检测阿尔茨海默病AD7c-NTP的垂直流分析试剂盒

检测阿尔茨海默病ad7c-ntp的垂直流分析试剂盒
技术领域
1.本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种检测阿尔茨海默病 ad7c-ntp的垂直流分析试剂盒。


背景技术：

2.根据国际阿尔茨海默病协会的数据，全球范围内，每3秒就新增一名阿尔茨海默病(alzheimers disease,ad)患者。
3.阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，是老年痴呆的主要病因。在患者大脑特别是在海马和额颞叶皮质区域，神经元发生退行性变，细胞外和细胞内产生斑块和缠结，导致神经元丢失，影响脑功能。目前还没有治愈阿尔茨海默病的方法，但是ad早期诊断为早期生活方式干预，药物干预及延缓病情提供帮助。
4.当前，用于ad诊断的特异性生物标志物有aβ42含量、tan蛋白总量和磷酸化tan蛋白等，但是这些生物学指标需要通过腰穿取脑脊液获得，有创伤性，不易被患者接受，而且上述检测未能广泛普及到普通医院，开展上述生物标志物检查工作受限。ad7c-ntp可特异性反应神经元损伤，与tau蛋白具有同等效力。且存在于尿液中，非常适合临床ad患者以及临床前具有ad危险因素的亚健康人群的早期发现与诊治。
5.目前，基于ad7c-ntp的elisa诊断试剂盒已广泛使用，试剂盒的工作原理一般是elisa双抗体夹心法，需经过待测样品孵育、一抗二抗孵育及多次的清洗过程，由于操作繁琐用时长，需要有专门的实验室来完成检测过程，社区、基层及大量临床前具有ad危险因素的亚健康人群急需快速简便的检测试剂盒。


技术实现要素：

6.本发明为解决上述技术问题提供了一种操作简单、可以快速进行阿尔茨海默病ad7c-ntp检测的垂直流分析试剂盒。
7.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种检测阿尔茨海默病ad7c-ntp的垂直流分析试剂盒，包括包被抗体、待检测抗原的检测抗体、酶标二抗和酶标板，所述待检测抗原为阿尔茨海默病 ad7c-ntp，所述包被抗体为阿尔茨海默病ad7c-ntp抗原的单抗，所述检测抗体为抗阿尔茨海默病ad7c-ntp抗原的多克隆抗体，所述酶标板包括支撑架和主体板；所述主体板水平设置在所述支撑架上，其内部设有多个中空且相互独立的反应室，所述主体板上表面开设有多个与所述反应室一一对应的加样孔，且每个所述加样孔的孔底分别开设有与对应的所述反应室的顶部相连通的加样小孔；每个所述反应室内部均自上而下的设有蛋白吸附膜和废液吸收层，所述蛋白吸附膜和所述废液吸收层自上至下依次设置在所述加样小孔下方，所述蛋白吸附膜上端覆盖于所述加样小孔处，其下端与所述废液吸收层的上表面接触。
8.所述垂直流试剂盒用于ad7c-ntp的免疫检测，其使用方法及原理为：将包被抗体结合在酶标板的蛋白吸附膜上用于捕获目标抗原，经封闭后，含有ad7c-ntp的受检标本(血
清或尿液)与包被抗体结合。再加入检测抗体用于检测目标抗原，加入对应检测抗体的酶标二抗，形成包被抗体-抗原-检测抗体-酶标二抗复合物，此时蛋白吸附膜上的酶量与标本中受检物质的有效抗体成分呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化显色，显色强度与标本中抗原含量直接相关，故可判断样品的阴阳性。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果为：将包被抗体通过加样孔和加样小孔结合在蛋白吸附膜上，通过逐步加入受检样品以及试剂即可完成检测反应，该酶标板的结构使加样液体处于流动状态，以保证对抗原抗体复合物以外的杂质进行彻底清洗，使得流经蛋白吸附膜的废液被废液吸收层吸收干净，而且在流动状态下抗原抗体的结合效率也更高。本发明的试剂盒减少了操作过程中的其他仪器的使用，简化了洗涤过程，缩短了操作时间，并大大降低了检测过程中各种抗体和试剂的使用量，相比使用传统酶标板的elisa试剂盒，本发明的试剂盒使用使得检测时间缩短90％，并节省90％以上的抗体和试剂，极大的节省了成本。
10.进一步，所述垂直流分析试剂盒还包括洗涤液、封闭液、显色底物、阳性对照和阴性对照。
11.本发明的试剂盒利用免疫反应进行ad7c-ntp的检测，酶标板、包被抗体、检测抗体和酶标二抗是其核心成分，至于辅助成分，比如洗涤液、封闭液、显色底物、阳性对照和阴性对照，可以与上述几种成分配套组装在一个试剂盒中，也可以单独提供，因此，本发明的试剂盒中可以包括这些辅助成分，也可以不包括，本发明优选包括这些辅助成分，以方便使用。
12.进一步，所述加样孔的底壁为向下突出的球面，所述加样孔的容积为90-200μl。
13.采用上述进一步方案的有益效果是使加样孔中的样品更方便的流入加样小孔中，使得加样液体充分利用，并适应在反应过程中需要添加样液的体积。
14.进一步，所述加样小孔为圆孔，其直径为1-2mm。
15.采用上述进一步方案的有益效果是使得蛋白吸附膜上的蛋白吸附区域的直径控制在1-2mm，既能保证检测的精度，又可以节省反应试剂。
16.进一步，所述蛋白吸附膜为硝酸纤维素膜、pvdf膜、玻璃纤维膜、尼龙膜或碳酸酯膜中的任一种。
17.采用上述进一步方案的有益效果是对蛋白的吸附效果好，且材料易获得。
18.进一步，所述废液吸收层为由吸水性材料制成的功能层，所述吸水性材料为海绵、吸水滤纸或吸水树脂中的任一种。
19.采用上述进一步方案的有益效果是加快实验过程中的废液吸收，使得抗原抗体复合物的清洗时间加快，提高清洗的效率，并且上述材料的吸水性好，且材料易获取，成本低。
20.进一步，所述反应室的顶壁下表面以所述加样小孔的中心点为中心设有十字花纹。
21.采用上述进一步方案的有益效果是增加反应室顶壁与蛋白吸附膜之间的摩擦，使得蛋白吸附膜更稳定，增加检测的精确度。
22.进一步，所述废液吸收层的四周与所述反应室的内侧壁接触。
23.采用上述进一步方案的有益效果是结构简单，方便的将废液吸收层在反应室内进行固定，并且对蛋白吸附膜起到支撑作用。
24.进一步，所述主体板由多个板条拼接而成，每个所述板条均包括多个反应室及与其一一对应的加样孔和加样小孔，多个所述板条分别水平设置在所述支撑架上，每个所述反应室的下部均敞口设置，所述板条的下端可拆卸的安装有用于遮盖住其上所有的所述反应室下端敞口的条底板。
25.采用上述进一步方案的有益效果是使用方便，可以根据检测样本的数量选择板条的条数，节省成本，提高酶标板的利用率，且结构简单，当上样液体比较少时，废液可以完全被废液吸收层吸收，当上样液体量比较大时，可以将废液固定在板条的反应室内不流出，避免污染桌面。
附图说明
26.图1为本发明实施例1的酶标板的结构示意图；
27.图2为本发明实施例1中酶标板去除底板、蛋白吸附膜和废液吸收层的结构示意图；
28.图3为本发明实施例1的主体板的剖视图；
29.图4为本发明实施例2的酶标板的结构示意图；
30.图5为本发明实施例2中酶标板去除蛋白吸附膜和废液吸收层的结构示意图；
31.图6为本发明实施例2中板条的结构示意图；
32.图7为本发明实施例2中板条去除蛋白吸附膜和废液吸收层的结构示意图；
33.图8为本发明实施例2中包含条底板的机构示意图。。
34.附图中，各标号所代表的部件列表如下：
35.10、支撑架，20、主体板，21、隔板，22、反应室，23、加样孔， 24、加样小孔，25、底板，30、蛋白吸附膜，40、废液吸收层，50、板条，51、条底板。
具体实施方式
36.以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
37.实施例1
38.本实施例提供了一种检测阿尔茨海默病ad7c-ntp的垂直流分析试剂盒，包括包被抗体、待检测抗原的检测抗体、酶标二抗和酶标板，所述待检测抗原为阿尔茨海默病ad7c-ntp抗原，所述包被抗体为阿尔茨海默病ad7c-ntp抗原的单抗，所述检测抗体为抗阿尔茨海默病ad7c-ntp抗原的多克隆抗体。
39.酶标板的结构如图1-3所示，包括支撑架10和主体板20；所述主体板20水平设置在所述支撑架10上，其内部设有多个中空且相互独立的反应室22，所述主体板20上表面开设有多个与所述反应室22 一一对应的加样孔23，且每个所述加样孔23的孔底分别开设有与对应的所述反应室22的顶部相连通的加样小孔；每个所述反应室22内部均自上而下的设有蛋白吸附膜30和废液吸收层40，所述蛋白吸附膜30上端覆盖于所述加样小孔24处，其下端与所述废液吸收层40 的上表面接触。
40.可以通过在主体板20的内部空腔中纵横交错设置多个隔板21，将空腔分隔成多个反应室22，每个所述反应室22的下部均敞口设置或所述主体板20的下端可拆卸的安装有用
于遮住其上所有的所述反应室22下端敞口的底板25。
41.蛋白吸附膜30设置在加样小孔24下方，可以为圆形，也可以为方形或其他形状，其中心点为加样小孔24的中心点尽量保持在同一竖直方向上，废液吸收层40的上端将所述蛋白吸附膜30的下端完全覆盖住。
42.在免疫检测过程中，将目的抗原或抗体通过加样孔23和加样小孔24结合在蛋白吸附膜30上，通过逐步加入样品以及试剂即可完成检测反应，该结构使加样液体处于流动状态，以保证对抗原抗体复合物以外的杂质进行彻底清洗，使得流经蛋白吸附膜30的废液被废液吸收层40吸收干净，而且在流动状态下抗原抗体的结合效率也更高。
43.本实施例中，将包被抗体结合在酶标板的蛋白吸附膜上用于捕获目标抗原，经封闭后，含有ad7c-ntp抗原的受检标本与包被抗体结合。再加入检测抗体用于检测目标抗原，加入对应检测抗体的酶标二抗，形成包被抗体-抗原-检测抗体-酶标二抗复合物，此时蛋白吸附膜上的酶量与标本中受检物质的有效抗体成分呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化显色，显色强度与标本中抗原含量直接相关，故可判断样品的阴阳性。
44.在一个优选方案中，上述试剂盒还包括洗涤液、封闭液、显色底物、阳性对照和阴性对照。
45.本实施例中的的酶标板可以替代传统的酶标板，与酶标板配套仪器如酶标仪配套使用，因此酶标板的尺寸可以采用现有的标准，支撑架10的形状可以参考通用的96孔酶标板，支撑架10的外框的尺寸可以采用长12.3mm*宽8.5mm*高1.4mm各尺寸可上下浮动1-2mm。
46.主体板20可以采用pc材料、pmma、pok、abs材料等，材料颜色可以根据调色可以获得各种颜色，目前使用的主要有两种颜色，白色或黑色，白色用于tmb显色和ecl显色，黑色用于荧光检测。主体板20上按照8*16的矩阵设有96个加样孔23和反应室22，主体板20直接设置在支撑架10上，也可以通过其两端的搭扣可拆卸的卡在支撑架10两端的卡槽内。
47.在一个优选方案中，所述加样孔23的底壁为向下突出的球面，方便加样孔23中的样品流入加样小孔24中，使得加样液体充分利用，加样孔23的容积为90-200μl，可以适应在反应过程中需要添加样液的体积。
48.在一个优选方案中，所述蛋白吸附膜30为硝酸纤维素膜、pvdf 膜、玻璃纤维膜、尼龙膜或碳酸酯膜中的任一种，上述对蛋白的吸附效果好，且材料易获得。蛋白吸附膜30可以为圆形，也可以为方形，其中心点与加样小孔24的中心点尽量保持在同一竖直方向上，其边缘位于加样小孔24边缘的外侧。
49.在一个优选方案中，所述废液吸收层40为由吸水性材料制成的功能层，加快实验过程中的废液吸收，使得抗原抗体复合物的清洗时间加快，提高清洗的效率，所述吸水性材料为海绵、吸水滤纸或吸水树脂中的任一种，上述材料的吸水性好，可以快速吸收废液，使膜上无污染物残留，从而保证背景干净，提高反应信噪比，且材料以获取，成本低。
50.在一个优选方案中，所述加样小孔24为圆孔，其直径为1-2mm，使得蛋白吸附膜30上的蛋白吸附区域的直径控制在1-2mm，既能保证检测的精度，又可以节省反应试剂。
51.将几种免疫检测方法的流程进行比较，结果如下表1所示：
52.表1不同免疫检测方法的操作流程比较
[0053][0054][0055]
与现有技术相比，利用本实施例中的垂直流分析试剂盒进行免疫检测具有如下有益效果为：
[0056]
1)利用本发明的垂直流分析试剂盒进行免疫检测的过程中，减少了操作过程中的其他仪器的使用；
[0057]
2)本发明的垂直流分析试剂盒进行免疫检测的操作时间短，与使用传统酶标板的elisa方法相比，使得检测时间缩短了90％。
[0058]
3)各种抗体和试剂的使用量，与使用传统酶标板的elisa方法相比，可节省90％以上的抗体和试剂，节省了成本。
[0059]
抗体的质量决定了免疫反应的特异性和敏感度，也就决定了免疫检测的质量，并且显色底物作为常用的显色剂，市场上的购买价格在 1-10元/ml左右，对于大量使用的检测试验来说，也是一个巨大的成本。下面以常用的双抗体夹心法检测抗原技术为例，比较使用传统酶标板的elisa试剂盒与本发明的垂直流分析试剂盒进行操作使用的各种试剂的剂量。
[0060]
抗体：使用传统酶标板进行elisa检测一抗加入量一般是100ul/ 孔，二抗对应的稀释液也加100ul/孔，而使用本发明的垂直流分析试剂盒，进行免疫检测时一抗和二抗分别只需要加1-2ul/孔，节省了抗体量；
[0061]
显色液：使用传统酶标板进行elisa检测一般加入的显色底物为50-100ul/孔，使用本发明的垂直流分析试剂盒，由于该酶标板进行免疫检测反应集中在加样小孔24对应的蛋白吸附膜30上，面积很小，需要的显色液非常少，一般只需要5ul/孔，节省了反应底物90％以上；
[0062]
清洗液：使用传统酶标板进行elisa检测中，多次清洗孔板是最大的工作量，为了减少操作者的手动工作，很多自动移液系统被用于洗板，但是清洗液的使用仍然很大，预计完成一个96孔酶标板的清洗需要的清洗液约为300ml，使用本发明的垂直流分析试剂盒进行免疫检测过程中，由于酶标板的结构可以使清洗液处于流动状态，用很少的清洗液即可将蛋白吸附膜30清洗干净而不会造成废液污染，预计完成一个96孔的酶标板的清洗需要的清洗液约为3ml。
[0063]
4)本发明的垂直流分析试剂盒中的酶标板可同时检测96孔的样品，且各样品中间通过隔板21分开不会相互污染，由于各样品之间具有独立性，一块板可以分多次使用，已使用的孔不会对干净的孔造成影响。
[0064]
5)使用本发明的垂直流分析试剂盒进行免疫检测的过程中，可以使用多种显色方法进行显色，包括tmb直接显色对样品进行定性分析和ecl显色通过化学信号读数对样品进行定量分析，ecl法的检测限为0.2ng；使用传统酶标板进行elisa检测的过程中，一般使用tmb显色通过蓝色的深浅对样品进行定性或半定量的测定，检测限为1ng，使用本发明的试剂盒进行检测的检测限高。
[0065]
在一个优选方案中，所述反应室22的顶壁下表面以所述加样小孔24的中心点为中心设有十字花纹，增加反应室22顶壁与蛋白吸附膜30之间的摩擦，使得蛋白吸附膜30更稳定。
[0066]
在一个优选方案中，所述废液吸收层40的四周与所述反应室22 的内侧壁接触，结构简单，方便的将废液吸收层40在反应室22内进行固定，并且对蛋白吸附膜30起到支撑作用。以加样孔23的外圈直径为8mm，孔深度为4mm，孔容积为100μl，反应室22长宽高分别为8mm*8mm*8mm，加样小孔24直径为1.5mm为例，蛋白吸附膜 30若为圆形，直径设为5-8nm为例，海绵选择尺寸为8mm*8mm*8mm 的正方体，设置在反应室22中，其形状与反应室22的形状相适应，可以固定在反应室22内。
[0067]
实施例2
[0068]
如图4-8所示，在一个优选方案中，本实施例的其他技术方案同实施例1，所述主体板20由多个板条50拼接而成，每个所述板条50 均包括多个反应室22及与其一一对应的加样孔23和加样小孔24，多个所述板条50分别水平设置在所述支撑架10上，每个板条50可以通过搭扣扣在支撑板上，使用方便，可以根据检测样本的数量选择板条50的条数，节省成本，提高本发明的酶标板的利用率。
[0069]
优选的，每个板条50上设有一排或一列反应室22，即板条50 上可以设有8个加样孔23，也可以设有12个加样孔23，与传统的可拆式的酶标板类似。
[0070]
在一个优选方案中，每个所述反应室22的下部均敞口设置，结构简单，当上样液体比较少时，废液可以完全被废液吸收层40吸收。
[0071]
在一个优选方案中，所述板条50的下端可拆卸的安装有用于遮盖住其上所有的所述反应室22下端敞口的条底板51，条底板51可以可拆卸的安装，实现可拆卸安装的结构有多种，均属于现有技术，其中一种实施方式为：条底板的左右两端向上延伸形成连接部，两个连接部相对的一侧设有凸起，底板左右两侧上与连接部相对应的位置上设有与凸起匹配的凹陷，使得条底板51可以卡在板条50的下端，也可以选择其他的实施方式。
[0072]
当上样液体量比较大时，可以将废液固定在板条50内不流出，避免污染桌面。在某些情况下，如果加入的液体超过反应室22的体积，或者希望液体流速快一些，可以将条底板51换成几层吸水纸。
[0073]
实施例3
[0074]
检测阿尔茨海默病ad7c-ntp的垂直流分析试剂盒的制备方法如下：
[0075]
1、抗原抗体原材料的制备
[0076]
(1)ad7c-ntp蛋白的制备：通过对ad7c-ntp蛋白的氨基酸序列分析发现其中包含3个跨膜区，为了在大肠杆菌表达系统中正常的可溶性表达，通过生物信息学软件分析，我们从全长蛋白上截取了两段序列(ad7c-1及ad7c-2)，分别进行克隆表达。取筛选好的菌种，在lb-kan(含50ug/ml卡那霉素)平板上划线，37℃过夜培养。取单菌落接种于5ml lb-kan(含50ug/ml卡那霉素)液体培养基中， 37℃过夜培养。取出4ml培养液，离心去上清，用新鲜自诱导培养基重悬接种到400ml自诱导-kan(含50ug/ml卡那霉素)液体培养基中，37℃过夜培养。菌种经诱导表达后，4000rpm离心10分钟收集菌体，将菌体进行超声裂解，8000rpm离心10min收集菌体上清，用 ni柱纯化，收集不同浓度的咪唑洗脱液，采用sds-page对表达蛋白的分子量、纯度进行鉴定。
[0077]
(2)单抗的制备：纯化的ad7c-1蛋白及ad7c-2蛋白分别免疫小鼠，取脾脏与骨髓瘤细胞融合，筛选高效表达的杂交瘤细胞，腹腔接种，采集腹水。单抗用protein g填料进行亲和纯化，甘氨酸洗脱，用pbs透析48h，bca法检测单抗浓度，用ad7c-1蛋白及ad7c-2 蛋白分别包被elisa检测单抗效价及特异性。最终获得ad7c-2单克隆抗体。
[0078]
(3)多抗的制备：纯化的ad7c-1蛋白及ad7c-2蛋白按照1:1 的比例混合后免疫新西兰大耳兔，动物免疫经过首免、十天后二免、一周后三免、两周后四免、一周后五免共2个月的时间，每次免疫前耳静脉采血检测抗体情况，达到效价1:10000以上后采集兔血清。多抗用protein g填料进行亲和纯化，甘氨酸洗脱，用pbs透析48h， bca法检测单抗浓度，wb法检测血清特异性，用ad7c-1蛋白及ad7c-2蛋白分别包被elisa检测多抗效价。
[0079]
2、传统elisa双抗体夹心法测试
[0080]
传统elisa法开发：将单抗和多抗梯度稀释进行棋盘试验，测试单抗包被浓度和多抗的检测浓度。单抗包被浓度为1:100、1:1000、 1:10000、1:100000，用ph9.0碳酸盐包被液稀释，4度包被过夜。用3％脱脂乳37度封闭2h。待测样品为ad7c标准蛋白1mg/ml母液梯度稀释液，1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000 共6个梯度，阴性对照为pbs液，加样后37度孵育1h。检测抗体为阿尔茨海默病ad7c-ntp多抗，用pbs进行梯度稀释1:100、1:1000、 1:10000、1:100000。用羊抗兔hrp酶标二抗按说明书推荐使用浓度 1:4000检测，单组份tmb试剂显色，终止液终止，波长450nm读数。数据分析：最优的单抗包被和多抗检测的浓度标准为阴性对照 od450小于0.2，同时对ad7c蛋白的检测限低。
[0081]
测试多抗包被浓度和单抗检测浓度。多抗包被浓度为1:100、 1:1000、1:10000、1:100000，用ph9.0碳酸盐包被液稀释，4度包被过夜。用3％脱脂乳37度封闭2h。待测样品为ad7c标准蛋白1mg/ml 母液梯度稀释液，1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000 共6个梯度，阴性对照为pbs液，加样后37度孵育1h。检测抗体为 ad7c-2单抗，用pbs进行梯度稀释1:100、1:1000、1:10000、 1:100000。用羊抗鼠hrp酶标二抗按说明书推荐使用浓度1:4000检测，单组份tmb试剂显色，终止液终止，波长450nm读数。数据分析：最优的单抗包被和多抗检测的浓度标准为阴性对照od450小于 0.2，同时对ad7c蛋白的检测限低。
[0082]
从传统elisa双抗体夹心法结果来看，较好的单抗包被浓度为1:100、多抗检测浓度为1:100、酶标二抗浓度为1:3000。
[0083]
3、检测阿尔茨海默病ad7c-ntp的垂直流分析试剂盒的制备
[0084]
1)单抗、多抗浓度测试：
[0085]
从传统elisa双夹心法结果来看，较好的单抗包被浓度为 1:100、多抗检测浓度为1:100、酶标二抗浓度为1:3000，本试剂盒以此结果为基础进行抗体浓度调整。
[0086]
a)组装好的板条3条，分别每条包被不同浓度单抗，依次是10-1
、 10-2
、10-3
，每孔10ul，包被好后的板条放在37℃温箱孵育30分钟；
[0087]
b)5％酪蛋白50ul/孔封闭；
[0088]
c)待测样品为ad7c蛋白标准品10ul，阳性组为0.01mg/ml标准品，阴性组为pbs；
[0089]
d)不同浓度多抗2.5ul，依次是10-1
、10-2
、10-3
。
[0090]
e)pbst清洗：每孔50ulpbst，流出后即可；
[0091]
f)hrp酶标二抗检测浓度为1:3000，孵育5分钟
[0092]
g)pbst清洗3次：每孔50ulpbst，加样4次，流出后即可
[0093]
h)tmb显色液5ul检测。
[0094]
2)hrp酶标二抗的测试：
[0095]
上述结果中最优的单抗包被浓度为1:100；最优多抗检测1:100。以此为基础，检测hrp的最优浓度：
[0096]
a)组装好的板条，包被10-2
单抗10ul，包被好后的板条放在37℃温箱孵育30分钟；
[0097]
b)5％酪蛋白50ul/孔封闭；
[0098]
c)待测样品为ad7c-ntp蛋白标准品10ul，阳性组为0.01mg/ml 标准品，阴性组为pbs；
[0099]
d)10-2
浓度多抗2.5ul；
[0100]
e)pbst清洗：每孔50ulpbst，流出后即可；
[0101]
f)hrp酶标二抗检测浓度为1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、 1:5000，分别加样2.5ul,孵育5min；
[0102]
g)pbst清洗3次：每孔50ulpbst，加样4次，流出后即可；
[0103]
h)tmb显色液5ul检测。
[0104]
3)封闭液的筛选：三种常用的封闭液在酶标板上进行测试，分别采用5％脱脂乳、5％bsa、5％casein，封闭条件为50ul封闭液加入上样孔，待液体流过后即可进行下一步操作。上述结果最优的单抗、多抗、酶标二抗浓度进行测试。
[0105]
a)组装好的板条3条，包被10-2
单抗10ul，包被好后的板条放在 37℃温箱孵育30分钟；
[0106]
b)分别用5％脱脂乳、5％bsa、5％casein 50ul/孔封闭；
[0107]
c)待测样品为ad7c-ntp蛋白标准品10ul，阳性组为0.01mg/ml 标准品，阴性组为pbs；
[0108]
d)10-2
浓度多抗2.5ul；
[0109]
e)pbst清洗：每孔50ulpbst，流出后即可；
[0110]
f)hrp酶标二抗检测浓度为1:4000，孵育5分钟；
[0111]
g)pbst清洗3次：每孔50ulpbst，加样4次，流出后即可；
[0112]
h)tmb显色液5ul检测。
[0113]
4)tmb显色液的筛选测试：测试三种类型的tmb显色液，分别是粉末配置的双组份；片剂配置的三组分；溶液单组份专用于 wb膜显色tmb。操作方法：
[0114]
a)组装好的板条3条，包被10-2
单抗10ul，包被好后的板条放在37℃温箱孵育30分钟；
[0115]
b)分别用5％casein 50ul/孔封闭；
[0116]
c)待测样品为ad7c-ntp蛋白标准品10ul，阳性组为0.01mg/ml 标准品，阴性组为pbs；
[0117]
d)10-2
浓度多抗2.5ul.
[0118]
e)pbst清洗：每孔50ulpbst，流出后即可；
[0119]
f)hrp酶标二抗检测浓度为1:4000，孵育5分钟；
[0120]
g)pbst清洗3次：每孔50ulpbst，加样4次，流出后即可；
[0121]
h)tmb显色液5ul检测:分别用各种类型的tmb显色，三种 tmb显色液性质如下表2所示：
[0122]
表2三种tmb显色液
[0123]
[0124]
5)试剂盒操作流程测试：
[0125]
a)包被条件，组装好的板条4条，包被10-2
单抗10ul，包被好后的板条放在不同条件下30分钟；
[0126]
室温静置-试验台；室温吹风-超净工作台；37度静置-培养箱；37度吹风-烘箱
[0127]
b)封闭时间，用5％casein50ul/孔封闭0-30分钟：0分钟(样品流出后即刻进行后续操作)、5分钟(样品流出后孵育5分钟)、10分钟(样品流出后孵育10分钟)、15分钟(样品流出后孵育15分钟)、20分钟(样品流出后孵育20分钟)、25分钟(样品流出后孵育25分钟)、30分钟(样品流出后孵育30分钟)
[0128]
c)待测样品孵育时间：0分钟(样品流出后即刻进行后续操作)、5分钟(样品流出后孵育5分钟)
[0129]
d)多抗孵育时间：0分钟(试剂流出后即刻进行后续操作)、5分钟(试剂流出后孵育5分钟)
[0130]
e)hrp酶标二抗孵育时间：0分钟(试剂流出后即刻进行后续操作)、5分钟(试剂流出后孵育5分钟)
[0131]
f)tmb显色时间：0分钟、3分钟、5分钟、10分钟
[0132]
4、试剂盒中的其他试剂的配制和使用方法
[0133]
bufferp1：洗涤液pbst(5ml)每次加50ul/孔，多抗检测液进行1次清洗、hrp酶标二抗进行4次清洗
[0134]
bufferp2：封闭液pbst-5％casein(1ml)，50ul封闭液/孔
[0135]
bufferp3：检测抗体30ul(原液稀释10倍)，洗涤液(bufferp1)稀释10倍后使用，2.5ul/孔
[0136]
bufferp4:hrp酶标二抗30ul(原液稀释400倍),洗涤液(bufferp1)稀释10倍后使用，2.5ul/孔
[0137]
bufferp5：tmb显色底物(500ul)，5ul/孔
[0138]
阳性对照pc：阿尔茨海默病ad7c-ntp抗原蛋白用pbs稀释至0.1ug/ml，与待测样品同时加入，10ul/孔
[0139]
阴性对照nc：pbs缓冲液
[0140]
包被板条：板条组装好，加稀释100倍的单抗(包被抗体)溶液每孔10ul，37度温箱静置30分钟。
[0141]
包被缓冲液(0.1mpbs缓冲液)：kh2po40.2g、na2hpo4·
12h2o2.9g、nacl8.0g、kcl0.2g、定容至1000ml，ph7.2；
[0142]
洗涤液(pbst)：kh2po40.2g、na2hpo4·
12h2o2.9g、nacl8.0g、kcl0.2g、tween-200.5ml，定容至1000ml，ph7.4；
[0143]
封闭液：casein-na5g、洗涤缓冲液100ml。
[0144]
5、检测阿尔茨海默病ad7c-ntp的垂直流分析试剂盒的使用方法
[0145]
a)板条取出备用，用5％casein50ul/孔封闭；
[0146]
b)加入待测样品50ul，流出后每孔50ulpbst清洗；
[0147]
c)稀释后多抗2.5ul，流出后每孔50ulpbst清洗；
[0148]
d)hrp酶标二抗检测浓度为1:4000，孵育5分钟；
[0149]
e)pbst清洗4次：每孔50ulpbst，加样4次，流出后即可；
[0150]
f)tmb显色液5ul检测3分钟观察结果；ecl显色液5ul 2分钟以内酶标仪检测结果。
[0151]
传统elisa试剂盒只能使用tmb显色法，其检出限为2ng，本实施例的检测阿尔茨海默病ad7c-ntp的垂直流分析试剂盒可使用 ecl发光法，其检出限可达到0.2ng，灵敏度高10倍。
[0152]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。