一种具有多细胞器依次成像和光动力治疗功能的荧光诊疗探针及其应用

1.本发明属于医用材料的技术领域，涉及一种荧光诊疗探针，具体涉及一种用具有多细胞器依次成像和光动力治疗功能的荧光诊疗探针及其应用。


背景技术：

2.在真核细胞中，线粒体、溶酶体、内质网和脂滴等细胞器是细胞的基本单元。每个细胞器都有其独特的功能，通过细胞器间的协同相互作用，调节并维持细胞的正常生理活动。任何一个细胞器的功能出现障碍或被破坏，都将诱导细胞死亡，因而，以细胞器作为治疗靶点的多种功能材料在抗肿瘤中发挥着越来越重要的作用，其中光动力疗法凭借其非侵入性、低毒性和靶向性强等优良特性，在肿瘤治疗领域日益引起广泛关注。
3.目前，荧光探针已被广泛用于生物医学成像领域，不断帮助人类破解未知的生命密码。近年来，随着各种荧光诊疗探针和超分辨成像技术的发展，使得荧光探针能够有效地用于肿瘤细胞内的细胞器和信号分子的实时追踪以及用于制备抗肿瘤产品。荧光诊疗探针是一类具有荧光成像和光动力治疗功能的分子体系，通过荧光成像介导光动力的治疗过程，有效提高了光动力治疗的时空分辨率。影响其光动力治疗效果的因素有很多，主要包括：探针的浓度及靶向位点、光源功率和氧气浓度等。其中，探针的设计尤为重要，其本身没有毒性，但在特定波长的光激发和氧气浓度下，可诱导其产生高活性的单线态氧(1o2)以及羟基自由基(
·
oh)、超氧阴离子自由基(o2·-)和过氧化氢(h2o2)等自由基，从而诱导肿瘤细胞发生不可逆氧化损伤，进而导致其自噬或凋亡。然而，传统的荧光探针大多数基于单细胞器靶向的应用，存在时空分辨率不可控和利用率低等问题，从而使得光动力诊疗效果低于预期值，限制了其在肿瘤治疗中的进一步应用。此外，利用多个细胞器靶向探针组合的协同光动力治疗，尽管可显著增强光动力治疗效果。但是该策略却仍具有合成步骤复杂、多个诊疗探针进入细胞的速率不均一及肿瘤细胞的多药耐药性增加等问题，不利于进一步的临床应用研究。因此，开发一种能够实现多个细胞器的依次成像并用于肿瘤的光动力治疗的荧光诊疗探针具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种具有多细胞器依次成像和肿瘤光动力治疗功能的多细胞器靶向荧光诊疗探针。在光照条件下，本发明的探针中部分探针发生光氧化脱氢反应生成三苯胺噻吩乙烯基取代的二氢吡啶中间体分子和吡啶鎓盐衍生物。在此过程中，光照前的四氢吡啶基团具有弱酸性响应，能够特异性染色溶酶体；随着光照时间的增加，四氢吡啶基团发生光氧化脱氢反应，生成亲脂性更高的二氢吡啶中间体分子能够特异性染色脂滴；最后生成的终产物为三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶盐衍生物，能够特异性染色线粒体，实现线粒体荧光成像，因而在光激活过程中实现对多个细胞器的依次成像。结合光激活前后的四氢吡啶衍生物和吡啶鎓盐产物均具有良好的光动
力活性，能够对多个细胞器成像破坏，进而杀灭肿瘤细胞。
5.本发明的另一目的在于提供上述的荧光诊疗探针的应用。所述多细胞器靶向荧光诊疗探针在溶酶体、脂滴和线粒体中荧光成像的应用，通过芳构化驱动的光氧化脱氢反应实现溶酶体、脂滴和线粒体的双色成像。所述荧光诊疗探针还可以用于动物肿瘤模型中黑色素瘤的光动力治疗的产品。本发明的荧光诊疗探针可用于多细胞器成像介导的光动力治疗产品，可有效提高光动力治疗效率和治疗的时空分辨率。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.一种具有多细胞器依次成像和光动力治疗功能的荧光诊疗探针，其结构为式i：
[0008][0009]
其中，r1、r2、r3、r4为独立的氢。
[0010]
r5为烷基、-亚烷基酯基(通式为：-r-coo-r
′
，r为亚烷基，r
′
为烷基)、亚烷基铵盐基(通式为：-r-n(r
′
)3x
′
，r为亚烷基，r
′
为烷基，x
′
为阴离子)。
[0011]
r5中所述烷基优选为c
1-10
烷基，更优选为c
1-5
烷基。
[0012]-亚烷基酯基、亚烷基铵盐基中亚烷基各自为c
1-10
亚烷基，优选为直链亚烷基；烷基为c
1-10
烷基，优选为c
1-5
烷基。
[0013]
所述亚烷基铵盐基，亚烷基铵盐基结构式：-r-n(r
′
)3x，r为亚烷基，r
′
为烷基，x为阴离子，其中r
′
优选c
1-5
烷基，如：甲基，阴离子为卤素，如：溴离子。
[0014]
所述多细胞器依次成像是指溶酶体、脂滴和线粒体中依次成像，且通过光激活实现多细胞器依次成像。
[0015]
所述荧光诊疗探针的制备方法，包括以下步骤：在有机溶剂中，将式ii化合物通过还原剂还原，得到荧光诊疗探针。
[0016]
所述还原剂为硼氢化钠。所述有机溶剂为乙腈或甲醇中一种以上。
[0017]
所述式ⅱ化合物与还原剂的摩尔比为1：(5～15)。
[0018]
式ii化合物为三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物，结构为
[0019][0020]
r1、r2、r3、r4、r5如式i的荧光诊疗探针所定义；x为一价阴离子。所述一价阴离子为碘离子、氯离子、溴离子、氢氧根离子、硝酸根离子、醋酸根离子、有机羧酸根离子。
[0021]
式ii中，x-为一价阴离子，如：i-、cl-、br-、oh-等。
[0022]
荧光诊疗探针制备的反应方程式：
[0023][0024]
一种利用上述荧光诊疗探针制备线粒体荧光成像剂的方法，包括以下步骤：将上述光激活荧光探针在光照和有氧的条件下进行脱氢反应，获得线粒体荧光成像剂。
[0025]
所述光照为蓝光或488nm激光。光照的强度为1-20mw/cm2。
[0026]
所述线粒体荧光成像剂为式ii：
[0027][0028]
所述反应在介质中进行，所述介质是指在光照氧化脱氢时，能够提供一价阴离子的介质。所述一价阴离子为氯离子、溴离子、氢氧根离子、硝酸根离子、醋酸根离子、有机羧酸根离子。如：介质为细胞提供的环境，又或者介质为含有非极性或弱极性物质的环境。
[0029]
式ii中，x
ˉ
为介质提供的一价阴离子，如：cl-、br-、oh-等。
[0030]
式ⅰ的三苯胺噻吩乙烯基取代的四氢吡啶衍生物在发生光氧化脱氢反应后会生成式ii的三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物，反应方程式：
[0031][0032]
所述多细胞器靶向荧光诊疗探针(具有多细胞器依次成像和光动力治疗功能的荧光诊疗探针)在溶酶体、脂滴与线粒体依次荧光成像中的应用，通过光氧化脱氢实现溶酶体、脂滴和线粒体的双色成像。发生光氧化脱氢反应的条件为光照和有氧，光源为蓝光或488nm激光。光照的强度为1-20mw/cm2。
[0033]
所述多细胞器靶向荧光诊疗探针用于制备动物肿瘤模型中黑色素瘤的光动力治疗产品。所述荧光诊疗探针在弱酸性微环境中具有良好的发光行为和脂滴内极性环境中发射波长具有较大程度的蓝移。
[0034]
本发明的探针在制备光激活抗肿瘤产品中的应用。所述光激活抗肿瘤产品为通过光照实现溶酶体、脂滴与线粒体依次荧光成像以及光动力治疗肿瘤的抗肿瘤产品。
[0035]
一种利用芳构化驱动的光氧化脱氢反应机制构建的多细胞器靶向荧光诊疗探针实现细胞内溶酶体、脂滴与线粒体依次成像的方法，包括以下步骤：将细胞与探针孵育，光照，实现溶酶体、脂滴和线粒体双色成像以及溶酶体、脂滴和线粒体依次成像。光源为蓝光
或488nm激光。光照的强度为1-20mw/cm2。
[0036]
本发明的探针为具有溶酶体、脂滴和线粒体依次荧光成像功能的探针，通过四氢吡啶光响应基团实现光照条件下的溶酶体、脂滴和线粒体特异性荧光成像的探针。本发明的探针还为光动力治疗肿瘤和杀灭肿瘤细胞的探针。
[0037]
本发明的探针在未光照前时，细胞中溶酶体内的荧光强度较强，光照过程中，探针发生光氧化脱氢反应，产生亲脂性更高的二氢吡啶中间体分子快速进入脂滴中，该二氢吡啶中间体分子在脂滴中能够稳定存在，且荧光强度增强和发射波长蓝移，同时光照后的光氧化脱氢产物能够实现线粒体特异性荧光成像，因此，本技术的荧光诊疗探针具有溶酶体、脂滴和线粒体依次荧光成像功能。在光照下，本发明的荧光诊疗探针发生光氧化脱氢反应经二氢吡啶中间体分子生成三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶盐衍生物，本发明的荧光诊疗探针和三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶盐衍生物发射光谱几乎没有重叠，因此，本发明的探针在溶酶体、脂滴中荧光成像和三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶盐衍生物在线粒体中荧光成像为双色荧光成像。
[0038]
本发明的多细胞器靶向荧光诊疗探针用于动物肿瘤模型中黑色素瘤的光动力治疗。
[0039]
所述多细胞器靶向荧光诊疗探针可用于多个细胞器的依次成像和破坏，有效提高肿瘤细胞的杀灭效率。本发明的荧光诊疗探针在蓝光照射下可快速高效结构转变，先生成发光蓝移的二氢吡啶中间体产物，接着生成发光显著红移的产物，且无毒副产物生成；将具有多细胞器依次成像功能的荧光诊疗探针应用于细胞中，并在有氧的条件下进行光照，利用其光动力活性诱导细胞凋亡，实现溶酶体、脂滴和线粒体的依次荧光点亮成像和破坏，并在多个细胞器成像介导下用于肿瘤的光动力治疗产品。
[0040]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0041]
1、本发明的多细胞器靶向荧光诊疗探针可用于溶酶体、脂滴与线粒体的依次荧光成像。本发明的多细胞器靶向荧光诊疗探针在光照条件下发生分子共轭结构、亲疏水性和所带电荷变化，选择性地染色溶酶体、脂滴和线粒体，与其它现有的荧光成像探针相比，具有更高的时空分辨率。
[0042]
2、本发明的多细胞器靶向荧光诊疗探针能够在光照下实现对溶酶体、脂滴和线粒体的依次荧光成像和破坏，进而有效提高肿瘤细胞的杀伤效率和肿瘤生长的抑制。该方法简便、避免了多种荧光诊疗探针的加入时进入细胞速率不均一及荧光成成像时不同染料发射光谱间的串扰。
附图说明
[0043]
图1为化合物i-1在光照下实现溶酶体、脂滴和线粒体依次成像及其成像机理的示意图；
[0044]
图2为化合物i-1的核磁氢谱和碳谱图；左图为氢谱图，右图为碳谱图；
[0045]
图3为化合物i-1的高分辨质谱结果图；
[0046]
图4为化合物
ⅰ‑
1光物理性质的表征；(a)化合物
ⅰ‑
1在dmso和磷酸盐缓冲溶液中的紫外吸收光谱图及其荧光发射光谱图(20μm)；(b)化合物
ⅰ‑
1在不同1,4-二氧六环含量的荧光发射光谱图，激发波长为400nm；(c)化合物
ⅰ‑
1在不同1,4-二氧六环含量溶液中最大发射
波长和在475nm处最大荧光强度的变化谱图；(d)荧光发射光谱图及(e)最大发射波长和荧光强度随ph升高时变化的谱图(20μm)，激发波长为400nm；(f)化合物i-1的lumo和homo能级示意图；
[0047]
图5为化合物i-1光激活过程的表征；(a)化合物i-1在磷酸盐缓冲溶液中随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间变化的紫外吸收光谱图(20μm)；(b)化合物i-1在牛血清白蛋白溶液中随光照(20mw/cm2)时间变化的荧光发射光谱图(20μm)，激发波长为400nm；(c)化合物i-1在牛血清白蛋白溶液中随光照(20mw/cm2)时间变化的荧光发射光谱图(20μm)，激发波长为485nm；(d)化合物i-1在磷酸盐缓冲溶液中的400nm和485nm处吸收强度随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间的比值变化图；(e)化合物i-1在牛血清白蛋白溶液中的471nm处荧光发射强度随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间的比值变化图，激发波长为400nm；(f)化合物i-1在牛血清白蛋白溶液中的580nm处荧光发射强度随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间的比值变化图，激发波长为485nm；
[0048]
图6为化合物i-1染色的a375黑色素瘤细胞的光激活荧光照片(绿光通道：化合物
ⅰ‑
1；红光通道：化合物i-1光氧化脱氢反应生成的化合物ii-1(红绿荧光强度的变化谱图由各自合并图像中白色带箭头的线得出)；光源为手持蓝光灯(λ＝450nm,20mw/cm2)；
[0049]
图7为化合物i-1用于细胞荧光成像及其与lysotracker red、mitotracker deep red和nile red共定位的结果；(a)化合物i-1(10μm)染色的a375黑色素瘤细胞的荧光照片，且与lysotracker red的共定位结果；(b)化合物i-1(10μm)染色的a375黑色素瘤细胞的荧光照片，且与mitotracker deep red的共定位结果；(c)化合物i-1(10μm)染色的a375黑色素瘤细胞的荧光照片，且光照(λ＝450nm,20mw/cm2)处理前与nile red的共定位结果；(d)化合物i-1(10μm)染色的a375黑色素瘤细胞的荧光照片，且光照(λ＝450nm,20mw/cm2)处理5分钟后与nile red的共定位结果；
[0050]
图8为化合物i-1染色染色脂滴的机制探究；(a)化合物
ⅰ‑
1在5％dmso甲醇溶液中的不同光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间(120min和150min)后对应荷质比的质谱图；(b)化合物
ⅰ‑
1光激活过程发生结构转变的可能机制；
[0051]
图9为化合物i-1的光动力活性评价；(a)化合物i-1(10μm)在含有活性氧指示剂dcfh(10μm)的磷酸盐缓冲溶液中的λ
ex
＝488nm，λ
em
＝525nm处的荧光强度变化谱图；(b)化合物i-1(10μm)在含有单线态氧指示剂abda(50μm)的磷酸盐缓冲溶液中在380nm处吸光值的变化谱图；(c)dcfh-da(10μm)检测化合物
ⅰ‑
1(10μm)处理后的a375黑色素瘤细胞内产生的活性氧，488nm(1％)的激光器；
[0052]
图10为化合物i-1在有无光照(λ＝450nm,20mw/cm2)条件下的细胞毒性结果；
[0053]
图11为化合物i-1染色的a375黑色素瘤细胞随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间变化的荧光照片及细胞凋亡试剂盒annexin/pi的染色结果；
[0054]
图12为化合物i-1在不同光照条件处理a375后的wb和qrt-pcr的检测结果；(a)化合物i-1在不同光照条件处理后相关促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达(p53，bcl-2，bax，caspase-3)的定性分析及(b)定量分析；(c、d、e、f)分别为化合物i-1在不同光照条件处理后相关促凋亡基因和抗凋亡基因表达(bax，p53，caspase-3，bcl-2)的定量分析；
[0055]
图13为化合物i-1在瘤内注射后光照(λ＝450nm,20mw/cm2)前后的红绿色荧光通道的变化；(a)化合物
ⅰ‑
1在体内的光氧化脱氢转变；(b)化合物
ⅰ‑
1的瘤内驻留能力；
[0056]
图14中(a)为裸鼠体内肿瘤体积指数随时间的变化图；(b)化合物
ⅰ‑
1治疗14天的肿瘤体积变化曲线及(c)肿瘤照片；(d)为肿瘤切片的苏木素-伊红(h&e)、ki67和caspase-3染色图；
[0057]
图15中(a)为心肝脾肺肾的苏木素-伊红染色图；(b、c、d、e)分别为裸鼠血液中的尿素氮，总蛋白、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的血生化指标图。
具体实施方式
[0058]
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0059]
实施例1
[0060]
化合物i-1的制备：
[0061]
称取化合物
ⅱ‑
1(116.5mg,0.2mmol)于50ml的两口圆底烧瓶中，向反应瓶中加入10ml乙腈使固体完全溶解；称取硼氢化钠(75.6mg,2mmol)并用2ml的甲醇将其溶解后加入上述反应液中；在氮气氛围下避光室温搅拌2小时；待反应完成后，将反应液减压蒸馏浓缩获得粗产物；在粗产物中加入10ml超纯水，超声，过滤得到淡黄色固体产物(化合物i-1)，并将此沉淀真空干燥，产率为44％。
[0062]
化合物i-1的结构为
[0063][0064]
化合物ii-1的结构为
[0065][0066]
产物化学结构表征数据如下：
[0067]1h nmr(400mhz,dmso-d6):7.52(d,j＝8.8hz,2h),7.35-7.25(m,5h),7.12-6.98(m,6h),6.94(d,j＝8.7hz,2h),6.67-6.52(m,2h),5.85(s,1h),2.94(s,2h),2.46(s,2h),2.26(s,2h),2.22(s,3h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):147.31,141.75,133.62,130.57,128.06,126.72,124.75,123.90,123.54,119.75,55.16,51.51,45.94,40.64,40.43,40.22,40.01,39.80,39.60,39.38,25.51.esi-hrms(m/z):calcd.for(c
30h28
n2s):448.2046；found,449.2055.
[0068]
图2为化合物i-1的核磁氢谱和碳谱图；左图为氢谱图，右图为碳谱图；图3为化合物i-1的高分辨质谱结果图。
[0069]
图1为化合物i-1在光照下实现溶酶体、脂滴和线粒体依次成像及其成像机理的示意图。利用芳构化驱动的光氧化脱氢反应机制，化合物
ⅰ‑
1在低功率光照射下可快速实现从化合物
ⅰ‑
1四氢吡啶前体经二氢吡啶中间体向化合物
ⅱ‑
1吡啶鎓盐的结构转变，通过分子
共轭结构、亲疏水性和所带电荷的变化，依次实现对溶酶体、脂滴和线粒体的靶向成像。同时，光氧化脱氢反应前后的四氢吡啶前体和吡啶鎓盐产物均具有优异的光动力活性，可依次协同破坏溶酶体、脂滴和线粒体三种细胞器，有效提高肿瘤细胞的精准杀灭效率，可实现体内肿瘤的光动力治疗效果。结果表明，基于化合物
ⅰ‑
1的多细胞器靶向光动力治疗技术手段，可有效杀灭肿瘤细胞并抑制肿瘤的生长。
[0070]
实施例2
[0071]
化合物i-1和化合物ii-1光物理性质的表征，如表1所示：
[0072]
表1化合物i-1和化合物ii-1在不同溶剂中光物理性质的表征
[0073][0074]
图4为化合物
ⅰ‑
1光物理性质的表征；(a)化合物
ⅰ‑
1在dmso和磷酸盐缓冲溶液中的紫外吸收光谱图及其荧光发射光谱图(20μm)；(b)化合物
ⅰ‑
1在不同1,4-二氧六环含量的荧光发射光谱图，激发波长为400nm；(c)化合物
ⅰ‑
1在不同1,4-二氧六环含量溶液中最大发射波长和在475nm处最大荧光强度的变化谱图；(d)荧光发射光谱图及(e)最大发射波长和荧光强度随ph升高时变化的谱图(20μm)，激发波长为400nm；(f)化合物i-1的lumo和homo能级示意图；
[0075]
如图4中a所示，化合物i-1(20μm)在在dmso和磷酸盐缓冲液的混合溶液中的最大吸收波长为400nm，最大发射波长为485nm，斯托克斯位移为85nm。图4中b和c所示，随着1,4-二氧六环含量的上升(0％
→
99％)，即极性逐渐减小，化合物
ⅰ‑
1发射峰的强度逐渐增强(强度增加至～92倍)且最大发射波长由517nm蓝移至446nm，表明化合物
ⅰ‑
1表现出分子内电荷转移(ict)性质，图4中f的理论计算的结果验证了化合物
ⅰ‑
1为扭转的分子内电荷转移(tict)性质。图4中d和e所示，在ph＝2时，化合物
ⅰ‑
1在526nm处具有最强的荧光发射，当ph从酸性变为碱性时，荧光强度急剧下降。通过chemdraw模拟计算，化合物
ⅰ‑
1的pka为9.232，接近溶酶体内的ph环境(ph＝4.5-6.0)，在弱酸性环境中更有利于化合物
ⅰ‑
1的质子化，从而促进其光光氧化脱氢反应过程。综上，化合物
ⅰ‑
1因其tict性质而具有极性响应能力，在与脂滴极性最接近的1,4-二氧六环溶液中发光强度较亮，从而具有对脂滴荧光成像的潜力；同时，化合物
ⅰ‑
1具有ph响应特性，在与溶酶体ph较接近的酸性环境中具有较强的荧光发射，能够对细胞内溶酶体进行荧光成像。
[0076]
实施例3
[0077]
化合物i-1光激活过程的表征：
[0078]
图5为化合物i-1光激活过程的表征；(a)化合物i-1在磷酸盐缓冲溶液中随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间变化的紫外吸收光谱图(20μm)；(b)化合物i-1在牛血清白蛋白溶液中随光照(20mw/cm2)时间变化的荧光发射光谱图(20μm)，激发波长为400nm；(c)化合物
i-1在牛血清白蛋白溶液中随光照(20mw/cm2)时间变化的荧光发射光谱图(20μm)，激发波长为485nm；(d)化合物i-1在磷酸盐缓冲溶液中的400nm和485nm处吸收强度随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间的比值变化图；(e)化合物i-1在牛血清白蛋白溶液中的471nm处荧光发射强度随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间的比值变化图，激发波长为400nm；(f)化合物i-1在牛血清白蛋白溶液中的580nm处荧光发射强度随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间的比值变化图，激发波长为485nm。
[0079]
如图5中a和d所示，在蓝光(λ＝450nm,20mw/cm2)的持续光照下，磷酸盐缓冲溶液中的化合物i-1(20μm)在400nm处的吸收强度逐渐减小，而在485nm处的吸收强度逐渐增强，表明溶液中化合物
ⅰ‑
1的量逐渐减少，化合物ii-1的量逐渐增多，即化合物i-1在蓝光光照下生成了化合物ii-1。
[0080]
如图5中b和e所示，在蓝光(λ＝450nm,20mw/cm2)的持续光照下，牛血清白蛋白(1mg/ml)溶液中的化合物i-1(20μm)在471nm处荧光发射强度逐渐降低，表明溶液中化合物i-1的量逐渐减少。如图5中c和f所示，溶液中在580nm处荧光发射强度逐渐升高，表明溶液中化合物ii-1的量逐渐增多。
[0081]
实施例4
[0082]
化合物i-1的细胞荧光成像结果：
[0083]
图6为化合物i-1染色的a375黑色素瘤细胞的光激活荧光照片(绿光通道：化合物
ⅰ‑
1；红光通道：化合物i-1光氧化脱氢反应生成的化合物ii-1(红绿荧光强度的变化谱图由各自合并图像中白色带箭头的线得出)；光源为手持蓝光灯(λ＝450nm,20mw/cm2)；
[0084]
如图6所示，化合物i-1染色a375黑色素瘤细胞后，在化合物i-1所对应的绿色荧光通道中能够观察到绿色荧光信号，表明化合物i-1能够进入并染色细胞。在手持蓝灯照射10分钟后，目标产物化合物
ⅱ‑
1所对应的红色荧光通道中可以观察到明显的红色荧光信号，表明化合物i-1能够在活细胞内发生光氧化脱氢反应并生成相应的吡啶盐产物化合物
ⅱ‑
1。
[0085]
实施例5
[0086]
化合物i-1在光照过程中对多个细胞器依次成像：
[0087]
图7为化合物i-1用于细胞荧光成像及其与lysotracker red、mitotracker deep red和nile red共定位的结果；(a)化合物i-1(10μm)染色的a375黑色素瘤细胞的荧光照片，且与lysotracker red的共定位结果；(b)化合物i-1(10μm)染色的a375黑色素瘤细胞的荧光照片，且与mitotracker deep red的共定位结果；(c)化合物i-1(10μm)染色的a375黑色素瘤细胞的荧光照片，且光照(λ＝450nm,20mw/cm2)处理前与nile red的共定位结果；(d)化合物i-1(10μm)染色的a375黑色素瘤细胞的荧光照片，且光照(λ＝450nm,20mw/cm2)处理5分钟后与nile red的共定位结果。
[0088]
图7中a所示，用化合物i-1(10μm)处理a375细胞40分钟后，在共聚焦荧光显微镜下对其进行观察。化合物i-1(10μm)的绿色荧光与lysotracker red的红色荧光(伪彩)可以很好地重叠在一起，通过image j计算得皮尔逊相关系数为0.88，表明化合物i-1进入细胞后，光氧化脱氢反应前优先在溶酶体中积累。图7中b所示，未进行光氧化脱氢反应的化合物i-1的绿色荧光与mitotracker deep red的红色荧光(伪彩)并没有重合在一起，计算其皮尔逊共定位系数为0.73，表明化合物i-1并不特异性靶向线粒体；而且在图6中，红色荧光通道中
的荧光信号推测来自光氧化脱氢产物化合物
ⅱ‑
1。可以看出，化合物i-1在光照前可实现对溶酶体的荧光成像，并能在光照后对线粒体成像。图7中c所示，化合物i-1处理a375细胞后的明场视野中观察到a375细胞内含有较多脂滴，同时，化合物i-1的绿色荧光与尼罗红的红色荧光(伪彩)在部分脂滴内有很好地重叠，通过image j计算得皮尔逊相关系数为0.87，表明化合物i-1在未光照前已有部分亲脂性的二氢吡啶中间体分子进入脂滴并具有较强的荧光信号。图7中d所示为光照后对脂滴成像，发现溶酶体内的绿色荧光变弱，而脂滴内的绿色荧光逐渐增强，皮尔逊相关系数为0.92，表明光氧化脱氢过程中又有部分化合物i-1转化为二氢吡啶中间体进入脂滴，因而表现出脂滴内绿色点状荧光逐渐增强的现象。
[0089]
实施例6
[0090]
化合物
ⅰ‑
1在光照过程中染色脂滴行为机制的探究：
[0091]
图8为化合物i-1染色染色脂滴的机制探究；(a)化合物
ⅰ‑
1在5％dmso甲醇溶液中的不同光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间(120min和150min)后对应荷质比的质谱图；(b)化合物
ⅰ‑
1光激活过程发生结构转变的可能机制。图8的a中每一排有三幅图，从左至右分别为化合物
ⅱ‑
1(m/z＝445)，二氢吡啶中间体(m/z＝447)，化合物
ⅰ‑
1(m/z＝448)对应的质谱图。
[0092]
如图8中a所示，溶液态不同光照时间的样品在蓝光照射120分钟和150分钟时，在质谱图中观察到较强的二氢吡啶中间体(m/z＝447)的强峰，表明在光照的过程中，部分化合物
ⅰ‑
1发生光氧化脱氢反应时仅脱去一个氢原子，生成瞬时存在的二氢吡啶中间体。经chemdraw模拟计算，化合物
ⅰ‑
1(m/z＝448)、二氢吡啶中间体(m/z＝447)和化合物
ⅱ‑
1(m/z＝445)的水油分配系数clogp分别为7.63、9.38和3.85，化合物
ⅰ‑
1在光氧化脱氢过程中会产生亲脂性更高的二氢吡啶中间体分子，从而看到脂滴内的绿色荧光信号在光氧化脱氢过程中变得更亮，这种染色脂滴的行为与其各自的clogp相一致。因此推断得出如图8(b)的反应机制，表明化合物
ⅰ‑
1在光氧化脱氢时染色脂滴是因为四氢吡啶脱氢反应过程中生成了亲脂性更高的二氢吡啶中间体。
[0093]
实施例7
[0094]
化合物i-1在溶液态和细胞内的光动力活性评价：
[0095]
图9为化合物i-1的光动力活性评价；(a)化合物i-1(10μm)在含有活性氧指示剂dcfh(厂家为sigma-aldrich)(10μm)的磷酸盐缓冲溶液中随光照时间在λ
ex
＝488nm，λ
em
＝525nm处荧光强度比值变化的谱图(光照后荧光强度与光照前荧光强度的比值)；(b)化合物i-1(10μm)在含有单线态氧指示剂abda(厂家为sigma-aldrich)(50μm)的磷酸盐缓冲溶液中随光照时间在380nm处吸光强度比值(光照后吸光值与光照前吸光值的比值)的变化谱图；(c)dcfh-da(厂家为碧云天)(10μm)检测化合物
ⅰ‑
1(10μm)处理后的a375黑色素瘤细胞内产生的活性氧，488nm(1％)的激光器经过不同扫描次数。
[0096]
图9中a所示，溶液中化合物i-1在蓝光照射下可以产生活性氧，因此，被氧化的dcfh指示剂在525nm处荧光强度值逐渐增加，在蓝光照射时间为3分钟时，荧光强度增加了三十多倍；图9中b所示，利用abda指示剂检测光照过程中产生的单线态氧，发现化合物i-1在蓝光照射时，产生的单线态氧能够有效消耗abda，使得abda的吸光值随着光照时间的增加不断下降。验证溶液态中的化合物i-1在蓝光照射下能够产生活性氧和单线态氧后，为利用其光动力产生的活性氧诱导肿瘤细胞凋亡，使用细胞内活性氧检测试剂盒dcfh-da考察了化合物i-1在细胞内产生活性氧的情况。图9中c所示，在488nm激光(功率为2％)扫描下，
化合物i-1 dcfh-da组处理的a375细胞内绿色荧光信号明显高于单独的dcfh-da组，说明化合物i-1在光照时产生的活性氧可显著氧化dcfh-da指示剂，使细胞内的绿色荧光信号更强。
[0097]
实施例8
[0098]
化合物
ⅰ‑
1的细胞毒性和光动力诱导a375黑色素瘤细胞凋亡及机制分析：
[0099]
图10为化合物i-1在有无光照(λ＝450nm,20mw/cm2)条件下的细胞毒性结果。
[0100]
图11为化合物i-1染色的a375黑色素瘤细胞随光照(λ＝450nm,20mw/cm2)时间变化的荧光照片及细胞凋亡试剂盒annexin/pi的染色结果。
[0101]
图12为化合物i-1在不同光照条件处理a375后的wb和qrt-pcr的检测结果；(a)化合物i-1在不同光照条件处理后相关促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达的定性分析及(b)定量分析；(c-f)分别为化合物i-1在不同光照条件处理后相关促凋亡基因和抗凋亡基因表达的定量分析。
[0102]
图10所示，化合物i-1在蓝光(λ＝450nm，20mw/cm2)的光照下能够将a375细胞的存活率降至10％，且细胞存活率表现出浓度依赖性。对比黑暗组，化合物i-1在光照下能够有效降低肿瘤细胞的存活率，表明化合物i-1在光照下产生的活性氧能够有效杀灭肿瘤细胞。
[0103]
如图11所示，在光照条件下，随着光照时间的延长，细胞膜上的绿色荧光逐渐增强，主要是由于annexin
ⅴ‑
fitc能够染色早期凋亡细胞中的磷脂酰丝氨酸蛋白，表明此时细胞正在发生凋亡过程。蓝光照射10分钟后，可以明显地观察到细胞核内的红色荧光逐渐增强，这是由于化合物i-1光动力产生的活性氧逐渐破坏细胞膜，造成细胞膜渗透性增加，pi穿过细胞膜进入细胞核，细胞逐渐死亡。结果表明，在光照射下，化合物i-1处理后诱导细胞死亡的途径是凋亡。
[0104]
图12为化合物i-1在不同条件处理细胞后，对相关促凋亡蛋白和基因及抗凋亡蛋白和基因表达情况的分析。图12(a)所示，western blotting分析证实促凋亡蛋白p53、bax和caspase-3在化合物
ⅰ‑
1(光照)和化合物
ⅱ‑
1(光照)组中显著表达，而抗凋亡相关蛋白bcl-2表达则显著下降。其它处理组与对照组相比，各凋亡相关蛋白表达的条带粗细基本一致。图12(b)所示，进一步通过半定量法评价各组凋亡相关蛋白的表达量，表明化合物
ⅰ‑
1在光照下能够促进促凋亡相关蛋白和抑制抗凋亡相关蛋白的表达，该结果与化合物
ⅱ‑
1在光照处理后的结果一致。如图12(c-f)所示qrt-pcr结果，在药物处理24小时后，化合物
ⅰ‑
1(光照)组的促凋亡基因(bax、p53和caspase-3)表达显著升高，且高于其它对照组；而抗凋亡基因bcl-2表达显著降低。说明化合物
ⅰ‑
1在蓝光照射下能产生较多的活性氧和单线态氧，从而上调促凋亡基因并抑制凋亡基因的表达，进一步诱导肿瘤细胞的凋亡。wb和qrt-pcr的结果表明，化合物
ⅰ‑
1在光照条件下诱导细胞凋亡，是通过上调促凋亡相关蛋白和基因的表达，同时抑制抗凋亡相关蛋白和基因的表达来实现。
[0105]
实施例9
[0106]
验证化合物
ⅰ‑
1在小鼠肿瘤部位的光照结构转变和在肿瘤部位的驻留能力：
[0107]
图13为化合物i-1在瘤内注射后光照(λ＝450nm,20mw/cm2)前后的红绿色荧光通道的变化；(a)化合物
ⅰ‑
1在体内的光氧化脱氢转变；(b)化合物
ⅰ‑
1的瘤内驻留能力。
[0108]
图13(a)所示，在瘤内注射thttpy(合物i-1)后，荷瘤裸鼠肿瘤部位的绿色荧光通道内均发现绿色荧光信号，而红色荧光通道内的红色荧光信号则较弱。在蓝光照射10分钟
后，发现化合物i-1的绿色荧光信号几乎完全转变为红色荧光信号，这一现象与溶液态及细胞内的红绿荧光转变结果相一致，表明化合物i-1在裸鼠体内可以实现光氧化脱氢结构转变；图13(b)所示，在6小时后，将这些裸鼠处死并解剖得到肿瘤和主要器官，主要器官包括心、肝、脾、肺、肾和小肠上，均未发现化合物
ⅰ‑
1的绿色荧光信号或化合物
ⅱ‑
1的红色荧光信号，仅在肿瘤部位有红绿色荧光信号，表明短时间内
ⅱ‑
1在肿瘤部位具有较好的驻留能力，且不会在正常器官内富集。
[0109]
实施例10
[0110]
通过动物肿瘤模型实验评估其抑制肿瘤生长的治疗潜力和生物相容性评价：
[0111]
图14中(a)为裸鼠体内肿瘤体积指数随时间的变化图；(b)化合物
ⅰ‑
1治疗14天的肿瘤体积变化曲线及(c)肿瘤照片；(d)为肿瘤切片的苏木素-伊红(h&e)、ki67和caspase-3染色图。
[0112]
图15为(a)为心肝脾肺肾的苏木素-伊红染色图；(b、c、d、e)分别为裸鼠血液中的尿素氮，总蛋白、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的血生化指标图。
[0113]
图14中a所示，经过14天的治疗，各组裸鼠在持续的体重监测过程中几乎未发生显著变化，且与对照组无明显差别，说明化合物
ⅰ‑
1和化合物
ⅱ‑
1在体内的暗毒性较小，不会影响裸鼠的正常生理活动；图14中b所示，荷瘤裸鼠经过14天治疗后，与空白组和对照组相比，化合物
ⅰ‑
1(光照)组裸鼠的肿瘤生长受到明显地抑制，甚至比阳性对照组化合物
ⅱ‑
1(光照)组的抑制作用还要好；图14中c和d所示，经过14天治疗后对各组剥离的肿瘤尺寸进行拍照对比和切片染色(h&e、ki67和caspase-3)结果表明，进一步证明化合物
ⅰ‑
1(光照)组能够显著抑制肿瘤的生长。
[0114]
图15中a所示，与对照组相比，化合物
ⅰ‑
1治疗的裸鼠，其主要器官的h&e染色结果没有明显的炎症区域或者损伤，表明化合物
ⅰ‑
1有良好的生物相容性。图15中b、c、d、e所示，实验结束后也对各组小鼠的血液进行了血生化指标分析，包括血尿素氮、总蛋白、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸转氨酶，化合物
ⅰ‑
1(光照)组和对照组的血生化指标是类似的，说明化合物
ⅰ‑
1具有良好的生物安全性。
[0115]
本发明构建了一种具有溶酶体、脂滴和线粒体依次成像多细胞器靶向荧光诊疗探针并将其用于制备肿瘤的协同光动力治疗的产品。以三苯胺噻吩-π-四氢吡啶为光响应基团，成功构建了多细胞器靶向荧光诊疗探针i-1。该探针在光氧化脱氢过程中，可快速实现从四氢吡啶前体化合物
ⅰ‑
1向吡啶鎓盐化合物
ⅱ‑
1的结构转变，通过分子共轭结构、亲疏水性和所带电荷的变化，依次实现对溶酶体、脂滴和线粒体的靶向成像。同时可以利用其光照前后化合物
ⅰ‑
1和目标产物
ⅱ‑
1的光动力活性依次破坏多个细胞器，从而有效诱导细胞凋亡。最后将化合物
ⅰ‑
1用于黑色素瘤裸鼠模型的光动力治疗产品。结果表明多细胞器靶向的光动力治疗，可有效杀灭肿瘤细胞并抑制肿瘤的生长。
[0116]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。