一种利用微通道促血管化的组织再生膜及其制备方法

1.本发明涉及一种组织的再生膜及其制备方法，尤其涉及一种利用微通道促血管化的组织再生膜及其制备方法。


背景技术：

2.目前，牙周组织受损、牙槽骨骨量不足是临床口腔种植的一个广泛难题。为了使种植手术后获得远期的良好效果，需要在种植牙齿之前，在种植点进行牙周组织修复。引导组织再生(gtr)技术，是修复人体牙周组织缺损的一种重要手段。通过引导牙周组织再生膜的植入，引导相关细胞的再生、维持细胞正常功能的表达。牙周组织再生膜需要起到一定的力学支撑、作为模板、促进血管化、阻隔成纤维细胞的长入、为骨细胞的黏附、分化、增殖等提供场所等作用。其中血管的再生与形成在牙周组织或器官的修复过程中扮演着重要的角色，基于丰富的血管网络系统，从而促使氧气和营养物质等运输到损伤区域，并清除代谢的副产物，达到牙周组织再生的目的。因此膜材料的特性以及结构特性对受损牙周组织或器官的修复至关重要。理想的gtr膜需要具备以下条件：良好的力学支撑效果；良好的生物相容性；可降解性；可控的孔结构以及高孔隙率。
3.聚己内酯、聚乳酸等人工聚合物材料，以及一些水凝胶材料，都体现了良好的生物相容性，因而广泛应用于生物医学、组织再生等领域。目前促血管化主要有两个研究方向，一是对于结构的构建，有很多技术被应用于制备不同结构的多孔gtr膜，如3d打印、静电纺丝、相分离、冻干法等方法，尽管这些技术都有着不同的优势，但除3d打印外其余方法均不能构建出可控孔隙和孔径的方法，而3d打印虽然可以控制孔隙大小，但受限于目前打印精度，其孔隙均较大，不利于血管的生长；另一方向是负载促血管化生长因子，如vegf、hgf、bfgf等，以及一些酶、离子等促进血管相关的基因和蛋白表达。
4.一个没有进行血管化的gtr膜，氧气等营养物质只能在植入膜中扩散小于200μm的深度，若牙周组织再生膜仅依靠材料本身自发诱导血管化，其诱导的血管往往长入太浅，这两种情况都会使得缺损区的修复区的细胞因缺氧或营养物质的缺乏而死亡，从而导致植入手术的失败。根据研究报道，孔径在血管生成速率和所形成血管的大小和成熟度中起着至关重要的作用，而目前现有的技术中还难以形成100μm以下的可控结构微通道。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是提供一种兼具良好的力学性能和促骨生成性能的利用微通道促血管化的组织再生膜；
6.本发明的第二个目的是提供一种通径大小可调、结构可控的利用微通道促血管化的组织再生膜的制备方法。
7.技术方案：本发明所述的利用微通道促血管化的组织再生膜，包括微通道层和纺丝层；所述微通道层为具有三维网络通道的再生膜，所述再生膜内的三维网络通道由弯曲固定后的金属丝经被腐蚀消除后制得；所述纺丝层包括高分子纤维丝，所述纺丝层设置于
再生膜的致密侧。
8.其中，上述的金属丝优选为镁金属丝材或镁合金丝材。其中，所述再生膜由可降解聚合物构成；所述可降解聚合物材料为聚己内酯、聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)、海藻酸钠或壳聚糖中的至少一种。
9.其中，所述微通道层和纺丝层之间还设有支撑层。
10.其中，所述微通道层内表面负载有血管内皮生长因子。
11.本发明的微通道层三维结构与通径大小可控，通道内表面负载有血管内皮生长因子有利于促进组织再生膜内的血管化，为种子细胞提供氧气和营养物质；支撑层为聚合物致密层和金属片的复合提高了组织再生膜力学性能，还阻挡了成纤维细胞的长入；纺丝层由无序高分子纤维丝组成，具有输送多孔结构，有利于骨细胞的黏附。
12.其中，所述支撑层为金属片与聚合物的复合层。金属片的厚度为80μm-200μm；金属片中的金属为镁、镁合金、锌或锌合金中的一种。
13.其中，所述纺丝层厚度为组织再生膜的1/3-2/5。
14.其中，所述金属丝的丝径范围为30μm-80μm。
15.其中，所述微通道层的孔隙率为20％-50％。
16.上述的利用微通道促血管化的组织再生膜的制备方法，包括如下步骤：
17.(1)将可降解聚合物在有机溶剂中溶解，形成可降解聚合物溶液，注入模具中；
18.(2)将微米级的金属丝材缠绕成为固定的三维网状结构，然后压至平整，置入可降解聚合物溶液中，通过蒸发成型获得复合材料；
19.(3)将复合材料经腐蚀液腐蚀，使得复合材料中的金属丝材去除，然后清洗、干燥后获得具有微通道的再生膜；
20.(4)将再生膜的致密侧朝上，并在致密侧的表面涂抹生物粘合剂或纺丝液后进行纺丝，获得非对称性结构的组织再生膜。
21.上述的利用微通道促血管化的组织再生膜的制备方法，包括如下步骤：
22.(1)将可降解聚合物在有机溶剂中溶解，形成可降解聚合物溶液，注入模具中；
23.(2)将微米级的金属丝材缠绕成为固定的三维网状结构，通过压平器压至平整，置入可降解聚合物溶液中，通过蒸发成型获得复合材料；
24.(3)将复合材料经腐蚀液腐蚀，洗去复合材料中的金属丝材，清洗、干燥后获得具有微通道的再生膜；
25.(4)在金属片表面涂抹纺丝液后加压黏附在再生膜的致密侧，凝固后，并在凝固后的表面涂抹生物粘合剂或纺丝液，进行纺丝，获得非对称性结构的组织再生膜。
26.上述的步骤(2)中，通过压平器将固定的三维网状结构压至平整。将缠绕形成的固定的三维网状结构压至平整，一方面保证平整度、另一方面可以调节三维网状结构的厚度，继而调节微通道层的厚度。
27.上述的步骤(2)中，将vegf溶解于pbs溶液后加入到可降解聚合物溶液中搅拌，获得vegf-聚合物溶液，然后将金属丝材缠绕成为固定的三维网状结构，压至平整，浸入vegf-聚合物溶液中，提出，使金属丝材表面附着有vegf-聚合物溶液，最后置入步骤(1)中的可降解聚合物溶液中；其中，vegf-聚合物溶液的浓度为500-1000ng/ml。
28.上述的步骤(1)中，可降解聚合物溶液的浓度为0.05-0.2g/ml。
29.上述的步骤(3)中，采用浓度10％-20％的盐酸洗去复合材料中的金属丝材。
30.上述的用于溶解可降解聚合物的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、六氟异丙醇、n,n-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或乙醇中的至少一种。
31.有益效果：本发明与现有技术相比，取得如下显著效果：1、本发明的再生膜具有不同的结构、功能层，拥有功能特异性，再生膜一侧为微通道结构，促进血管的长入；另一侧为纺丝多孔结构，有利于骨细胞的生长和黏附。2、在微通道层和纺丝层之间致密的聚合物和金属片的复合层隔成纤维细胞的长入，为骨细胞增殖提供空间，同时为整体组织再生膜提高了力学支撑性能。3、再生膜由可降解材料制成，具有良好的生物相容性和功能性，在体内可逐渐降解，避免二次手术，可降低对患者的伤害和经济负担。4、通过控制微米级金属丝材的丝径大小，丝材构建固定形成的结构，精确控制血管网络模板的通径大小和三维网络结构的连通性，解决了难以形成100μm以下的微通道难题，构建的微结构可促进组织血管化。5、利用金属丝负载血管内皮细胞生长因子并引入组织再生膜中，通过酸洗去除金属丝，实现在微通径内表面上负载有血管内皮细胞生长因子，在植入体内后可针对性发挥作用，引导血管在微通道内生长。
附图说明
32.图1为本发明中的利用微通道促血管化的组织再生膜的截面图；
33.图2为本发明实施例1的微米级镁或镁合金丝材缠绕的结构示意图；
34.图3为本发明实施例1的微米级镁或镁合金丝材缠绕后压平的结构示意图；
35.图4为实施例1～4膜与细胞共培养14天血管内皮因子基因及蛋白的表达；
36.图5为本发明实施例3和实施例4的力学测试曲线。
具体实施方式
37.下面结合说明书附图对本发明作进一步详细描述。
38.实施例1
39.如图1所示，本发明提供了一种利用微通道促血管化的组织再生膜，包括微通道层1、支撑层3、纺丝层2；微通道层为三维网状结构，图1中的4为镁丝洗脱后的微通道结构，该微通道通径为40μm。其制备方法如下：
40.(1)聚合物选择：选择8万分子量的聚己内酯，将2.5gpcl溶于50ml六氟异丙醇中,即pcl溶液浓度为0.05g/ml，获得pcl粘稠溶液，注入模具中；
41.(2)负载血管内皮生长因子的镁合金丝制备：将vegf以5μg/ml溶解于pbs溶液中，随后加入到浓度为10％的pcl二氯甲烷溶液中充分搅拌，获得浓度为500ng/ml的vegf-聚合物溶液，将拉拔到丝径为40μm的镁合金丝材缠绕成为三维网格状结构，如图2所示；用压平器压平成为镁丝薄片，如图3所示；然后将镁丝薄片浸入上述溶液中，匀速提出，使镁丝薄片表面附着该溶液；
42.(3)微通道结构的形成：将镁丝薄片置入pcl粘稠溶液的上层，在室温中蒸发成膜，脱模后将膜浸泡在10％的盐酸溶液中浸泡2h后，在蒸馏水中洗涤，烘干,测得孔隙率约为50％；
43.(4)组织再生膜的获得：将1.2g聚己内酯放入10ml六氟异丙醇中，磁力搅拌3h，获
得静电纺丝溶液，搭建好静电纺丝仪器，调节电压为8kv，推进速度为0.5ml/h，针头到收集器之间的距离为5cm，用纺丝液将厚度80μm的纯镁片加压黏附在聚合物致密层，凝固后的聚合物致密层朝上，在膜层表面喷涂同浓度纺丝液放置在纺丝平台上，纺丝时间5h后烘干，获得组织再生膜。
44.经过测试，再生膜膜厚为325
±
23μm，其中纺丝层厚度约为再生膜的1/3，分别用rt-qpcr和elisa法检测复合膜与细胞共培养14天后，vegf的基因表达水平如图4中的(a)所示，在骨髓间充质干细胞上清中蛋白的表达水平如图4中的(b)所示，发现再生膜使vegf基因与蛋白的表达水平位于相对较高水平。
45.实施例2
46.在实施例1的基础上，与实施例1不同的是：微通道通径为80μm。制备方法中：
47.(1)聚合物选择：选择6万分子量的plga，将4g plga溶解于20ml氯仿和dmf的混合溶液中，获得0.2g/mlplga粘稠液，注入模具中；氯仿：dmf溶液体积比为7：3；
48.(2)负载血管内皮生长因子的镁丝制备：将vegf以10μg/ml溶解于pbs溶液中，随后加入到浓度为10％的plga氯仿溶液中充分搅拌，获得浓度为800ng/ml的vegf-聚合物溶液，将拉拔到丝径为80μm的镁合金丝材缠绕在扎有细针的板子上，形成交错网络图案的三维结构后浸入上述溶液中，匀速提出，使丝材表面附着该溶液；
49.(3)微通道结构的形成：将固定的镁丝三维结构置入熔融聚合物的上层，将模具在室温冷却后固化，将膜浸泡在10％的盐酸溶液中浸泡2h，在蒸馏水中洗涤，烘干，测得孔隙率约为20％；
50.(4)组织再生膜的获得：将1.5g plga加入10ml氯仿和dmf的混合溶液中，磁力搅拌10h，获得静电纺丝溶液，用纺丝液将厚度100μm的纯锌片加压黏附在聚合物致密层，凝固后的聚合物致密层朝上，表面涂一层配置好的静电纺丝液，约0.2ml，将剩余静电纺丝液吸入针筒中，搭建好静电纺丝仪器，将调节电压为20kv，推进速度为1.5ml/h，针头到收集板距离为12cm，纺丝时间1h，烘干获得再生膜。
51.经过测试，再生膜膜厚为452
±
13μm，其中纺丝层厚度约为再生膜的1/3，分别用rt-qpcr和elisa法检测复合膜与细胞共培养14天后，vegf的基因表达水平如图4中的(a)所示，在骨髓间充质干细胞上清中蛋白的表达水平如图4中的(b)所示，发现再生膜使vegf基因与蛋白的表达水平位于相对较高水平。
52.实施例3
53.一种利用微通道促血管化的组织再生膜，微通道为网状结构，该微通道通径为30μm。其制备方法如下：
54.(1)聚合物选择：选择分子量为12万的pla，以质量体积比＝1：5的比例溶于二氯甲烷中，获得0.2g/mlpla粘稠溶液，磁力搅拌3h后将溶液倒入模具中，使其平铺；
55.(2)负载血管内皮生长因子的镁合金丝材制备：将vegf以20μg/ml溶解于pbs溶液中，随后加入到浓度为8％的pla二氯甲烷溶液中充分搅拌，获得浓度为1000ng/ml的vegf-聚合物溶液，将拉拔到丝径为30μm的镁合金丝材缠绕在扎有细针的板子上，形成层间交错网络图案的三维结构后浸入上述溶液中，匀速提出，使丝材表面附着该溶液；
56.(3)微通道结构的形成：将固定的镁丝三维结构置入熔融聚合物的上层，将模具在室温冷却后固化，将膜浸泡在10％的盐酸溶液中浸泡2h，在蒸馏水中洗涤，烘干；
57.(4)组织再生膜的获得：将1g聚乳酸放入10ml六氟异丙醇中，磁力搅拌4h，获得静电纺丝溶液，搭建好静电纺丝仪器，调节电压为15kv，推进速度为3ml/h，针头到收集器之间的距离为12cm，用纺丝液将厚度200μm的纯镁片加压黏附在聚合物致密层，凝固后的聚合物致密层朝上，在膜层表面涂抹生物粘合胶放置在纺丝平台上，纺丝时间3h后烘干，获得组织再生膜。
58.经过测试，再生膜膜厚为576
±
26μm，其中纺丝层厚度约为再生膜的2/5，通过拉伸测试，复合膜的最大应力为35mpa左右，同时将复合膜与细胞共培养14天后，vegf的基因表达水平如图4中的(a)所示，在骨髓间充质干细胞上清中蛋白的表达水平如图4中的(b)所示，可以看出，两者均位于较高水平。
59.实施例4
60.一种利用微通道促血管化的组织再生膜，微通道为网状结构，该微通道通径为30μm。其制备方法如下：
61.(1)聚合物选择：选择分子量为12万的pla，以质量体积比＝1：5的比例溶于二氯甲烷中，获得0.2g/mlpla粘稠溶液，磁力搅拌3h后将溶液倒入模具中，使其平铺；
62.(2)负载血管内皮生长因子的镁合金丝材制备：将vegf以20μg/ml溶解于pbs溶液中，随后加入到浓度为8％的pla二氯甲烷溶液中充分搅拌，获得浓度为1000ng/ml的vegf-聚合物溶液，将拉拔到丝径为30μm的镁合金丝材缠绕在扎有细针的板子上，形成层间交错网络图案的三维结构后浸入上述溶液中，匀速提出，使丝材表面附着该溶液；
63.(3)微通道结构的形成：将固定的镁丝三维结构置入熔融聚合物的上层，将模具在室温冷却后固化，将膜浸泡在10％的盐酸溶液中浸泡2h，在蒸馏水中洗涤，烘干，测得孔隙率为30％；
64.(4)组织再生膜的获得：将1g聚乳酸放入10ml六氟异丙醇中，磁力搅拌4h，获得静电纺丝溶液，搭建好静电纺丝仪器，调节电压为15kv，推进速度为3ml/h，针头到收集器之间的距离为12cm，将组织再生膜致密侧朝上，放置在静电纺丝平台上，在其表面涂抹生物粘合胶放置在纺丝平台上，纺丝时间3h后烘干，获得组织再生膜。
65.经过测试，再生膜膜厚为550
±
32μm，其中纺丝层厚度约为再生膜的2/5，通过拉伸测试，复合膜的最大应力为8mpa左右。