脱落；有效的平衡保湿剂，可帮助皮肤在需要时产生更多的神经酰胺和脂肪酸，而在不需要的地方调节皮脂的产生，维持皮肤屏障功能；修复受损的皮肤细胞，明显减少发红和发炎，增加胶原蛋白的产生。
15.本发明中，聚谷氨酸和烟酰胺同时使用具有协同作用，酪氨酸酶活性抑制作用更强，美白效果也更加显著。
16.优选地，聚谷氨酸和4-正丁基间苯二酚的质量比为1:0.00001-1，优选为1:0.0001-0.01。
17.本发明中，聚谷氨酸和4-正丁基间苯二酚设定在该配比范围内时，能够更有效地抑制酪氨酸酶活性和阻断黑色素形成。
18.优选地，聚谷氨酸和谷胱甘肽的质量比为1:0.01-10。
19.本发明中，聚谷氨酸和谷胱甘肽设定在该配比范围内时，同样也能更有效地抑制酪氨酸酶活性和阻断黑色素形成。
20.优选地，聚谷氨酸和烟酰胺的质量比为1:0.1-10。
21.本发明中，聚谷氨酸和烟酰胺设定在该配比范围内时，同样也能更有效地抑制酪氨酸酶活性和阻断黑色素形成。
22.本发明还提出一种具有增效美白作用的护肤品，包括上述酪氨酸酶活性抑制剂。
23.本发明中，酪氨酸酶活性抑制剂可以协同提高对酪氨酸酶的活性抑制效果，当用于护肤品时可以从源头上抑制黑色素的生成。
24.优选地，所述护肤品还包括抗坏血酸乙基醚。
25.抗坏血酸乙基醚即3-o-乙基抗坏血酸醚(简称vce)，是目前最稳定的vc衍生物成员，是亲油亲水两性物质，且易穿透角质层进入真皮层，进入机体后非常容易体内的生物酶分解从而发挥维生素c的生物学功效。其作用机理包括：抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素形成产生；卓越的抗氧化效果，甚至将氧化型黑色素直接还原成浅色；进入真皮层后直接参与胶原蛋白的合成修复皮肤细胞活性，使胶原蛋白增加。
26.本发明中，抗坏血酸乙基醚用于护肤品中，可以进一步增强美白效果。
27.优选地，所述护肤品包括聚谷氨酸、4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺和抗坏血酸乙基醚。
28.本发明中，在全面综合考虑黑色素形成的各种因素的前提下，选用安全，无毒，稳定，不刺激皮肤和不易变色的美白组分(聚谷氨酸、4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺和抗坏血酸乙基醚)，4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、聚谷氨酸单独使用虽能够抑制酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性，当三者复配时，却可以更加有效地抑制酶活，阻断皮肤黑色素的形成；与此同时，谷胱甘肽还能促进合成褐黑色素而非真黑色素；抗坏血酸乙基醚则将氧化型
黑色素直接还原；烟酰胺、4-正丁基间苯二酚还可抑制黑色素颗粒转移至角质细胞；烟酰胺加速皮肤细胞的更新速度促进含黑素的细胞脱落；抗坏血酸乙基醚、烟酰胺修复受损的皮肤细胞，明显减少发红和发炎，增加胶原蛋白的产生；聚谷氨酸有一定的抑菌效果；抗坏血酸乙基醚、谷胱甘肽、4-正丁基间苯二酚有优秀的抗氧化功能；聚谷氨酸的添加提高了抗坏血酸乙基醚、谷胱甘肽、正丁基间苯二酚、烟酰胺的功效；即各组分之间相互作用，具有很好的协同美白作用，美白效果显著，具有很好的市场应用前景。
29.事实上，经过大量相关实验，本发明最终确定以聚谷氨酸、4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺和抗坏血酸乙基醚这五种成分作为护肤品的主要美白功效成分，具有显著的美白效果。
30.优选地，以护肤品的总质量计，聚谷氨酸的含量为0.1-10％、4-正丁基间苯二酚的含量为0.0001-0.1％、谷胱甘肽的含量为0.01-1％、烟酰胺的含量为0.1-1％、抗坏血酸乙基醚的含量为0.1-10％。
31.本发明中，当聚谷氨酸、4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺和抗坏血酸乙基醚的含量过高时，成本过高，且相应的美白效果的提升不明显，当聚谷氨酸、4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺和抗坏血酸乙基醚的含量过低时，黑色素的含量降低量少，则不能起到美白的作用。
32.与此同时，考虑到4-正丁基间苯二酚在国内的限制添加量为0.3％，本发明选取0.1％作为最高添加量；烟酰胺的浓度在2％以下，吸收率随着添加量线性增加，达到2％后，吸收率不会线性增加，且虽然烟酰胺的添加浓度高，效果好，但是刺激性会大大增加，很多皮肤受不了，因此本发明选取1％为最高添加量。即本发明中，烟酰胺、4-正丁基间苯二酚均选用了国内限制添加量以内的较低浓度，在保证美白效果的同时减少刺激，具有更好的皮肤耐受性，更适合东方人群的皮肤体质。
33.优选地，所述护肤品还包括水、增稠剂、保湿剂、乳化剂、皮肤调理剂、ph调节剂或螯合剂中的至少一种。
34.本发明中，所述护肤品还包括护肤品领域可接受的各种辅料，优选为还包括水、增稠剂、保湿剂、乳化剂、皮肤调理剂、ph调节剂或螯合剂中的至少一种。
35.优选地，所述增稠剂为丙烯酰二甲基牛磺酸铵/vp共聚物、聚丙烯酸钠、丙烯酸(酯)类共聚物钠、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、聚丙烯酸酯-13、丙烯酰二甲基牛磺酸铵-山嵛醇聚醚/25甲基丙烯酸酯交联聚合物、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物中的至少一种；
36.所述保湿剂为乙醇、甘油、丙二醇、双丙甘醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇、己二醇、1，2-戊二醇、辛甘醇、尿囊素、山梨醇或甜菜碱中的至少一种；
37.所述乳化剂为氢化卵磷脂、聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-60、鲸蜡醇磷酸酯钾、月桂醇聚醚-7、甲基葡聚糖聚醚-10、peg-9聚二甲基硅氧乙基聚二甲基硅氧烷或ppg-1-peg-9月桂二醇醚中的至少一种；
38.所述皮肤调理剂为α-甘露聚糖、透明质酸钠、pca钠、甜菜碱、聚季铵盐-51、果聚糖、麦芽寡糖葡糖苷、氢化淀粉水解物、皱波角叉菜(chondrus crispus)提取物、脱乙酰壳多糖、β-葡聚糖或肌酸中的至少一种；
39.所述ph调节剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氨甲基丙醇、柠檬酸钠或三乙醇胺中的至少
一种；
40.所述螯合剂为edta二钠、edta四钠、柠檬酸或柠檬酸钠中的至少一种。
41.优选地，所述护肤品为水剂型护肤品、凝胶型护肤品、乳液型护肤品或霜剂型护肤品中的至少一种。
42.本发明中，所述水剂型护肤品包括：美白水、美白精华液、美白面膜中的至少一种；所述凝胶型护肤品包括：美白精华、美白啫喱、美白啫喱状睡眠面膜中的至少一种；乳液型护肤品包括：美白乳液；所述霜剂型护肤品包括：美白膏霜。
43.在一些实施例中，所述护肤品还包括医药部外品的概念，其形态没有特别的限制，可以取液态、膏状、凝胶状、固体状、粉末状、泡状、啫哩状等任意的形态。具体地，可列举化妆水、润肤露、霜、乳液、美容液、洗发剂、染发液、护发素、摩斯、发胶、发蜡、粉底霜、眼线笔、眉笔、睫毛膏、眼影、腮红、润唇膏、口红、白粉、香粉、面膜、罩式面膜、香水、古龙水、洁面泡沫、洁面乳、卸妆泡沫、卸妆油、卸妆啫哩、牙膏、香皂、气雾剂、沐浴液、生发水、防晒剂(防晒)等。
44.本发明的有益效果为：
45.本发明酪氨酸酶活性抑制剂包括了聚谷氨酸和4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽或烟酰胺中的至少一种，各组分发挥协同作用，当用于护肤品时可以从源头上抑制黑色素的生成。
46.本发明还全面综合考虑了黑色素形成的各种因素，采用多种性能的美白组分复配来得到护肤品，不仅能从皮肤内部有效抑制黑色素形成过程中关键酶的活性、淡化已合成的黑色素，还能通过全方位、多通路的美白机制来提供安全、长效、无副作用的美白效果。
47.本发明护肤品配方完全符合国家颁布的《化妆品安全技术规范》(2021版)中的各项指标，其不含有任何有毒物质，没有任何潜在危害。
具体实施方式
48.下面，本发明通过具体实施例对所述技术方案进行详细说明，但是应该明确提出这些实施例用于举例说明，但是不解释为限制本发明的范围。
49.实施例
50.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
51.对比例1-5
52.分别取4-正丁基间苯二酚(对比例1)、谷胱甘肽(对比例2)、烟酰胺(对比例3)、抗坏血酸乙基醚(对比例4)和聚谷氨酸(对比例5)作为酪氨酸酶活性抑制剂。
53.测试过程中，将对比例1-5的酪氨酸酶活性抑制剂分别溶于ph 6.8的pb缓冲液中，得到不同组分的样品溶液，样品溶液的浓度参照表3所示。
54.实施例1-4
55.取4-正丁基间苯二酚和聚谷氨酸作为酪氨酸酶活性抑制剂，具体是将4-正丁基间苯二酚和聚谷氨酸按质量比0.00013:1(实施例1)、0.004:1(实施例2)、0.000013:1(实施例
3)、0.0004:1(实施例4)混合后，得到酪氨酸酶抑制剂。
56.测试过程中，将实施例1-4的酪氨酸酶活性抑制剂分别溶于ph 6.8的pb缓冲液中，得到不同浓度的样品溶液，样品溶液的浓度参照表3所示。
57.实施例5-8
58.取谷胱甘肽和聚谷氨酸作为酪氨酸酶活性抑制剂，具体是将谷胱甘肽和聚谷氨酸按质量比0.1:1(实施例5)、3:1(实施例6)、0.033:1(实施例7)、1:1(实施例8)混合后，得到酪氨酸酶抑制剂。
59.测试过程中，将实施例5-8的酪氨酸酶活性抑制剂分别溶于ph 6.8的pb缓冲液中，得到不同浓度的样品溶液，样品溶液的浓度参照表3所示。
60.实施例9-12
61.取烟酰胺和聚谷氨酸作为酪氨酸酶活性抑制剂，具体是将烟酰胺和聚谷氨酸按质量比13.33:1(实施例9)、400:1(实施例10)、1.33:1(实施例11)、40:1(实施例11)混合后，得到酪氨酸酶抑制剂。
62.测试过程中，将实施例9-11的酪氨酸酶活性抑制剂分别溶于ph 6.8的pb缓冲液中，得到不同浓度的样品溶液，样品溶液的浓度参照表3所示。
63.实施例13-16
64.取抗坏血酸乙基醚和聚谷氨酸作为酪氨酸酶活性抑制剂，将抗坏血酸乙基醚和聚谷氨酸按质量比20:1(实施例13)、600:1(实施例14)、3.33:1(实施例15)、100:1(实施例16)混合后，得到酪氨酸酶抑制剂。
65.测试过程中，将实施例12-13的酪氨酸酶活性抑制剂分别溶于ph 6.8的pb缓冲液中，得到不同浓度的样品溶液，样品溶液的浓度参照表3所示。
66.体外测试
67.1、酪氨酸酶活性抑制实验
68.(1)实验原理
69.在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，在ph6.8的pb缓冲液中，可催化酪氨酸转化为多巴，再由多巴转化成多巴醌，在分光光度计475nm处可测定吸光值。具有酪氨酸酶单酚酶活性抑制作用的活性成分可以减少酪氨酸转化成多巴，具有酪氨酸酶二酚酶活性抑制作用的活性成分可以减少多巴转化成多巴醌，从而减少黑色素的形成，降低吸光值，根据吸光值的变化，评估活性成分对酪氨酸酶单酚酶及二酚酶活性的抑制作用。
70.(2)实验过程
71.0.1m na2hpo4·
12h2o：将17.91g的na2hpo4·
12h2o溶于500ml水中，玻璃棒搅拌至溶解完全得到；
72.0.1m nah2po4.2h2o：将7.8g的nah2po4.2h2o溶于500ml水中，玻璃棒搅拌至溶解完全得到；
73.ph6.8 pb缓冲液：将46.3ml 0.1m na2hpo4·
12h2o和53.7ml 0.1mnah2po4.2h2o混合，配制成100ml的pb缓冲液；
74.酪氨酸酶母液：用ph6.8的pb缓冲液将酪氨酸酶配制成1250u/ml的母液，分装后-20℃保存(可保存一个月)；
75.酪氨酸酶工作液：用ph6.8的pb缓冲液将1250u/ml母液稀释成200u/ml的工作液；
76.l-酪氨酸溶液(单酚酶活力底物)：将0.025g l-酪氨酸加入17.5ml 0.1mhcl溶液中，玻璃棒搅拌至溶解完全后，用ph6.8 pb缓冲液定容至50ml；
77.左旋多巴溶液(二酚酶活力底物)：用ph6.8 pb缓冲液将左旋多巴配制成1mg/ml的溶液。
78.实验过程中，将曲酸作为阳性对照物，用ph6.8 pb缓冲液稀释成：0.25mg/ml、0.13mg/ml、0.06mg/ml、0.03mg/ml和0.01mg/ml的系列浓度用以验证试验系统；
79.受试物为实施例和对比例所述样品溶液；
80.参照表1所示，使用96孔板设立样品孔(t)、样品本底(t0)、酶反应孔(c)和溶剂本底(c0)，每一样品的每个受试浓度的样品孔(t)需设立3个平行孔，同时酶反应孔(c)也需设立3支平行孔；
81.在样品(t)和样品本底(t0)孔中各加入50μl浓度相同的样品溶液，酶反应孔(c)和溶剂本底(c0)孔中则分别加入50μlph6.8的pb缓冲液；
82.在样品孔(t)和酶反应孔(c)中各加入50μl的酪氨酸酶工作液，样品本底(t0)与溶剂本底(c0)孔中则以50μl pb缓冲液代替，将96孔板放置37℃恒温箱中孵育10分钟；
83.若检测样品是对酪氨酸酶的单酚酶抑制活性，在各反应孔中加入100μl l-酪氨酸溶液(0.5mg/ml)；若检测样品是对酪氨酸酶的二酚酶抑制活性，在各反应孔中则加入100μl左旋多巴溶液(1mg/ml)；室温放置1小时后将96孔板放置微孔板检测系统(酶标仪)中，在475nm处检测各孔吸光值。
84.表1样品加液要求
[0085][0086]
(3)实验结果
[0087]
计算酪氨酸酶抑制率：
[0088][0089]
式(a)中：t—样品孔吸光值；t0—样品本底吸光值；c—酶反应孔吸光值，即未加样品时酪氨酸酶和l-酪氨酸(左旋多巴)反应的吸光值；c0—溶剂本底吸光值。
[0090]
分别计算曲酸、4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺、抗坏血酸乙基醚和聚谷氨酸的样品溶液对酪氨酸酶的抑制率，并且在进行样品间酪氨酸酶抑制活性的比较时，绘制样品溶液浓度与酪氨酸酶抑制率的关系曲线，应用拟合公式(r2≥0.9)计算各样品的ic
50
(抑制率为50％时对应的样品质量浓度)，ic
50
越小代表活性越强，结果如下表2所示。
[0091]
表2列出了曲酸、4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺、抗坏血酸乙基醚和聚谷氨酸对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的抑制率为50％时对应的的质量浓度ic
50
。
[0092]
表2不同样品对酪氨酸酶的ic50
[0093]
原料名称单酚酶/ic50(mg/ml)二酚酶/ic50(mg/ml)曲酸0.0140.044-正丁基间苯二酚0.000020.0018谷胱甘肽0.0150.21烟酰胺23.3275.04抗坏血酸乙基醚3.17516.02聚谷氨酸3.54
[0094]
由上表2可知，无论是酪氨酸酶单酚酶抑制活性，还是二酚酶抑制活性，4-正丁基间苯二酚的ic50最低，均远远低于阳性对照—曲酸。4-正丁基间苯二酚对酪氨酸酶的抑制效果在受测功效成分是最佳的；此外谷胱甘肽、聚谷氨酸对酪氨酸酶的抑制率也较高，低浓度即达到较好的抑制效果。因而选取4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、聚谷氨酸作为酪氨酸酶活性抑制剂的主要美白功效成分。
[0095]
需要注意的是，尽管烟酰胺单独对于酪氨酸酶的抑制活性效果欠佳，但是其美白机制有别于酪氨酸酶抑制，其可有效抑制高达68％的黑素小体的转移。
[0096]
计算样品间的协同作用：
[0097]
按照金氏公式计算：
[0098]
q＝e(a b)/[ea eb-ea*eb]
ꢀꢀ
(b)
[0099]
式(b)中：q为系统作用系数，ea与eb为a和b单独使用时的效果；e(a b)为两者合用的效果。
[0100]
q＝0.85-1.15为单纯相加；1.15＜q＜20为增强；q＞20为明显增强；q＜0.56-0.85为拮抗；q＜0.55为明显拮抗。
[0101]
分别计算实施例和对比例所述样品溶液对酪氨酸酶抑制率和协同作用系数，结果如下表3所示。
[0102]
表3列出了不同浓度的实施例和对比例所述样品溶液对酪氨酸酶的单酚酶抑制活性以及不同质量配比下4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺、抗坏血酸乙基醚与聚谷氨酸复配后的作用系数。
[0103]
表3不同样品对酪氨酸酶的抑制率和协同系数
[0104]
[0105]
[0106][0107]
由上表3可知，本发明所述酪氨酸酶活性抑制剂中，在特定配比条件下，聚谷氨酸协同增加了4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺的酪氨酸酶抑制活性，起到了1 1》2的效果，对抗坏血酸乙基醚虽未检测出协同效果，但也没有抑制抗坏血酸乙基醚作用，是叠加的效果。
[0108]
2、b16黑色素瘤细胞增殖毒性实验：
[0109]
(1)实验原理
[0110]
在检测不同样品对b16黑色素瘤细胞黑色素的抑制效果前，本发明设计了细胞增殖毒性实验，确定4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺、聚谷氨酸、抗坏血酸乙基醚对b16黑色素瘤细胞的安全实验浓度，以进一步确定上述组分在配方中的添加量。
[0111]
3-(4，5二甲基噻唑-2-酰基)-2，5-二苯基四唑溴酸盐(mtt)是一种四唑盐，当四唑盐经活细胞的线粒体作用后，四唑环裂开生成蓝紫色不溶于水的甲臜化合物，可被异丙醇或二甲基亚砜等有机溶剂溶解；这个反应是定量进行的，并且只与活细胞起反应，生成的有色物质用酶标仪测定光密度定量，在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。
[0112]
(2)实验过程
[0113]
取对数生长期的b16f10细胞，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至4
×
104/ml，接种于6孔板，每孔总体积100μl，放置于37℃，5％co2培养箱中培养24h，至细胞完全贴壁且生长稳定，取出，弃去细胞培养液，加入150μl浓度梯度的样品溶液，设6个复孔，同时设置细胞对照孔(细胞 培养基)；于5％co2，37℃下孵育24小时(以给药时间计算)，倒置显微镜下观察样品的作用效果；
[0114]
弃去细胞培养液，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)及150μl培养基，继续培养4h；弃去上清液，每孔加入100μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；酶标
仪检测490nm处吸光度值。
[0115]
(3)实验结果
[0116]
计算细胞增殖率：
[0117]
细胞增殖率＝od实验组/od细胞对照组
×
100％
[0118]
分别计算4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺、聚谷氨酸、抗坏血酸乙基醚的细胞增殖率，结果可知，4-正丁基间苯二酚的添加量超过5μg/ml，谷胱甘肽的添加量超过1000μg/ml，烟酰胺的添加量超过1500μg/ml，聚谷氨酸的添加量超过1000μg/ml，vc乙基醚的添加量超过3500μg/ml时具有细胞毒性；考虑到两个样品叠加毒性，因此在抑制黑色素实验时选择剂量不超过样品最高无毒剂量的1/2。
[0119]
3、黑色素产生率实验
[0120]
(1)实验原理
[0121]
为评估实施例所述酪氨酸酶活性抑制剂的美白效果而测定了黑色素产生率。
[0122]
b16小鼠黑素瘤细胞是常用的研究黑素生成的细胞模型，黑色素细胞能合成并分泌黑色素，黑色素是一种氨基酸衍生物，与氢氧化钠反应后，产生能溶于水的化合物，通过405nm检测吸收值来计算黑色素的量；通过计算正常细胞分泌的黑色素与样品作用组细胞分泌的黑色素的差异值来计算，判定黑色素的抑制情况。
[0123]
(2)实验过程
[0124]
取对数生长期的b16f10细胞，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至1
×
104/ml，接种于96孔板，待测细胞的密度为20000/孔；将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养约24h，至细胞完全贴壁且生长稳定，取出，弃去细胞培养液，加入2ml浓度梯度的样品溶液，设3个复孔，同时设置细胞对照孔(细胞 培养基)；于5％co2，37℃继续孵育48小时(以给药时间计算)，倒置显微镜下观察样品的作用效果；
[0125]
弃去细胞培养液，用1ml无菌pbs清洗每孔2遍，加入200μl胰酶溶液消化后，分两次加入1mlpbs洗涤消化后细胞，吸取细胞悬液至1.5ml ep管，5000rpm离心5min；弃上清液，加入150μl 1mol/l的氢氧化钠溶液(含10％dmso)，置于90℃水浴中1h，使黑色素充分溶解；吹打上述溶解液使均匀，吸取100μl至96孔板，以1mol/l氢氧化钠溶液(含10％dmso)为空白对照，酶标仪405nm处检测吸光度值。
[0126]
(3)实验结果
[0127]
黑色素抑制率计算：
[0128]
黑色素抑制率＝(od细胞对照组-od实验组)/od细胞对照组
×
100％
[0129]
协同作用按照金氏公式计算：
[0130]
q＝e(a b)/[ea eb-ea*eb](b)
[0131]
式(b)中：q为系统作用系数，ea与eb为a和b单独使用时的效果；e(a b)为两者合用的效果。
[0132]
q＝0.85-1.15为单纯相加；1.15＜q＜20为增强；q＞20为明显增强；q＜0.56-0.85为拮抗；q＜0.55为明显拮抗。
[0133]
分别计算实施例和对比例所述样品的黑色素抑制率和协同作用系数，结果如下表4所示。
[0134]
表4列出了不同浓度的4-正丁基间苯二酚、烟酰胺、谷胱甘肽、聚谷氨酸、抗坏血酸
乙基醚对黑色素的抑制率以及不同浓度配比下4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺、抗坏血酸乙基醚与聚谷氨酸复配后的作用系数。
[0135]
表4不同样品对黑色素的抑制率和协同系数
[0136][0137][0138]
由上表4可知，本发明所述酪氨酸酶活性抑制剂中，聚谷氨酸协同增加了4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺的黑色素抑制活性，起到了1 1》2的效果，对抗坏血酸乙基醚虽未检测出协同效果，但也没有抑制抗坏血酸乙基醚作用，是叠加的效果。
[0139]
结合前述酪氨酸酶活性抑制实验以及黑素细胞黑色素抑制实验可知，本发明选择聚谷氨酸复配4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺作为酪氨酸酶活性抑制剂，并结合黑色素转运抑制、黑色素代谢，以及抗氧化的机制，进一步包含抗坏血酸乙基醚的组分，形成包含五种成分的美白组合物。在不引起细胞毒性的前提下，综合考虑限制添加量、稳定性、美白功效等因素，选取了各成分在可控范围内的最高浓度，以实现各成分在其对应美白机理上最佳的功效。本发明通过合理配伍，提高了各成分以及美白组合物整体配方的稳定性，并减轻了可能造成的刺激和敏感，由此所形成护肤品具有功效更佳、更稳定和低刺激的特点。
[0140]
以下，对本发明的护肤品进行例示。
[0141]
表5护肤液(重量％表示、总量100)
[0142]
[0143][0144]
4、美白功效测试
[0145]
(1)对人体皮肤的安全性测试
[0146]
测试人数：共30人，男7人，女23人；最小年龄：26岁，最大年龄：45岁；平均年龄33.75
±
6.05岁志愿入选标准。
[0147]
测试方法：将应用实施例1-3做斑贴测试。选用合格的斑试器，以封闭型斑贴试验方法，将护肤液约0.020-0.025ml置于斑试器内，外用医用胶带贴敷于受试者前臂曲侧，24小时后去除受试物，分别于移除斑贴后0.5、24、48小时观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应分级标准记录其结果。
[0148]
人体皮肤封闭型斑贴试验结果显示，30人中0例出现阳性反应，根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)中规定，该美容液对本批次受试者不会引起皮肤不良反应。
[0149]
(2)对人体皮肤的功效测试
[0150]
用双盲法测试评价本发明的美白效果，受试者25人，每组5人。整个面部作为受试部位，分别给予应用实施例1-3，每天使用两次，早晚各一次。连续使用4周，使用前和使用4周后进行皮肤数据测试(chromameter，cr-400，minolta)，每个测试区测试3次取平均值，为了避免伤害皮肤每人测试一组数据，在每组中去掉两个最大值与两个最小值之后，取剩余人的平均值；利用皮肤色差测试探头及多功能皮肤测试系统(cl400和mpa6，德国ck)和皮肤红黑色素测试仪及测试探头(mexametermx18，德国ck公司)评测受试者使用美容液前后皮肤明亮度(亮度)和皮肤黑色素含量的变化，测量结果用国际照明委员会(commission international del eclairage，cie)l*a*b*颜色系统表示(参见下表5)。
[0151]
其中：l*值表示从白色到黑色的平衡，纯黑色为0，纯白色为100，l*值越大，越靠近白色，l*值越小，越靠近黑色a*值表示从红色到绿色的平衡，其变化范围为 60～-60，正值表示红色方向，负值表示绿色方向。b*值表示从黄色到蓝色的平衡，其变化范围为 60～-60，正值表示黄色方向，负值表示蓝色方向。通过公式ita
°
＝[arc tan((l*-50)/b*)]
×
180/3.14159计算出ita
°
值，ita
°
值表示皮肤颜色，数值越高，皮肤越白。
[0152]
表5 ck皮肤探头测试结果
[0153][0154][0155]
由上表5可知，在测试周期4周后，测试者使用应用实施例1-3的护肤液后ita值有所升高，应用实施例1的ita值增加量达到47.8％(p《0.01)，与使用前具有明显差异；黑色素由149降低至121，降低了28；由此说明本发明的护肤液采用4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺、聚谷氨酸、抗坏血酸乙基醚的美白组分相互配合、协同作用，具有良好的皮肤美白效果。
[0156]
棕斑是早期的光老化、脂肪被氧化之后形成的褐色素，如雀斑、雀斑样痣、黄褐斑等皮损。随着年纪增长，皮肤深层的斑点可能向表皮层层递进。本发明采用面部图像分析仪visia-cr(canfield，美国)进行全脸拍照，配合ipp图像分析软件，分析得到每位测试者的棕斑改善情况，以此考察护肤液对面部的亮肤美白效果。
[0157]
表6 visia测试结果(％)
[0158]
棕色斑使用前使用1周使用2周使用3周使用4周应用实施例110.0811.8313.3315.2516.30应用实施例210.0811.6212.9914.8716.00应用实施例310.0810.8310.3610.7512.00
[0159]
注：百分位数数值越高，效果越好
[0160]
由上表6可知，本发明的护肤液采用4-正丁基间苯二酚、谷胱甘肽、烟酰胺、聚谷氨酸、抗坏血酸乙基醚的美白组分相互配合、协同作用，具有良好的皮肤美白效果。该护肤液对棕色斑具有良好的祛斑效果。
[0161]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。