用于检测黄瓜抗细菌性角斑病性状的SNP分子标记及其应用

用于检测黄瓜抗细菌性角斑病性状的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测黄瓜抗细菌性角斑病性状的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.黄瓜是人们生活中常见的具有丰富营养价值的一种蔬菜，近年来随着人们对黄瓜的需求量日益增加，黄瓜的栽培面积越来越大。早在20世纪50年代，我国就有黄瓜细菌性角斑病(cucumber bacterial angular leaf spot)发生的报道(方仲达和俞大绂，1956)，该病害主要发生在东北、华中和华北等地区，病害发生严重时，病株率可达到100％，使黄瓜减产大半，甚至绝收。细菌性角斑病在黄瓜的苗期和成株期均可发病，叶片初期会出现黄色圆形小斑点，后期圆形斑点由于受叶脉限制而发展成为多角形褐色斑点，最终导致叶片穿孔、干枯、植株死亡(陈明和赵永波，2010；李宝聚和李焕玲，2012；刘燕妮等，2018)。
3.黄瓜细菌性角斑病抗性是多基因控制的数量遗传性状(chand&walker，1964)，目前仅有少数研究定位了黄瓜细菌性角斑病抗病相关的基因/qtl位点。等人(2018)使用snp标记构建包含7个连锁群，717个位点的遗传图谱，图长599.7cm，平均距离为0.84cm，最终在5号染色体上检测到psl5.1和psl5.2这2个主效qtl位点。zhang等(2019)利用重组自交系群体发现细菌性角斑病抗性由单隐性位点psl-1控制，并将psl-1定位到1号染色体的3,118,855～3,951,558bp区间。wang等(2019)发现gy14
×
wi2757群体中dm1、cla、psl是同一位点，黄瓜对3种病害的抗性可能是由同一个基因cssgr(pan et al.，2018)控制的，但其分子机制尚未研究清楚。吴志明等(2019)基于黄瓜细菌性角斑病抗性基因cspsl的snp位点开发了1个kasp标记。
4.上述研究对于开展黄瓜细菌性角斑病的分子标记辅助育种奠定了一定的基础，然而依然缺乏与细菌性角斑病抗性基因紧密连锁的分子标记，且很少应用于黄瓜育种。


技术实现要素：

5.本发明基于对上述领域的研究，提供一种与黄瓜细菌性角斑病相关的snp分子标记，所述snp分子标记位于黄瓜第6号染色体上物理位置7,969,469
‑‑
7,969,682bp处，其中第7969575位的碱基为g或a，该位点碱基为g的黄瓜材料为细菌性角斑病抗性候选材料，碱基为a的黄瓜为细菌性角斑病易感候选材料。
6.所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示,其中第107位碱基是g或a。
7.本发明还提供一种用于检测上述的snp分子标记的特异性引物对，包括引物psl-snp1-f、psl-snp1-r，所述引物的序列为：
8.psl-snp1-f：5
’‑
ctgggagttcagtatcaggaggtc-3’，
9.psl-snp1-r：5
’‑
gggatggaggttgatgataaaa-3’。
10.本发明还提供一种用于检测上述的snp分子标记的试剂盒，包含上述的特异性引物对。
11.优选地，所述试剂盒还包含黄瓜基因组dna提取试剂、pcr扩增反应试剂、pcr扩增产物测序试剂。
12.本发明最后提供上述的snp分子标记在如下(1)-(5)任一中的应用：
13.(6)鉴定或辅助鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性材料；
14.(7)鉴定或辅助鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因cspsl6.1；
15.(8)筛选或者辅助筛选抗细菌性角斑病的黄瓜品种；
16.(9)培育或者辅助培育抗细菌性角斑病的黄瓜品种；
17.(10)黄瓜育种。
18.所述应用包括以下步骤：提取待测样品的基因组dna作为模板，采用前述的snp分子标记的扩增引物进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行测序判断。
19.优选地，所述snp分子标记的扩增引物如下：
20.psl-snp1-f：5
’‑
ctgggagttcagtatcaggaggtc-3’，
21.psl-snp1-r：5
’‑
gggatggaggttgatgataaaa-3’；
22.pcr扩增获得214bp片段，其第107个碱基为g的黄瓜材料为细菌性角斑病抗性候选材料，为a的黄瓜材料为细菌性角斑病易感候选材料。
23.pcr扩增的反应体系为：总反应体系20μl，浓度5.0ng
·
μl-1
的基因组dna 2μl，浓度50ngμl-1
的引物psl-snp1-f/psl-snp1-r各1μl，10μl 2
×
phanta max master mix，6μl双蒸水。
24.pcr扩增的程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟。
25.本发明的有益效果是：鉴别到了与细菌性角斑病抗性基因相关的snp位点，经实验验证证实，该snp位点与黄瓜抗细菌性角斑病基因cspsl6.1紧密连锁，可用于鉴别黄瓜对细菌性角斑病的抗性；采用本发明获得的snp标记，可以在黄瓜候选材料的苗期判断出材料是否抗细菌性角斑病，从而进行对植株抗性材料的筛选，提高了选育抗细菌性角斑病黄瓜育种材料的效率，缩短了育种周期，为开展黄瓜细菌性角斑病的分子标记辅助育种奠定了一定的基础。
具体实施方式
26.以下结合具体实施例进一步阐述本发明，需要说明的是，实施例仅用于解释本发明而不代表限制本发明的范围。
27.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。
28.试验材料
29.本发明所用的试验材料为黄瓜cg104(p1)、cg37(p2)，及其188个株系的ril重组自交系群体，以及中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组保存的68份黄瓜核心种质材料。以上试验材料本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
30.cg104：生长势强，分枝中等，节间长度较长，叶片较大,茎粗壮，第一雌花节位为第4节，雌花节率为30％左右，瓜色深花绿，不亮，果粉轻，瓜长18.9cm,把长1.9cm，瓜粗4.1cm，
心腔1.9cm,刺白稀，瘤大，微棱，少纹，为抗细菌性角斑病材料。
31.cg37：生长势中等，分枝中等，节间长度中等，叶片较小,茎粗中等，第一雌花节位10节以上，雌花节率为17％左右，瓜色深绿，果粉较重，瓜长6.3cm,把长0.6cm,瓜粗3.7cm,心腔2.3cm，刺黑、较密，无瘤，无棱，无纹，为感细菌性角斑病材料。
32.psl-snp标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用primer 5.0软件设计，并在北京生工公司合成。重测序的基因组信息详见qi等在《nature genetics》杂志2013年发表的论文《a genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity》。
33.主要试剂
34.pcr实验使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的2
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phanta max master mix；测序由生工生物工程股份有限公司完成。
35.实施例1.黄瓜抗细菌性角斑病基因连锁的snp标记的获得
36.在前期研究中我们利用抗细菌性角斑病材料
‘
cg104’为母本和感细菌性角斑病材料为父本
‘
cg37’，以及其杂交后代通过单粒传方法多年自交构建了188个株系的ril重组自交系群体作为试验材料，分别在2020年和2021年进行两次黄瓜幼苗期细菌性角斑病接种鉴定。以叶片上的病斑数量及面积为分级标准，划分为0级、1级、2级、3级、4级、5级，并计算病情指数，结果如表1中所示。依据病情指数进行遗传分析得到双亲间病情指数差异显著，ril群体的病情指数呈正态分布，符合数量性状遗传。
37.表1.黄瓜细菌性角斑病病情指数
[0038][0039]
利用ril群体的病情指数结合高密度遗传图谱进行qtl定位研究，两次重复检测到抗细菌性角斑病主效位点psl6.1，物理位置定位在6号染色体7.4-9.2mb之间，lod值为6.12，贡献率达11.83％。
[0040]
在此目标区域内结合课题组重测序的基因组信息，根据亲本snp位点多态性发现第7969575位的碱基在抗病亲本材料cg104中，该位点碱基为g；在感病亲本材料cg37中，该位点碱基为a。基于获得的黄瓜抗细菌性角斑病基因的snp标记snp7969575，通过黄瓜基因组数据库网站(http://cucurbitgenomics.org/)下载黄瓜6号染色体参考基因组(华北型黄瓜品系9930的参考基因组序列，版本号为v2)的上述区段的dna序列，利用引物设计软件primer premier 5.0设计引物。
[0041]
设计的引物的核苷酸序列如下所示：
[0042]
psl-snp1-f(seq id no.1)：5
’‑
ctgggagttcagtatcaggaggtc-3’，
[0043]
psl-snp1-r(seq id no.2)：5
’‑
gggatggaggttgatgataaaa-3’。
[0044]
随后进行pcr扩增及扩增产物序列的测序，按照改良的ctab法(clark，1998)提取黄瓜叶片样品基因组dna。
[0045]
pcr反应体系为：总反应体系20μl,2μl基因组dna(5.0ng
·
μl-1
)，引物psl-snp1-f/
psl-snp1-r(50ng
·
μl-1
)各1μl，10μl 2
×
phanta max master mix，6μl双蒸水。
[0046]
pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，4℃保存。
[0047]
pcr扩增获得一个214bp的片段，pcr扩增产物交由生工生物工程股份有限公司北京分公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与华北型黄瓜品系9930(v2版本)基因组序列对比，得出对应snp位点的突变。
[0048]
测序结果如下所示(seq id no.3)，下划线处为snp突变位点：
[0049]
ctgggagttcagtatcaggaggtctttcttgaaactgaacactgggggcatgctgaagcctagaaaggtattcaagcagctttccttgtatttcttctaacatttg(g/a)tgtgtatttttgttctccatattactgggagcaacatgcagagtgtaatcagggccaaaatactcataatattcatgttgtggcattttatcatcaacctccatccc。
[0050]
实施例2.snp标记的验证和应用
[0051]
利用本课题保存的68份核心种质材料，按照实施例1中的pcr扩增和测序方法对获得的与cspsl6.1基因连锁的标记snp7969575 g/a进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性：pcr扩增获得一个214bp的片段，扩增出的214bp片段中第107个碱基为g的待测样品判断为抗细菌性角斑病，第107个碱基为a的待测样品判断为感细菌性角斑病。
[0052]
经和所选材料的苗期抗病鉴定表现型相比，结果如表2中所示，在68份核心种质材料中，cg49、cg118、cg6、cg9、cg39、cg52、r100的苗期抗病鉴定表型与基因型不一致，其余试验材料的基因型与苗期抗病鉴定表型一致，正确率为89.7％。
[0053]
表2.试验材料验证结果
[0054]
[0055][0056]
*注：抗病表型r为苗期抗病鉴定为抗细菌性角斑病材料，抗病表型s为苗期抗病鉴定为感细菌性角斑病材料。