一种具有神经保护活性的竹柏总黄酮提取物及其制备方法和应用

1.本发明属于竹柏活性成分提取技术领域，具体涉及一种具有神经保护活性的竹柏总黄酮提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)，俗称老年痴呆，是一种最常见的中枢神经系统退行性疾病，起病隐袭，病程呈慢性进行性。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。本病最早由德国医生alois alzheimer于1906年描述(ferri c p,prince m，brayne c，et al.global prevalence of dementia：a delphi consensus study[j].the lancet,2006,366(9503):2112-2117.goedert m,spillantini m g.acentury of alzheimer’s disease[j].science,2006,314(5800):777-781.)，是痴呆最常见的病因，其患病率随年龄增高而增高，在65岁以上人群中约为10％，85岁以上人群中约50％(zhang yw,thompson r,zhang h,et al.app processing in alzheimer's disease[j].mol brain,2011,4:3.)。随着人口的老龄化，ad的发病率逐年上升，严重危害老年人的身心健康和生活质量，给病人造成深重的痛苦，给家庭和社会带来沉重的负担，已成为严重的社会问题，引起各国政府和医学界的普遍关注。
[0003]
ad的病因及发病机制尚未阐明，目前认为可能与环境和遗传因素这两方面有关。其特征性病理改变为β-淀粉样蛋白(aβ)沉积形成的细胞外老年斑(sp)和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结(nfts)，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。
[0004]
aβ是淀粉样蛋白前体降解产物，由39～42个氨基酸残基组成，其活性片段主要在第25-35个氨基酸残基(gong cx,shaikh s,wang jz,et al.phosphatase activity toward abnormally phosphorylated tau:decrease in alzheimer disease brain[j].jounal of neurochemistry,1995,65(2):732-738.)。aβ具有神经毒性，能诱发神经细胞的凋亡和炎症反应、破坏神经细胞内外钙离子稳态、引起氧化应激反应及激活补体(kurz a,perneczky r.amyloid clearance as a treatment target against alzheimer's disease[j].alzheimers dis,2011,24suppl 2:61-73.)。最近又有报道称寡聚体aβ能减少神经棘突的密度并且抑制长时程增强效应(ltp)(rowan mj,klyubin i,wang q,et al.synaptic memory mechanisms:alzheimer's disease amyloid beta-peptide-induced dysfunction.biochem soc trans,2007,35(pt 5):1219-1223.)。β-淀粉样蛋白除了与神经炎斑形成有关外，同时也参与神经原纤维缠结的形成。即当神经炎斑形成以后，可溶性的β-淀粉样蛋白进入神经元，使与微管蛋白相结合的蛋白过度磷酸化而脱离了微管蛋白，形成神经原纤维缠结(郑观成.脑老化与老年痴呆第二卷[m]：脑老化科学.上海：复旦大学出版社，2008:208.)。研究发现，ad的主要病理改变在于aβ沉积。aβ的神经毒性作用被认为是ad发病机制中的关键环节和靶点。而aβ的神经毒性作用正是因其由可溶性转变为不
可溶性沉积产生的(于丽红,于天贵,张庆柱.神经细胞内aβ沉积与阿尔茨海默病的发生机制[j].生命的化学，2010,30(03):425-428.)。因此，减少aβ的产生，降低aβ诱导的细胞毒性被认为是治疗ad的根本途径。
[0005]
谷氨酸(glutamic acid,glu)是中枢神经系统内兴奋性神经递质。病理情况下,glu大量释放造成神经细胞损害是导致神经损伤和很多神经退行性疾病的重要因素。glu对神经细胞的损害可以通过过度激活成熟神经元膜上的glu受体产生兴奋性神经毒性(oliver g r,inge b,chung h y,et al.glutamate-induced cell death of immol lortalized murine hippocampal neurons:neuroprotective activity of heme oxygenase-1,heat shock protein70，and sodium selenite[j].neuroscience lett,2004,36(2):253-257.),还可通过抑制细胞膜上谷氨酸/胱氨酸转运子的功能产生氧化性毒性,后者与帕金森病、阿尔茨海默病等退行性神经系统疾病有关(vornov j」,coylej t.gutamate neurotoxicity and the inhibition of proteinsynthesis in the hippocampal slice.j neurochem，1991；56:996～1006)。对glu兴奋性神经毒性研究国内外已有大量文献报道,对glu氧化性神经毒性的研究近年来已引起重视,因为该毒性与许多神经系统疾病密切相关,如缺血性中风、阿尔茨海默病及帕金森病等(newell dw,barth a.papermaster v,malouf at.glutamate andnonrglutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen andglucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.j nerrosci，1995；15:7702～11))。
[0006]
谷氨酸大量释放对神经元产生的毒性作用是导致神经损伤和一些神经退行性疾病的重要因素(obrenovitch t p.high extracellular glutamate and neuronal death in neurological disorders.cause,contribution of consequence？[j].ann n y aced sci,1999,890:273-286.)。。glu对神经细胞的损害除可通过激活glu受体产生兴奋性神经毒性外,还可通过抑制细胞膜上谷氨酸/胱氨酸转运体而产生氧化性细胞毒性(schubert d,piasecki d.oxidative glutamate toxicity can be a component of the excitotoxicity cascade[j].j neurosci,2001，21(19):7455-7462.)。氧化损伤的病理改变在ad并称恶化中发挥重要作用，在ad患者出现神经损伤的极早期，易感神经元即出现氧化损伤，说明氧化损伤是ad发病早期的重要病理因素，在ad发病过程中，由于体内氧化还原平衡收到破坏，体内抗氧化酶类包括sod、gsh-px活性下调，导致自由基大量释放，产生养活应急，造成脂质过氧化、线粒体损伤等，进而损伤神经细胞，影响记忆功能。
[0007]
目前治疗阿尔茨海默病或老年痴呆的药物，主要针对相应的发病原因如胆碱能神经异常、β-淀粉样蛋白堆积、炎症、铝中毒、钙平衡失调、代谢紊乱、自由基损伤以及线粒体损伤等加以治疗。其中有一种药物疗效显著且被广泛接受，即以银杏叶提取物为原料的金纳多。银杏叶提取物中主要为黄酮类成分，且大部分为双黄酮。研究表明，银杏叶提取物能增加脑血管流量，降低脑血管阻力，改善脑部血液循环，保护脑细胞免受缺血损害，清除有害的氧化自由基，并具有提高免疫能力和抗衰老作用(xie h，wang jr，yau lf，liu y，liu l，han qb，et al.quantitative analysis of the flavonoid glycosides and terpene trilactones in the extract of ginkgo biloba and evaluation of their inhibitory activity towards fibril formation ofβ-amyloid peptide[j].molecules,2014,19(4):4466-4478.)。因此，深入挖掘和发挥中医药的诊疗优势来寻找对
ad确切有效的防治方法的意义变得尤为重大(纪荣芳,牛建昭,许树强,等.从数据挖掘角度看中医药治疗健忘与痴呆[j].中日友好医院学报,2006(06):337-340.)。
[0008]
竹柏(podocarpus nagi(thunb.)zoll.et mor ex zoll.)为罗汉松科竹柏属常绿乔木，别名糖鸡子、罗汉柴、椰树、山杉、铁甲树等，属裸子植物类。广泛分布于广东、浙江、福建、广西等地(李嵘,龙春林.云南金平瑶族医药初探[j].中国药学杂志,2000(11):55-59.8.)。竹柏在我国南方有大量栽培，但多作为观赏的庭园、园林树种，在医药上的研究应用并不多见。竹柏具有止血、接骨、消肿、抗肿瘤作用(戴斌,丘翠嫦,李剑东,周丽娜,陈少锋.瑶医用药品种调查报告[j].中草药,1997(12):746-749.)，其主要含黄酮、萜类、挥发油等成分(孙同兴,王雪英.竹柏属植物的分类、地理分布及药用价值[j].亚热带植物科学,2005(02):53-55.)，但在黄酮类成分方面的研究仍较为鲜见。竹柏叶中黄酮类成分以双黄酮类成分为主，是该植物的特征性成分，袁旭红等(袁旭江,杜红光.rp-hplc法测定竹柏叶中穗花双黄酮含量[j].中国新药杂志,2009,18(09):852-854.)用高效液相色谱法对竹柏叶成分含量测定发现以穗花双黄酮含量较高，是其主要成分之一。
[0009]
近年来研究发现，黄酮类化合物在调节神经功能和抗神经退行性疾病方面具有显著的作用。在临床或动物实验中，人们发现富含黄酮类化合物的植物和水果等能改善认知功能，同时能修复受损神经元，并增强神经细胞功能或刺激神经细胞再生(youdim ka,joseph ja.a possible emerging role of phytochemicals in improving age-related neurologicaldysfunctions:a multiplicity of effects[j].free radic biol med,2001,30(6):583-594.)。有研究发现，卷柏穗花杉双黄酮(af)抑制aβ诱导的毒性及纤维形成，且研究表明双黄酮较单黄酮抗aβ作用效果更好，可能是由于双黄酮具有两个活性区域(ishola,i.o.tota,s.adeyemi,o.o.agbaje,e.o.narender,t.shukla,r.protective effect of cnestis ferruginea and its active constituent on scopolamine-induced memory impairment in mice:a behavioral and biochemical study[j].pharm biol,2013,51(7):825-35.)。在整体实验中，小鼠灌胃可以抑制东莨菪碱诱导的小鼠认知障碍，抑制乙酰胆碱酯酶活力，并提高抗氧化酶的活性。曹秦等(曹秦.穗花杉双黄酮对mptp诱导帕金森病小鼠模型的神经保护作用及机制研究[d].上海:上海中医药大学,2015.)的研究结果表明，穗花双黄酮对mpp 诱导sh-sy5y细胞损伤以及mptp诱导pd模型小鼠da能神经元损伤具有一定保护作用，可能是通过抑制pi3k/akt信号通路从而启动bcl-2/bax和caspase-3凋亡程序启动实现。张莲珠等(张莲珠.卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对认知障碍模型的治疗及可能作用途径[d].长春:吉林大学,2013)的整体动物和离体细胞株的研究结果表明，卷柏穗花杉双黄酮对小鼠记忆功能障碍具有较明显的治疗作用，对正常神经细胞起促增殖作用以及对aβ25-35、冈田酸、过氧化氢等多种损伤因子致sh-sy5y细胞神经细胞株损伤的保护和修复作用，对冈田酸致损的神经细胞的保护作用可能主要通过维护微管的结构与功能、抗线粒体功能障碍和抗氧化应激途径实现。
[0010]
综合现有文献报道，竹柏对阿尔茨海默症有效部位的化学成分和作用机理研究国内外均未见报道。


技术实现要素：

[0011]
本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种具有神经保护活性的竹柏总黄酮提
取物及其制备方法和应用。
[0012]
本发明是通过以下技术方案实现的：
[0013]
一种具有神经保护活性的竹柏总黄酮提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0014]
(1)回流提取：
[0015]
将竹柏叶粗粉，用70％乙醇回流提取2-3次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩至0.5g生药/ml；
[0016]
(2)大孔树脂纯化
[0017]
醇提液上d101大孔树脂柱，95％乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，调整含醇量至85％。；
[0018]
(3)聚酰胺纯化：
[0019]
取大孔树脂洗脱液，通过聚酰胺柱，85％乙醇洗脱至无色，洗脱液浓缩回收乙醇，干燥，即得。
[0020]
进一步地，步骤(2)中所述的d101，可为ab-8等非极性大孔树脂的1种或几种。
[0021]
进一步地，步骤(2)中所述的洗脱乙醇浓度为50-95％。
[0022]
进一步地，步骤(2)中所述的洗脱液调整含醇量为50％-95％。
[0023]
进一步地，步骤(2)所述的乙醇洗脱浓度为50％-95％。
[0024]
进一步地，按照权利要求1的方法制备而成。
[0025]
一种具有神经保护活性的竹柏总黄酮提取物的应用，所述具有神经保护活性的竹柏总黄酮提取物具体对aβ25-35、谷氨酸诱发的离体培养神经元的阿尔茨海默症、兴奋性毒性模型有神经保护作用。
[0026]
本发明相比现有技术具有以下优点：
[0027]
1、本技术采用大孔树脂和聚酰胺柱色谱联用富集纯化竹柏总黄酮，应用aβ25-35、谷氨酸诱导的神经细胞损伤模型，探讨竹柏总黄酮的保护神经细胞的机制，进一步确证竹柏总黄酮的神经保护活性。
[0028]
2、本技术可为开发保护神经退行性疾病的产品提供科学依据。
[0029]
3、本技术首次观察竹柏总黄酮对aβ25-35、谷氨酸诱发的ad、兴奋性毒性细胞模型起神经保护作用，初步探讨竹柏总黄酮保护和修复受损神经细胞的可能作用机理，为开发阿尔茨海默症等治疗药物提供实验依据。
附图说明
[0030]
图1为本技术竹柏总黄酮提取工艺路线图；
[0031]
图2为本技术原代培养神经元鉴定；
[0032]
图3为本技术aβ25-35诱导神经元ad细胞模型的最佳剂量和最佳作用时间1μmol/l，作用24小时；
[0033]
图4为本技术谷氨酸诱导神经元兴奋性毒性细胞模型的最佳剂量和最佳作用时间1mmol/l和2mmol/l作用6小时或18小时；
[0034]
图5为本技术竹柏乙酸乙酯提取物aβ模型作用24h对神经元的抑制效应结果图；
[0035]
图6为本技术竹柏正丁醇提取物aβ模型作用24h对神经元的抑制效应结果图；
[0036]
图7为本技术竹柏石油醚提取物aβ模型作用24h对神经元的抑制效应结果图；
[0037]
图8为本技术竹柏水提取物aβ模型作用24h对神经元的抑制效应结果图；
[0038]
图9为本技术竹柏乙酸乙酯提取物glu模型作用6h对神经元的抑制效应结果图；
[0039]
图10为本技术竹柏乙酸乙酯提取物glu模型作用18h对神经元的抑制效应结果图；
[0040]
图11为本技术竹柏正丁醇提取物glu模型6h对神经元的抑制效应结果图；
[0041]
图12为本技术竹柏正丁醇提取物glu模型作用18h对神经元的抑制效应结果图；
[0042]
图13为本技术竹柏石油醚提取物glu模型作用6h对神经元的抑制效应结果图；
[0043]
图14为本技术竹柏石油醚提取物glu模型作用18h对神经元的抑制效应结果图；
[0044]
图15为本技术竹柏水提取物glu模型作用6h对神经元的抑制效应结果图；
[0045]
图16为本技术竹柏水提取物glu模型作用18h对神经元的抑制效应结果图。
具体实施方式
[0046]
下面结合附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。此外，本领域技术人员根据本文件的描述，可以对本文件中实施例中以及不同实施例中的特征进行相应组合。
[0047]
实施例子：
[0048]
实例1：竹柏叶粗粉1kg，8倍量体积的70％乙醇浸泡30min，回流提取2次，回流液减压浓缩0.5g生药/ml，浓缩液通过d101型大孔树脂柱(2000ml，上样量与树脂比为1:1)，以95％乙醇洗脱至无色，收集未吸附浓缩液及洗脱液并减压浓缩，调整含醇量至85％，通过聚酰胺色谱柱(上样量与树脂比为3:1)，85％乙醇洗脱至无色。减压浓缩洗脱液干燥得竹柏叶总黄酮。竹柏总黄酮提取物用甲醇溶解，注入uplc-ms(高分辨)联用仪，以穗花杉双黄酮为基准，推测出主要色谱峰的化学成分结构，明确竹柏总黄酮的主要成分。
[0049]
实例2：竹柏叶粗粉1kg，8倍量体积的70％乙醇浸泡30min，回流提取2次，回流液减压浓缩0.5g生药/ml(乙醇浓度为70％)，浓缩液通过ab-8型大孔树脂柱(2000ml，上样量与树脂比为1:1)，以85％乙醇洗脱至无色，收集未吸附浓缩液及洗脱液并减压浓缩至1g生药/ml(含醇量50％)，通过聚酰胺色谱柱(上样量与树脂比为3:1)，80％乙醇洗脱至无色。减压浓缩洗脱液干燥得竹柏叶总黄酮。
[0050]
3.竹柏总黄酮的保护脑神经的研究
[0051]
3.1建立aβ25-35诱导神经元ad细胞模型
[0052]
a.原代神经元细胞培养
[0053]
在无菌条件下取e14-18的胎鼠，剥离出大脑半球，在解剖显微镜下剥除软脑膜及血管，分离出大脑皮层组织，预冷pbs漂洗2-3次，然后用2.5％胰酶37℃消化15-30min，用含10％血清的dmem/f12培养液终止胰酶，接着用dnase i处理细胞3min，最后用吸管将组织吹打分离成为单细胞悬液，以含有10％b27、5％pen/strep、25μm glutamate的neurobasal medium将细胞接种于培养器皿中，通常一个胎鼠的皮层细胞可以重悬于10ml培养液中。次日，以10％b27、5％pen/strep、0.5mm glutamine的neurobasal medium全量换液，继续培养3-4天后半量换液，加入10μm arac抑制胶质细胞的生长。以后每3-4天半量换液。取培养7-10天的细胞进行实验，为实验的准确性及可比性，本实验中统一选择培养7天的神经元进行实验。
[0054]
b.确定aβ25-35诱导神经元ad细胞模型的最佳剂量和最佳作用时间
[0055]
分别分为正常对照组(control)、aβ25-35(高、中、低剂量)模型组，作用时间分24h、48h、72h。
[0056]
c.确定aβ25-35诱导神经元ad细胞模型的最佳有效部位
[0057]
将原代培养的皮层神经元随机分为以下几组：分别为正常对照组(control)、aβ25-35模型组、aβ25-35诱导神经元ad有效部位(高、中、低剂量)组、有效部位(高、中、低剂量)组。
[0058]
d.统计学处理
[0059]
采用spss软件对实验结果进行分析，数据用x
±
s表示，多组间比较采用方差分析。
[0060]
实验结果
[0061]
与本技术有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩
[0062]
(1)免疫细胞化学法观察并鉴定大鼠皮层原代神经元
[0063]
map-2可以特异性标记神经元。用神经细胞的特异性抗体map-2标记培养7天的原代神经元，在荧光显微镜下，能观察神经元原代培养的分布和活性。
[0064]
(2)本技术前期已确定aβ25-35诱导神经元ad细胞模型的最佳剂量和最佳作用时间
[0065]
用谷氨酸(mmol)造模，6小时时程，1mmol/l以上即有差异，抑制率为21％，p《0.01；18小时时程，2mmol/l以上有差异，抑制率为10％，p《0.05；24小时时程，5mmol/l以上有差异，抑制率为24％，p《0.01，72小时时程，20mmol/l以上有差异，抑制率为31％，p《0.05。确定用谷氨酸建立皮层神经元细胞凋亡模型浓度为1mmol/l和2mmol/l作用6hour或18hour用于下一步实验。
[0066]
用aβ25-35(μmol/l)造模，12小时时程，25μmol/l以上有差异，抑制率为61％，p《0.001；18小时时程，5μmol/l以上有差异，抑制率为19％，p《0.05，24小时时程，1μmol/l以上有差异，抑制率为35％，p《0.001。确定用aβ25-35建立皮层神经元ad模型浓度为1μmol/l，作用24hour，用于下一步实验。
[0067]
(3)本技术前期已完成竹柏活性部位抗神经元ad模型的活性研究
[0068]
a.竹柏乙酸乙酯提取物
[0069]
神经元单独给予竹柏乙酸乙酯提取物(g/ml)，用谷氨酸(1mmol)造模，同时给予竹柏正丁醇提取物，20μg/ml即可以翻转glutamate对神经元的抑制效应。*p《0.05vs.control，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001vs.glutamate。
[0070]
神经元单独给予竹柏乙酸乙酯提取物(g/ml)，用谷氨酸(2mmol)造模，同时给予竹柏正丁醇提取物，20μg/ml即可以翻转glutamate对神经元的抑制效应。*p《0.05vs.control，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001vs.glutamate。
[0071]
神经元单独给予竹柏乙酸乙酯提取物(g/ml)，与对照组相比，20μg/ml即有显著差异，p《0.01，说明竹柏乙酸乙酯提取物可能有助于神经元存活；用aβ25-35(1μmol)造模，同时给予竹柏乙酸乙酯提取物，20μg/ml即可以翻转aβ对神经元的抑制效应。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，
#
p《0.05，
##
p《0.01，
###
p《0.001vs.aβ25-35。
[0072]
b.竹柏正丁醇提取物
[0073]
神经元单独给予竹柏正丁醇提取物(g/ml)，与对照组相比，50μg/ml即有显著差异，p《0.001，说明竹柏正丁醇提取物可能有助于神经元存活；用谷氨酸(mmol)造模，同时给
予竹柏正丁醇提取物，20μg/ml即可以翻转glutamate对神经元的抑制效应。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001vs.glutamate。
[0074]
神经元单独给予竹柏正丁醇提取物(g/ml)，与对照组相比，20μg/ml即有显著差异，p《0.05，说明竹柏正丁醇提取物可能有助于神经元存活；用谷氨酸(2mmol)造模，同时给予竹柏正丁醇提取物，100μg/ml即可以翻转glutamate对神经元的抑制效应。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001vs.glutamate。
[0075]
神经元单独给予竹柏石油醚提取物(g/ml)，与对照组相比，250μg/ml即有显著差异，p《0.01，说明竹柏石油醚提取物可能有助于神经元存活；用谷氨酸(1mmol)造模，同时给予竹柏石油醚提取物，50μg/ml即可以翻转glutamate对神经元的抑制效应。500μg/ml对神经元可能具有毒性作用，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001vs.glutamate。
[0076]
神经元单独给予竹柏正丁醇提取物(g/ml)，与对照组相比，不能翻转aβ对神经元的抑制效应，相反大剂量250μg/ml以上对神经元抑制神经元的存活。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，
#
p《0.05，
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p《0.01，
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p《0.001vs.aβ25-35。
[0077]
c.竹柏石油醚提取物
[0078]
神经元单独给予竹柏石油醚提取物(g/ml)，与对照组相比，50μg/ml即有显著差异，p《0.05，说明竹柏石油醚提取物可能有助于神经元存活；用谷氨酸(2mmol)造模，同时给予竹柏石油醚提取物，50μg/ml即可以翻转glutamate对神经元的抑制效应。500μg/ml对神经元具有毒性作用，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001vs.glutamate。
[0079]
如图11、12所示，神经元单独给予竹柏水提取物(g/ml)，glu模型作用6h和18h，竹柏水提取物不能翻转glu对神经元的抑制效应。同时竹柏水提取物不影响神经元的存活。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001vs.glutamate。
[0080]
如图13所示，神经元单独给予竹柏石油醚提取物(g/ml)，与对照组相比，20μg/ml即有显著差异，p《0.001，说明竹柏石油醚提取物可能有助于神经元存活；用aβ25-35(1μmol)造模，同时给予竹柏石油醚提取物，20μg/ml即可以翻转aβ对神经元的抑制效应。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，
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p《0.05，
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p《0.01，
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p《0.001vs.aβ25-35。
[0081]
d.竹柏水提取物
[0082]
神经元单独给予竹柏水提取物(g/ml)，aβ模型作用24h，竹柏水提取物不能翻转aβ对神经元的抑制效应。同时竹柏水提取物不影响神经元的存活。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001vs.glutamate。
[0083]
神经元单独给予竹柏水提取物(g/ml)，aβ模型作用24h，竹柏水提取物不能翻转aβ对神经元的抑制效应。同时竹柏水提取物不影响神经元的存活。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vs.control，
#
p《0.05，
##
p《0.01，
###
p《0.001vs.glutamate。
[0084]
综上所述，竹柏乙酸乙酯部位提取物的效果是最好的，而正丁醇和石油醚提取物小剂量(100μg/ml以下)也有助于神经元的存活，当加大剂量至250μg/ml以上时就对神经元具有毒性作用，水提取物对神经元无作用。
[0085]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。