高纯酒石酸伐尼克兰原料中醛类基因毒性杂质的检测方法与流程

1.本发明涉及的是一种高纯酒石酸伐尼克兰原料中醛类基因毒性杂质的检测方法，属于医药分析技术领域。


背景技术：

2.酒石酸伐尼克兰，化学名称为7,8,9,10-四氢-6,10-亚甲基-6h-吡嗪并[2,3-h][3] 苯并氮杂-(2r,3r)-2,3-二羟基丁二酸盐(1:1)，其结构式如下：
[0003][0004]
酒石酸伐尼克兰通过结合于神经元烟碱型乙酰胆碱受体，调节胆碱能作用，可用于治疗多种症状或疾病，例如炎症性肠病(非限制性实例：溃疡性结肠炎、脓皮病和克罗恩氏病)，肠易激综合征，痉挛性肌张力障碍，慢性疼痛，急性疼痛，口炎性腹泻，结肠袋炎，血管收缩，焦虑症，惊恐障碍，抑郁症，双相情感障碍，自闭症，睡眠障碍，快速时差综合征，肌萎缩侧索硬化症(als)，认知障碍，高血压，贪食症，厌食症，肥胖，心律失常，胃酸分泌过多，溃疡，嗜铬细胞瘤，进行性核上性麻痹，药物依赖和成瘾(依赖或成瘾于例如尼古丁(和(或)烟草产品)，酒精，苯二氮卓类，巴比妥类，阿片类或可卡因)，头痛，偏头痛，痉挛，创伤性脑损伤(tbi)，强迫症(ocd)，精神病，亨廷顿舞蹈病，迟发性运动障碍，运动过度，失读症，精神分裂症，多发性脑梗死性痴呆，年龄相关的认知衰退，癫痫(包括失神癫痫)，阿尔茨海默病(ad)，帕金森病(pd)，注意力缺陷多动障碍(adhd) 和抽动秽语综合征，等等
[0005]
目前酒石酸伐尼克兰的合成工艺中均需使用乙二醛，最典型的合成路线如下：
[0006][0007]
而工业乙二醛水溶液中通常含有微量的甲醛。近几年基因毒性杂质成为人们关注的焦点，基因毒性杂质是指直接或者间接损害dna，导致基因突变或者癌变的物质。因此对于酒石酸伐尼克兰及其生产工艺可能含有的醛类基因毒性杂质，应严格控制毒理学关注阈值(ttc)水平。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于克服现有酒石酸伐尼克兰的合成工艺未对基因毒性杂质进行检测的缺陷，提出一种高纯酒石酸伐尼克兰原料中醛类基因毒性杂质的检测方法。
[0009]
本发明的技术解决方案：高纯酒石酸伐尼克兰原料中醛类基因毒性杂质的检测方法，具体包括如下步骤：
[0010]
(1)衍生化试剂溶液配制：称取2，4-二硝基苯肼(dnph)200mg，置50ml 量瓶中，加适量稀释溶剂溶解后，加0.5ml浓盐酸，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得每1ml中含2,4-dnph 2mg和hcl 0.12mmol的溶液，作为衍生化试剂溶液。
[0011]
(2)甲醛、乙二醛限度对照溶液配制：取40％甲醛水溶液和40％乙二醛水溶液各约234.4mg，精密称定，分别置25ml量瓶中，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。分别量取各0.5ml置同一50ml量瓶中，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。取1ml，置10ml量瓶中，加衍生化试剂溶液1ml，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。置60℃水浴锅反应105min，放至室温后用0.45um滤膜过滤，制得每1 ml中含甲醛和乙二醛均约为3.75ug的溶液。
[0012]
(3)供试品溶液：取供试品约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加适量稀释溶剂溶解，加衍生化试剂溶液1ml，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，置60℃水浴锅反应105min，放至室温后用0.45um滤膜过滤，制成每1ml中含主成分 2.5mg的溶液，作为供试品溶液。
[0013]
(4)高效液相色谱测定：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水为a 相，乙腈作为b相，进行线性梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml，柱温为30℃，进样盘温度为10℃，检测波长为400nm。精密量取供试液和对照液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算甲醛和乙二醛含量。
[0014]
与现有技术相比，本发明的优点在于：灵敏度高、选择性高、操作简便、专属性良好。
附图说明
[0015]
附图1是空白衍生化体系高效液相色谱图。
[0016]
附图2是限度对照衍生化体系高效液相色谱图。
[0017]
附图3是样品衍生化体系高效液相色谱图。
[0018]
附图4是样品加限度对照衍生化体系高效液相色谱图。
[0019]
附图5是甲醛衍生产物浓度和峰面积的标准曲线图。
[0020]
附图6是乙二醛衍生产物浓度和峰面积的标准曲线图。
[0021]
附图7是甲醛和乙二醛衍生化温度和峰面积关系曲线图。
[0022]
附图8是甲醛衍生化时间和峰面积关系曲线图。
[0023]
附图9是乙二醛衍生化时间和峰面积关系曲线图。
[0024]
附图10是甲醛衍生化试剂加入量和峰面积关系曲线图。
[0025]
附图11是乙二醛衍生化试剂加入量和峰面积关系曲线图。
[0026]
附图12是甲醛衍生化催化剂加入量和峰面积关系曲线图。
[0027]
附图13是乙二醛衍生化催化剂加入量和峰面积关系曲线图。
具体实施方式
[0028]
下面结合附图进一步说明本发明的技术方案。以下通过参考附图描述的实施例和相关实验数据仅为示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0029]
欧洲药物管理局发布基因毒性杂质(gti)的最大摄取量为1.5μg/d，对于酒石酸伐尼克兰而言，按照每天使用2mg来计，2个基因毒性杂质的限度和不超过750ppm时，可达到ich m7的要求，按平均值计算，单个基因毒性杂质限度不得超过375ppm。因此制定高纯酒石酸伐尼克兰原料中醛类基因毒性杂质的检测方法：
[0030]
(1)称取2,4-dnph 200mg，置50ml量瓶中，加适量稀释溶剂溶解后，加0.5ml浓盐酸，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得每1ml中含2，4-dnph 2mg和hcl0.12mmol的溶液，作为衍生化试剂溶液。
[0031]
(2)取40％甲醛水溶液和40％乙二醛水溶液各约234.4mg，精密称定，分别置25ml量瓶中，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。分别量取各0.5ml置同一 50ml量瓶中，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。取1ml，置10ml量瓶中，加衍生化试剂溶液1ml，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。置60℃水浴锅反应 105min，放至室温后用0.45um滤膜过滤，制得每1ml中含甲醛和乙二醛均约为3.75ug的限度对照溶液。
[0032]
(3)取供试品约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加适量稀释溶剂溶解，加衍生化试剂溶液1ml，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，置60℃水浴锅反应105min，放至室温后用0.45um滤膜过滤，制成每1ml中含主成分2.5mg的溶液，作为供试品溶液。
[0033]
(4)用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(推荐inertsil c8柱，4.6mm
×
150 mm
×
5μm；或效能相当的色谱柱)，以乙腈-水(50∶50)为a相，乙腈作为流动相 b，按下表进行线性梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml，柱温为30℃，进样盘温度为10℃，检测波长为400nm。精密量取供试液和对照液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算甲醛和乙二醛含量。测得的空白衍生化体系、限度对照衍生化体系、样品衍生化体系和样品加限度对照衍生化体系高效液相色谱图如图1-4所示，可以看出，甲醛衍生产物保留时间为5.4min左右，乙二醛衍生产物保留时间为10.3min左右，峰形良好，空白溶剂和供试品溶液对测定无干扰。
[0034]
甲醛和乙二醛的衍生物标准曲线如图5-6所示，具体数据见下表：
[0035]
甲醛衍生产物的标准曲线数据
[0036][0037]
线性回归方程：y＝275017x 69907，r2＝0.993
[0038][0039]
线性回归方程：y＝472285x-154637，r2＝0.9967
[0040]
由计算可得，该方法检测准确，精密度良好(rsd％≤2.0％)，灵敏度高 (定量限为0.75μg/ml)。
[0041]
该方法甲醛和乙二醛的衍生化温度曲线如图7所示，具体数据见下表：
[0042]
温度甲醛乙二醛408326502322057508386702382125608477662406594708286052179400808535702256558
[0043]
由图表结合可得，衍生化温度选择在40-80℃，优选60℃。
[0044]
该方法甲醛和乙二醛的衍生化时间曲线如图8-9所示，具体数据见下表：
[0045]
时间甲醛-dnph乙二醛-dnph0min77670595218815min824733174891730min831025203257045min834642212091760min822648216276275min839623218039690min8345382186886105min8359002194404120min83588021918833h83738021977624h8429542193330
[0046]
由图表结合可得，衍生化时间选择在30-180min，优选105min。
[0047]
该方法甲醛和乙二醛的衍生化试剂加入量曲线如图10-11所示，具体数据见下表：
[0048]
dnph甲醛-dnph乙二醛-dnph200ul4165791046959400ul4232471094505600ul4214271099578800ul41738911062861000ul42094410998081500ul4200861099770
[0049]
由图表结合可得，衍生化试剂(2mg/ml dnph)加入量应在200ul以上，优选1000ul。
[0050]
该方法甲醛和乙二醛的衍生化催化剂加入量曲线如图12-13所示，具体数据见下表：
[0051]
盐酸加入里ph甲醛-dnph乙二醛-dnph50ul3.02448166871655100ul2.68217448519470
200ul2.62212943529066500ul2.042119835459531000ul1.762092435400382000ul1.702059475297953000ul1.46211074171966
[0052]
由图表结合可得，衍生化催化剂优选1％盐酸，其加入量应在100ul以上，优选1000ul。
[0053]
实施例
[0054]
仪器：agilent 1100高效液相色谱仪，bs 21s分析天平(德国satrious公司)。
[0055]
试剂：2，4-二硝基苯肼(质量浓度为50％，萨恩化学技术有限公司)、冰醋酸(南京化学试剂股份有限公司)、乙腈(天地化学试剂有限公司)。
[0056]
试药：40％甲醛水溶液，40％乙二醛水溶液，环合产物(fn21901)，游离碱(fn31901)，酒石酸伐尼克兰(afn1901)。
[0057]
液相色谱条件：采用inertsil c8色谱柱(150mm
×
4.6mm，5μm)，以水为流动相a，乙腈为流动相b，检测波长为400nm，流速为1ml/min，柱温为 30℃，进样盘温度为10℃，自动进样20μl。线性梯度(a:b)洗脱方式：0min (50:50)
→
6.5min(50:50)
→
7min(25:75)
→
11.5min(25:75)
→
12min (50:50)
→
15min(50:50)。
[0058]
(1)溶液配制与衍生化体系制备
[0059]
①
甲醛储备液：精密称取40％甲醛水溶液约23.44mg，置于25ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1ml约含甲醛375μg的甲醛储备液。
[0060]
②
乙二醛储备液：精密称取40％乙二醛水溶液约23.44mg，置于25ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1ml约含乙二醛375μg的乙二醛储备液。
[0061]
③
2,4-二硝基苯肼溶液：精密称取质量浓度为50％的2,4-二硝基苯肼约 400mg，置50ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1ml约含 2,4-二硝基苯肼4mg的2,4-二硝基苯肼溶液。
[0062]
④
限度对照衍生化体系制备：精密移取甲醛储备液100μl和乙二醛储备液 100μl，置10ml容量瓶中，加2,4-二硝基苯肼溶液1ml和1％盐酸溶液1ml，加稀释溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。置60℃水浴中加热2h后取出，冷却至室温，用0.45μm有机滤膜滤过，置于进样瓶中待测定。
[0063]
(2)样品衍生化体系制备
[0064]
①
环合产物：精密称取环合产物约100mg，置10ml容量瓶中，加适量乙腈溶解，加2,4-二硝基苯肼溶液1ml和1％盐酸溶液1ml，用乙腈稀释至刻度，摇匀。置60℃水浴中加热2h后取出，冷却至室温，用0.45μm有机滤膜滤过，置于进样瓶中待测定。
[0065]
②
游离碱：精密称取游离碱约100mg，置10ml容量瓶中，加适量乙腈溶解，加2,4-二硝基苯肼溶液1ml和6％盐酸溶液1ml，用乙腈稀释至刻度，摇匀。置60℃水浴中加热2h后取出，冷却至室温，用0.45μm有机滤膜滤过，置于进样瓶中待测定。
[0066]
③
酒石酸伐尼克兰：精密称取酒石酸伐尼克兰约100mg，置10ml容量瓶中，加2ml水溶解，加2,4-二硝基苯肼溶液1ml和1％盐酸溶液1ml，用乙腈稀释至刻度，摇匀。置60℃水浴中加热2h后取出，冷却至室温，用0.45μm有机滤膜滤过，置于进样瓶中待测定。
[0067]
各批次样品中醛类杂质测样结果如下表：(单位：ppm)
[0068]
样品名称样品批号甲醛含量乙二醛含量环合物fn21901粗品96358游离碱fn31901141na酒石酸伐尼克兰afn1901nana
[0069]
(na：小于检测限)
[0070]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。