一种双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法

技术特征：
1.一种双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：通过第53位定点饱和突变和全序列易错pcr诱变技术改造vhb的基因，所述vhb的基因序列如seq id no.1所示；步骤2：根据特定的改造目的，经过多轮随机突变，筛选出有价值的高效催化合成非天然氨基酸的vhb突变体；步骤3：将筛选出的vhb突变体应用于催化级联反应合成非天然氨基酸。2.根据权利要求1所述的双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征在于，在步骤1中，所述第53位定点饱和突变以构建在puc19质粒上的vhb基因为模板，设计引物将谷氨酰胺突变为其他19种氨基酸，筛选得到最佳突变体，命名为vhb df1，其将seq id no.1所示的氨基酸残基第53位的谷氨酰胺突变为组氨酸。3.根据权利要求2所述的双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征在于，在步骤1中，通过易错pcr诱导vhb df1随机突变，构建突变体文库，并利用高效液相色谱筛选出催化非天然氨基酸高产率合成的突变体vhb df2，突变体vhb df2具体的突变位点为第62位亮氨酸突变成色氨酸。4.根据权利要求3所述的双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征在于，在步骤2中，在突变体vhb df2基础之上进行第二轮定向进化，筛选出突变体vhb df3，突变体vhb df3具体的突变位点为第75位亮氨酸突变成丝氨酸，第132位缬氨酸突变成谷氨酸。5.根据权利要求2所述的双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征在于，步骤3中的催化级联反应合成非天然氨基酸的方程式如下所示：其中，r1表示4-甲基、3-甲基、2-甲基、4-氟、4-氯、4-溴、4-甲氧基；r2表示重氮酯类被甲基、乙基、叔丁基所取代；r3表示异丙基，环己基，乙基，正丙基，正丁基。6.根据权利要求5所述的双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征在于，反应的底物为苯胺类化合物、重氮乙酸酯类化合物以及烷基硼酸类化合物的混合物，其中，所述底物的浓度范围为0.1μm-300mm；苯胺类化合物、重氮乙酸酯类化合物、烷基硼酸类化合物的摩尔比为1：1：1～1：1：2。7.根据权利要求5所述的双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征在于，反应体系中突变体的加入量为0.01μm-1mm，所述突变体与苯胺类化合物与重氮乙酸酯类化合物加入至ph5.0-9.0的缓冲溶液中，厌氧条件下在25℃-45℃反应10min-4h，待卡宾转移的反应结束后，再添加烷基硼酸类化合物与1-4倍量的叔丁基过氧化氢，在温度相同的条件下反应1h-6h来实现底物的氧化烷基化。8.根据权利要求7所述的双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征在于，反应的溶剂为ph7.4的0.1m的磷酸盐缓冲液。9.根据权利要求7所述的双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征
在于，第一步的卡宾转移反应时间为2小时，第二步氧化烷基化的时间为6小时。10.根据权利要求7所述的双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，其特征在于，所述叔丁基过氧化氢的用量是3倍量。

技术总结
本发明适用于生物催化合成技术领域，提供了一种双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法，包括以下步骤：步骤1：通过第53位定点饱和突变和全序列易错PCR诱变技术改造VHb的基因，所述VHb的基因序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：根据特定的改造目的，经过多轮随机突变，筛选出有价值的高效催化合成非天然氨基酸的VHb突变体；步骤3：将筛选出的VHb突变体应用于催化级联反应合成非天然氨基酸。该方法通过级联反应可高效合成非天然氨基酸类化合物。同时，该发明中的生物催化系统相比于传统化学合成方法更加高效绿色，催化剂用量少，底物的价格低廉，弥补了传统化学法的缺陷，并为蛋白在催化非天然反应的应用中开阔了新的应用前景。用前景。


技术研发人员：王磊 李正强 李奉熙 许雅宁 徐岳林 谢汉青 吴俊浩 王春宇
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/6/28