一种硼替佐米和榄香烯分子配伍药物组合及其应用

1.本发明涉及药物组合物领域，具体涉及一种硼替佐米和榄香烯分子配伍组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.胰腺癌是恶性程度极高的肿瘤，其死亡率与发病率非常接近，被称为“癌中之王”。其临床特点是早期诊断和治疗困难，死亡率极高，5年生存率不足10％[hu,j.-x.,et al.,pancreatic cancer:areviewofepidemiology,trend,andriskfactors.world journal of gastroenterology,2021.27(27):4298-4321]。大部分胰腺癌患者一经诊断就处于中晚期，丧失了最佳的手术治疗时机，中晚期胰腺癌患者只能接受以缓解症状、延长生存期和提高生活质量为目的姑息治疗，其中位生存期只有2-3个月[中国抗癌协会胰腺癌专业委员会,中国胰腺癌综合诊治指南(2020版).中华外科杂志,2021.59(02):81-100]。胰腺癌现有一线和二线化疗药物疗效欠佳，毒副作用大，选择有限，亟需探索新的治疗方案以改善患者的预后。
[0003]
榄香烯(elemene)是从中药温郁金(温莪术)提取的挥发油中发现的高效低毒抗癌活性成分并将其开发成榄香烯脂质体抗癌中药。榄香烯包括α、β、γ、δ等多种榄香烯异构体及不同比例异构体的混合物，是通过多途径、多通道遏制多种肿瘤的发展，不仅能够诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞，还能够参与肿瘤的免疫调控机制，抑制肿瘤血管生成，对抑制细胞浸润和转移起积极作用[谢恬,et al.,榄香烯脂质体系列靶向抗癌天然药物基础研究进展.中国中西医结合杂志,2014.34(4):507-512]。
[0004]
硼替佐米(bortezomib)是第一个被应用于临床的蛋白酶体抑制剂，被批准用于治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。硼替佐米作为硼酸类的不可逆蛋白酶体抑制剂，通过泛素-蛋白酶体系统调节细胞周期和凋亡相关的因子发挥抗癌活性[johnson,d.e.,the ubiquitin-proteasome system:opportunities for therapeutic intervention in solid tumors.endocrine-related cancer,2015.22(1):t1-t17]。在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多种实体瘤的临床前研究中显现出良好的广谱抗癌作用[manasanch,e.e.and r.z.orlowski,proteasome inhibitors in cancer therapy.nature reviews clinical oncology,2017.14:417]。
[0005]
现有技术中公开了硼替佐米和榄香烯均有一定的抗癌作用，但其单独使用在实体瘤上的疗效有限，硼替佐米还具有较大的毒副作用，故其适用范围较小，在性能上还有待提高。


技术实现要素：

[0006]
本发明的第一个目的在于针对现有技术的不足，提供一种硼替佐米和榄香烯分子配伍药物组合物，该组合物作用于胰腺癌上具有协同增敏的作用，从而可以增强抗胰腺癌的疗效，可以减少硼替佐米的用量降低其毒副作用。
[0007]
一种药物组合物，包括硼替佐米和榄香烯。
[0008]
作为优选，所述榄香烯和硼替佐米的质量比为1.7:1-450:1；更为优选为1.7:1-80:1；
[0009]
作为优选，所述榄香烯选自α-榄香烯、β-榄香烯、γ-榄香烯、δ-榄香烯中各种榄香烯异构体的一种或几种不同比例的混合物，更为优选为β-榄香烯。
[0010]
作为优选，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
[0011]
本发明的第二个目的是提供一种硼替佐米和榄香烯分子配伍的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0012]
作为优选，所述肿瘤为胰腺癌。
[0013]
本发明通过对已批准的抗肿瘤药物库进行了榄香烯联合用药的高通量筛选，发现硼替佐米与榄香烯具有协同增敏抗胰腺癌的效应。
[0014]
在二维和三维胰腺癌细胞模型上通过肿瘤细胞抑制的ic
50
和协同指数评估榄香烯增强硼替佐米抑制细胞增殖的能力，具有显著的协同增敏效应，增敏倍数高达20倍以上。
[0015]
榄香烯和硼替佐米的组合物可以将胰腺癌细胞周期阻滞在g2/m期，可以诱导胰腺癌细胞凋亡和后期的继发性坏死。
[0016]
本发明组合物中的榄香烯通过介导硼替佐米对蛋白酶体活性的抑制，抑制周期调节因子的降解，上调p21和cyclin b1，诱导g2/m期阻滞和凋亡的发生，从而起到增敏硼替佐米抗胰腺癌的作用。此外，榄香烯改变细胞渗透性，增加硼替佐米在细胞内的富集。
[0017]
本发明组合物在裸鼠胰腺癌移植瘤模型上抑制肿瘤生长的效果好于单药组，说明该药物组合物具有显著的抗胰腺癌作用；组合物组小鼠体重与单药组没有显著差异，说明小鼠对组合物能够耐受。所以该药物组合物在显著增强抗胰腺癌效果的同时可以通过减少硼替佐米的用量降低毒性。
[0018]
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0019]
(1)本发明硼替佐米和榄香烯分子配伍药物组合物显著提高了对胰腺癌的疗效，其增敏倍数达20倍以上，尤其是对于化疗药物不敏感的三维肿瘤细胞其增敏倍数分别为31倍和45倍。
[0020]
(2)本发明提出在保证药物效果时利用少量榄香烯协同增敏硼替佐米，从而降低硼替佐米的用量，增强硼替佐米抑制细胞增殖能力，进而显著降低硼替佐米药物毒副作用，以改善患者的预后和生活质量。本发明的药物组合物提供了胰腺癌治疗的新“药物联合”策略，对于难治的晚期胰腺癌治疗具有重要的意义和应用前景。
附图说明
[0021]
图1为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物处理后二维panc-1胰腺癌细胞的形态图。
[0022]
图2为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对二维胰腺癌细胞panc-1(a)和bxpc-3(b)的抑制率曲线。
[0023]
图3为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对三维胰腺癌细胞panc-1(a)和bxpc-3(b)的抑制率曲线。
[0024]
图4为榄香烯和硼替佐米组合物对panc-1移植瘤的抑瘤效果：其中4(a)为给药期
间各组裸鼠体重随时间的变化；4(b)为给药期间各组肿瘤体积随时间的变化；4(c)为实验终点各组瘤体俯视图；4(d)为实验终点各组的瘤体重量。
[0025]
图5为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对二维panc-1(a)及bxpc-3(b)细胞周期的影响。
[0026]
图6为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对二维和三维panc-1细胞凋亡(a)和坏死(b)的影响。
[0027]
图7为榄香烯与硼替佐米及其组合物对蛋白酶体活性的影响：其中7(a)为药物对panc-1细胞中蛋白酶体活性的影响；7(b)为榄香烯共存时硼替佐米与蛋白酶体分子对接图。
[0028]
图8为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对细胞周期相关蛋白表达的影响：其中8(a)为western blot分析panc-1细胞经药物处理48h后关键蛋白的表达情况；8(b)为p21蛋白免疫组化染色分析的典型图。
具体实施方式
[0029]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0030]
实施例1：二维胰腺癌细胞模型上榄香烯联合用药的高通量筛选
[0031]
(1)取对数生长期的panc-1细胞，重悬为单细胞悬液，每孔200个细胞/4μl细胞液，接种于1536孔白色孔板中，过夜培养，待细胞贴壁后加入不同药物1μl，每孔的终体积为5μl。
[0032]
榄香烯单药组加入不同浓度的榄香烯,其浓度分别为60，40，30，20，15，7.5，5，2.5μg/ml；nci抗癌药物单药组加入3倍梯度稀释10个浓度点的nci药物，其浓度分别为5，1.67，0.55，0.18，0.06，0.02，0.007，0.002，0.0008，0.0003μm；联用组固定榄香烯终浓度为无细胞毒的10μg/ml，其余操作同nci抗癌药物单药组。同时设置对照组(含细胞，无药物)和空白组(无细胞)，以上各浓度组均3个复孔。
[0033]
(2)步骤(1)加药后培养皿置于湿盒中，于细胞培养箱中继续孵育72h，取出培养皿室温平衡5-10min，每孔加入5μl celltiter-glo检测试剂，室温条件下避光震荡孵育15min，酶标仪测定化学发光值(rlu)。
[0034]
根据以下公式进行抑制率计算，采用graphpad prism软件进行ic
50
数据分析：
[0035]
抑制率％＝(对照孔rlu值-实验孔rlu值)/(对照孔rlu值-空白孔rlu值)
×
100％
[0036]
图1为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物处理后二维panc-1胰腺癌细胞的形态图。
[0037]
nci抗癌药物库含有美国fda已批准上市的抗癌小分子药物，共128种药物，包括胰腺癌药物吉西他滨、5-fu、奥沙利铂等。针对二维胰腺癌细胞panc-1对已批准上市的128个抗肿瘤药物进行了榄香烯联合用药的高通量筛选，首先测定榄香烯的细胞增殖曲线，选取一个不产生明显细胞毒性的榄香烯浓度，通过比较有无榄香烯存在时抗癌药物的细胞增殖曲线、ic
50
值来寻找榄香烯的配伍组合分子。在128个nci抗癌药物中，仅发现榄香烯能够增强蛋白酶体抑制剂硼替佐米对二维panc-1细胞增殖的抑制作用，而对其它抗癌药物包括另一个蛋白酶体抑制剂卡非佐米则没有作用。从药物处理后细胞形态图(图1)可以看出榄香
烯和硼替佐米组合物在抗胰腺癌细胞增殖上具有良好的抑制效果。
[0038]
实施例2：二维胰腺癌细胞模型测定药物组合物对细胞增殖的抑制
[0039]
类似于实施例1，进一步确定榄香烯联合硼替佐米对胰腺癌细胞panc-1和bxpc-3的细胞毒作用。收取对数生长期的panc-1和bxpc-3胰腺癌细胞，重悬为单细胞悬液，每孔800个细胞/20μl细胞液，接种于白色384孔板中，过夜培养，细胞贴壁后加药液/培养基5μl，每孔的终体积为25μl。榄香烯抑制曲线测定设置9个浓度点(80，60，40，30，20，15，7.5，5，2.5μg/ml)。硼替佐米最高终浓度为5μm，3倍梯度稀释10个浓度点(同实施例1)；联用组固定榄香烯终浓度为10或5μg/ml，加入一系列浓度的硼替佐米(同单药组浓度)。每个测试均3个复孔。加药后培养皿置于湿盒中，于细胞培养箱中继续孵育72h，取出培养皿室温平衡5-10min，每孔加入25μl提前准备好的celltiter-glo检测试剂，室温震荡孵育15min，酶标仪测定发光值。
[0040]
图2为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对二维胰腺癌细胞panc-1(a)和bxpc-3(b)的抑制率曲线。
[0041]
如图2，榄香烯抑制panc-1细胞增殖的ic
50
为32μg/ml，在低于15μg/ml时对细胞生长没有明显的抑制活性。所以在联合筛选的实验中选定榄香烯浓度为10μg/ml，其抑制活性只有5％。与硼替佐米组相比，在10μg/ml榄香烯共存时硼替佐米的ic
50
降低了～24倍，说明榄香烯能够显著增强硼替佐米对panc-1细胞增殖的抑制，两者有明显的协同效应。
[0042]
榄香烯对二维bxpc-3细胞增殖抑制的ic
50
为26.49μg/ml，在低于7.5μg/ml时对细胞生长没有明显的抑制活性。所以在组合药物测试中固定榄香烯浓度为5μg/ml，排除榄香烯本身的抑制作用。与硼替佐米组相比，在与无细胞毒作用浓度榄香烯共存时硼替佐米对对bxpc-3细胞的ic
50
由293.4nm降至2.63nm，降低了～111倍，说明榄香烯能够显著增强硼替佐米对二维bxpc-3细胞增殖的抑制，两药物具有明显的协同效应，组合物增强对胰腺癌细胞的杀伤作用。
[0043]
实施例3：三维胰腺癌细胞模型测定药物组合物对细胞增殖的抑制
[0044]
三维模型采用的是u形384孔板，每孔接种2500个细胞/20μl细胞液，待48h后长成细胞球后加药。测定榄香烯对三维panc-1或bxpc-3细胞增殖曲线，选取无细胞毒作用的榄香烯浓度30μg/ml或20μg/ml进行组合用药活性测定，硼替佐米的最高终浓度为10μm或30μm，依次3倍梯度稀释，8-10个浓度点，其余操作步骤同实施例2二维实验。采用graphpad prism软件进行数据分析并计算ic
50
值。
[0045]
图3为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对三维胰腺癌细胞panc-1(a)和bxpc-3(b)的抑制率曲线。
[0046]
大部分药物在二维和三维肿瘤模型中具有不同的响应，对接近生理的三维模型的响应一般不如对二维模型敏感。因此，需要在三维胰腺癌细胞模型上对榄香烯和硼替佐米的增敏效果和抗癌药效进行确认。
[0047]
榄香烯在低于30μg/ml时对三维胰腺癌细胞生长没有明显的细胞毒作用，所以在组合药物测试中固定榄香烯浓度为30μg/ml或更低。与硼替佐米组相比，在与无细胞毒作用浓度榄香烯共存时硼替佐米对三维panc-1细胞的ic
50
由806nm降低到25.7nm，降低了～31倍，对三维bxpc-3细胞的ic
50
由5.2μm降至0.11μm，降低了～49倍，说明榄香烯能够显著增强硼替佐米对三维panc-1和bxpc-3细胞增殖的抑制，两药物具有显著的协同效应，药物组合
物具有增强的抗胰腺效果。
[0048]
综合实施例1、2、3的结果，对硼替佐米和榄香烯组合物的疗效和增敏倍数进行汇总(表1)，并计算在不同比例下两药相互作用指数(表2)。从表1可以看出，无论在二维和三维细胞模型，榄香烯的加入显著增强硼替佐米对胰腺癌细胞的杀伤作用，增敏倍数达24倍以上。两药相互作用指数cdi(coefficient of drug interaction)＝ab/(a
×
b)，其中ab是联用组的细胞活力，a和b分别代表单药组的细胞活力。cdi＜1表明具有协同效应；cdi＝1表明具有加和效应；cdi＞1表明具有拮抗作用。除硼替佐米个别低浓度下，这些药物组合比例下计算得到的两药相互作用系数cdi均小于1，表明榄香烯和硼替佐米在较宽比例范围内(榄香烯：硼替佐米质量比1.7～421.6)具有显著的协同作用。
[0049]
表1不同药物对细胞增殖抑制的ic
50
值及榄香烯对硼替佐米的增敏倍数；
[0050][0051][0052]
表2不同比例榄香烯和硼替佐米时两药的相互作用指数
[0053][0054]
实施例4：裸鼠胰腺癌移植瘤模型药效评价
[0055]
接种3
×
106个panc-1细胞于4～6周龄balb/c裸鼠腹部腋下的位置。每周用游标卡尺测量2次肿瘤长径(l)和短径(w)，按v＝(l
×
w2)
×
0.52计算肿瘤的体积。将肿瘤体积过大或过小的老鼠剔除，选取肿瘤体积100
–
200mm3的老鼠随机分组给药。给药分组：4个实验组，每组7-8只小鼠。1)对照组(ctrl)；2)榄香烯组(ele 40mg/kg，每周6次)；3)硼替佐米组(bz 0.6mg/kg，每周2次)；4)榄香烯 硼替佐米组(ele 40mg/kg，每周6次；bz 0.6mg/kg，每周2次)。连续给药5周，对裸鼠体重及肿瘤体积进行检测记录。肿瘤不超过2000mm3时，处死老鼠，取肿瘤组织拍照、称重，并保存组织做后续相关分析。
[0056]
图4为榄香烯和硼替佐米组合物对panc-1移植瘤的抑瘤效果：其中4(a)为给药期间各组裸鼠体重随时间的变化；4(b)为给药期间各组肿瘤体积随时间的变化；4(c)为实验终点各组瘤体俯视图；4(d)为实验终点各组的瘤体重量。
[0057]
整个给药过程中各组小鼠的体重没有明显差异，说明小鼠对这些药物能够耐受。不论是对瘤体大小还是瘤体重量进行分析，终点联合用药抑制肿瘤增长效果都比单药组好，其抑制率分别为ele bz(66％)；ele(41％)；bz(17％)。榄香烯联合硼替佐米组抑制肿瘤生长的效果优于单药组。
[0058]
实施例5：硼替佐米和榄香烯组合物对细胞周期的影响
[0059]
接种对数生长期的panc-1或bxpc-3细胞于六孔板中，每孔约7
×
105个细胞，贴壁后50-80％融合度时加入硼替佐米(40nm)和榄香烯(10μg/ml)，处理24h后收细胞，每组三复孔，采用pi染料和流式技术对细胞周期进行分析。
[0060]
图5为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对二维panc-1(a)及bxpc-3(b)细胞周期的影响。
[0061]
硼替佐米或榄香烯单独处理对panc-1和bxpc-3细胞周期分布的影响不大，与对照组的周期分布相近；而榄香烯联合硼替佐米处理胰腺癌细胞后能明显引起细胞的g2/m期阻滞，且两株细胞的结果一致。
[0062]
实施例6：硼替佐米和榄香烯组合物对细胞凋亡和坏死的影响
[0063]
取对数生长期的panc-1细胞，重悬为单细胞悬液，每孔接种2500个细胞/25μl于白色384孔板中(2d用平底孔板，3d用u形孔板)，过夜培养，待细胞贴壁后加12
×
的药液/培养基5μl(即药物终浓度若为10μg/ml，加入药液的浓度即为120μg/ml)，然后添加30μl 2
×
realtime-glo apoptosis and necrosis assay检测试剂，保证每孔的终体积为60μl，平板摇床上摇晃30s混匀，培养箱孵育，在不同时间点采用酶标仪检测化学发光(rlu)和荧光信号值(rfu，485nm ex/520
–
530nm em)。2d细胞模型榄香烯的终浓度10μg/ml，硼替佐米的终浓度为80nm；3d细胞模型榄香烯的终浓度30μg/ml，硼替佐米的终浓度为3μm；该实验测定的时间点为0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、20h、24h、28h、32h、44h、48h、52h、56h、68h、72h。
[0064]
图6为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对二维和三维panc-1细胞凋亡(a)和坏死(b)的影响。
[0065]
采用realtime-glo
tm apoptosis and necrosis assay试剂盒实时监测细胞凋亡和坏死的情况，rlu值正比于细胞的凋亡率，rfu值正比于细胞的坏死率。相比于硼替佐米单药组，榄香烯明显增强了硼替佐米对二维和三维panc-1细胞的早期凋亡和后期的细胞坏死，联用组的凋亡和坏死均明显高于单药组。细胞形态照片与试剂盒监测的结果一致，表明榄香烯能够增强硼替佐米诱导胰腺癌细胞的凋亡和继发性坏死。
[0066]
实施例7：硼替佐米和榄香烯组合物对蛋白酶体活性的影响
[0067]
取对数生长期panc-1细胞，每孔接种3000个细胞/20μl于白色384孔板中，过夜培养，待细胞贴壁后加入5μl榄香烯(10μg/ml)和硼替佐米(20nm、30nm、40nm)处理细胞2h，每组各3个复孔，然后取出培养皿于室温平衡10min，每孔加入25μl提前配置好的并室温平衡30min的proteasome-glo
tm cell-based reagent，平板摇床上混匀2min，室温条件下避光孵育10min，然后在酶标仪上读取化学发光数值。
[0068]
图7为榄香烯与硼替佐米及其组合物对蛋白酶体活性的影响：其中7(a)为药物对panc-1细胞中蛋白酶体活性的影响；7(b)为榄香烯共存时硼替佐米与蛋白酶体分子对接图。
[0069]
硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，榄香烯增强了硼替佐米对胰腺癌细胞增殖、周期阻滞以及凋亡和继发性坏死。所以有必要探讨榄香烯的额外加入对细胞中蛋白酶体的活性影响。细胞蛋白酶体的活性正比于rlu值。10μg/ml的榄香烯单药组对蛋白酶体的活性无影响，硼替佐米组在20nm-40nm浓度下均呈现对蛋白酶体的抑制活性。相比于硼替佐米单药组，榄香烯的加入增强了对多个浓度的硼替佐米对蛋白酶体活性的抑制，与分子对接预期结果一致。由此说明，榄香烯与硼替佐米在抑制蛋白酶体活性上的确存在着显著的协同作用，是硼替佐米配伍榄香烯的分子基础。
[0070]
实施例8：硼替佐米和榄香烯组合物对蛋白酶体调节的关键蛋白影响
[0071]
western blot分析：将panc-1细胞接种于10cm的培养皿，待细胞长至60-70％融合度时加榄香烯和硼替佐米处理48h(榄香烯组10μg/ml，硼替佐米组40nm)。用含1mm pmsf的ripa裂解液提取细胞总蛋白，bca法测定蛋白浓度。变性蛋白，上样30μg总蛋白进行sds-page电泳，湿法转膜(300ma，1.5
–
2h)，5％脱脂牛奶封闭1.5h，4℃过夜孵育一抗，tbst洗膜3次，室温孵育二抗1h，tbst洗膜5次，加入曝光液曝光显影，分析结果。
[0072]
组织切片免疫组化分析：瘤组织石蜡包埋后切片，60℃烘片1h，二甲苯浸泡脱蜡，梯度乙醇水化，枸橼酸盐缓冲液高压热修复抗原，3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，pbs洗5次，湿盒中4℃过夜孵育一抗，pbs洗5次，加适量即用型快捷免疫组化max vision
tm hrp试剂室温孵育30min，dab显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，封片，显微镜下拍照。
[0073]
图8为榄香烯与硼替佐米及其药物组合物对细胞周期相关蛋白表达的影响：其中8(a)为western blot分析panc-1细胞经药物处理48h后关键蛋白的表达情况；8(b)为p21蛋白免疫组化染色分析的典型图。
[0074]
rt-pcr、蛋白组学和wb结果均表明联合用药明显导致细胞周期相关蛋白p21和cyclin b1表达的上调，佐证联合用药导致g2/m期阻滞。免疫组化切片染色分析进一步验证了p21蛋白在瘤体中的表达情况，联用组p21的表达量明显高于硼替佐米或榄香烯单药组。
[0075]
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。