一种基于表面增强拉曼光谱技术的急性胰腺炎评估装置的制作方法

1.本发明属于胰腺疾病诊断和拉曼光谱检测领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术的急性胰腺炎评估装置。


背景技术：

2.急性胰腺炎(acute pancreatitis,ap)是多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应，以疾病进展迅速，重症患者死亡率高为特征，是消化及重症领域亟待解决的难题。急性胰腺炎因危重程度不同，预后差异大。轻者以胰腺水肿为主，病情常呈自限性，预后良好，为轻症急性胰腺炎(mild acute pancreatitis，map)；重者表现为胰腺出血坏死，伴多器官功能障碍，且常继发感染，病死率高，为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，sap)。sap是典型的急症，病情凶险，进展迅速，患者通常在数天内即可从临床表现相对轻微的症状发展至全身性炎性反应综合症及多器官功能衰竭。统计数据显示，发病1-2周内伴持续性器官功能衰竭的sap患者，死亡风险可达42％～46％。因此，及时对急性胰腺炎(ap)病情及严重程度进行判断，尤其是早期识别重症患者并采取针对性的治疗措施，是降低重症患者死亡率的重要环节。
3.目前，在ap诊疗中，临床医生多根据患者临床表现，并结合实验室及影像检查结果，诊断ap及评估严重程度。ap的诊断主要包括：患者典型症状及查体表现(剧烈而持续的腹痛、腹部压痛及腹膜炎体征)、实验室生化检测(脂肪酶、淀粉酶升高)、影像学特征表现(胰腺水肿/坏死，或胰腺周围渗出积液)；而危重度评估主要依靠传统评分系统。但目前这些评分系统便捷性和时效性尚不理想，其在临床诊疗中的应用未能获得满意的效果，究其原因主要为：(1)大多数评分系统包含的评价指标较多，操作繁琐：例如常见的ranson评分系统由11项临床和生化指标构成，包含2项临床指标(年龄和体液丢失或隔离)和9项实验室指标(白细胞计数，血糖，乳酸脱氢酶，门冬氨酸氨基转移酶，血清钙，红细胞压积下降，尿素氮增加，动脉氧分压，碱丢失)。急性生理与慢性健康评分(acute physiology and chronic health evaluation，apache评分)系统由年龄、急性生理学评分和慢性健康状况评分三部分构成。尽管apacheⅱ在原apache系统的基础上已有所简化，但仍包含了12项评价指标，过程繁琐，使用不便。(2)时效性较差：实验室检测指标及影像学结果的获取通常需要1-2天。而常见危重度评分系统因评价指标较多，在临床工作早期有限的时间内，难以收集齐全评分系统纳入的大量实验室指标。例如ranson系统中就有6项指标需待发病48小时后才能完成评估。而sap的病情和严重程度会在短时间内快速变化，临床医生对于病情走向的前瞻判断，及时把握治疗时机，予以准确干预，对于sap的有效治疗至关重要。因此，目前的评分系统难以满足sap临床需求，临床医生需及时评估ap严重程度，做出正确临床决策及治疗方案，挽救患者生命。
4.针对目前临床常用评估体系及检测方式在便捷性和时效性方面的不足，迫切需要寻求一种操作更为简单、快速的检测手段对ap严重程度作及时评估，以此指导临床采取更有效的治疗措施，改善sap预后，降低死亡率。
5.拉曼光谱(raman spectroscopy)是一种散射光谱，可通过激光照射引起分子键振动产生对应的指纹光谱，从而对检测物进行快速的定性及定量分析(图1)。因其基于光技术检测原理，以光子为探针，具有检测速度快、无损伤的优点，通常可在数秒内获得拉曼指纹图谱，它可以通过识别样品分子的指纹峰进行物质的检测。普通拉曼的散射信号较弱，当检测一些痕量分子时，就需要使用表面增强拉曼散射技术对拉曼信号进行增强。表面增强拉曼光谱(surface-enhanced raman spectroscopy，sers)在普通拉曼光谱的基础上添加了表面粗糙的贵金属(通常为金或者银)微纳米结构或颗粒，在激发区域内，样品表面或近表面的电磁场的增强可使样本分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射信号增强百万倍(图2)。基于sers检测技术高效、简便、精度高、稳定性强的优势，近年来其在生物医学检测领域的应用引起了临床医务人员及科研工作者的广泛关注，如通过检测患者尿液、血液或腹水等体液识别循环肿瘤细胞、microrna、外泌体、病原微生物等。但sers在不同疾病中应用的技术细节变化大，如不同疾病血样适用的sers检测方法及基底材料不同，不同疾病血样的前期样本处理及后续数据分析方法也不尽相同。
6.ap作为急性炎症，与肿瘤等慢性疾病不同，其发病过程中机体炎性反应剧烈，疾病进展迅速，机体本身及血液样本具有一定的特殊性。目前还没有将sers技术应用于急性胰腺炎诊断或危重度评估的报道，相关技术细节也尚未有公布。


技术实现要素：

7.本发明要解决的问题是：提供一种基于表面增强拉曼光谱技术的急性胰腺炎评估装置；所述的评估不仅包括对急性胰腺炎的识别，更重要的是对重症急性胰腺炎的识别。
8.本发明的技术方案如下：
9.一种基于表面增强拉曼光谱技术的急性胰腺炎评估装置，它包括样品预处理模块、sers检测模块、数据处理模块、结果输出模块；
10.所述样品是加入抗凝剂的全血、血浆及血清中任意一种；
11.所述样品预处理模块用于所述样品预处理模块用于稀释和干燥样品，使其更易于与基底结合，结果更稳定；
12.所述sers检测模块用于检测样品的表面增强拉曼光谱，获得拉曼光谱指纹图谱数据；
13.数据处理模块内置数据输入端口、图谱预处理算法和机器学习模型；
14.所述数据输入端口，用于接收sers检测模块所采集的数据；
15.所述图谱预处理算法，是对拉曼光谱指纹图谱数据进行降噪处理的方法；
16.所述结果输出模块以文字、图像和/或声音的方式输出数据处理结果。
17.进一步地，所述机器学习模型包括对有、无急性胰腺炎进行二分类的机器学习模型和/或对轻症急性胰腺炎和重症急性胰腺炎进行二分类的机器学习模型。
18.进一步地，所述样品预处理模块对样品稀释的倍数为2～5倍；优选地，所述样品稀释倍数为2倍。
19.sers对生物样本的检测法有多种方式，有些是将样本滴注于基底检测片表面进行光谱检测，有些是将样本与金属纳米颗粒相混合后再进行光谱检测。两者各有优缺点，对于ap血样的sers检测来讲，采用金属纳米基底片的方法检测效果更优，混合金属纳米颗粒的
方法易产生较多杂峰，不利于后续分析。
20.进一步地，所述降噪处理是使用pca和/或lda多元统计判别算法对拉曼光谱指纹图谱的数据进行降噪处理，得特征峰数据。
21.进一步地，所述机器学习模型是支持向量机模型。
22.直接以不经处理的血清为样品进行检测，所得指纹图谱效果差，甚至无法读取有效的指纹图谱，不能对重症和轻症进行有效区分。发明人通过研究发现，通过稀释血清2～5倍，可使血清与基底结合更紧密，检测结果更稳定、有效。
23.本发明还提供表面增强拉曼光谱检测装置用于制造上述急性胰腺炎评估装置的用途，所述急性胰腺炎评估，是评估检测对象有无急性胰腺炎，和/或，对轻、重症急性胰腺炎进行区分。
24.进一步地，所述装置以加入抗凝剂的全血、血浆或血清中任意一种为检测样品。
25.优选地，所述装置包括样品预处理模块，该模块用于稀释和干燥样品；
26.优选地，需对样品进行稀释，样品稀释倍数为2～5倍；进一步优选地，稀释倍数为2倍。
27.进一步地，所述表面增强拉曼光谱检测装置工作时设置的参数如下：
28.激发光波长532nm、633nm或785nm，波长扫描范围400-1800cm-1
；
29.优选地，激发光波长为785nm。
30.进一步地，所述急性胰腺炎评估装置内置了图谱预处理算法；
31.所述图谱预处理算法，是对拉曼光谱指纹图谱数据进行降噪处理的方法；
32.优选地，所述降噪处理是使用pca和/或lda多元统计判别算法对拉曼光谱指纹图谱的数据进行降噪处理，得特征峰数据。
33.进一步地，所述急性胰腺炎评估装置内置了机器学习模型；
34.所述机器学习模型包括对有、无急性胰腺炎进行二分类的机器学习模型和/或对轻症急性胰腺炎和重症急性胰腺炎进行二分类的机器学习模型；优选地，所述机器学习模型是支持向量机模型。
35.本发明的有益效果在于：
36.1)可快速获取结果并实现即时检测。
37.本发明可在数分钟内完成检测，得到急性胰腺炎诊断及危重度初步评估结果，同时可做到即时检测；而目前常用的方法涉及多项检测指标，且有的指标需要等待较长时间才能获取结果。sap是典型的急症，其病程和严重程度会在短时间内急剧变化，在等待ranson、apacheⅱ等目前常用方法的评估结果时，往往会导致患者出现病情加重、干预不及时等问题，本发明可避免这样的问题，实现快速检测及实时监测。
38.具体对比如下表：
39.表1检测方法复杂程度及耗时对比
[0040][0041]
2)操作便捷。
[0042]
本发明仅需取血，进行单个项目检测，非专业人员经简单培训即可掌握；而现有的方法需要检测多个项目(例如ranson和apacheⅱ评分涉及十余个生理、生化及健康状况评估指标)，检测工作量繁重复杂，对人员及设备专业性要求高。ranson和apacheⅱ需获取的信息及检测指标如下：
[0043]
表2ranson评分表
[0044][0045]
表3危重病人apacheⅱ评分表
[0046][0047]
3)准确率高。
[0048]
在对ap轻、重症患者的区分上，目前常用的ranson评分系统的总敏感度和特异度分别为57％-85％和68％-85％，apacheⅱ的敏感度为81％，特异度为65.7％；而本发明的敏感度约84.6％，特异度约75.0％，高于apacheⅱ，与rnason相当。随着机器学习的样本量增大，本发明的急性胰腺炎评估装置的敏感度和特异度会进一步提高。
[0049]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0050]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0051]
图1：拉曼散射光基本原理。当激光照射到样品上时，入射光会被样本散射，绝大部分散射光的频率(波长)与入射光波长相同的成分(瑞利散射)，但是有少量的散射光改变了波长，这就是拉曼散射。
[0052]
图2：sers的电磁增强原理。当入射光作用于金属纳米颗粒时，光电场会诱导粒子内的自由电子在电力作用下发生周期性振荡，当入射光频率与粒子内的固有自由电子振荡频率相同时，则发生表面等离基元共振，导致入射光场的增强。
[0053]
图3：本装置检测所获取的sers指纹光谱。
[0054]
图4：健康对照与ap患者sers指纹光谱特征峰；
[0055]
图5：健康对照与ap患者分类散点图；c，健康对照，d，ap患者；直线y＝0上判定为ap患者，直线y＝0下判定为健康对照。
[0056]
图6：健康对照与ap患者分类的roc曲线。
[0057]
图7：map与sap患者分类散点图。
[0058]
图8：map与sap患者分类的roc曲线。
具体实施方式
[0059]
实施例1应用本发明的装置区分正常健康对照与ap患者
[0060]
1.方法
[0061]
对25例正常健康对照和50例ap患者抽取外周血，分离血清，-80℃冻存。待所有样本收集完全后，冰上解冻，将稀释2倍(2～5倍均可)后的血清20μl滴加于预先制备好的拉曼检测基底片(检测基底采用与cn202010613921.0中相同的方法制备得到)，烘箱干燥1小时。于ihr550型号拉曼光谱检测仪检测，获取sers指纹光谱。
[0062]
sers光谱检测的相关参数：
[0063]
激发光：785nm波长；波长扫描范围400-1800cm-1
，激光功率3.5mw。为消除不同位置的信号差异，每个样本在不同位置测试5次，对信号去背景并取平均值。
[0064]
结合pca多元统计判别算法对指纹光谱进行降噪处理(图3)，获得健康对照与ap患者的光谱平均值，筛选得到特征峰(图4)，随机选择一半数据进行svm向量机算法进行机器学习(训练)，再将训练所得模型对另一半数据进行预测。
[0065]
2.结果
[0066]
如图5所示，左侧椭圆内为训练结果，右侧为预测结果,红色虚线(y＝0所示曲线)下为预测健康，线上预测胰腺炎，可见对ap和对照的分类十分准确。
[0067]
图6为ap预测对应的roc分析结果，可见曲线下面积(auc)约0.915，敏感度约为88.2％，特异度和精确度为100％，准确度约为92.3％。
[0068]
本实验例的结果说明：稀释2倍的血清通过sers检测后，先用pca多元统计判别算法进行降噪处理，再用svm向量机算法进行是否患有ap的训练，可得到准确的ap诊断模型，用于区分ap患者和健康人群。
[0069]
实施例2应用本发明的装置对ap的危重程度进行区分
[0070]
1.方法
[0071]
对25例ap轻症(map)患者及25例ap重症(sap)患者抽取外周血，分离血清，-80℃冻存。待所有样本收集完全后，冰上解冻，将稀释2倍(2～5倍均可)后的血清20μl滴加于预先制备好的拉曼检测基底片，烘箱干燥1小时。于ihr550型号拉曼光谱检测仪检测，获取sers指纹光谱。
[0072]
拉曼光谱检测的相关参数：
[0073]
激发光：785nm波长；波长扫描范围400-1800cm-1
，激光功率3.5mw。为消除不同位置的信号差异，每个样本在不同位置测试5次，对信号去背景并取平均值。
[0074]
结合pca多元统计判别算法对指纹光谱进行降噪处理，获得map和sap的光谱平均
值，筛选得到特征峰，随机选择一半数据进行svm向量机算法进行机器学习(训练)，再将训练所得模型对另一半数据进行预测。
[0075]
map的标准：无局部或全身并发症，无器官功能衰竭，在1～2周内恢复。
[0076]
sap的标准：伴有持续的器官功能衰竭(持续48h以上)，可累及一个或多个脏器。
[0077]
2.结果
[0078]
如图7所示，左侧椭圆内为训练结果，右侧为预测结果,红色虚线(y＝0所示曲线)上为轻症(map)，线下为重症(sap)。
[0079]
图8为ap轻、重症对应的roc分析结果，可见曲线下面积(auc)约为0.885，敏感度约84.6％，特异度约75.0％，精确度约91.6％，准确度约82.3％。本实施例用于机器学习的样本量较低，随着机器学习的样本量的增加，可以预见其敏感度、特异度、精确度和准确度会进一步提高。
[0080]
本实验例的结果说明：稀释2倍的血清通过sers检测后，先用pca多元统计判别算法进行降噪处理，再用svm向量机算法进行ap轻、重症的区分训练，可得到准确的ap轻重症评估模型，用于区分ap轻、重症患者。
[0081]
综上，本发明基于表面增强拉曼光谱技术的急性胰腺炎评估装置可快速、准确地对是否患有急性胰腺炎进行诊断，并能对急性胰腺炎患者的危重程度(轻症、重症)进行有效区分、评估，应用前景良好。