一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS及其启动子和应用

一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps及其启动子和应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种马尾松香叶基焦磷酸合 成酶基因pmgpps及其启动子和应用。


背景技术：

2.马尾松(pinus massoniana lamb.)是松科松属多年生常绿树种，是我国特 有的乡土树种，其适应性强，耐干旱瘠薄，广泛分布在秦岭以南18个省，主产 地区为赣、浙、闽、桂、粤、湘、川、渝、鄂、黔等地。马尾松林面积居我国 林木前列。其木材纤维细长，非常适合造纸，因而马尾松是我国主要的纸浆材 树种。此外，马尾松也是主要的采脂树种，中国每年松脂产量的70％以上来自 马尾松(杨章旗，2015)，其松脂可提取松节油和松香，它们都是重要的化工 原料，而松脂单产较低是制约马尾松松脂产业发展的重要因素，因此选育高产 脂优良品种和营建高产脂人工林是提高松脂产量的有效措施。此外，松脂在抗 生物逆境中也发挥着重要的作用。
3.香叶基焦磷酸合成酶基因(geranyl diphosphate synthase，gpps)作为松脂 中单萜组分直接前体的合成酶，是松脂生物合成mep途径中第二阶段的关键限 速酶之一。前人研究发现，在野生山苍子中瞬时表达和在烟草中过表达lcgpps 均能提高单萜的产量，甚至在烟草中引入lcgpps.ssu1会影响牻牛儿焦磷酸 (geranylgeranylpyrophosphate，ggpp)的表达，从而提高二萜的产量。将cigpps 和cifpps基因在烟草中过表达后发现，烟草中的萜烯类物质含量显著增加， 在过表达gpps的长春花(catharanthus roseus)株系中也有类似的现象。这些 结果表明过表达gpps对提高萜类代谢物的产量。本发明公开马尾松gpps序 列及功能研究，有助于马尾松pmgpps基因功能的深入研究，并为提高马尾松 萜类化合物合成的定向育种工作提供一种分子手段和依据。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供 一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps；本发明所要解决的第二技术问 题在于提供一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps的表达蛋白；本发明 所要解决的第三技术问题在于提供一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因 pmgpps的启动子；本发明所要解决的第四技术问题在于提供上述马尾松香叶 基焦磷酸合成酶基因pmgpps、表达蛋白、启动子的应用。
5.激活胃癌细胞中prdm5表达的sarna。本发明所要解决的另一技术问题 在于提供前述sarna在制备抗胃癌药物中的应用。本发明所要解决的最后一技 术问题在于提供一种利用前述sarna制备的抗胃癌药物。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps，其核苷酸序列如seq idno.1所示，或者为编码seq id no.2的dna序列。
8.所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps的表达蛋白，其氨基酸序 列如seq id no.2所示。
9.在seq id no.2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白 质，也属于本发明的保护范围。
10.所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps的启动子，其核苷酸序列 如seq id no.3所示。
11.含有所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps的重组表达载体、重 组菌或转基因细胞系。
12.含有所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps的启动子的重组表达 载体、重组菌或转基因细胞系。其载体还含有与所述的启动子可操作地连接的 目的基因。
13.所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps的启动子在启动目的基因 表达中的应用，所述目的基因位于所述启动子的下游。
14.所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps在响应植物非生物胁迫或 激素胁迫中的应用。
15.本发明通过qrt-pcr技术对马尾松不同组织中pmgpps基因表达量及不同 胁迫下叶片中的表达量分析，将马尾松幼苗进行六种非生物胁迫和激素处理， 即15％peg
6000
渗透胁迫、机械损伤、10mm h2o2、100μm茉莉酸甲酯(meja)、500μm乙烯利(eth)和1mm水杨酸(sa)。渗透胁迫处理方法为将植株根 部浸没进15％peg
6000
液体中，机械损伤处理方法为将每个针叶束剪去一半长 度，其余处理方法为喷施液体至植株各部位。发现pmgpps在马尾松的嫩叶中 的表达较高且均能响应这些非生物胁迫和激素处理。
16.所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps的启动子在驱动目的基因 在响应植物非生物胁迫或激素胁迫中的应用。
17.本发明通过构建不同长度35s：propmgpps：gus表达载体，瞬时转入本 式烟草叶片中，在不同胁迫处理后进行gus染色。观察各片段在烟草叶片中的 表达情况及不同激素处理下的启动子活性。通过对不同长度的启动子片段在烟 草叶片中瞬时表达分析，初步表明各片段均能启动其相应的顺式作用元件。
18.所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps在构建转基因植物中的应 用。将所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps导入植物组织或细胞， 得到转基因植物，所述转基因植物为烟草、拟南芥或马尾松。
19.所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps的启动子在构建转基因植 物中的应用。将含有马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps的启动子以及启 动子可操作地连接的目的基因，构建重组表达载体，导入植物组织或细胞，得 到转基因植物，所述转基因植物为烟草、拟南芥或马尾松。
20.所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因pmgpps或所述的马尾松香叶基焦 磷酸合成酶基因pmgpps的启动子在提高转基因植物gpps酶活性中的应用或 在提高转基因植物叶绿素含量中的应用或在提高转基因植物的萜类化合物产量 中的应用。
21.本发明以模式植物拟南芥为研究对象，将克隆得到的马尾松异戊烯基转移 酶基因pmgpps利用农杆菌介导转化至拟南芥中，通过筛选与培育，最终获得 t3代纯合转基因植株。通过检测野生型拟南芥与8个转基因拟南芥株系的生理 指标，发现转基因拟南芥中
gpps酶活性和叶绿素含量均高于野生型拟南芥， 同时，萜类物质合成相关基因的表达量较野生型均有不同程度的上调。
22.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
23.本发明通过qrt-pcr技术对马尾松不同组织中pmgpps基因表达量及不同 胁迫下叶片中的表达量分析，发现pmgpps在马尾松的嫩叶中的表达较高且均 能响应这些非生物胁迫和激素处理；通过不同长度的启动子片段在烟草叶片中 瞬时表达分析，初步表明各片段均能启动其相应的顺式作用元件。此外，发明 以模式植物烟草和拟南芥为研究对象，将克隆得到的马尾松异戊烯基转移酶基 因pmgpps利用农杆菌介导转化至拟南芥中，通过筛选与培育，最终获得t3 代纯合转基因植株；通过检测野生型拟南芥与8个转基因拟南芥株系的生理指 标，发现转基因拟南芥中gpps酶活性和叶绿素含量均高于野生型拟南芥，同 时，萜类物质合成相关基因的表达量较野生型均有不同程度的上调，表明本发 明可通过调控萜类代谢途径中上游物质的表达，有效提高下游物质及萜类化合 物的产量。本发明为提高马尾松萜类化合物合成的育种工作提供一种分子手段 和依据。
附图说明
24.图1是马尾松总rna的1.2％琼脂糖凝胶电泳图；
25.图2是pmgpps基因完整开放阅读框克隆的pcr结果图；
26.图3是各组织pmgpps基因相对表达量分析图；图中，相同字母表示差异 不显著；
27.图4是各处理下pmgpps基因相对表达量分析图；图中，星号表示差异的 显著性：*p＜0.05，**p＜0.01；
28.图5是pmgpps启动子片段pcr产物图；图中，六条片段分别对应六对 引物；
29.图6是不同长度启动子构建gus质粒的阳性鉴定图；图中，1： pbi121-pmgpps-1690bp-gus；2：pbi121-pmgpps-1130bp-gus；3： pbi121-pmgpps-570bp-gus；
30.图7是各片段启动子gus染色的情况；图中，1、2、3为每个片段的三个 重复；
31.图8是是四种外源激素处理下的gus染色情况；图中，a： pbi121-pmgpps-570bp-gus；b：pbi121-pmgpps-1130bp-gus；c： pbi121-pmgpps-1690bp-gus；1、2、3为每种处理的三个重复；
32.图9是重组蛋白表达分析蛋白纯化分析；图a中，1，3为未诱导的对照组， 2，4为诱导后的蛋白；图b中，1-4为纯化蛋白样品；
33.图10是转pmgpps基因拟南芥t1代植株dna的pcr检测结果图；图中， 1-15表示转基因拟南芥；wt表示野生型拟南芥；
34.图11是叶绿素含量分析图；图中，wt表示野生型拟南芥；1-8表示转基因 拟南芥。星号表示差异的显著性：**p＜0.01；
35.图12是gpps酶活性分析图；图中，wt表示野生型拟南芥；1-8表示转基 因拟南芥。星号表示差异的显著性：**p＜0.01；
36.图13是萜类物质合成相关基因的相对表达量分析图；图中，星号表示差异 的显著性：*p＜0.05，**p＜0.01。
具体实施方式
37.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均 为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值，检验方法为t-test检验。
38.实施例1马尾松pmgpps基因开放阅读框的获得
39.取7年生马尾松针叶组织，利用植物总rna提取试剂盒(tiangen)提 取总rna，利用逆转录试剂盒合成cdna(vazyme)，按照试剂盒提供的说明 书操作。设计相应引物进行pcr。pcr扩增产物经过电泳检测并回收后，连入 克隆载体peasy(transgen)并转化大肠杆菌t1菌株感受态细胞，经过抗生 素筛选和菌落pcr鉴定后将阳性菌进行测序，将连接好的克隆载体命名为 peasy-pmgpps。获得pmgpps基因编码蛋白质的orf序列。利用orffinder 对pmgpps的编码区进行翻译成氨基酸序列。
40.具体步骤如下：
41.(1)总rna的提取
42.使用天根多糖多酚植物总rna提取试剂盒提取rna，提取前事先将研钵 研棒用锡纸包裹后在烘箱中180℃烘烤4h左右。将样品放在液氮中研磨成粉末 后，按照试剂盒说明书提取rna，-80℃保存。马尾松叶片总rna的1.2％琼 脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带较清晰；测定总rna的吸光度，od
260
/od
280
值为2.32，od
260
/od
230
为2.09，可用作基因克隆。
43.(2)cdna的获取
44.使用hiscript iii 1st strand cdna synthesis kit( gdna wiper)试剂盒 (vazyme)，以提取的rna为模板，反转录edna。
45.具体过程为：
46.1)在rnase-free离心管中配制如下混合液：5μg total rna，rnase-freeddh2o to 8μl。60℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
47.2)上一步混合液8μl中加入2μl 5
×
gdna wiper mix，用移液枪轻轻吹打 混匀。42℃2min。
48.(3)目的基因的克隆
49.根据马尾松转录组测序得到的pmgpps基因序列，通过primer 5.0设计中 间片段特异性引物，克隆获得pmgpps基因片段，然后进行连接载体、转化大 肠杆菌、目的序列测序和序列分析，确定为目的基因。
50.pmgppsorf克隆引物为：
51.pmgpps-orf-f：5
′‑
atgggttacagtggcatggtagtt-3
′
；
52.pmgpps-orf-r：5
′‑
tcacttctgtcttgaggcaatgtaat-3
′
。
53.pcr反应体系(50μl)为：2μl forward primer(10um/l)、2μl reverseprimer(10um/l)、2μl template cdna(100ng/ul)、25μl 2
×
taq pcr master mix、 19μl ddh2o。
54.pcr反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，58℃退火10s，72℃ 延伸45s，35个循环，72℃再延伸5min。
55.(4)连接载体与转化：在离心管中加入4μl产物，再加入1μl blunt载体， 混合后在室温反应15min。反应结束后加入50μl刚解冻的trans1-t1感受态细 胞，混匀后冰浴30min。
将连接产物放于42℃金属浴中40s，之后立刻置于冰 中2min。加入250μl平衡至室温的lb液体培养基(无kan)，200rpm，37℃ 培养1h。10000rpm离心30s，弃上清液150μl，剩余培养液用移液枪吹打混合 均匀后涂布在kan抗性培养基上(培养基事先放于37℃培养箱中1h)，在37 ℃培养箱中过夜培养。阳性克隆检测后送至擎科生物测序。
56.实施例2马尾松pmgpps在不同组织及不同胁迫处理下的表达量
57.本实施例随机选取三株长势一致的马尾松幼苗，采集其成熟叶、种子、幼 苗、嫩叶、嫩茎5个部位进行rna提取，反转录成cdna后分析pmgpps基 因的相对表达量。此外，将马尾松幼苗进行六种非生物胁迫和激素处理，即15％ peg
6000
渗透胁迫、机械损伤、10mm h2o2、100μm茉莉酸甲酯(meja)、500μm 乙烯利(eth)和1mm水杨酸(sa)。渗透胁迫处理方法为将植株根部浸没 进15％peg
6000
液体中，机械损伤处理方法为将每个针叶束剪去一半长度，其 余处理方法为喷施液体至植株各部位，每种处理选择三个长势一致的幼苗作为 三个生物学重复，分别在0h、3h、6h、12h和24h采集针叶作为样本，在液氮 中冷冻并保存在-80℃，将未经任何处理收集的0h样品用作对照，对所有样本 进行rna提取和cdna合成，分析pmgpps基因的相对表达量。实验设置三 个重复，同时运用t-检验方法分析各表达量与对照组差异的显著性。
58.具体步骤为：
59.(1)cdna的获取
60.rna提取及cdna第一链的合成方法，同实施例1(1)、(2)。反转录 后edna稀释10倍。
61.(2)qrt-pcr分析
62.选用马尾松tua(km496535.1)作为内参基因。按照chamq
tm sybr qpcrmaster mix试剂盒说明书方法分析pmgpps基因的相对表达量，同时运用t-检 验方法分析各表达量与对照组差异的显著性。
63.qrt-pcr引物为：
64.tua-f：5
′‑
caaacttggtcccgtatcctc-3
′
；
65.tua-r：5
′‑
cacagaaagctgctcatggtaa-3
′
；
66.qpcr-pmgpps-f：5
′‑
ttcgacaagtacctgcattccaa-3
′
；
67.qpcr-pmgpps-r：5
′‑
aagctcctgtgttcctcccacaa-3
′
；
68.qrt-pcr反应体系(10μl)为：0.4μl forward primer(10μm/l)、0.4μl reverseprimer(10μm/l)、1μl template cdna、5μl sybr green mix、3.2μl ddh2o。
69.qrt-pcr反应程序为：95℃1min；95℃15s，58℃15s，72℃45s，循环 40次。
70.通过qrt-pcr技术对马尾松不同组织中pmgpps基因表达量及不同胁迫下 叶片中的表达量分析，发现pmgpps在马尾松的嫩叶中的表达较高且均能响应 这些非生物胁迫和激素处理。
71.实施例3马尾松pmgpps基因启动子的克隆
72.取7年生马尾松叶片，利用植物基因组dna提取试剂盒(tiangen)提 取总dna。设计6条前引物和1条后引物进行pcr。pcr扩增产物经过电泳 检测并回收后，连入克隆载体peasy(transgen)并转化大肠杆菌t1菌株感 受态细胞，经过抗生素筛选和菌落pcr鉴定后将阳性菌进行测序。将测序获得 的6条序列进行拼接，获得完整的启动子序列。
73.具体步骤为：
74.(1)dna的提取
75.使用天根新型植物基因组dna提取试剂盒提取马尾松总dna，提取前事 先将研钵研棒用锡纸包裹后在烘箱中180℃烘烤4h左右。将样品放在液氮中研 磨成粉末后，按照试剂盒说明书提取dna，-80℃保存。测定总dna的吸光度， od
260
/od
280
值为2.43，od
260
/od
230
为2.17，可用作启动子克隆。
76.(2)pmgpps基因启动子序列的克隆
77.将pmgpps基因放入火炬松基因组中进行比对，选取相似度最高的基因起 始密码子上游2800bp左右序列为预测序列，通过primer 5.0设计6对特异性引 物，克隆获得6条pmgpps启动子片段，然后进行连接载体、转化大肠杆菌(同 实例1(4))、目的序列测序和拼接，确定为目的基因。
78.pmgpps启动子克隆引物为：
79.ppmgpps-f1：5
′‑
atatgatggttatgtcaggccct-3
′
；
80.ppmgpps-f2：5
′‑
gtcaagtagagtaaggtgagggg-3
′
；
81.ppmgpps-f3：5
′‑
gtagtggagcaacacgagatatga-3
′
；
82.ppmgpps-f4：5
′‑
ctggagttctacgagtgtgttgcc-3
′
；
83.ppmgpps-f5：5
′‑
caattctgattgatagcgagggct-3
′
；
84.ppmgpps-f6：5
′‑
tcattcctcacgttgatattggag-3
′
；
85.ppmgpps-r1：5
′‑
tgctgggactacataatgcatagt-3
′
。
86.pcr反应体系(50μl)为：2μl forward primer(10um/l)、2μl reverseprimer(10um/l)、2μl template gdna(100ng/u1)、25μl 2
×
taq pcr master mix、 19μl ddh2o。
87.pcr反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃ 延伸1min，35个循环，72℃再延伸5min。
88.实施例4启动子在烟草中瞬时表达分析
89.构建不同长度35s：propmgpps：gus表达载体，瞬时转入本式烟草叶片 中，在不同胁迫处理后进行gus染色。观察各片段在烟草叶片中的表达情况及 不同激素处理下的启动子活性。
90.具体步骤为：
91.(1)pbi121-gus载体的构建
92.将带有gus报告基因的pbi121作为瞬时表达的载体，设计包含xba i和 bamh i两个酶切位点的引物，扩增带有酶切位点的各个片段，三个片段长分别 为1690bp、1130bp及570bp，将其插入到pbi121-gus载体中构建重组质粒。 分别命名为ppmgpps-1690bp-gus、ppmgpps-1130bp-gus及 ppmgpps-570bp-gus。所用大肠杆菌菌株为trans1-t1(transgen)；表达载体为 pbi121(南京林业大学实验室保存)；限制性内切酶和连接酶购自诺唯赞 (vazyme)。
93.1)通过pcr向三个片段上下游分别添加xbai和bamh i酶切位点，1.2％ 琼脂糖凝胶电泳进行分离；用gel dna extraction mini kit进行回收 并纯化酶切产物，溶于20μl的elution buffer中。pcr体系及反应条件同全长 扩增，引物分别是：
94.ppmgpps-121-f1：5
′‑
ggagagaacacgggggactctagaacatccccc agacaagtcttatcc-3
′
；
95.ppmgpps-121-f2：5
′‑
ggagagaacacgggggactctagatcggcacta gcttataattagcca-3
′
；
96.ppmgpps-121-f3：5
′‑
ggagagaacacgggggactctagataaaaaat atgttatttgatacag-3
′
；
97.ppmgpps-121-r：5
′‑
aagggactgaccacccggggatccgttatattcc ctatgattagttcc-3
′
。
98.2)pcr产物测序正确后，在连接酶的作用下，可进行载体的构建。使用 xbai和bamhi内切酶进行酶切反应处理pbi121表达载体。
99.表达载体的双酶切体系(50μ1)为：1μg pbi121-gus质粒、1μl quickcut xbai、1μl quickcut bamh i、5μl 10
×
quickcut buffer、ddh2o up to 50μl。
100.表达载体的双酶切程序为：37℃30min；85℃20s。
101.3)检测所回收的目的片段长度，按连接体系加入各试剂(最适克隆载体使用 量＝[0.02
×
克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)；最适插入片段使用量＝[0.04
×
插入 片段碱基对数]ng(0.06pmol))，37℃30min。
[0102]
表达载体连接体系(20μl)为：100ng线性化载体、80ng目的片段、2μl exnaseii、4μl 5
×
ce ii buffer、ddh2o up to 20μl。
[0103]
表达载体连接体系(20μl)为：100ng线性化载体、80ng目的片段、2μl exnaseii、4μl 5
×
ce ii buffer、ddh2o up to 20μl。
[0104]
4)连接产物转化大肠杆菌trans1-t1感受态细胞，挑取单菌落接种到lb液 体培养基中，37℃震荡培养过夜；使用全长引物进行菌液pcr，以筛选阳性克 隆。同时测序检测载体构建过程中是否发生突变或者缺失现象。
[0105]
(2)启动子各片段在烟草叶片中的瞬时表达及不同激素处理下的启动子活 性分析
[0106]
1)将重组载体转化农杆菌gv3101感受态，挑取单菌落接种到lb液体培 养基中，28℃震荡培养2d；使用全长引物进行菌液pcr，以筛选阳性克隆。
[0107]
2)将pbi121-gus、ppmgpps-1690bp-gus、ppmgpps-1130bp-gus及 ppmgpps-570bp-gus的农杆菌菌株加入到50ml含100mg/l rif和100mg/l kan 的lb液体培养基中28℃，200rpm过夜摇菌，直至菌液od
600
＝0.8-1.0。
[0108]
3)取适量菌液5000rpm离心10min，弃上清。
[0109]
4)配制重悬液：10mm mgcl2、10mm mes与200μmol/l乙酰丁香酮(as) 溶于水中。用重悬液将离心的菌体重新悬浮，准备10ml去掉针头的注射器从烟 草背面注射烟草，并做好标记。
[0110]
5)注射后的烟草放入25℃，14h光照和10h黑暗的培养箱中培养2d。
[0111]
6)取注射不同菌株的烟草各喷施100μm茉莉酸甲酯(meja)、100mg/l 赤霉素(ga)、1mm水杨酸(sa)及100mg/l生长素(iaa)四种外源激素， 对照组用h2o处理。
[0112]
7)培养24h后，用打孔器采取注射部位的叶片用gus染色液染色，37℃避 光染色12-16h。
[0113]
8)换脱色液(70％乙醇)脱色，每2-3h更换一次脱色液，直至阴性对照的 叶片完全透明，用立体荧光显微镜拍照记录染色情况。
[0114]
通过不同长度的启动子片段在烟草叶片中瞬时表达分析，初步表明各片段均 能启动其相应的顺式作用元件。
[0115]
实施例5马尾松pmgpps基因原核表达
[0116]
(1)peasy-blunt e2-pmgpps载体构建
[0117]
1)目的片段与载体的连接与转化
[0118]
使用peasy-blunt e2载体作为原核表达载体，将4μl pmgpps质粒与1μlpeasy-blunt e2轻轻混合，室温反应5分钟，反应结束后置于冰上。转化大肠 杆菌trans1-t1，转化步骤同实例1(4)，涂布amp抗性的lb固体培养基。阳 性检测后进行测序。
[0119]
其中阳性克隆检测引物为：
[0120]
t7启动子引物：5
′‑
taatacgactcactataggg-3
′
；
[0121]
t7终止子引物：5
′‑
tgctagttattgctcagcgg-3
′
。
[0122]
2)重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)
[0123]
取50μl冰上融化的bl21(de3)感受态细胞，加入5μl e2-pmgpps重组质 粒并轻轻混匀，冰上静置25分钟。42℃水浴热激45s，冰浴静置2min。在离心 管中加入700μl无抗lb液体培养基，放入摇床37℃，200rpm复苏60min。5000rpm 离心1min收菌，留取200μl上清吹打重悬菌液并涂布到含amp的lb固体培养 基上，37℃倒置过夜培养。阳性检测后进行测序。
[0124]
(2)原核表达分析及蛋白纯化
[0125]
1)iptg诱导蛋白表达
[0126]
挑取e2-pmgpps-de3单克隆菌株至5ml含100mg/lamp的lb液体培养基 中，放入37℃摇床200rpm摇菌12h。将菌液接种到50ml含100mg/lamp的lb 液体培养基中，37℃，200rpm摇菌3-4h，直至od
600
＝0.8，取出10ml菌液作为 对照，暂时放4℃保存。将剩余菌液分成两部分分别加入0.5mmol/l、1mmol/l iptg诱导蛋白表达，37℃，200rpm摇菌6-8h。将所有的菌液6000rpm，8min 离心收菌，弃上清。加入10ml 1
×
pbs震荡重悬菌体，6000rpm，8min离心收菌， 弃上清，重复两次后，加入10ml 1
×
pbs震荡重悬菌体，准备破碎。采用冻融法 破碎：先放入液氮中速冻，随后37℃水浴融化，震荡，重复4-6次。破碎结束后， 6000rpm，8min离心收菌，取上清，4℃保存备用。
[0127]
2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测目的蛋白
[0128]
配制胶：将玻璃板装至凝胶模具中，按说明书先配10ml 10％的分离胶，立 刻打入模具中，注入蒸馏水与玻璃齐平，等待30-40min，待分离胶凝固后，倒 掉蒸馏水并用滤纸吸尽残留水分，再配制4ml 5％的浓缩胶，打入模具，插上梳 子，静置40min左右后装进电泳槽中等待跑胶。
[0129]
配制5
×
tris-甘氨酸电泳缓冲液：在去离子水中加入0.125mol/l tris、 1.25mol/l甘氨酸、0.5％sds，室温保存。
[0130]
点完样后，设置电压为160v，电泳时长50min，随后将胶取出冲洗干净， 用考马斯亮蓝超快染色液染色30-40min，再用清水脱色至看清蛋白条带为止， 拍照记录。
[0131]
3)蛋白纯化
[0132]
准备好蛋白上清液，按照ni-nta亲和层析介质说明书进行蛋白纯化。将介 质装入柱子中，用四倍柱体积的平衡缓冲液洗涤后，加入蛋白澄清样品，流速控 制为0.5-1ml/min，随后以流速为1ml/min的洗涤缓冲液洗涤柱子以去除杂蛋白， 直到流出液的a280值达
到最低且稳定。最后用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液以 0.5-1ml/min的流速洗脱，分管收集洗脱液，测定a280的数值至最低且稳定时停 止收集，取a280数值最高的几管洗脱液进行电泳检测，方法同实例5(2)2)。
[0133]
缓冲液方法如下(均溶于蒸馏水中)：
[0134]
lysis平衡缓冲液(le buffer)：50mm na2hpo4 0.3m nacl；
[0135]
洗涤缓冲液：50mm na2hpo4 0.3m nacl 10mm咪唑(imidazole)；
[0136]
洗脱缓冲液：50mm na2hpo4 0.3m nacl 250mm咪唑(imidazole)。
[0137]
实施例6 pmgpps转基因拟南芥鉴定与筛选
[0138]
构建35s：pmgpps表达载体，转入野生型哥伦比亚拟南芥中，比较t3代 转基因拟南芥和野生型拟南芥的差异，观察马尾松pmgpps基因是否能促进萜 类化合物的产生，分析马尾松pmgpps基因的功能。
[0139]
(1)pcambia-pmgpps-1302载体构建
[0140]
本发明所用大肠杆菌菌株为trans1-t1(transgen)；表达载体为 pcambia-1302(南京林业大学实验室保存)；限制性内切酶和连接酶购自诺唯赞 (vazyme)。
[0141]
具体步骤如下：
[0142]
通过pcr向三个片段上下游分别添加ncoi和spe i酶切位点，1.2％琼脂糖 凝胶电泳进行分离；用gel dna extraction mini kit进行回收并纯化酶 切产物，溶于20μl的elution buffer中。
[0143]
1302-pmgpps-f：5
′‑
cacgggggactcttgaccatgatgacggtaggaa ctaatcat-3
′
；
[0144]
1302-pmgpps-r：5
′‑
gaaaagttcttctcctttactagtcagatctaccat cttctgtcttgaggcaatgta-3
′
。
[0145]
2)pcr产物测序正确后，酶切载体、连接、转化、阳检、送测，测序正确 的质粒转入农杆菌用于转化拟南芥。使用ncoi和spe i内切酶进行酶切反应处 理pcambia-1302表达载体，酶切载体体系同实例4(1)2)；连接转化体系、 程序同实例4(1)3)和实例1(4)。
[0146]
(2)拟南芥的培养
[0147]
1)拟南芥种子消毒：取适量野生型拟南芥种子放入灭菌后的ep管中，加 入适量75％乙醇，振荡消毒30s后吸出；加入同等量0.1％升汞，消毒2.5min后 吸出(弃于专用废液缸)；加入同等量去离子水，振荡洗涤后吸出并将种子放于 新ep管中；重复水洗四次。
[0148]
2)拟南芥的培养：将消毒完毕后的种子置于悬浮液中，利用移液枪均匀播 入1/2ms培养基中；密封好培养基，放入4℃冰箱中春化3天；将春化后的培养 基置于23℃恒温培养室培养7天；待拟南芥幼苗长出2片真叶时，将拟南芥移 栽至事先准备好的基质培养土中，并放入光照培养箱中培养，光照培养箱设置参 数为：23℃恒温、光强5ls，湿度75％，光照时间16h/d；待拟南芥进入盛花期 前用于转化。
[0149]
(3)农杆菌的转化
[0150]
将重组载体转化农杆菌gv3101感受态，挑取单菌落接种到lb液体培养基 中，28℃震荡培养2d；使用全长引物进行菌液pcr，以筛选阳性克隆，4℃保存 阳性克隆备用。待种植的健康状态的拟南芥生长至开花。将pcr检测的阳性克 隆，摇菌至od
600
为0.8时，进行拟南芥花器官浸泡转化。
[0151]
具体步骤如下：
[0152]
将菌液5000rpm，5min离心，收集菌体，用5％蔗糖溶液悬浮；
[0153]
1)在浸泡前，加入silwetl-77，浓度为0.05％(500μl/l)，晃出泡沫；
[0154]
2)将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡30sec，期间轻轻晃动；
[0155]
3)将浸过的拟南芥平躺在托盘里，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h；
[0156]
4)揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水；
[0157]
5)收集拟南芥的种子为t1代种子，并于37℃烘干一周后保存。
[0158]
(4)转pmgpps基因的拟南芥t1代阳性植株的筛选及t3代转基因苗的获 取
[0159]
1)t1代转基因拟南芥pcr检测
[0160]
农杆菌侵染转化过的拟南芥的种子经消毒后播入含卡那霉素(50mg/l)的 1/2ms培养基中，春化3d开始发芽后，转入光照培养室，观察植株生长变化。 由于卡那霉素的影响，非转基因植株与对照组植株幼苗逐渐黄化枯萎，转基因幼 苗正常生长。10d左右转基因植株与对照组植株全部黄化死亡。经卡那霉素筛选 后获得15株植株，分别命名为t1-1至t1-15。试剂盒提取这15个转基因拟南 芥株系的dna后(方法同实施例3(1))，进行pcr检测，t1-1至t1-15分 别获得了相应条带(目的片段长485bp)，即成功转入基因pmgpps。
[0161]
t1代转基因拟南芥pcr检测上游引物：
[0162]5′‑
atgggttacagtggcatggt-3
′
；
[0163]
t1代转基因拟南芥pcr检测下游引物：
[0164]5′‑
gcacaagcagttggcatcgc-3
′
。
[0165]
pcr体系(50μl)为：19μl ddh2o，25μl 2
×
taq pcr master mix，2μlprimer-f(10μm)，2μl primer-r(10μm)，2μl dna。
[0166]
pcr程序为：95℃5min；95℃15s，58℃15s，72℃1min，35cycles；72 ℃5min；4℃保存。
[0167]
2)t3代转基因拟南芥的获取
[0168]
将上述t1代种子进行消毒处理后(方法同实例6(4)1))，播入含卡那 霉素(50mg/l)的1/2ms培养基中，春化3d后，放入适宜环境中培养(培养条 件同上)。然后移入基质土中，收取种子为t2代转基因拟南芥种子。将所得t2 代转基因拟南芥种子进行如上述步骤的培养，筛选t3代纯合转基因拟南芥种子 及植株，移入基质土后，放于光照培养箱中培养(设置参数为：23℃恒温光照、 光强5ls，湿度75％，光照时间16h/d)培养。
[0169]
(5)叶绿素含量分析
[0170]
随机选取1株野生型(wt)和8株t3代转基因拟南芥植株，每个株系三 个重复，剪取拟南芥叶片60mg，根据植物叶绿素(chlorophyll)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书测定gpps叶绿素的含量。
[0171]
具体步骤如下：
[0172]
1)称取约新鲜植物叶片或其它绿色组织，去掉中脉，称取约0.1g，剪碎， 用蒸馏水洗干净。
[0173]
2)提取液的准备：取400ml无水乙醇和800ml丙酮，充分混匀待用。
[0174]
3)加入1ml蒸馏水，少量试剂一(约50mg)，在黑暗或弱光条件下充分 研磨，转入10ml玻璃试管。
[0175]
4)用提取液冲洗研钵，将所有冲洗液转入玻璃试管，用提取液补充至10ml， 玻璃
试管置于黑暗条件下或者包上锡箔纸浸提3h，观察试管底部组织残渣完全 变白则提取完全，若组织残渣未完全变白，继续浸提至其完全变白。
[0176]
5)取浸提液200μl于微量石英比色皿/96孔板，提取液调零，测定663nm 和645nm处吸光值，分别记为a663和a645。
[0177]
计算公式如下所示：
[0178]
叶绿素a含量(mg/g鲜重)＝(12.7
×
a663-2.69
×
a645)
×
v提
×d÷mꢀ÷
1000＝0.01
×
(12.7
×
a663-2.69
×
a645)
×d÷
m；
[0179]
叶绿素b含量(mg/g鲜重)＝(22.9
×
a645-4.68
×
a663)
×
v提
×d÷mꢀ÷
1000＝0.01
×
(22.9
×
a645-4.68
×
a663)
×d÷
m；
[0180]
叶绿素总含量(mg/g鲜重)＝(20.21
×
a645 8.02
×
a663)
×
v提
×d÷ꢀm÷
1000＝0.01
×
(20.21
×
a645 8.02
×
a663
×d÷
m；
[0181]
v：提取液体积，10ml；d：稀释倍数；m：样本质量，g。
[0182]
(6)gpps酶活性分析
[0183]
随机选取1株野生型(wt)和8株t3代转基因拟南芥植株，每个株系三 个重复，剪取拟南芥叶片60mg。gpps酶活性由上海沪鼎生物科技有限公司根 据植物牻牛儿基焦磷酸合酶(gpps)酶联免疫分析试剂盒使用说明书测定。
[0184]
(7)转基因拟南芥种萜类物质合成相关基因的表达分析
[0185]
pmgpps在拟南芥中过表达后，进行qpcr分析萜类物质合成途径中其他一 些基因的表达情况，如的1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸还原酶(dxr)、4-羟基-3-甲 基-2-苯基二磷酸还原酶(hdr)、八氢番茄红素合成酶(psy)及萜类合成酶(tps)、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶a还原酶(hmgr)、甲戊酸激酶(mk)。将拟南芥 actin2作为内参基因(安航，2020)，通过primer 5.0设计各基因的特异性引物， 各目的片段扩增长度为150-200bp。方法、程序同实施例2(2)。
[0186]
引物序列如下：
[0187]
atactin2-f：5
′‑
gctctcctttgttgctgtt-3
′
；
[0188]
atactin2-r：5
′‑
gaatctctcagcaccaatcg-3
′
。
[0189]
qatdxr-f：5
′‑
taaaggaagttaaagtagcgg-3
′
；
[0190]
qatdxr-r：5
′‑
ctgtgtttcaatcatggaatg-3
′
。
[0191]
qathdr-f：5
′‑
cgtttgtgattacattctcgg-3
′
；
[0192]
qathdr-r：5
′‑
atctcctctgtttctcccttt-3
′
。
[0193]
qathmgr-f：5
′‑
actcagcacgaaccctctcc-3
′
；
[0194]
qathmgr-r：5
′‑
aatcaaaacgaatccaccca-3
′
。
[0195]
qatmk-f：5
′‑
ctccttgcttcttctatttc-3
′
；
[0196]
qatmk-r：5
′‑
cactgacggtgttgtctatc-3
′
。
[0197]
qatpsy-f：5
′‑
gggttgctacttcttctcta-3
′
；
[0198]
qatpsy-r：5
′‑
tcttctacttcggttcctta-3
′
。
[0199]
qattps-f：5
′‑
gacgaagacggtgaagaggac-3
′
；
[0200]
qattps-r：5
′‑
aacgaaccaacgaggataaga-3
′
。
[0201]
本技术以模式植物拟南芥为研究对象，将克隆得到的马尾松异戊烯基转移 酶基
因pmgpps利用农杆菌介导转化至拟南芥中，通过筛选与培育，最终获得 t3代纯合转基因植株。通过检测野生型拟南芥与8个转基因拟南芥株系的生理 指标，发现转基因拟南芥中gpps酶活性和叶绿素含量均高于野生型拟南芥， 同时，萜类物质合成相关基因的表达量较野生型均有不同程度的上调。