1.本发明属于ket检测
技术领域：
：，尤其涉及一种新型氯胺酮快速定性筛查和准确定量分析方法。
背景技术：
：：2.由于氯胺酮（本发明简称ket）定性定量分析使用的广泛性、重要性和急迫性，近年来研究者几乎已使用了所有已知分析方法，而且新的分析方法还不断涌现。传统上，色谱、质谱(ms)以及两者联用的方法被视为成瘾药物分析的金标准，包括：气相色谱(gc)[1-4]、液相色谱(lc)[4-6]、gc-质谱联用法（包括单四级杆气相色谱质谱联用法gc-ms和串联四级杆气相色谱质谱联用法(gc-ms/ms)[7,8]、lc-质谱联用法[9-12]、质谱法[13,14]。尽管这些技术具有优良的准确性和灵敏度，但也存在一些缺点，包括不够便携，测试时间长，涉及繁琐和溶剂消耗的样品制备步骤，需要熟练的操作者，运行和维护费用昂贵，不适于现场分析。其它常用方法还有：毛细管电泳法[15,16]、荧光免疫法[17,18]、电化学方法[19,20]、表面等离子体共振(spr)[21]、拉曼光谱法[22-24]、红外光谱（ir）法[25-28]等。其中，毛细管电泳法分离效率高，但其具有与色谱法同样的缺点。电化学方法简单，成本低，可实现现场检测。但其抗干扰能力差对检测体系要求高，电极修饰较复杂，稳定性重现性较差。spr法具有快速响应的优点，灵敏度和特异性高，不需要复杂的样品制备。但需要特殊仪器，对检测体系要求高，技术性强。拉曼光谱和ir技术简单、快速、灵敏度高、可无损检测，但是拉曼光谱往往具有强烈的荧光背景，应采用衬底材料制成表面增强拉曼光谱，然而仍需仔细、有侵入性的样品制备，因此不适合常规分析。ir技术对缴获的固体合成毒品分析简单快速，但是对于复杂基质的液体样品，由于基质背景干扰严重分析困难。总之在众多分析方法中，荧光免疫分析法由于其灵敏度高、简单、快速、易于使用、便携、一次性等优点，已成为成瘾药物测定方面的新热点[17,18,29-32]。[0003]本文采用竞争的新思路构建cfia方法，获得ket特异性分析的新平台。在氯胺酮抗体（ket-ab）上标记异硫氰酸荧光素(fitc)作为结果信号分子。样品溶液中的ket作为抗原（ket-ag）与微孔板上包被的氯胺酮半抗原（ket-bsa）相互竞争，与fitc标记的ket-ab结合。荧光强度与ket浓度负相关，ket定量方程的线性相关系数大于0.992%。采用gc-ms/ms法和cfia法对ket的lod值分别进行测定，发现cfia法对ket的lod值低1×104倍，而且此两种方法同时用于ket实际样品检测时，获得定量结果的相对偏差小于10%。综上，ket分析新方法，即：cfia法，被成功建立。该方法简单、灵敏，便携、无需复杂的样品前处理，可进行大量生物样品和环境样品的定性筛查，以及快速定量分析。cfia法还可被进一步推广应用到其它成瘾药物，以及多种混合成瘾药物的简单、快速定性筛查和准确定量分析中。技术实现要素：[0004]针对现有技术的不足，本发明的目的是提出了一种灵敏的间接竞争荧光免疫定量ket检测法。[0005]本发明的目的是这样实现的，一种新型氯胺酮（ket）快速定性筛查和准确定量分析方法，包括如下步骤：第一步，缓慢将氯胺酮半抗原（ket-bsa）溶液滴加到微孔板的每个微孔中，包被过夜，然后用pbst洗涤，备用；第二步，用ova溶液封闭ket-bsa中的非特异性结合位点，再用pbst洗涤；第三步，氯胺酮单克隆抗体（ket-ab）用荧光染料标记；将荧光染料标记的ket-ab，与待测样品溶液或各种ket标准溶液中的氯胺酮抗原（ket-ag），进行混合，得到混合液，把上述的混合液再分别加入微孔板不同的微孔中；然后进行ket-ag/ket-ab孵育；孵育完成后再用pbst洗涤；第四步，将孵育并洗涤完成后的微孔板在酶标仪上分别测定每个微孔的荧光强度值，通过记录ket的相对荧光强度值来定性定量检测ket。[0006]上述ket-ab标记染料为fitc，ket-bsa包被微孔板的最佳浓度为50μg/ml，包被最佳条件为4℃下12h；抗原抗体（ket-ag/ket-ab）反应的最佳条件为37℃下反应2h；ket-ag/ket-ab反应时pbs缓冲液最佳ph值为中性，pbs缓冲液中最佳磷酸盐浓度为0.01mol/l。[0007]在上述第三步中，要在具有高度特异性的ket-ab上标记荧光染料作为信号分子，而且制备的ket-ab应具有高度的ket识别专一性，对基质复杂样品中的其它结构类似的干扰药物的交叉反应率应尽量低，这样才能保证ket定性定量结果的准确性。因此该高度特异的ket-ab制备流程为：第一步，小鼠免疫；第二步，淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合；第三步，杂交瘤细胞的筛查；第四步，ket-ab的纯化。[0008]本发明采用上述的一种新型ket快速定性筛查和准确定量分析方法，其特征在于：能对ket进行高特异性识别和分析。[0009]本发明具有如下特点和优点：本发明采用ket-bsa包被微孔板并与待测样品中的ket-ag竞争结合fitc标记ket-ab的新型模式，间接快速对人体尿液、血液和环境样品中的ket进行定量分析。该方法中，样品的ket含量与检测到的荧光强度负相关。最终获得的竞争定量方程线性相关系数为0.992，线性范围是0.01μg/ml~0.5μg/ml，lod为0.1pg/ml，方法特异性结果表明去甲氯胺酮的交叉反应率低于10%。在加标样品检测中回收率在96%至104%之间。cfia法与gc-ms/ms法同时用于ket实际样品检测时，获得定量结果的相对偏差小于10%。采用gc-ms/ms法和cfia法对ket的lod值分别进行测定，发现cfia法对ket的lod值低1×104倍，而且样品前处理以及经济投入方面都较经典的气质联用法有很大优势。总之，该方法可作为临床血液、尿液样本或者环境水样品中ket的快速灵敏初筛以及定量的新思路。附图说明[0010]图1为本发明ket-bsa合成路线图。[0011]图2a为本发明ket、ket-bsa和bsa的ir对比图。[0012]图2b为本发明ket-bsa和bsa的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（maldi-tof-ms）对比图。[0013]图2c为本发明fitc标记ket-ab的荧光光谱图。[0014]图3为本发明最优色谱条件下gc-ms/ms法检测ket的三对特征母离子/子离子对色谱图和总离子流色谱图。[0015]图4a为本发明ket-bsa包被浓度优化曲线图。[0016]图4b为本发明ket的竞争曲线图和定量线性方程图（插图）。具体实施方式[0017]本发明提出了一种简单、高效、灵敏的间接竞争荧光免疫定量ket检测法。[0018]一种新型氯胺酮（ket）快速定性筛查和准确定量分析方法，包括如下步骤：第一步，缓慢将氯胺酮半抗原（ket-bsa）溶液滴加到微孔板的每个微孔中，包被过夜，然后用pbst洗涤，备用；第二步，用ova溶液封闭ket-bsa中的非特异性结合位点，再用pbst洗涤；第三步，氯胺酮单克隆抗体（ket-ab）用荧光染料标记；将荧光染料标记的ket-ab，与待测样品溶液或各种ket标准溶液中的氯胺酮抗原（ket-ag），进行混合，得到混合液，把上述的混合液再分别加入微孔板不同的微孔中；然后进行ket-ag/ket-ab孵育；孵育完成后再用pbst洗涤；第四步，将孵育并洗涤完成后的微孔板在酶标仪上分别测定每个微孔的荧光强度值，通过记录ket的相对荧光强度值来定性定量检测ket。[0019]上述ket-ab标记染料为fitc，ket-bsa包被微孔板的最佳浓度为50μg/ml，包被最佳条件为4℃下12h；抗原抗体（ket-ag/ket-ab）反应的最佳条件为37℃下反应2h；ket-ag/ket-ab反应时pbs缓冲液最佳ph值为中性，pbs缓冲液中最佳磷酸盐浓度为0.01mol/l。[0020]在上述第三步中，要在具有高度特异性的ket-ab上标记荧光染料作为信号分子，而且制备的ket-ab应具有高度的ket识别专一性，对基质复杂样品中的其它结构类似的干扰药物的交叉反应率应尽量低，这样才能保证ket定性定量结果的准确性。因此该高度特异的ket-ab制备流程为：第一步，小鼠免疫；第二步，淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合；第三步，杂交瘤细胞的筛查；第四步，ket-ab的纯化。[0021]具体实施如下：1、实验部分1.1仪器96孔板的荧光测量在varioskanflash多模微孔板阅读器(thermofisherscientific,usa)上进行。实验用微孔板（96孔）为丹麦nunc产品。采用ir(vertex70,brukeroptics,usa)对已合成的ket-bsa进行基团的检测，并采用maldi-tof-ms质谱仪(autoflexspeed,bruker,usa)对已合成的ket-bsa进行精确分子量检测。ket-ab标记fitc分子染料的浓度采用荧光仪perkinelmerls55（perkinelmer,usa）测算。所有溶液的酸度和碱度用denverub-10精密酸度计(denverinstruments,usa)测量。整个实验中的免疫过程在恒温培养箱中进行，恒温控制精度为0.1℃。超纯水是自来水经aquapro净水器（重庆，中国）和milliqiq7000实验室水系统（ma，usa）后的二次纯水。[0022]1.2试剂盐酸氯胺酮（ket•hcl）、吗啡（morphine）、海洛因（heroin）、可待因（codeine）、可卡因（cocaine）、去甲氯胺酮（norketamine）和麻黄碱（ephedrine）标准品购自上海原思标物科技有限公司（上海，中国）。卵清蛋白(ova)、fitc、tween20和牛血清白蛋白(bsa)从sigma-aldrich获得(st.louis,mo,usa)。乙酸乙酯，氢氧化钠（naoh），碳酸钠（na2co3），碳酸氢钠（nahco3），磷酸氢二钠（na2hpo4），磷酸二氢钾（kh2po4），氯化钠（nacl）和氯化钾（kcl）购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）。[0023]实验中制备了以下缓冲溶液：制备碳酸盐缓冲液（cbs），浓度为0.05mol/l，ph值为9.6，是称取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g后加超纯水定容至1000ml。制备磷酸盐缓冲液（pbs），ph值为7.4，是称取8g氯化钠，2.9g十二水和磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾后加超纯水定容至1000ml。制备ph为7.2的pbst清洗剂，是将适量吐温20溶解在pbs缓冲液中，吐温20在pbs缓冲液中的含量为0.05%（v/v）。ket-bsa溶解在cbs缓冲液中用来制备母液。ket-ab上标记了荧光信号分子fitc并溶解在pbs溶液中。清洗96孔板的清洗溶液为pbst缓冲液。制备封闭剂ova溶液是将ova溶解在pbs缓冲液中，ova在pbs缓冲液中的含量为0.1%（v/v）。该试剂的作用是防止微孔板上已包被ket-bsa的非特异性吸附。[0024]本研究中所有实验数据全部是平均了五次平行实验结果后的数值。实验中所用的化学试剂和药品均是分析纯，实验用水均为超纯蒸馏水。[0025]1.3合成ket-bsa按照图1合成ket-bsa。ket-bsa是将小分子ket(mw285)与大分子bsa偶联后形成的具有免疫原性的生物大分子。[0026]步骤1：羧基-氯胺酮（ket-cooh）的制备。以ket•hcl为原料，游离后与溴乙酸乙酯进行取代反应引入酯基，得到ket的酯，然后在碱性条件下水解得到ket-cooh。[0027]将ket•hcl溶于超纯水中，加入氨水调ph值至10，采用有机溶剂二氯甲烷进行萃取，收集三次萃取的有机相。再对有机相进行无水硫酸镁除水、过滤除杂、减压蒸发除有机溶剂等操作后，就制得了游离态ket。将游离态ket溶于丙酮中，加入溴乙酸乙酯和碳酸钾，70℃下回流反应16h，冷却至常温，过滤，得到滤液；滤液减压蒸馏得到ket的酯；将制备的ket酯与四氢呋喃、甲醇混合均匀。然后加入naoh溶液，室温下反应16h。然后用盐酸调ph至7，用乙酸乙酯萃取一次。收集有机相，通过减压蒸馏得到ket-cooh。经高效液相色谱(hplc)纯化，纯度可达99.8%以上。[0028]步骤2：ket-bsa的制备：通过碳二亚胺法使ket-cooh与bsa结合制备ket-bsa：将ket-cooh与n,n-甲基甲酰胺(dmf)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和环己基尿素二亚胺(dcc)三种物质混合均匀，室温下反应16h。反应结束时，将溶液离心，取上清液作为a液。将bsa加入到pbs缓冲液混合均匀，得到b液；将a液和b液按体积比为1:5混合均匀，4℃下反应16h，得到ket-bsa混合液，用pbs缓冲液透析5次，透析结束后离心取上清液，得到ket-bsa。[0029]1.4ket-bsa的验证所得ket-bsa的分子结构鉴定分别采用ir和ms进行确证。[0030]首先，分别取ket-bsa、bsa和ket固体粉末1mg（纯度》95%）与干燥的kbr粉末100mg（预先放置于马弗炉中200℃干燥10小时）混匀后置于玛瑙研钵中研磨过筛，过筛后的粉末在红外灯下压片，采用kbr压片法在波数为400-4000cm-1范围，利用ir仪进行测定，见图2a。[0031]其次，将所得ket-bsa通过maldi-tof-ms进行偶联比的测定。由于maldi-tof-ms可以检测带正电荷的肽离子，而且ket-bsa偶联物的电离被认为是与bsa蛋白类似的，因此任何质量转移都归因于已经结合在ket-bsa中的bsa蛋白。取0.5ꢀµlbsa或者ket-bsa，分别与0.5ꢀµl芥子酸（tfa）溶液混合(浓度为10mg/ml，所用溶剂为乙腈和水等体积混合后再加入0.1%(v/v)的tfa)。然后点在maldi-tof的抛光钢mtp384靶板上。在室温下自然干燥，送入离子源中进行检测。同样的方法在相邻靶位上点bsa校准标准品。原始数据使用flexanalysis软件进行处理。见图2b。[0032]1.5制备ket-ab：这个过程分为四个步骤。步骤1：小鼠免疫。选择8周龄雌性balb/c小鼠进行皮下淋巴组织免疫。步骤2：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合。首先，小鼠腹腔细胞悬浮液，离心沉淀得到饲养细胞悬浮液。其次，通过传代培养获得生长状态良好、适合细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)。再次，获得免疫处理过的小鼠淋巴结，研磨、离心、沉淀，完成含淋巴细胞的培养基imdm的制备。最后，将淋巴细胞、骨髓瘤细胞和饲养细胞与聚乙二醇(peg)融合，获得杂交瘤细胞。步骤3：杂交瘤细胞的筛选。杂交瘤细胞的筛选方法为竞争抑制elisa法，筛选标准为竞争抑制率最大值。选取3e7细胞株进行克隆培养。步骤4：ket-ab的纯化。经过反复培养，得到阳性率为100%的单克隆ket-ab，用hitrapproteinghp等亲和柱精制。最后，制备了纯化的ket-ab。[0033]1.6fitc染料标记ket-ab。据文献[33]，为了获得发荧光的ket-ab，采用摩尔浓度比为nket-ab:nfitc=10:1时，将ket-ab与fitc偶联。标记时ket-ab分散于pbs缓冲液中，溶液浓度为5mg/ml，fitc溶解在cbs缓冲液中，溶液浓度为0.5mg/ml。混合时ket-ab溶液先加入反应瓶中，随后缓慢加入fitc溶液，避光常温搅拌两小时。再使用sephadexg-25层析柱对标记了fitc的ket-ab进一步纯化。收集纯化后的1ml溶液并且在280nm测量吸光度。fitc与蛋白质的比率（f/p）根据下式计算[34]：molar(f/p)=(2.77×a495)/(a280-0.35×a495)上式中，a495是fitc染料的吸光度值。仅仅收集溶液具有f/p系数在1到4之间的部分以避免蛋白的过度标记。因为荧光团自淬灭效应，蛋白的过度标记将导致增加非特异性结合并减少量子产率[34-36]。如图2c所示。经计算，fitc与ket-ab(nfitc/nket-ab)的近似摩尔比为7.8。[0034]1.7cfia法测定过程。整个实验过程在96孔板上展开。第一步，缓慢将ket-bsa溶液（50ꢀµg/ml，100ꢀµl）滴加到每个微孔中，在4℃包被12小时，然后用pbst洗涤3次，每次3分钟。第二步，用1%ova溶液封闭ket-bsa中的非特异性结合位点，每孔350ꢀµl,37℃恒定0.5h，再用pbst洗涤三次，每次3分钟。第三步，将fitc标记的ket-ab（用pbs稀释，50ꢀµg/ml，100ꢀµl）与待测样品溶液或各种ket标准溶液（用pbs溶解）混合后，把混合液分别加入包被ket-bsa的微孔中；然后在最佳的温度和时间条件下进行孵育（37℃下反应2.0h）。第四步，微孔板在酶标仪上分别测定每个微孔的荧光强度值，通过计算ket的相对荧光强度值来定性定量检测ket。酶标仪设定的最佳激发波长(λex)为488nm，在最佳发射波长(λem)525nm处读取荧光强度数值。荧光强度与ket浓度相对应，形成竞争曲线。曲线上每个点的数值是五次平行实验的平均值。ic50值定义为在最大荧光强度值50%时对应的样品中ket-ag的浓度。lod定义为ket的相对荧光强度为背景荧光强度的3倍时的ket浓度。最大荧光强度（fmax）定义为微孔板上包被的ket-bsa全部与ket-ab结合时的荧光强度。此时样品中不含ket，不存在与ket-bsa竞争结合ket-ab。荧光强度（f）定义为微孔板上包被的ket-bsa一部分与ket-ab结合时的荧光强度。此时样品中含有部分ket与ket-bsa竞争结合ket-ab。背景荧光强度（f0）定义为微孔板上包被的ket-bsa未与ket-ab结合时的荧光强度。此时样品中大量ket直接与ket-ab结合，ket-bsa不能竞争结合ket-ab。相对荧光强度用f-f0进行计算。[0035]1.8gc-ms/ms分析。该方法被公认为是测量ket的准确方法。该方法比常见的gc-ms法对目标物的lod值更低，定量结果更为准确，可用以对新型cfia法的定性定量结果进行对比和评价。本研究的实际样品为ket滥用者的血液和尿液样品以及环境样品，均由福建警察学院实鸣司法鉴定中心提供。待检样品应该采用密封玻璃瓶盛装，样品体积应不少于5ml。先将尿液、血清或全血样品以及环境水样（1ml）置于离心管（10ml）中进行样品预处理。用4mol/lnaoh调ph为13，用2ml乙酸乙酯分别萃取两次，萃取时将样品与乙酸乙酯充分混合，以10000r/min离心3min，破除乳化，促进分层。将提取两次的有机层转移到另一个玻璃管中，在40℃下用氮气干燥。残留物用200ꢀµl甲醇溶解，1微升溶液被注入gc-ms/ms仪器进行分析。[0036]实验中用于色谱分析的gc-ms/ms仪型号为agilent7890a/7000qqqb，所配色谱柱为hp-5capillarycolumn(30m×0.25mm×0.25µm)。柱温箱程序升温条件为：起始温度120℃保持1分钟，然后以20℃/min的升温速率，升高到250℃后再保持1分钟。使用载气he，气相色谱以恒定流量1ml/min的分流模式运行，分流比10:1。进样口温度为230℃。质谱测量采用电子电离源(ei)在70ev下进行电离。串联四极杆和离子源的温度分别保持在150℃和230℃。采用多反应监测(mrm)模式设置质谱/质谱(ms/ms)系统，以高纯氮气作为碰撞气体，将目标化合物的特征母离子裂解成子离子。利用mrm模式，选择目标化合物在最佳碰撞能量下的两个或三个特征母离子-子离子对进行定性和定量分析。峰面积最大的离子对为定量离子对，其余为定性离子对。建立ket的mrm最佳检测方法，主要是确定其特征母离子/子离子对和相应的碰撞能量等参数，使方法具有高灵敏度和特异性。三对最佳的ket母离子-子离子对和碰撞能量分别为180-116.1对应ce25v（该母离子-子离子对为定量离子对）、180-151对应ce10v和180-145.1对应ce10v（这两对母离子-子离子对为定性离子对）。ket的保留时间为7.373min。见图3。[0037]2、结果与讨论2.1ket-bsa确证分析：采用固体kbr压片，对ket-bsa、bsa和ket进行ir测定，如图2a所示。通过上述三种化合物红外吸收光谱中特征基团吸收峰的相似性来判断ket-bsa是否成功合成。首先，将ket-bsa与bsa的ir进行比较，发现它们在2800-3400cm-1和1500-1700cm-1区域有相似的吸收峰。由于这些波数范围是bsa中氨基酸的典型吸收区域，可以合理地解释为bsa已共价结合在新合成的ket-bsa分子中。其次，比较了ket-bsa和ket的ir，发现在600-1200cm-1区域有相似的吸收。由于这个波数范围是ket的特征吸收区域，而bsa在此范围没有明显的吸收，说明ket已经共价结合在新合成的ket-bsa分子中，这才使ir可以出现ket官能团的特征吸收峰。以上结果从特征官能团的红外吸收角度验证了ket-bsa的成功合成。[0038]此外，利用maldi-tof-ms从分子量的角度进一步验证ket-bsa的成功合成。在图2b中，x轴为质荷比，y轴为响应值。当电荷设为1时，x轴就代表物质的分子量。ket-bsa用红线表示，bsa用黑线表示。两物质的图形总体相似，但是红色实线明显比黑色实线向右平移。右移是分子量增加的方向，说明新合成的ket-bsa的分子量大于bsa的分子量，再次证实了ket-bsa的合成成功。根据ket-bsa和bsa的分子量差可以计算出bsa与ket的结合比。如图2b所示，ket-bsa和bsa的分子量分别为72828.423和66399.708，因此bsa与ket的结合比例约为1:27。[0039]2.2cfia法实验条件优化。[0040]随着ket在临床麻醉和抗抑郁方面的广泛应用、ket在毒品市场中日益高涨的热度以及ket在环境污水中的定期监测和环境风险评估中检测要求的不断提高，如何对其简单、快速、便携、灵敏、准确的定性定量分析已成为所有研究者亟待解决的关键问题。[0041]免疫分析由于其具有优异的特异性和灵敏性一直以来都是研究的焦点。由于ket是一种有机小分子，其必须与大分子结合才能获得免疫原性。因此免疫分析必须在竞争机制下进行，才能得到准确的检测结果。通过将ket与bsa偶联成ket-bsa并提前包被在微孔板上，再将标记fitc的ket-ab与样品溶液混合，然后加入被ket-bsa包被的微孔板中，最后通过计算ket的相对荧光强度来定性定量检测ket。在该新型cfia法分析中，荧光强度与样品中ket的浓度呈负相关。优化各种检测参数可以提高方法的灵敏度且降低lod值。具体参数包括包被ket-bsa浓度、包被ket-bsa的时间和温度、缓冲液的ph值和离子强度、ket-ag/ket-ab孵育时间、ket-ag/ket-ab反应温度等。[0042]2.2.1ket-bsa包被浓度的优化。将不同浓度的ket-bsa经cbs缓冲液稀释后涂覆在微孔板上，以确定ket-bsa的最佳包被浓度。每孔加入等量fitc标记的ket-ab，测定荧光强度。分别取涂覆ket-bsa的不同浓度值（0.3、6.25、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200ꢀµg/ml）和相应获得的荧光强度值绘制滴定曲线（见图4a），每个包被浓度对应的荧光强度值为5次平行实验数据的平均值。在图4a中，当ket-bsa的浓度为0-50ꢀµg/ml时，相对荧光强度随着包被ket-bsa浓度的增加而增加。当ket-bsa的浓度大于50ꢀµg/ml时，相对荧光强度不再增加保持在恒定值。因此，本实验选择在曲线拐点处的ket-bsa包被浓度(50μg/ml)作为最佳实验浓度。[0043]2.2.2ket-bsa包被时间和温度的优化。[0044]针对ket-bsa包被温度和包被时间条件开展了一系列的实验研究，具体包括：条件一，在4℃包被10h；条件二，在4℃包被12h；条件三，在4℃包被14h；条件四，在37℃包被1h；条件五，在37℃包被2h；条件六，在37℃包被3h，条件七，在37℃包被4h。结果表明，在4℃下将ket-bsa包被在微孔板12h的条件下，荧光强度值最高。因此，本实验推荐在4℃下包被微孔板12h。[0045]2.2.3ket-ag/ket-ab反应孵育时间和孵育温度的优化。[0046]孵育时间和温度在ket-ag和ket-ab的反应中也很重要。本研究涉及两个部分。一是标记fitc的ket-ab与包被在微孔板上的ket-bsa结合反应，二是在实际样本中ket-ag与标记fitc的ket-ab的结合反应。低温可提高它们的结合率，高温可加速结合。在37℃条件下，研究了ket-ag/ket-ab反应的孵育时间。当孵育时间从0变化至2h时，发现免疫荧光强度迅速增加。当孵育时间从2h继续变化到4h时，免疫荧光强度缓慢下降。结果表明，最佳孵育时间为2h。[0047]2.2.4pbs缓冲液ph值的影响：pbs缓冲液常被用作免疫反应的介质。制备了一系列不同ph值(具体ph值为4、5、6、7、8、9、10)的pbs缓冲液。这些pbs缓冲液在本研究中被用作免疫荧光实验的介质。结果发现在ph值为中性的pbs缓冲液中免疫荧光强度最强，检测效果更好。在ph值为酸性或碱性的pbs缓冲液中，免疫荧光强度都会降低。因此，在本研究中选择ph值为7.4的pbs缓冲液作为免疫实验的介质。[0048]2.2.5pbs缓冲液离子强度的影响：pbs缓冲液中磷酸盐浓度值从0增加到0.01mol/l时，免疫荧光强度急剧增加。当pbs缓冲液中磷酸盐浓度为0.01mol/l时，免疫荧光强度达到最高。当pbs缓冲液中磷酸盐浓度从0.01mol/l继续增加时，免疫荧光强度逐渐下降。因此，在本研究中选择磷酸盐浓度为0.01mol/l的pbs缓冲液。[0049]2.3荧光竞争曲线和定量线性方程。[0050]在最优条件下，得到了不同浓度ket与相应荧光强度值绘制的荧光竞争曲线。fitc标记的ket-ab混合不同浓度的ket标准溶液(分别为0、1×10-7、1×10-6、1×10-4、0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5和2.5μg/ml)滴加到已包被ket-bsa(50μg/ml)的微孔板上。ket标准溶液浓度在0~2.5μg/ml范围内的荧光强度值和荧光竞争曲线见图4b。该图中，x轴和y轴分别为ket的浓度和相对荧光强度值。竞争曲线上每个点的数值是五次平行实验的平均值。根据荧光竞争曲线，测定了采用cfia新方法对ket的ic50值为1pg/ml（用于降低荧光50%的化学物质的浓度）。[0051]对竞争曲线的拐点进行分析，并根据拐点处ket浓度和相对荧光强度绘制ket定量校准线性方程。定量方程和线性范围分别为y=-0.69642x 0.34854（其中x为ket浓度，y为相对荧光强度）和10~500ng/ml。线性相关系数(r2)为0.992。ket的定性检测限为0.1pg/ml(见图4b插图)。[0052]血液、尿液及环境样品中ket的检测技术大多是基于gc-ms法。然而，将传统的gc-ms法用于含有微量ket的基质复杂样品分析时，常会遇到方法灵敏度和选择性较低而检不出目标物ket的情况[19,20]。gc-ms/ms是近年来迅速发展起来的可靠技术。其定性定量分析结果准确，具有更高的灵敏度和选择性。该技术对基质复杂样品中超微量物质的靶向分析有很好效果。表1中列出了用于ket分析的两种方法（即gc-ms/ms法和新cfia法）的各项参数，包括线性范围，线性方程，r2，lod。对比该两种方法，发现cfia法对ket分析具有更宽的定量范围和更低的lod值，并且两种方法定量方程的线性相关系数相当，均大于0.99。当定量方程线性相关系数大于0.99时，定量结果的准确性可以保证。采用gc-ms/ms法和cfia法对ket的lod值分别进行测定，发现cfia法对ket的lod值低1×104倍。人尿样品中ket的标准添加及回收率结果见表2。尿液基质中添加的标准物质浓度选择为定量方程线性范围内的低、中、高浓度水平。cfia法和gc-ms/ms法的回收率均小于10%，说明两种方法在各浓度定量结果都准确可靠。然而，在实际样品检测中，gc-ms/ms法需要完成复杂耗时的样品前处理过程，cfia法却无需样品预处理。因此，cfia法较gc-ms/ms法在实际应用中更有优势和前景。[0053]表1：cfia和gc-ms/ms法检测ket的线性回归方程、线性范围、r2和lodmethodcfiagc-ms/mslinearrange(μg/ml)0.01~0.52.0-7.5linearregressionequationy=-0.69642x 0.34854y=5.7390x-12022.8302r20.9920.998lod(ng/ml)1×10-41.4表2：尿液中ket标准添加样品的检测结果（n=5）2.4cfia方法特异性。免疫分析方法的特异性对定量结果的准确性十分重要。因此对与目标物ket具有相似分子结构的药物类似物，例如：吗啡、海洛因、可待因、可卡因、去甲氯胺酮和麻黄碱等，进行了潜在的交叉反应性(cr)评价。除ket外，其它几种药物在吸毒人群中也很流行。所以多种毒品及其代谢物就可能会同时出现在药物滥用者的尿液和血液中。上述新问题的解决有赖于制备出高度专一识别的抗体并研发出具有高特异性的免疫分析体系。cr比率按照下面公式来进行计算。[0054]公式中，各种药物的ic50值测定，均按照2.7所述步骤，在已优化的最佳条件下进行。当荧光强度值降低到原始强度的50%时，所加入的药物浓度即为该药物的ic50值。[0055]表3为吗啡、海洛因、可待因、可卡因、去甲氯胺酮、麻黄碱、ket的cr比值。从表中可以明显看出，cfia法对ket具有高度特异性。抗体对抗原的分子识别是依据抗原独特的结构特征。在这些共存药物中去甲氯胺酮是ket的代谢物，与其结构与ket最为相似，所以去甲氯胺酮的cr值也最大（为9.6%见表3），它对抗体的干扰性也最强。此外，其它共存药物的cr值都很小几乎检测不到。[0056]查文献知wendizhang等也建立了一种生物样品中ket的测定方法，即生物素-亲和素扩增酶联免疫吸附法（ba-elisa）[37]。该方法对ket的lod值为0.03ꢀµg/ml。方法特异性研究中，ket、norketamine、morphine、cocaine的cr值分别为100%、35.13%、1.09%和0.48%。对比本研究的新型cfia法，ket的lod值为0.1pg/ml。方法特异性的结果中ket和norketamine的cr值分别为100%、9.6%。其它药物类似物的cr值均小于《0.05%。结果表明，首先cfia法对ket的lod值较文献方法有大幅降低，在基质复杂样品痕量ket定性定量检测方面优势明显。其次cfia法针对ket的特异性比文献方法更高，可排除样品基质中各种杂质的干扰，定性和定量准确性也明显增强。[0057]表3cfia新方法的特异性结果crossreactantscrratio(%)ket100norketamine9.6morphine《0.05heroin《0.05codeine《0.05cocaine《0.05ephedrine《0.052.5实际样品分析。人体血液、尿液和环境水样均来自福建警察学院实鸣司法鉴定中心。在最佳条件下用cfia法对不同类型样品进行研究。人体血液、尿液中ket浓度随吸食时间增加而降低。ket滥用者血液、尿液中实际ket阳性送检样品的浓度根据经验一般为1-6μg/ml。根据cfia法定量的范围，实际样品需稀释10-100倍后再进行分析。此外，对实际样本也采用gc-ms/ms方法进行分析。如果浓度低于仪器的lod值，可以在前处理中增加富集步骤。在表4中，不同类型样品（包括血样、尿样和环境水样）通过cfia法和gc-ms/ms法检测的结果被列出，经对比发现同一样品无论是什么样品类型或采用什么检测方法，结果的相对fangmi,jiutongli,anovelsurface-enhancedramanscatteringmethodforsimultaneousdetectionofketamineandamphetamine,rscadvances,2020,10(60):36609-36616.25.e.deconinck,c.aït-kaci,a.raes,m.canfyn,j.l.bothy,c.duchateau,c.mees,k.debraekeleer,l.gremeaux,p.blanckaert,aninfraredspectroscopicapproachtocharacterisewhitepowders,easilyapplicableinthecontextofdrugchecking,drugpreventionandonsiteanalysis,drugtestingandanalysis,2021,13(3):679-693.26.cui-meiliu,yuhan,shun-gengmin,weijia,xinmeng,pei-peiliu,rapidqualitativeandquantitativeanalysisofmethamphetamine,ketamine,heroin,andcocainebynear-infraredspectroscopy,forensicscienceinternational,2018,290:162-168.27.cui-meiliu,yuhan,shun-gengmin,rapidqualitativeanalysisofmethamphetamine,ketamine,heroin,andcocainebyfouriertransforminfraredspectroscopy(ftir),spectroscopyandspectralanalysis,2019,39(7):2136-2141.28.radigyam.correia,eloilsondomingos,flaviatosato,nayaraa.dossantos,juliadea.leite,mayaradasilva,marceloc.a.marcelo,rafaels.ortiz,paulor.filgueiras,wandersonromão,portablenearinfraredspectroscopyappliedtoabusedrugsandmedicinesanalyses,analyticalmethods,2018,10(6):593-603.29.rafałwalczak,jankrüger,shanemoynihan,aminiaturisedimagebasedfluorescencedetectionsystemforpoint-of-care-testingofcocaineabuse,measurementscienceandtechnology,2015,26(8):1-15.085401.30.priyamishra,ivneetbanga,roshikatyagi,tanyamunjal,adityagoel,neenacapalash,princesharma,c.r.suri,sonugandhi,animmunochromatographicdipstickasanalternateformonitoringofheroinmetabolitesinurinesamples,rscadvances,8(41):23163-23170.31.emineguler,gulizbozokalfa,bilaldemir,zinarpinargumus,baharguler,ebrualdemir,sunatimur,hakancoskunol,anaptamerfolding-basedsensoryplatformdecoratedwithnanoparticlesforsimplecocainetesting,drugtestingandanalysis,2016,9(4):578-587.32.sijialiang,qiaoyuwu,jikaimao,chengong,dongdongyu,jianguangzhou,anovelsmartphone-baseddeviceforrapidon-sitemethamphetaminedetection,materialsexpress,10(10):1638-1645.33.héctorvázquez-becerra,enriquepérez-cárdenas,saéꢀmuñiz-hernández,vanessaizquierdo-sánchez,luisalbertomedina,characterizationandinvitroevaluationofnimotuzumabconjugatedwithcisplatin-loadedliposomes,journalofliposomeresearch,2017,27(4):274-282.fitc34.t.h.the,t.e.w.feltkamp,conjugationoffluoresceinisothiocyanatetoantibodiesꢀⅰ.experimentsontheconditionsofconjugation,immunology,1970,18(6):865-873.35.t.h.the,t.e.w.feltkamp,conjugationoffluoresceinisothiocyanatetoantibodiesꢀⅱ.areproduciblemethod,immunology,1970,18(6):875-881.36.arthurf.wells,curtise.miller,marvink.nadel,rapidfluoresceinandproteinassaymethodforfluorescent-antibodyconjugates,appliedmicrobiology,1966,14(2):271-275.37.wendizhang,pingsu,yiyang,zhenquanguo,developmentofasensitivebiotin-avidinamplifiedenzyme-linkedimmunosorbentassayforthedeterminationofketamineinbiologicalsamples.journalofimmunoassayandimmunochemistry,2010,31:205-216。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，尤其涉及一种新型氯胺酮快速定性筛查和准确定量分析方法。
背景技术：
：：2.由于氯胺酮（本发明简称ket）定性定量分析使用的广泛性、重要性和急迫性，近年来研究者几乎已使用了所有已知分析方法，而且新的分析方法还不断涌现。传统上，色谱、质谱(ms)以及两者联用的方法被视为成瘾药物分析的金标准，包括：气相色谱(gc)[1-4]、液相色谱(lc)[4-6]、gc-质谱联用法（包括单四级杆气相色谱质谱联用法gc-ms和串联四级杆气相色谱质谱联用法(gc-ms/ms)[7,8]、lc-质谱联用法[9-12]、质谱法[13,14]。尽管这些技术具有优良的准确性和灵敏度，但也存在一些缺点，包括不够便携，测试时间长，涉及繁琐和溶剂消耗的样品制备步骤，需要熟练的操作者，运行和维护费用昂贵，不适于现场分析。其它常用方法还有：毛细管电泳法[15,16]、荧光免疫法[17,18]、电化学方法[19,20]、表面等离子体共振(spr)[21]、拉曼光谱法[22-24]、红外光谱（ir）法[25-28]等。其中，毛细管电泳法分离效率高，但其具有与色谱法同样的缺点。电化学方法简单，成本低，可实现现场检测。但其抗干扰能力差对检测体系要求高，电极修饰较复杂，稳定性重现性较差。spr法具有快速响应的优点，灵敏度和特异性高，不需要复杂的样品制备。但需要特殊仪器，对检测体系要求高，技术性强。拉曼光谱和ir技术简单、快速、灵敏度高、可无损检测，但是拉曼光谱往往具有强烈的荧光背景，应采用衬底材料制成表面增强拉曼光谱，然而仍需仔细、有侵入性的样品制备，因此不适合常规分析。ir技术对缴获的固体合成毒品分析简单快速，但是对于复杂基质的液体样品，由于基质背景干扰严重分析困难。总之在众多分析方法中，荧光免疫分析法由于其灵敏度高、简单、快速、易于使用、便携、一次性等优点，已成为成瘾药物测定方面的新热点[17,18,29-32]。[0003]本文采用竞争的新思路构建cfia方法，获得ket特异性分析的新平台。在氯胺酮抗体（ket-ab）上标记异硫氰酸荧光素(fitc)作为结果信号分子。样品溶液中的ket作为抗原（ket-ag）与微孔板上包被的氯胺酮半抗原（ket-bsa）相互竞争，与fitc标记的ket-ab结合。荧光强度与ket浓度负相关，ket定量方程的线性相关系数大于0.992%。采用gc-ms/ms法和cfia法对ket的lod值分别进行测定，发现cfia法对ket的lod值低1×104倍，而且此两种方法同时用于ket实际样品检测时，获得定量结果的相对偏差小于10%。综上，ket分析新方法，即：cfia法，被成功建立。该方法简单、灵敏，便携、无需复杂的样品前处理，可进行大量生物样品和环境样品的定性筛查，以及快速定量分析。cfia法还可被进一步推广应用到其它成瘾药物，以及多种混合成瘾药物的简单、快速定性筛查和准确定量分析中。技术实现要素：[0004]针对现有技术的不足，本发明的目的是提出了一种灵敏的间接竞争荧光免疫定量ket检测法。[0005]本发明的目的是这样实现的，一种新型氯胺酮（ket）快速定性筛查和准确定量分析方法，包括如下步骤：第一步，缓慢将氯胺酮半抗原（ket-bsa）溶液滴加到微孔板的每个微孔中，包被过夜，然后用pbst洗涤，备用；第二步，用ova溶液封闭ket-bsa中的非特异性结合位点，再用pbst洗涤；第三步，氯胺酮单克隆抗体（ket-ab）用荧光染料标记；将荧光染料标记的ket-ab，与待测样品溶液或各种ket标准溶液中的氯胺酮抗原（ket-ag），进行混合，得到混合液，把上述的混合液再分别加入微孔板不同的微孔中；然后进行ket-ag/ket-ab孵育；孵育完成后再用pbst洗涤；第四步，将孵育并洗涤完成后的微孔板在酶标仪上分别测定每个微孔的荧光强度值，通过记录ket的相对荧光强度值来定性定量检测ket。[0006]上述ket-ab标记染料为fitc，ket-bsa包被微孔板的最佳浓度为50μg/ml，包被最佳条件为4℃下12h；抗原抗体（ket-ag/ket-ab）反应的最佳条件为37℃下反应2h；ket-ag/ket-ab反应时pbs缓冲液最佳ph值为中性，pbs缓冲液中最佳磷酸盐浓度为0.01mol/l。[0007]在上述第三步中，要在具有高度特异性的ket-ab上标记荧光染料作为信号分子，而且制备的ket-ab应具有高度的ket识别专一性，对基质复杂样品中的其它结构类似的干扰药物的交叉反应率应尽量低，这样才能保证ket定性定量结果的准确性。因此该高度特异的ket-ab制备流程为：第一步，小鼠免疫；第二步，淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合；第三步，杂交瘤细胞的筛查；第四步，ket-ab的纯化。[0008]本发明采用上述的一种新型ket快速定性筛查和准确定量分析方法，其特征在于：能对ket进行高特异性识别和分析。[0009]本发明具有如下特点和优点：本发明采用ket-bsa包被微孔板并与待测样品中的ket-ag竞争结合fitc标记ket-ab的新型模式，间接快速对人体尿液、血液和环境样品中的ket进行定量分析。该方法中，样品的ket含量与检测到的荧光强度负相关。最终获得的竞争定量方程线性相关系数为0.992，线性范围是0.01μg/ml~0.5μg/ml，lod为0.1pg/ml，方法特异性结果表明去甲氯胺酮的交叉反应率低于10%。在加标样品检测中回收率在96%至104%之间。cfia法与gc-ms/ms法同时用于ket实际样品检测时，获得定量结果的相对偏差小于10%。采用gc-ms/ms法和cfia法对ket的lod值分别进行测定，发现cfia法对ket的lod值低1×104倍，而且样品前处理以及经济投入方面都较经典的气质联用法有很大优势。总之，该方法可作为临床血液、尿液样本或者环境水样品中ket的快速灵敏初筛以及定量的新思路。附图说明[0010]图1为本发明ket-bsa合成路线图。[0011]图2a为本发明ket、ket-bsa和bsa的ir对比图。[0012]图2b为本发明ket-bsa和bsa的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（maldi-tof-ms）对比图。[0013]图2c为本发明fitc标记ket-ab的荧光光谱图。[0014]图3为本发明最优色谱条件下gc-ms/ms法检测ket的三对特征母离子/子离子对色谱图和总离子流色谱图。[0015]图4a为本发明ket-bsa包被浓度优化曲线图。[0016]图4b为本发明ket的竞争曲线图和定量线性方程图（插图）。具体实施方式[0017]本发明提出了一种简单、高效、灵敏的间接竞争荧光免疫定量ket检测法。[0018]一种新型氯胺酮（ket）快速定性筛查和准确定量分析方法，包括如下步骤：第一步，缓慢将氯胺酮半抗原（ket-bsa）溶液滴加到微孔板的每个微孔中，包被过夜，然后用pbst洗涤，备用；第二步，用ova溶液封闭ket-bsa中的非特异性结合位点，再用pbst洗涤；第三步，氯胺酮单克隆抗体（ket-ab）用荧光染料标记；将荧光染料标记的ket-ab，与待测样品溶液或各种ket标准溶液中的氯胺酮抗原（ket-ag），进行混合，得到混合液，把上述的混合液再分别加入微孔板不同的微孔中；然后进行ket-ag/ket-ab孵育；孵育完成后再用pbst洗涤；第四步，将孵育并洗涤完成后的微孔板在酶标仪上分别测定每个微孔的荧光强度值，通过记录ket的相对荧光强度值来定性定量检测ket。[0019]上述ket-ab标记染料为fitc，ket-bsa包被微孔板的最佳浓度为50μg/ml，包被最佳条件为4℃下12h；抗原抗体（ket-ag/ket-ab）反应的最佳条件为37℃下反应2h；ket-ag/ket-ab反应时pbs缓冲液最佳ph值为中性，pbs缓冲液中最佳磷酸盐浓度为0.01mol/l。[0020]在上述第三步中，要在具有高度特异性的ket-ab上标记荧光染料作为信号分子，而且制备的ket-ab应具有高度的ket识别专一性，对基质复杂样品中的其它结构类似的干扰药物的交叉反应率应尽量低，这样才能保证ket定性定量结果的准确性。因此该高度特异的ket-ab制备流程为：第一步，小鼠免疫；第二步，淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合；第三步，杂交瘤细胞的筛查；第四步，ket-ab的纯化。[0021]具体实施如下：1、实验部分1.1仪器96孔板的荧光测量在varioskanflash多模微孔板阅读器(thermofisherscientific,usa)上进行。实验用微孔板（96孔）为丹麦nunc产品。采用ir(vertex70,brukeroptics,usa)对已合成的ket-bsa进行基团的检测，并采用maldi-tof-ms质谱仪(autoflexspeed,bruker,usa)对已合成的ket-bsa进行精确分子量检测。ket-ab标记fitc分子染料的浓度采用荧光仪perkinelmerls55（perkinelmer,usa）测算。所有溶液的酸度和碱度用denverub-10精密酸度计(denverinstruments,usa)测量。整个实验中的免疫过程在恒温培养箱中进行，恒温控制精度为0.1℃。超纯水是自来水经aquapro净水器（重庆，中国）和milliqiq7000实验室水系统（ma，usa）后的二次纯水。[0022]1.2试剂盐酸氯胺酮（ket•hcl）、吗啡（morphine）、海洛因（heroin）、可待因（codeine）、可卡因（cocaine）、去甲氯胺酮（norketamine）和麻黄碱（ephedrine）标准品购自上海原思标物科技有限公司（上海，中国）。卵清蛋白(ova)、fitc、tween20和牛血清白蛋白(bsa)从sigma-aldrich获得(st.louis,mo,usa)。乙酸乙酯，氢氧化钠（naoh），碳酸钠（na2co3），碳酸氢钠（nahco3），磷酸氢二钠（na2hpo4），磷酸二氢钾（kh2po4），氯化钠（nacl）和氯化钾（kcl）购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）。[0023]实验中制备了以下缓冲溶液：制备碳酸盐缓冲液（cbs），浓度为0.05mol/l，ph值为9.6，是称取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g后加超纯水定容至1000ml。制备磷酸盐缓冲液（pbs），ph值为7.4，是称取8g氯化钠，2.9g十二水和磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾后加超纯水定容至1000ml。制备ph为7.2的pbst清洗剂，是将适量吐温20溶解在pbs缓冲液中，吐温20在pbs缓冲液中的含量为0.05%（v/v）。ket-bsa溶解在cbs缓冲液中用来制备母液。ket-ab上标记了荧光信号分子fitc并溶解在pbs溶液中。清洗96孔板的清洗溶液为pbst缓冲液。制备封闭剂ova溶液是将ova溶解在pbs缓冲液中，ova在pbs缓冲液中的含量为0.1%（v/v）。该试剂的作用是防止微孔板上已包被ket-bsa的非特异性吸附。[0024]本研究中所有实验数据全部是平均了五次平行实验结果后的数值。实验中所用的化学试剂和药品均是分析纯，实验用水均为超纯蒸馏水。[0025]1.3合成ket-bsa按照图1合成ket-bsa。ket-bsa是将小分子ket(mw285)与大分子bsa偶联后形成的具有免疫原性的生物大分子。[0026]步骤1：羧基-氯胺酮（ket-cooh）的制备。以ket•hcl为原料，游离后与溴乙酸乙酯进行取代反应引入酯基，得到ket的酯，然后在碱性条件下水解得到ket-cooh。[0027]将ket•hcl溶于超纯水中，加入氨水调ph值至10，采用有机溶剂二氯甲烷进行萃取，收集三次萃取的有机相。再对有机相进行无水硫酸镁除水、过滤除杂、减压蒸发除有机溶剂等操作后，就制得了游离态ket。将游离态ket溶于丙酮中，加入溴乙酸乙酯和碳酸钾，70℃下回流反应16h，冷却至常温，过滤，得到滤液；滤液减压蒸馏得到ket的酯；将制备的ket酯与四氢呋喃、甲醇混合均匀。然后加入naoh溶液，室温下反应16h。然后用盐酸调ph至7，用乙酸乙酯萃取一次。收集有机相，通过减压蒸馏得到ket-cooh。经高效液相色谱(hplc)纯化，纯度可达99.8%以上。[0028]步骤2：ket-bsa的制备：通过碳二亚胺法使ket-cooh与bsa结合制备ket-bsa：将ket-cooh与n,n-甲基甲酰胺(dmf)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和环己基尿素二亚胺(dcc)三种物质混合均匀，室温下反应16h。反应结束时，将溶液离心，取上清液作为a液。将bsa加入到pbs缓冲液混合均匀，得到b液；将a液和b液按体积比为1:5混合均匀，4℃下反应16h，得到ket-bsa混合液，用pbs缓冲液透析5次，透析结束后离心取上清液，得到ket-bsa。[0029]1.4ket-bsa的验证所得ket-bsa的分子结构鉴定分别采用ir和ms进行确证。[0030]首先，分别取ket-bsa、bsa和ket固体粉末1mg（纯度》95%）与干燥的kbr粉末100mg（预先放置于马弗炉中200℃干燥10小时）混匀后置于玛瑙研钵中研磨过筛，过筛后的粉末在红外灯下压片，采用kbr压片法在波数为400-4000cm-1范围，利用ir仪进行测定，见图2a。[0031]其次，将所得ket-bsa通过maldi-tof-ms进行偶联比的测定。由于maldi-tof-ms可以检测带正电荷的肽离子，而且ket-bsa偶联物的电离被认为是与bsa蛋白类似的，因此任何质量转移都归因于已经结合在ket-bsa中的bsa蛋白。取0.5ꢀµlbsa或者ket-bsa，分别与0.5ꢀµl芥子酸（tfa）溶液混合(浓度为10mg/ml，所用溶剂为乙腈和水等体积混合后再加入0.1%(v/v)的tfa)。然后点在maldi-tof的抛光钢mtp384靶板上。在室温下自然干燥，送入离子源中进行检测。同样的方法在相邻靶位上点bsa校准标准品。原始数据使用flexanalysis软件进行处理。见图2b。[0032]1.5制备ket-ab：这个过程分为四个步骤。步骤1：小鼠免疫。选择8周龄雌性balb/c小鼠进行皮下淋巴组织免疫。步骤2：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合。首先，小鼠腹腔细胞悬浮液，离心沉淀得到饲养细胞悬浮液。其次，通过传代培养获得生长状态良好、适合细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)。再次，获得免疫处理过的小鼠淋巴结，研磨、离心、沉淀，完成含淋巴细胞的培养基imdm的制备。最后，将淋巴细胞、骨髓瘤细胞和饲养细胞与聚乙二醇(peg)融合，获得杂交瘤细胞。步骤3：杂交瘤细胞的筛选。杂交瘤细胞的筛选方法为竞争抑制elisa法，筛选标准为竞争抑制率最大值。选取3e7细胞株进行克隆培养。步骤4：ket-ab的纯化。经过反复培养，得到阳性率为100%的单克隆ket-ab，用hitrapproteinghp等亲和柱精制。最后，制备了纯化的ket-ab。[0033]1.6fitc染料标记ket-ab。据文献[33]，为了获得发荧光的ket-ab，采用摩尔浓度比为nket-ab:nfitc=10:1时，将ket-ab与fitc偶联。标记时ket-ab分散于pbs缓冲液中，溶液浓度为5mg/ml，fitc溶解在cbs缓冲液中，溶液浓度为0.5mg/ml。混合时ket-ab溶液先加入反应瓶中，随后缓慢加入fitc溶液，避光常温搅拌两小时。再使用sephadexg-25层析柱对标记了fitc的ket-ab进一步纯化。收集纯化后的1ml溶液并且在280nm测量吸光度。fitc与蛋白质的比率（f/p）根据下式计算[34]：molar(f/p)=(2.77×a495)/(a280-0.35×a495)上式中，a495是fitc染料的吸光度值。仅仅收集溶液具有f/p系数在1到4之间的部分以避免蛋白的过度标记。因为荧光团自淬灭效应，蛋白的过度标记将导致增加非特异性结合并减少量子产率[34-36]。如图2c所示。经计算，fitc与ket-ab(nfitc/nket-ab)的近似摩尔比为7.8。[0034]1.7cfia法测定过程。整个实验过程在96孔板上展开。第一步，缓慢将ket-bsa溶液（50ꢀµg/ml，100ꢀµl）滴加到每个微孔中，在4℃包被12小时，然后用pbst洗涤3次，每次3分钟。第二步，用1%ova溶液封闭ket-bsa中的非特异性结合位点，每孔350ꢀµl,37℃恒定0.5h，再用pbst洗涤三次，每次3分钟。第三步，将fitc标记的ket-ab（用pbs稀释，50ꢀµg/ml，100ꢀµl）与待测样品溶液或各种ket标准溶液（用pbs溶解）混合后，把混合液分别加入包被ket-bsa的微孔中；然后在最佳的温度和时间条件下进行孵育（37℃下反应2.0h）。第四步，微孔板在酶标仪上分别测定每个微孔的荧光强度值，通过计算ket的相对荧光强度值来定性定量检测ket。酶标仪设定的最佳激发波长(λex)为488nm，在最佳发射波长(λem)525nm处读取荧光强度数值。荧光强度与ket浓度相对应，形成竞争曲线。曲线上每个点的数值是五次平行实验的平均值。ic50值定义为在最大荧光强度值50%时对应的样品中ket-ag的浓度。lod定义为ket的相对荧光强度为背景荧光强度的3倍时的ket浓度。最大荧光强度（fmax）定义为微孔板上包被的ket-bsa全部与ket-ab结合时的荧光强度。此时样品中不含ket，不存在与ket-bsa竞争结合ket-ab。荧光强度（f）定义为微孔板上包被的ket-bsa一部分与ket-ab结合时的荧光强度。此时样品中含有部分ket与ket-bsa竞争结合ket-ab。背景荧光强度（f0）定义为微孔板上包被的ket-bsa未与ket-ab结合时的荧光强度。此时样品中大量ket直接与ket-ab结合，ket-bsa不能竞争结合ket-ab。相对荧光强度用f-f0进行计算。[0035]1.8gc-ms/ms分析。该方法被公认为是测量ket的准确方法。该方法比常见的gc-ms法对目标物的lod值更低，定量结果更为准确，可用以对新型cfia法的定性定量结果进行对比和评价。本研究的实际样品为ket滥用者的血液和尿液样品以及环境样品，均由福建警察学院实鸣司法鉴定中心提供。待检样品应该采用密封玻璃瓶盛装，样品体积应不少于5ml。先将尿液、血清或全血样品以及环境水样（1ml）置于离心管（10ml）中进行样品预处理。用4mol/lnaoh调ph为13，用2ml乙酸乙酯分别萃取两次，萃取时将样品与乙酸乙酯充分混合，以10000r/min离心3min，破除乳化，促进分层。将提取两次的有机层转移到另一个玻璃管中，在40℃下用氮气干燥。残留物用200ꢀµl甲醇溶解，1微升溶液被注入gc-ms/ms仪器进行分析。[0036]实验中用于色谱分析的gc-ms/ms仪型号为agilent7890a/7000qqqb，所配色谱柱为hp-5capillarycolumn(30m×0.25mm×0.25µm)。柱温箱程序升温条件为：起始温度120℃保持1分钟，然后以20℃/min的升温速率，升高到250℃后再保持1分钟。使用载气he，气相色谱以恒定流量1ml/min的分流模式运行，分流比10:1。进样口温度为230℃。质谱测量采用电子电离源(ei)在70ev下进行电离。串联四极杆和离子源的温度分别保持在150℃和230℃。采用多反应监测(mrm)模式设置质谱/质谱(ms/ms)系统，以高纯氮气作为碰撞气体，将目标化合物的特征母离子裂解成子离子。利用mrm模式，选择目标化合物在最佳碰撞能量下的两个或三个特征母离子-子离子对进行定性和定量分析。峰面积最大的离子对为定量离子对，其余为定性离子对。建立ket的mrm最佳检测方法，主要是确定其特征母离子/子离子对和相应的碰撞能量等参数，使方法具有高灵敏度和特异性。三对最佳的ket母离子-子离子对和碰撞能量分别为180-116.1对应ce25v（该母离子-子离子对为定量离子对）、180-151对应ce10v和180-145.1对应ce10v（这两对母离子-子离子对为定性离子对）。ket的保留时间为7.373min。见图3。[0037]2、结果与讨论2.1ket-bsa确证分析：采用固体kbr压片，对ket-bsa、bsa和ket进行ir测定，如图2a所示。通过上述三种化合物红外吸收光谱中特征基团吸收峰的相似性来判断ket-bsa是否成功合成。首先，将ket-bsa与bsa的ir进行比较，发现它们在2800-3400cm-1和1500-1700cm-1区域有相似的吸收峰。由于这些波数范围是bsa中氨基酸的典型吸收区域，可以合理地解释为bsa已共价结合在新合成的ket-bsa分子中。其次，比较了ket-bsa和ket的ir，发现在600-1200cm-1区域有相似的吸收。由于这个波数范围是ket的特征吸收区域，而bsa在此范围没有明显的吸收，说明ket已经共价结合在新合成的ket-bsa分子中，这才使ir可以出现ket官能团的特征吸收峰。以上结果从特征官能团的红外吸收角度验证了ket-bsa的成功合成。[0038]此外，利用maldi-tof-ms从分子量的角度进一步验证ket-bsa的成功合成。在图2b中，x轴为质荷比，y轴为响应值。当电荷设为1时，x轴就代表物质的分子量。ket-bsa用红线表示，bsa用黑线表示。两物质的图形总体相似，但是红色实线明显比黑色实线向右平移。右移是分子量增加的方向，说明新合成的ket-bsa的分子量大于bsa的分子量，再次证实了ket-bsa的合成成功。根据ket-bsa和bsa的分子量差可以计算出bsa与ket的结合比。如图2b所示，ket-bsa和bsa的分子量分别为72828.423和66399.708，因此bsa与ket的结合比例约为1:27。[0039]2.2cfia法实验条件优化。[0040]随着ket在临床麻醉和抗抑郁方面的广泛应用、ket在毒品市场中日益高涨的热度以及ket在环境污水中的定期监测和环境风险评估中检测要求的不断提高，如何对其简单、快速、便携、灵敏、准确的定性定量分析已成为所有研究者亟待解决的关键问题。[0041]免疫分析由于其具有优异的特异性和灵敏性一直以来都是研究的焦点。由于ket是一种有机小分子，其必须与大分子结合才能获得免疫原性。因此免疫分析必须在竞争机制下进行，才能得到准确的检测结果。通过将ket与bsa偶联成ket-bsa并提前包被在微孔板上，再将标记fitc的ket-ab与样品溶液混合，然后加入被ket-bsa包被的微孔板中，最后通过计算ket的相对荧光强度来定性定量检测ket。在该新型cfia法分析中，荧光强度与样品中ket的浓度呈负相关。优化各种检测参数可以提高方法的灵敏度且降低lod值。具体参数包括包被ket-bsa浓度、包被ket-bsa的时间和温度、缓冲液的ph值和离子强度、ket-ag/ket-ab孵育时间、ket-ag/ket-ab反应温度等。[0042]2.2.1ket-bsa包被浓度的优化。将不同浓度的ket-bsa经cbs缓冲液稀释后涂覆在微孔板上，以确定ket-bsa的最佳包被浓度。每孔加入等量fitc标记的ket-ab，测定荧光强度。分别取涂覆ket-bsa的不同浓度值（0.3、6.25、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200ꢀµg/ml）和相应获得的荧光强度值绘制滴定曲线（见图4a），每个包被浓度对应的荧光强度值为5次平行实验数据的平均值。在图4a中，当ket-bsa的浓度为0-50ꢀµg/ml时，相对荧光强度随着包被ket-bsa浓度的增加而增加。当ket-bsa的浓度大于50ꢀµg/ml时，相对荧光强度不再增加保持在恒定值。因此，本实验选择在曲线拐点处的ket-bsa包被浓度(50μg/ml)作为最佳实验浓度。[0043]2.2.2ket-bsa包被时间和温度的优化。[0044]针对ket-bsa包被温度和包被时间条件开展了一系列的实验研究，具体包括：条件一，在4℃包被10h；条件二，在4℃包被12h；条件三，在4℃包被14h；条件四，在37℃包被1h；条件五，在37℃包被2h；条件六，在37℃包被3h，条件七，在37℃包被4h。结果表明，在4℃下将ket-bsa包被在微孔板12h的条件下，荧光强度值最高。因此，本实验推荐在4℃下包被微孔板12h。[0045]2.2.3ket-ag/ket-ab反应孵育时间和孵育温度的优化。[0046]孵育时间和温度在ket-ag和ket-ab的反应中也很重要。本研究涉及两个部分。一是标记fitc的ket-ab与包被在微孔板上的ket-bsa结合反应，二是在实际样本中ket-ag与标记fitc的ket-ab的结合反应。低温可提高它们的结合率，高温可加速结合。在37℃条件下，研究了ket-ag/ket-ab反应的孵育时间。当孵育时间从0变化至2h时，发现免疫荧光强度迅速增加。当孵育时间从2h继续变化到4h时，免疫荧光强度缓慢下降。结果表明，最佳孵育时间为2h。[0047]2.2.4pbs缓冲液ph值的影响：pbs缓冲液常被用作免疫反应的介质。制备了一系列不同ph值(具体ph值为4、5、6、7、8、9、10)的pbs缓冲液。这些pbs缓冲液在本研究中被用作免疫荧光实验的介质。结果发现在ph值为中性的pbs缓冲液中免疫荧光强度最强，检测效果更好。在ph值为酸性或碱性的pbs缓冲液中，免疫荧光强度都会降低。因此，在本研究中选择ph值为7.4的pbs缓冲液作为免疫实验的介质。[0048]2.2.5pbs缓冲液离子强度的影响：pbs缓冲液中磷酸盐浓度值从0增加到0.01mol/l时，免疫荧光强度急剧增加。当pbs缓冲液中磷酸盐浓度为0.01mol/l时，免疫荧光强度达到最高。当pbs缓冲液中磷酸盐浓度从0.01mol/l继续增加时，免疫荧光强度逐渐下降。因此，在本研究中选择磷酸盐浓度为0.01mol/l的pbs缓冲液。[0049]2.3荧光竞争曲线和定量线性方程。[0050]在最优条件下，得到了不同浓度ket与相应荧光强度值绘制的荧光竞争曲线。fitc标记的ket-ab混合不同浓度的ket标准溶液(分别为0、1×10-7、1×10-6、1×10-4、0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5和2.5μg/ml)滴加到已包被ket-bsa(50μg/ml)的微孔板上。ket标准溶液浓度在0~2.5μg/ml范围内的荧光强度值和荧光竞争曲线见图4b。该图中，x轴和y轴分别为ket的浓度和相对荧光强度值。竞争曲线上每个点的数值是五次平行实验的平均值。根据荧光竞争曲线，测定了采用cfia新方法对ket的ic50值为1pg/ml（用于降低荧光50%的化学物质的浓度）。[0051]对竞争曲线的拐点进行分析，并根据拐点处ket浓度和相对荧光强度绘制ket定量校准线性方程。定量方程和线性范围分别为y=-0.69642x 0.34854（其中x为ket浓度，y为相对荧光强度）和10~500ng/ml。线性相关系数(r2)为0.992。ket的定性检测限为0.1pg/ml(见图4b插图)。[0052]血液、尿液及环境样品中ket的检测技术大多是基于gc-ms法。然而，将传统的gc-ms法用于含有微量ket的基质复杂样品分析时，常会遇到方法灵敏度和选择性较低而检不出目标物ket的情况[19,20]。gc-ms/ms是近年来迅速发展起来的可靠技术。其定性定量分析结果准确，具有更高的灵敏度和选择性。该技术对基质复杂样品中超微量物质的靶向分析有很好效果。表1中列出了用于ket分析的两种方法（即gc-ms/ms法和新cfia法）的各项参数，包括线性范围，线性方程，r2，lod。对比该两种方法，发现cfia法对ket分析具有更宽的定量范围和更低的lod值，并且两种方法定量方程的线性相关系数相当，均大于0.99。当定量方程线性相关系数大于0.99时，定量结果的准确性可以保证。采用gc-ms/ms法和cfia法对ket的lod值分别进行测定，发现cfia法对ket的lod值低1×104倍。人尿样品中ket的标准添加及回收率结果见表2。尿液基质中添加的标准物质浓度选择为定量方程线性范围内的低、中、高浓度水平。cfia法和gc-ms/ms法的回收率均小于10%，说明两种方法在各浓度定量结果都准确可靠。然而，在实际样品检测中，gc-ms/ms法需要完成复杂耗时的样品前处理过程，cfia法却无需样品预处理。因此，cfia法较gc-ms/ms法在实际应用中更有优势和前景。[0053]表1：cfia和gc-ms/ms法检测ket的线性回归方程、线性范围、r2和lodmethodcfiagc-ms/mslinearrange(μg/ml)0.01~0.52.0-7.5linearregressionequationy=-0.69642x 0.34854y=5.7390x-12022.8302r20.9920.998lod(ng/ml)1×10-41.4表2：尿液中ket标准添加样品的检测结果（n=5）2.4cfia方法特异性。免疫分析方法的特异性对定量结果的准确性十分重要。因此对与目标物ket具有相似分子结构的药物类似物，例如：吗啡、海洛因、可待因、可卡因、去甲氯胺酮和麻黄碱等，进行了潜在的交叉反应性(cr)评价。除ket外，其它几种药物在吸毒人群中也很流行。所以多种毒品及其代谢物就可能会同时出现在药物滥用者的尿液和血液中。上述新问题的解决有赖于制备出高度专一识别的抗体并研发出具有高特异性的免疫分析体系。cr比率按照下面公式来进行计算。[0054]公式中，各种药物的ic50值测定，均按照2.7所述步骤，在已优化的最佳条件下进行。当荧光强度值降低到原始强度的50%时，所加入的药物浓度即为该药物的ic50值。[0055]表3为吗啡、海洛因、可待因、可卡因、去甲氯胺酮、麻黄碱、ket的cr比值。从表中可以明显看出，cfia法对ket具有高度特异性。抗体对抗原的分子识别是依据抗原独特的结构特征。在这些共存药物中去甲氯胺酮是ket的代谢物，与其结构与ket最为相似，所以去甲氯胺酮的cr值也最大（为9.6%见表3），它对抗体的干扰性也最强。此外，其它共存药物的cr值都很小几乎检测不到。[0056]查文献知wendizhang等也建立了一种生物样品中ket的测定方法，即生物素-亲和素扩增酶联免疫吸附法（ba-elisa）[37]。该方法对ket的lod值为0.03ꢀµg/ml。方法特异性研究中，ket、norketamine、morphine、cocaine的cr值分别为100%、35.13%、1.09%和0.48%。对比本研究的新型cfia法，ket的lod值为0.1pg/ml。方法特异性的结果中ket和norketamine的cr值分别为100%、9.6%。其它药物类似物的cr值均小于《0.05%。结果表明，首先cfia法对ket的lod值较文献方法有大幅降低，在基质复杂样品痕量ket定性定量检测方面优势明显。其次cfia法针对ket的特异性比文献方法更高，可排除样品基质中各种杂质的干扰，定性和定量准确性也明显增强。[0057]表3cfia新方法的特异性结果crossreactantscrratio(%)ket100norketamine9.6morphine《0.05heroin《0.05codeine《0.05cocaine《0.05ephedrine《0.052.5实际样品分析。人体血液、尿液和环境水样均来自福建警察学院实鸣司法鉴定中心。在最佳条件下用cfia法对不同类型样品进行研究。人体血液、尿液中ket浓度随吸食时间增加而降低。ket滥用者血液、尿液中实际ket阳性送检样品的浓度根据经验一般为1-6μg/ml。根据cfia法定量的范围，实际样品需稀释10-100倍后再进行分析。此外，对实际样本也采用gc-ms/ms方法进行分析。如果浓度低于仪器的lod值，可以在前处理中增加富集步骤。在表4中，不同类型样品（包括血样、尿样和环境水样）通过cfia法和gc-ms/ms法检测的结果被列出，经对比发现同一样品无论是什么样品类型或采用什么检测方法，结果的相对fangmi,jiutongli,anovelsurface-enhancedramanscatteringmethodforsimultaneousdetectionofketamineandamphetamine,rscadvances,2020,10(60):36609-36616.25.e.deconinck,c.aït-kaci,a.raes,m.canfyn,j.l.bothy,c.duchateau,c.mees,k.debraekeleer,l.gremeaux,p.blanckaert,aninfraredspectroscopicapproachtocharacterisewhitepowders,easilyapplicableinthecontextofdrugchecking,drugpreventionandonsiteanalysis,drugtestingandanalysis,2021,13(3):679-693.26.cui-meiliu,yuhan,shun-gengmin,weijia,xinmeng,pei-peiliu,rapidqualitativeandquantitativeanalysisofmethamphetamine,ketamine,heroin,andcocainebynear-infraredspectroscopy,forensicscienceinternational,2018,290:162-168.27.cui-meiliu,yuhan,shun-gengmin,rapidqualitativeanalysisofmethamphetamine,ketamine,heroin,andcocainebyfouriertransforminfraredspectroscopy(ftir),spectroscopyandspectralanalysis,2019,39(7):2136-2141.28.radigyam.correia,eloilsondomingos,flaviatosato,nayaraa.dossantos,juliadea.leite,mayaradasilva,marceloc.a.marcelo,rafaels.ortiz,paulor.filgueiras,wandersonromão,portablenearinfraredspectroscopyappliedtoabusedrugsandmedicinesanalyses,analyticalmethods,2018,10(6):593-603.29.rafałwalczak,jankrüger,shanemoynihan,aminiaturisedimagebasedfluorescencedetectionsystemforpoint-of-care-testingofcocaineabuse,measurementscienceandtechnology,2015,26(8):1-15.085401.30.priyamishra,ivneetbanga,roshikatyagi,tanyamunjal,adityagoel,neenacapalash,princesharma,c.r.suri,sonugandhi,animmunochromatographicdipstickasanalternateformonitoringofheroinmetabolitesinurinesamples,rscadvances,8(41):23163-23170.31.emineguler,gulizbozokalfa,bilaldemir,zinarpinargumus,baharguler,ebrualdemir,sunatimur,hakancoskunol,anaptamerfolding-basedsensoryplatformdecoratedwithnanoparticlesforsimplecocainetesting,drugtestingandanalysis,2016,9(4):578-587.32.sijialiang,qiaoyuwu,jikaimao,chengong,dongdongyu,jianguangzhou,anovelsmartphone-baseddeviceforrapidon-sitemethamphetaminedetection,materialsexpress,10(10):1638-1645.33.héctorvázquez-becerra,enriquepérez-cárdenas,saéꢀmuñiz-hernández,vanessaizquierdo-sánchez,luisalbertomedina,characterizationandinvitroevaluationofnimotuzumabconjugatedwithcisplatin-loadedliposomes,journalofliposomeresearch,2017,27(4):274-282.fitc34.t.h.the,t.e.w.feltkamp,conjugationoffluoresceinisothiocyanatetoantibodiesꢀⅰ.experimentsontheconditionsofconjugation,immunology,1970,18(6):865-873.35.t.h.the,t.e.w.feltkamp,conjugationoffluoresceinisothiocyanatetoantibodiesꢀⅱ.areproduciblemethod,immunology,1970,18(6):875-881.36.arthurf.wells,curtise.miller,marvink.nadel,rapidfluoresceinandproteinassaymethodforfluorescent-antibodyconjugates,appliedmicrobiology,1966,14(2):271-275.37.wendizhang,pingsu,yiyang,zhenquanguo,developmentofasensitivebiotin-avidinamplifiedenzyme-linkedimmunosorbentassayforthedeterminationofketamineinbiologicalsamples.journalofimmunoassayandimmunochemistry,2010,31:205-216。当前第1页12当前第1页12
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