一种抗原检测产品及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于医疗用品领域，具体涉及一种抗原检测产品及其制备方法和应用。


背景技术：

2.抗原检测在食品、医药等多个领域中均具有广泛的应用前景。抗原检测的第一步为取样，而取样的质量也直接关系到检测的效果。以检测人类传染病为例，待测样品可选为口咽拭子、鼻拭子、唾液、尿液和血液等。这些样本中都存在大量各类生物分子，其中最丰富的是蛋白质。如果能有效选择并鉴定到特征蛋白质，则能快速完成检测。因此，抗原检测中最普遍的方法就是用针对特征蛋白质的特异性抗体对样本进行检测，并可进一步进行定量分析。
3.以新型冠状病毒（以下简称“新冠病毒”）的抗原检测试剂盒为例。当前市场上存在多种新冠病毒抗原检测试剂盒，多针对新冠病毒的核蛋白（n蛋白）进行。目前，基于胶体金技术的新冠病毒抗原检测试剂盒应用最为广泛。以cn112162092a、cn114167056a、cn112666350b等为例，其反应过程为：滴加受试样本后，样品中包括的抗原与标记垫上的特异性标记抗体结合，再进一步流经硝酸纤维膜，通过硝酸纤维膜检测带上固定的捕获抗体（在一些文献中又称包被抗体）富集胶体金，根据检测带是否产生颜色变化来判断样品中是否存在抗原。通常硝酸纤维膜上还设置一条质控带，用于试剂质控，即判断试剂是否失效。
4.目前这类产品均只有一条用于排除试剂故障的质控线，普遍存在一个巨大缺陷：无论取样质量如何，无论测试样本是否真实包含待测样本，只要试剂未变质，质控线上都能显色（显阳性）。而在实践中，由于测试量大、取样量极大，很容易出现取样质量低甚至取样失败的情况，比如鼻拭子取样时，棉签探入鼻腔深度不够、受试者鼻腔较干燥、取样时间不够，甚至使用者有意逃避检测等，都可能导致取样失败，从而出现假阴性。
5.另外还有使用荧光微球标记技术、乳胶标记技术等的抗原试剂检测盒，虽然检测原理、过程有所差异，但也都存在相同问题：无法对取样质量进行控制，从而无法避免检测“假阴性”的问题。在取样和检测基数较大的情况下，即使只有1
‰
的取样误差，检测出现误差的绝对值也会非常大。
6.因此，亟需一种可有效避免“假阴性”的抗原检测方法及产品。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种抗原检测产品及其制备方法和应用。
8.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种抗原检测方法，所述待测样品为人体来源，所述检测方法包括：检测待测样品取样是否合格的质检步骤；所述质检步骤包括：利用待测样品所含细胞相关的蛋白质的对应抗体，检测待测样品中是否存在人体来源物；所述待测样品所含细胞相关的蛋白质为以下三类蛋白质中的任意一种：（1）分泌出细胞的且与抗菌功能相关的蛋白质；（2）存在于细胞内、可以稳定表达且必需的结构蛋
白；（3）维持细胞基本生命活动所必需的且稳定表达的蛋白质。
9.相应的，一种抗原检测产品，所述检测产品中包括：所述待测样品来自人体，所述检测产品中同时包括：用于检测待测样品是否合格的标记抗体与捕获抗体、用于检测待检测抗原的标记抗体与捕获抗体；所述用于检测待测样品是否合格的标记抗体和捕获抗体为待测样品所含细胞相关的以下三类蛋白质中的任意一种的对应抗体：（1）分泌出细胞的且与抗菌功能相关的蛋白质；（2）存在于细胞内、可以稳定表达且必需的结构蛋白；（3）维持细胞基本生命活动所必需的且稳定表达的蛋白质。
10.优选的，所述检测产品中同时包括：用于检测待测样品是否合格的标记抗体与捕获抗体、用于检测待检测抗原的标记抗体与捕获抗体、用于所述用于检测待检测抗原的标记抗体的质量控制的抗体。
11.优选的，所述分泌出细胞的且与抗菌功能相关的蛋白质包括：粘液蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶、鼻上皮癌关联蛋白。
12.优选的，所述粘液蛋白包括：muc-5ac；所述乳铁蛋白包括：lactoferrin；所述免疫球蛋白包括：iga、igg；所述溶菌酶包括：lysozyme；所述鼻上皮癌关联蛋白包括：plunc。
13.优选的，所述存在于细胞内、可以稳定表达且必需的结构蛋白包括：肌动蛋白、组蛋白、微管蛋白。
14.优选的，所述肌动蛋白包括：γ-actin 、β-actin；所述组蛋白包括：histone h1, histone h2a、histone h2b、histone h4；所述微管蛋白包括：tubulin。
15.优选的，所述维持细胞基本生命活动所必需的且稳定表达的蛋白质包括：甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乙醛脱氢酶、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶、丙酮酸激酶。
16.优选的，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶为gapdh；所述乙醛脱氢酶为aldh1a1、aldh2、aldh3a1；所述次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶为hprt1；所述丙酮酸激酶为pkm。
17.优选的，所述抗原检测产品为检测试剂、检测试纸、检测试剂盒或检测试剂卡片；当所述抗原检测产品为检测试剂盒时，所述检测试剂盒上同时包括：检测线和样品质控线。
18.本发明具有以下有益效果：本发明首创式地为抗原检测产品增加了一条新的质控带：样品质控带。从而有效解决了当前抗原快速检测试剂盒缺乏对样本质量控制的问题，从而避免了假阴性的检测结果。
19.以人体来源的样品为例，本发明还提供了与人体来源的样品质控高度相关的三类人体来源的蛋白质，并进一步提供了这三类蛋白质中效果优异（特异性强且表达量稳定）的几类蛋白质，可以通过这三类蛋白质对应抗体检测人体来源的样品是否存在且达到一定含量（可被检出的含量），从而实现样品质控，具有巨大且广泛的应用前景。
20.本发明虽以新冠病毒的抗原检测为例，但也可以运用在所有的、尤其是涉及到使用人体来源的样本的任何抗原检测试剂中，包括但不限于其它病毒（例如流感，禽流感等）的检测、细菌的检测、慢性疾病的检测等。
附图说明
21.图1为本发明提供的两线式试剂盒结构示意图；
图2为本发明提供的三线式试剂盒结构示意图；图3为两线试剂盒检测结果为阳性时的显色示意图；图4为两线试剂盒检测结果为阴性时的显色示意图；图5为两线试剂盒检测结果无效时的显色示意图；图6为三线试剂盒检测结果为阳性时的显色示意图；图7为三线试剂盒检测结果为阴性时的显色示意图；图8为三线试剂盒检测结果为取样不合格时的显色示意图；图9为三线试剂盒检测结果为试剂不合格时的显色示意图。
具体实施方式
22.本发明提供了一种提高抗原检测准确率和有效性的方法，具体为在检测中增加待测样品取样是否合格的质检步骤/操作/环节。具体到产品上，则为在检测产品（例如检测试剂、检测试纸、检测试剂盒、检测试剂卡片等）中额外添加待测样品本身的质检试剂，优选的方案为：添加待测样品对应的标记抗体与捕获抗体。
23.其中一种实施方式为：所述检测产品中同时包括：用于检测待测样品取样质量的标记抗体（以下称“第一抗体”）与捕获抗体（以下简称“样品捕获抗体”）、用于检测待检测抗原的标记抗体（以下称“第二抗体”）与抗原捕获抗体。优选的方案为：所述检测产品中还包括用于第二抗体质量控制的抗体（以下称“第三抗体”）。当所述待检测样品为人体来源时，第一抗体与捕获抗体对应的靶蛋白均为人体来源。
24.所述标记抗体（第一抗体、第二抗体）可以采用胶体金或乳胶等标记，也可以采用荧光分子来标记，为本领域现有技术。本领域技术人员可以根据待测抗原及实际需要进行常规选择设置。
25.上述实施方式的检测产品具体为试剂盒（或检测试剂卡片）时，所述试剂盒中同时包括：标记抗体垫、硝酸纤维膜（nc膜，用于样品捕获抗体、抗原捕获抗体和第三抗体(如有)的固定与显色）、样本垫、吸样垫、用于封装的检测卡框架材料，以及制备试剂盒的其他所必需的业内常规材料。所述第一抗体、第二抗体均设置在所述标记抗体垫上。
26.所述第一抗体、第二抗体可以同为胶体金标记，也可以同为乳胶标记，也可以部分为胶体金，部分为乳胶标记，本领域技术人员可以根据实际需要进行常规选择。优选的方案为：第一、第二抗体以及样品捕获抗体，抗原捕获抗体均为单克隆抗体，例如，为鼠或兔来源的单克隆抗体等。
27.一种实施方式下，所述试剂盒用途为对人类样品进行抗原检测，人体样品优选于来自人体鼻腔。这种实施方式下，所述第一抗体和样品捕获抗体对应靶蛋白均为人体来源，且优选为对应以下三类存在于鼻腔上皮细胞内的蛋白的对应抗体之一：（1）分泌出细胞的且与抗菌功能相关的蛋白质，例如粘液蛋白、lysozyme(溶菌酶)、lactoferrin（乳铁蛋白）、plunc(鼻上皮癌关联蛋白)、免疫球蛋白如iga、igg等。（2）存在于细胞内、可以稳定表达且必需的结构蛋白，例如actin(肌动蛋白)、histone(组蛋白)、tubulin(微管蛋白)等。（3）维持细胞基本生命活动所必需的代谢相关的且稳定表达的酶类蛋白质等，例如gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、aldh1a1(乙醛脱氢酶1a1)、hprt1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)、pkm(丙酮酸激酶)、ubc(泛素)等。后文将上述三类蛋白统称为人类来源样品的取样及预处理质
控品（qrosho，quality reference of sampling and preprocessing for samples of human origin）。需要说明的是：全文所称抗体，均指免疫球蛋白（ig）。免疫球蛋白也具有其独特的抗原性，当第一抗体对应靶蛋白（qrosho）为来源于人体的（尤其是存在于鼻腔中的）免疫球蛋白时，则第一抗体和捕获抗体为免疫球蛋白的对应抗体，即“抗抗体”。例如，当第一抗体对应蛋白选择为免疫球蛋白igg时，则第一抗体为anti-igg。
28.所述试剂盒的具体制备方法按本领域常规、成熟的现有技术进行即可。当不包含第三抗体时，所述试剂盒（以下称“两线式试剂盒”）的结构示意图如图1所示，当包含第三抗体时，所述试剂盒（以下称“三线式试剂盒”）的结构示意图如图2所示。所述试剂盒包括长条状的硝酸纤维膜，所述硝酸纤维膜一端设置样品垫，用于滴加待测样品，所述样品垫材质可选为玻璃纤维。所述样品垫与硝酸纤维膜中间设置金标垫，金标垫一端位于样品垫下方，另一端伸出样品垫。所述硝酸纤维膜另一端设置吸样垫，使滴加到样品垫上的样品沿着硝酸纤维膜的长条横向方向逐渐被吸向吸样垫方向。所述吸样垫材质可选为纸滤纸。所述硝酸纤维膜中间，从样品垫到吸样垫方向，依次设置检测带（t线，对应第二抗体）、样品质控带（c线，对应第一抗体）和试剂质控带（r线，对应第三抗体，当设置第三抗体时，则设置此质控带）。
29.对于两线式试剂盒：如两条线均显色，则受试样品为阳性（即认为检测出待测抗原），如图3所示；如只有c线显色，则受试样品为阴性（即认为没有检测出待测抗原），如图4所示；如c线未显色，则检测无效（即认为受试样品有问题或第二抗体有问题），如图5所示。
30.对于三线式试剂盒：如三条线均显色，则受试样品为阳性（即认为检测出待测抗原），如图6所示；如c线、r线显色，t线不显色，则受试样品为阴性（即认为没有检测出待测抗原），如图7所示；如只有r线显色，则检测无效（取样不合格，需重新取样检测），如图8所示；如r线不显色，则检测无效（第二抗体有问题），如图9所示。
31.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
32.实施例一：试剂盒的制备1、待测样品、抗原和各抗体的准备：待测样品：选择提纯的来自哺乳动物细胞表达的新型冠状病毒n蛋白为标准品，同时选择10个非感染人体（男女各半，年龄为20～50岁之间）的鼻拭子。
33.待检测抗原来自哺乳动物细胞表达的新型冠状病毒n抗原（来自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，货号：dra91）。
34.以下用于样本质量控制的第一抗体及捕获抗体、用于检测的第二抗体及捕获抗体均为鼠单克隆抗体，样品均购自北京义翘神州科技股份有限公司、赛默飞世尔科技中国有限公司或艾博抗（上海）贸易有限公司。其中，第一抗体及捕获抗体分别为质控蛋白的各对应抗体，质控蛋白均为人体来源，所测试质控蛋白包括：乳铁蛋白（lactoferrin）、溶菌酶、粘液蛋白（mucin 5）、iga、白介素-1β（il-1β）、tnf-α(肿瘤坏死因子α)、histone h4、histone h2a、 histone h2b、肌动蛋白（β-actin）、tubulin、pkm、integrin-α2(整合素α2)、claudin-1(紧密连接封闭蛋白-1)、rps24(核糖体蛋白s24)、eif4h(翻译起始因子4h)、甘油
醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）、hprt1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)、polr2b(rna聚合酶ii)、stat2（信号转导与转录激活因子2）等的各对应抗体。第二抗体及捕获抗体为新型冠状病毒n蛋白的对应抗体。第三抗体（如果设置）的设置目的为对第二抗体进行质控，为来自艾博抗（上海）贸易有限公司的艾博抗ab6708，是羊抗鼠多克隆抗体，igg。
35.2、金标垫的准备：（1）制备胶体金溶液：取0.02%（w/v）氯金酸水溶液,柠檬酸三钠溶液(10% w/v)至终浓度为0.2%(w/v)，混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却。
36.（2）制备抗体金标液：取步骤（1）制备的胶体金溶液1ml，用na0h溶液或hcl调节ph值至7.2～7.6（本实施例中设置为7.5），再分别加入20～30μg（本实施例中统一为25μg）上述各蛋白对应的第一抗体或第二抗体充分混匀，再加入50～100μl 10%(w/v)的牛血清白蛋白（bsa）混匀（本实施例中统一为75μl）。静置2～3小时（本实施例中统一为2小时）。加入50～100μl 10%(w/v)的peg2000混匀（本实施例中统一为75μl）。
37.（3）抗体金标液纯化：将步骤（2）制备的抗体金标液离心后弃去上清，加入含有金标复溶液溶解，即得纯化的抗体金标液。所述金标复溶液组分包括：50mm tris、0.5% pvp(w/v)、0.1% triton x-100(w/v)、0.5% bsa (w/v)、2.0% 蔗糖(w/v)。纯化后的抗体金标液中，第一抗体或第二抗体的浓度为10～30
µ
g/ml（本实施例中统一为20
µ
g/ml）。
38.（4）制备金标垫：准备20
×
30cm的玻璃纤维，在喷膜仪上按照60μl/cm2的量，使用步骤（3）制备的纯化后的第二抗体的金标液对玻璃纤维进行喷金。喷金后，在冷冻干燥机中干燥1.5～2h（本实施例中统一为2h）。然后用各第一抗体的金标液对玻璃纤维进行喷金，在冷冻干燥机中干燥2h，最后在铝箔袋中，用真空封装机封口，放置在常温下保存。
39.3、硝酸纤维膜的准备：（1）各包被液的准备：准备抗原检测线（t线）包被液，所述包被液成分包括：终浓度为10mm的磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4、0.1% bsa(w/v)）。在所述包被液中加入抗原捕获抗体（终浓度为0.5～1mg/ml，本实施例中统一为1mg/ml），充分混匀。
40.准备样品质控线（c线）包被液，成分包括：终浓度为10mm的磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4、0.1% bsa(w/v)）。在所述包被液中加入上述各质控蛋白对应的样品捕获抗体（终浓度为0.5～1mg/ml，本实施例中统一为1mg/ml），充分混匀。
41.准备试剂质控线（r线）包被液，其制备方法如下：终浓度为10mm的磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4、0.1% bsa(w/v)）。在所述包被液中加入第三抗体（终浓度为0.5～1mg/ml，本实施例中统一为0.5mg/ml），充分混匀。
42.（2）将所述硝酸纤维膜放在喷金划膜仪上。将所述抗原检测线（t线）包被液、样品质控线（c线）包被液和试剂质控线（r线）包被液在硝酸纤维素膜上按1μl/mm进行划线。两线式试剂盒只进行t线和c线的包被液划线，三线式试剂盒同时包括三种包被液的划线。
43.将划好线的硝酸纤维膜放置在37℃烘箱中2～2.5h烘干。干燥后放入铝箔袋中，用真空封装机封口，常温下保存。
44.4、样品垫的准备：样品垫为玻璃纤维膜，样本垫处理液（含10mm tris、20mm酪蛋白钠盐、0.5% tween-20(v/v）浸泡过夜。
45.5、试剂盒的组装：按具体实施方式和图1、2的结构示意图，根据本领域常规技术进
行组装即可。
46.实施例二：试剂盒的效果展示1、对新型冠状病毒n蛋白（标准品）的检测效果展示。利用稀释液（50mm tris-hcl、150mm nacl、50mm arginine, ph=7.2），将标准品稀释为20ng/ml的样品液。分别滴加1滴样品液到实施例一制备的含各不同第一抗体的试剂盒中，结果如表1所示。需要说明的是：本实施例中，各操作均分别在各两线式试剂盒和三线式试剂盒中进行10次重复试验；为便于阐述、避免冗长，后续均只展示在各两线式试剂盒中的测试效果。
47.表1 对新型冠状病毒n蛋白（标准品）的检测效果对照表结果表明：各第一抗体均不会影响新型冠状病毒n蛋白的检测，且各第一抗体均可被检出。
48.2、选择10个非感染人体（男女各半，年龄为20～50岁之间）的鼻拭子，分别加入0.3ml的样品抽提液中（10mm pbs，0.5% triton x-100，2mm edta，0.05% sds），并加入新冠病毒n蛋白（终浓度为20ng/ml）制备成标准阳性样品液，分别滴加3滴上述标准阳性样品液到实施例一制备的含各不同第一抗体的试剂盒中，结果如表2所示。
49.表2 对标准阳性样品液检测效果对照表结果显示：以上所测试的多类蛋白例如分泌出细胞外的细胞因子，如il-1β、tnf-α等，上皮细胞中所含的细胞膜蛋白如integrin-α2、claudin-1等，参与细胞中翻译机制的核糖体蛋白rps24、eif4h等，以及参与细胞转录调节的rna聚合酶polr2b、stat2等均未能覆盖所有测试样品,因此不适合作为抗原检测中的样品质量参照。而本发明要求保护的三类蛋白即（1）分泌出细胞的且与抗菌功能相关的蛋白质，例如粘液蛋白、lactoferrin（乳铁蛋
白）、免疫球蛋白如iga等；（2）存在于细胞内、可以稳定表达且必需的结构蛋白，例actin(肌动蛋白)、histone(组蛋白)、tubulin(微管蛋白)等；（3）维持细胞基本生命活动所必需的代谢相关的酶类蛋白质等，例如gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、hprt1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)、pkm(丙酮酸激酶)等均得到完全的检出，且不影响n蛋白的检出。因此，这些蛋白均可作为有效的样品质量参照。
50.3、选择第一抗体对应蛋白为lactoferrin，测试合适的捕获抗体浓度。其他操作与实施例一的方法均完全相同，只是控制样品捕获抗体的终浓度分别为0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml。分别使用步骤1的样品液进行检测，结果如表3所示。
51.表3 不同浓度的样品捕获抗体检测效果对照表从表3可以看出，0.5～2mg/ml的终浓度，均可发挥作用。发明人同时以多个蛋白质对应的样品捕获抗体进行了不同终浓度的相同实验，综合考虑，建议实践中选择容错率更高的1mg/ml的终浓度。
52.4、选择10个正常人体（男女各半，年龄为20～50岁之间），分别进行正确鼻拭子取样、不正确鼻拭子取样（鼻拭子取样质量取决于多种因素，为保持试验的一致性，本实施例的不正确鼻拭子取样方法统一为：取样棉签不贴鼻内壁，仅深入鼻孔1cm左右，不做擦拭立即取出）。同时将步骤1的样品抽提液及n蛋白样品与正确鼻拭子取样的混合液（终浓度为20ng/ml）作为对照。分别滴加3滴样品液到实施例一制备的含各不同第一抗体的试剂盒中，结果如表4所示。表4中的市售试剂盒分别来自于芯超生物、东方基因、万孚生物、艾康生物的产品（截止于专利申请日）。需要说明的是：因各不同第一抗体的试剂盒中，抗原检测线（t线）的显色结果一致，所以表4中统一列出各试剂盒的t线显色结果；因各市售试剂盒对各样品的t线和c线显色结果相同，所以表4中只展现了一组结果，未逐一展示。
53.表4 对不同鼻拭子的检测效果对照表结果显示：现有市售试剂盒无法区分样品是否使用了鼻拭子或鼻拭子取样不合格，其c线只能对试剂质量进行控制。而本发明提供的试剂盒能很好判断样品是否合格，从而有效避免了假阴性结果。
54.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。