一种提高水牛夏季同期发情-定时输精效果的处理方法

1.本发明属于畜牧业水牛繁殖技术领域，具体涉及一种提高水牛夏季同期发情-定时输精效果的处理方法。


背景技术：

2.水牛属于季节性繁殖家畜，主要分布于热带和亚热带地区，其繁殖性能容易受到环境和气候的影响。其在非繁殖季节繁殖性能较低，尤其是夏季，主要原因是夏天的热应激导致安静发情，发情排卵不规律，假发情，发情鉴定比较难，很难把握排卵时间，或发情持续时间比较长，产后乏情期长，产犊间隔较长，很难预算排卵时间，因此很难掌握适时输精的时机，致使配种受胎率较低，性成熟的时间比较晚、发情持续的时间较长，可达4-64h(campanile et al.，2010，perera，2011)；发情症状不明显，发情检测相对较难，有较高的卵泡闭锁率和较低的受胎率(30-40％)(singh et al.1984，barkawi et al.1993，de rensis et al.2005)。夏季热应激是影响泌乳牛繁殖率低下的重要因素，它能够抑制卵泡的发育(guzeloglu et al.，2001)、颗粒细胞的功能(yu et al.，2017)、类固醇的合成(roth et al.，2001)、卵母细胞的品质(al-katanani et al.，2002；ferreira et al.，2011)。有研究表明，排卵卵泡直径小或排出不成熟的卵泡可能会降低牛的受胎率和增加胚胎死亡率(vasconcelos et al.，2001；)。
3.此外，夏季热应激会引起水牛发情，排卵，配种受胎率低，抑制卵泡的发育，采食量下降，产奶量下降，食欲降低，导致机体能量供需不平衡，产后能量供需不平衡状态会直接影响繁殖性能。
4.夏季水牛产奶量和配种受胎率更低，主要是夏季热应激泌乳水牛繁殖率低，抑制卵泡的发育，不发情，安静发情，卵泡囊肿和卵巢囊肿率高，产后乏情期长，产犊间隔较长，产后子宫和卵巢机能恢复比较慢，发情持续时间比较长，很难预算排卵时间，因此，如何能提高水牛受配率和受胎率，进而提高繁殖率、加快品种改良具有非常重要的意义。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高水牛夏季同期发情-定时输精效果的处理方法。
6.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
7.一种提高水牛夏季同期发情-定时输精效果的处理方法，该处理方法为对经产水牛在同期发情处理前两天即产后第48天注射褪黑素后，再进行同情发情-定时输精。
8.如上所述的处理方法，优选地，所述经产水牛为产后50天的水牛，所述褪黑素按每一头一次性皮下注射18mg/50kg体重。(平均一头牛体重500kg计算180mg褪黑素用少量75％乙醇溶液溶解，用生理盐水稀释到5ml)
9.如上所述的处理方法，优选地，所述同情发情-定时输精包括如下步骤：
10.s1、向健康的处于发情周期的母水牛肌肉注射促性腺素释放激素，这一天记为水
牛同期发情处理的第0天；
11.s2、水牛同期发情处理后的第7天，肌肉注射氯前列醇钠；
12.s3、水牛同期发情处理后的第9天，第二次注射促性腺素释放激素，同时注射米非司酮以促进排卵；
13.s4、水牛同期发情处理后的第10天，即注射米非司酮后的24小时，实施人工输精；
14.s5、水牛同期发情处理后的第15天，肌肉注射人绒毛膜促性腺激素；
15.s6、水牛同期发情处理后的第45天，用b超确定牛只妊娠情况。
16.如上所述的处理方法，优选地，在步骤s1中，促性腺素释放激素按400μg/头进行。
17.如上所述的处理方法，优选地，在步骤s2中，氯前列醇钠按0.5mg/头进行。
18.如上所述的处理方法，优选地，在步骤s3中，促性腺素释放激素按400μg/头进行，米非司酮按0.4mg/kg体重进行。
19.如上所述的处理方法，优选地，在步骤s5中，人绒毛膜促性腺激素按2000iu/头进行。
20.褪黑素在提高水牛夏季发情，排卵，配种受胎率，促进卵泡发育，增加卵泡发育速率，降低卵泡囊肿率及降低奶中体细胞数的应用。
21.如上所述的应用，优选地，所述褪黑素在同期发情处理之前的前两天，也就是产后第48天，选择产后奶水牛按每一头一次性皮下注射褪黑素18mg/50kg体重，其中将分娩当天记为0天，在产后第50天即记为奶牛同期发情处理第0天，下午肌肉注射促性腺素释放激素，第7天下午肌肉注射氯前列醇钠，第9天下午第二次肌肉注射促性腺素释放激素，同时注射米非司酮，第10天也就是注射米非司酮注射后24个小时，进行人工输精，第15天(即人工输精后第5天)对接受配种的牛只肌肉注射人绒毛膜促性腺激素hcg，第45天(即人工输精后第35天)用b超确定牛只妊娠情况。
22.如上所述的应用，优选地，促性腺素释放激素gnrh的注射剂量为400μg/头；米非司酮按0.4mg/kg体重进行；注射米非司酮后24小时，实施人工输精。
23.如上所述的应用，优选地，人绒毛膜促性腺激素按2000iu/头进行。
24.本发明的有益效果在于：
25.本发明提供的提高水牛夏季同期发情-定时输精效果的处理方法，具体是在同期发情处理前两天(产后第48天)注射褪黑素后，进行同情发情-定时输精效果的处理方法，同期发情处理前两天皮下注射褪黑素后促进卵泡发育和增加了卵泡发育速率、大卵泡和排卵卵泡的直径和数量，使奶水牛在非繁殖季节也有较高的发情和排卵比例，并降低卵泡囊肿率，促进卵泡发育和排卵、从而提高了情期受胎率，并能有效提高水牛日产奶量，降低牛奶中体细胞数，同时还提高了乳成分中的蛋白质率、乳糖含量及乳脂率。
26.本发明了还提供了褪黑素新的用途，具体是指褪黑素在提高水牛夏季发情，排卵，配种受胎率，促进卵泡发育，增加卵泡发育速率，降低卵泡囊肿率及降低奶中体细胞数的应用。
附图说明
27.图1为本发明试验操作流程说明图。
28.图2为注射不同处理方式的褪黑素对最大卵泡直径的影响
29.图3为杂交水牛注射不同处理的褪黑素采用gpgmh同期发情处理后同期发情第0天到最大卵泡直径卵泡发育规律，x坐标和y坐标的值都用对数表示。
30.图4为不同处理的褪黑素对泌乳奶水牛血液中褪黑素的影响。
31.图5为不同处理的褪黑素对泌乳奶水牛血液中免疫球蛋白m(igm)的影响。
具体实施方式
32.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
33.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。
34.实施例1
35.为改良现有同期发情方案夏季同期发情效果不佳的问题，同时降低水牛体细胞数，提高配种受胎率。进行褪黑素 同期发情定时输精方案，流程见图1所示，具体选择体况良好的健康围产前期杂交水牛62头，在7月份，选择产后(分娩当天为0天)第50天的母水牛，按年龄、体重、产奶量、胎次等指标在各组均衡分配分成3组，t1组从同期发情的前四天(产后第46天)开始，每天皮下注射褪黑素6mg/50kg体重，连续3天，每天一次，共注射3次(即处理组t1在同期发情的前三天每天都皮下注射褪黑素)；t2组从同期发情的前两天(即产后第48天)开始一次性单次(单次指只注射一次)皮下注射褪黑素按18mg/50kg体重进行(即处理组t2同期发情的前两天一次性单次注射褪黑素)，对照组control同期发情的前四天(产后第46天)开始每头皮下注射5ml生理盐水，连续注射3天生理盐水，每天一次，共注射3次(即对照组注射生理盐水)。其中，18mg/50kg体重进行就是平均一头牛体重500kg计算，就是180mg褪黑素，先用1ml的75％乙醇溶液溶解，用生理盐水稀释到5ml，之后注射。
36.所有牛只接受同期发情和人工授精处理，具体操作如下：产后第50天计为水牛同期发情处理第0天，下午按400μg/头进行肌肉注射促性腺素释放激素(gnrh)，b超检查从第6天(即pgf2
ɑ
注射前一天)至第12天排卵为止(即第二次注射gnrh后72h)，记录卵泡发育及发情、排卵状况；第7天下午肌肉注射氯前列醇钠(pgf2
ɑ
)，按0.5mg/头注射，第9天下午(注射pgf2
ɑ
后48小时)第二次肌肉注射gnrh(200μg/头)，同时注射米非司酮(按0.4mg/kg体重)以促进排卵，第10天下午(第二次注射gnrh后24小时)进行人工输精，第15天(即人工输精后第5天)对接受配种的牛只肌肉注射hcg(2000iu/头)，以促进早期胚胎存活，第45天(即人工输精后第35天)用b超确定牛只妊娠情况。
37.同期发情和人工授精处理的第6天至12天进行b超观察卵泡的生长发育和排卵情况。对不同处理的各组分别测定水牛卵泡发育和发情持续时间的影响结果，取平均值，结果见表1，并将最大卵泡直径绘制成图如图1所示。
38.表1杂交水牛不同处理的褪黑素对其卵泡发育和发情持续时间的影响
39.40.结果说明杂交水牛同期发情前注射褪黑素，不同处理方法和不同时间段都对大卵泡的直径有显著性的影响，t2组的最大卵泡直径(13.8
±
1.4mm)显著大于其他组(如图1)，其中，对照组的大卵泡直径只与单次注射组t2具有显著性差异(p《0.05)，并且单次注射组t1的大卵泡直径与单次注射组t2无显著性差异(p》0.05)。t2组初始卵泡直径9.3
±
0.9mm大于其他组，但是差异不显著(p》0.05)。t2组第二次gnrh至排卵间隔时间为8.7
±
1.7h，第二次gnrh至发情间隔时间为23.6
±
1.1h，发情持续时间为15.7
±
0.7h，比其他组短，但是没有差异显著(p》0.05)(表1)。虽然不同剂量组实验结果差异不显著，但相较于空白对照组(0)，褪黑素t2组在一定程度上可以促进杂交水牛卵泡发育、延长发情时间，具有一定的实际生产意义。
41.表2杂交水牛注射不同剂量的褪黑素对发情，排卵，受胎率的影响
[0042][0043]
表2结果说明，杂交水牛同期发情前注射不同处理方式的褪黑素，褪黑素对经产奶水牛的发情率、排卵率和受胎率，卵泡囊肿率均有显著性影响，实验组的发情，排卵和受胎率显著(p《0.05)高于对照组。单次注射组t2的杂交水牛发情率为91.3％(21/23)，排卵率为87.0％(20/23)，受胎率为78.3％(18/23)，卵泡生长速度达到1.8
±
0.32mm/day，显著(p《0.05)高于对照组，但是与多次注射t1组之间没有显著性差异(p》0.05)；与其它实验组相比，t2组卵泡囊肿率(0％)显著(p《0.05)低于其他处理组。根据(图2)说明，单次注射组t2的卵泡发育比较规律，稳定，发育速度和排卵卵泡最大直径高于其他组，但是没有显著性差异(p》0.05)(图2)。说明注射的褪黑素可显著提高水牛发情率、排卵率、受胎率、卵泡生长速度，降低卵泡囊肿率。
[0044]
3、杂交水牛注射不同剂量的褪黑素采用上述同期发情-定时输精方案对产奶量的结果见表3。其中，取样时间是按同期发情处理当天为0天计算。
[0045]
表3各组杂交水牛注射不同处理的褪黑素后各期杂交水牛的日产奶量
[0046]
[0047][0048]
注：同一指标，同行肩注不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0049]
上表3的结果说明，杂交水牛皮下注射褪黑素后，对杂交水牛生产性能的影响发现最初的5天里泌乳量呈现逐渐增加的趋势。其中从产后46天开始在皮下注射褪黑素后(t2组)对奶水牛提高产奶量有更显著的效果。产奶量在皮下注射褪黑素后实验组高于对照组，但是差异不显著(p》0.05)。产奶量在皮下注射褪黑素后t2单次注射组有高于其他组的趋势，和其他组之间没有显著差异(p》0.05)。
[0050]
褪黑素注射前一天多次注射组和单次注射组产奶量分别为3.04
±
1.9和3.23
±
1.6，差异不显著(p》0.05)。停止褪黑素注射后，多次注射组和单次注射组水牛产奶量分别为3.17
±
2.3和3.49
±
1.8，高于注射前的趋势，但是差异不显著(p》0.05)。直到治疗后第10天，多次注射组和单次注射中产奶量分别为4.11
±
2.9和4.48
±
2.9，也显著性高于注射前产奶量(p《0.05)，第8、9、10天，t2单次注射组均高于多次注射组和对照组，逐渐稳定趋势，处理组产奶量均高于对照组，说明注射褪黑素在一定程度上提高了产奶量(见表3)。
[0051]
皮下注射不同剂量褪黑素后对泌乳奶水牛血液中褪黑素和igm进行检查，其中，血液中褪黑素是按照上海酶联生物科技有限公司牛褪黑素(mt)测定试剂盒说明书中的具体操作进行测定。血液中igm按照上海酶联生物科技有限公司牛免疫球蛋白m(igm)测定试剂盒说明书中的具体操作进行测定，检测结果见图3和表4。
[0052]
表4各组杂交水牛注射不同剂量褪黑素后的血清生化指标
[0053][0054]
注：同一指标，同行肩注不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。皮下注射外源褪黑素对奶水牛的血液生化指标作用明显，血液中褪黑素浓度有所提高。如图4所示，无论对于单次注射组(t2组)(18mg/50kg体重/一次性)还是多次注射组(t1组)(6mg/50kg体重/天，共三天)而言，与第0次采血(注射褪黑素前)相比，第1次采血后(注射褪黑素后第1天)血液中褪黑素浓度显著性增加(p《0.05)。然而第2、3次采血后(注射褪黑素后第5、10天)血液中褪黑素浓度与第0次采血间均差异不显著(p》0.05)，并且单次注射组(18mg/50kg体重)和多次
注射组(6mg/50kg体重)的血液中褪黑素浓度差异不显著(p》0.05)。
[0055]
说明皮下注射不同剂量褪黑素对泌乳奶水牛血液中褪黑素的影响不大。
[0056]
皮下注射外源外源褪黑素注射后对泌乳奶水牛血液中igm浓度有所显著性影响。如图5所示，第0次采血(注射褪黑素前)与第1次采血(注射褪黑素后第1天)相比，第0次采血后(注射褪黑素前)血液中igm浓度显著性低于第1次采血(注射褪黑素后第1天)(p《0.05)。随着处理天数的增加，血液中igm的含量呈逐渐下降的趋势，但各采血次数之间差异不显著(p》0.05)。与此同时，单次注射组(18mg/50kg体重)和多次注射组(6mg/50kg体重)的血液中igm浓度呈现相同的变化趋势，但无统计学差异(p》0.05)。
[0057]
5、注射褪黑素后采用同期发情-定时输精方案对各组乳成分包括总固、脂蛋比、尿素氮、乳糖含量、体细胞数、乳脂率进行测定，其结果见表5所示。
[0058]
表5褪黑素的不同处理方式对泌乳初期乳成分的影响结果注:同一列不同小写字母a，b表示差异显著(p《0.05)。
[0059][0060]
从上表5中看出在注射褪黑素前，乳脂率、乳糖含量、非脂乳固体分析、总固、尿素氮、体细胞数和组间均无明显差异(p》0.05)，只有t2组单次注射褪黑素蛋白质率显著(p《0.05)高于对照组，与t1多次注射褪黑素组之间差异不显著(p》0.05)。
[0061]
在停止注射褪黑素后，在体细胞数(scc＝50万个/ml)以上的水牛奶中体细胞数呈现下降的趋势，与使用褪黑素处理前相比，处理组下降趋势明显。在停止注射褪黑素后第10天，可以看到处理组乳脂率、蛋白质率、乳糖含量、非脂乳固体分析、总固高于对照组，但是组间均无明显差异(p》0.05)。尿素氮、体细胞数出现了显著差异(p《0.05)，其中t2组单次注射褪黑素尿素氮和体细胞数显著(p《0.05)低于对照组，与t1多次注射褪黑素组之间差异不显著(p》0.05)。在注射褪黑素前处理组和对照组之间体细胞数差异不显著(p》0.05)，停止注射褪黑素后第10天可以看到处理组体细胞数显著(p《0.05)低于对照组；也显著性(p《0.05)低于注射褪黑素前体细胞数，处于亚健康水平。但是两种注射褪黑素不同剂量组治疗后的各个时间点体细胞数没有显著性差异(p》0.05)。本试验研究表明，皮下注射褪黑素可以降低泌乳奶水牛的奶中体细胞数(奶中的体细胞数是衡量奶牛乳房健康状态的非常重要的间接指标，体细胞数(scc)的增加会引起产奶量的下降，以及水牛奶品质下降，极大影响了水牛奶的营养价值)。
[0062]
实施例2
[0063]
一种同期发情之前注射褪黑素用于水牛夏季同期发情-定时输精效果的处理方法，选择健康，没有生殖道疾病的水牛，试验前做直肠检查，有生殖道疾病的牛(两侧子宫角大小不对称、卵泡囊肿，卵巢囊肿，子宫角较大、有炎症)不能用于试验，可按流程如图5所述进行，具体方案如下：
[0064]
同期发情处理前两天：将分娩当天记为0天，在产后第48天(第一周)，星期一下午15：00pm褪黑素按每一头一次性皮下注射18mg/50kg体重，促进卵泡发育。
[0065]
同期发情处理的第0天：在产后第50天(第一周)，向一个或多个健康的处于发情周期的水牛星期三下午15：00pm肌肉注射第一次gnrh，注射剂量为400μg/头，以诱导发情。
[0066]
同期发情处理的第6天：产后第56天，b超检查从同期发情的第6天(pgf2
ɑ
注射前一天)至第12天排卵为止(即注射gnrh后72h),记录卵泡发育及发情、排卵状况。
[0067]
同期发情处理的第7天：在产后第57天(第二周)，星期三下午15：00pm肌肉注射pgf2
ɑ
，注射剂量为0.5mg/头，以启动发情。
[0068]
同期发情处理的第9天：在产后第59天(第二周)，星期五下午15：00pm肌肉注射第二次gnrh(400μg/头)，同时肌肉注射米非司酮(0.4mg/kg)以促进排卵。
[0069]
同期发情处理的第10天：在产后第60天(第二周)，星期六下午15：00pm进行人工输精。需要注意的是：每次人工授精之前，用酒精消毒输精抢，高锰酸钾消毒液(0.1mol/l)消毒外阴部分，人工授精人员确保手指甲剪短；切实掌握好输精技术，使用一次性输精枪套。精液解冻时动作迅速，解冻温度为37.5摄氏度，显微镜检查精子活力，解冻后精子活力高于0.3。
[0070]
同期发情处理的第11天：上午b超检测排卵情况，如果发现没有排卵的牛下午15:00进行第二次人工输精。
[0071]
同期发情处理的第15天：在产后第65天(第三周)，星期四下午16：00pm(即人工授精后第5天)，对接受配种的牛只肌肉注射hcg(2000iu/头)，以促进早期胚胎存活率。注：严禁使用过期的激素；注射使用一次性注射器。
[0072]
同期发情处理的第45天：在产后第110天(第六周，星期一)(即人工授精后第35天)上午10：00利用b超进行妊娠诊断。要注意观察牛的发情、排卵情况，做好记录
[0073]
上述的同期发情定时输精方案操作，因为考虑胚胎早期死亡的问题，首次妊娠诊断是通过观察牛只是否返情确定，为进一步提高诊断准确率，妊娠诊断是在人工输精后第45天，利用b超确定牛只妊娠情况并记录。
[0074]
上述利用本发明方法在夏季产后杂交水牛注射褪黑素结合gpgmh同期发情处理可以提高繁殖性能母牛发情率，排卵率、受胎率分别为91.3％，87.0％，78.3％。而夏季利用传统的gpg同期发情方案处理水牛，母牛发情率，排卵率、受胎率分别为86.7％、76.7％和33.3％。生产性能方面，产奶量在注射褪黑素后慢慢上升，按注射剂量为18mg/50kg体重组升高(p》0.05)，比对照组提高了16.61％。
[0075]
本发明的方法在杂交水牛产后第48天，同期发情处理前两天褪黑素按每一头一次性皮下注射18mg/50kg体重，可以促进卵泡发育和卵泡发育速度，增加排卵最大卵泡直径(p《0.05)，提高了排卵率和配种受胎率，提高同期发情效果。停止注射褪黑素后第10天可以显著提高乳蛋白质率、乳脂率、乳糖率等指标，乳中尿素氮水平和体细胞数降低，血糖水平升
高，提高水牛的产奶性能，提高产奶量和早期胚胎存活率。可见，本发明方法可显著提高夏季水牛促进卵泡发育和卵泡发育速度，发情，排卵和配种受胎率，减少卵泡囊肿率，减少胚胎早起死亡率，降低体细胞数，减少子宫炎症和子宫内膜炎的发生率，降低成本，节约养殖成本，提高养殖效益。而且，本发明操作比较方便，不需要进行发情鉴定，是一种程序化的同期发情定时输精方案，便于推广应用。