一种细菌源S-烷基-L-半胱氨酸亚砜裂解酶的筛选及其应用

一种细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的筛选及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的筛选及其应用。


背景技术：

2.二烷基硫代亚磺酸酯类物质是百合科很多植物组织破碎后刺激味道的来源，具有非常广泛的抑制真菌及细菌生长的能力，和抗生素相比微生物无法对其产生抗性，是一种非常有潜力和应用价值的天然抗生素。
3.在自然状态下，二烷基硫代亚磺酸酯会在一些百合科植物鳞茎破碎时产生。由于底物s-烷基-l-半胱氨酸亚砜类物质与半胱氨酸亚砜裂解酶分别存在于这些植物的细胞质和液泡中，当细胞破碎时，二者才会相互接触发生反应。在将百合科植物鳞茎破碎充分酶解后产生的硫代亚磺酸酯量低且成分复杂，无法直接在医药领域应用。现有的乙醇提取硫代亚磺酸酯的方法提取率很低，而且硫代亚磺酸酯极不稳定，其玻璃化转变温度为-36.9oc，在-20oc仍不稳定。另外，乙醇提取的方法还需经过旋蒸去除有机溶剂工艺，在这一过程中二烷基硫代亚磺酸酯将转化为一系列的硫醚类化合物，如二烷基一二三四硫醚等，这些衍生物相对稳定且具有一定的抑菌能力，但抗菌等性能与二烷基硫代亚磺酸酯相比会降低很多。由于二烷基硫醚相对稳定且具有一定的抑菌能力，市面上出现了化学合成法所制备的如二烯丙基三硫醚等物质，高纯度的产品价格高且存在有害物质氯丙烯等存在残留的问题。有文献通过从植物中提取纯度高的半胱氨酸亚砜裂解酶，通过将半胱氨酸亚砜裂解酶和二烷基半胱氨酸亚砜分开放置互不接触，待到有需要时再互相接触进行反应生成二烷基硫代亚磺酸酯，以这种方法来制得纯度高的二烷基硫代亚磺酸酯从而达到更好的抑菌效果。然而，在植物中s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的纯化过程复杂，要得到大量高纯度的酶成本高且难度大，因此市面上植物来源的活性物质价格昂贵且含量不高；与此同时，多位学者也对植物s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的异源表达进行了研究，结果发现其在大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌中的表达均不理想，前者形成大量包涵体，后者即使经过密码子优化或点突变有所改善，但表达比酶活仍然比较低，如现有专利201510354253.3和201610330256.8，难以实现工业化。


技术实现要素：

4.本发明的目的是解决现有技术中的问题，挖掘细菌源、高活性的s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶并进行鉴定。提供一种细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的筛选及其应用，作为植物源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的同工酶，易于实现异源表达及高表达，最终获得高活性高产量的酶用于催化形成高活性抑菌物质，为大规模低成本的产业化应用提供生物催化材料。
5.本发明的技术方案是：一种细菌源硒代半胱氨酸裂解酶，具有s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的催化功
能，产物为二烷基硫代亚磺酸酯，命名为细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1，分离的细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜的裂解酶lcc1能够β位裂解s-烷基-l-半胱氨酸亚砜类物质，其分离自油气田含硫污水样品，辅基为磷酸吡哆醛(plp)，蛋白序列如序列表中的序列1所示。
6.细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的宿主细胞为大肠杆菌。
7.作为一种优选的技术方案，催化的反应为s-烷基-l-半胱氨酸亚砜的β位裂解反应。底物s-烷基-l-半胱氨酸亚砜中的烷基碳链长度为c1-c8，包括甲基、乙基、丙基、烯丙基、丙烯基、丁基以及所述基团的同分异构体。生成的原始产物为对应的二烷基硫代亚磺酸酯，二烷基硫代亚磺酸酯会逐步转化为所对应的二烷基一至三硫醚。
8.一种细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的制备方法为：实验室收集不同来源的油气田含硫污水、在不同细菌培养基中富集培养一周后，收集培养液，每组培养液分成三份，一份进行高压破碎仪破碎获得发酵液与细胞破碎液的混合物，通过dnph法，以s-烷基-l-半胱氨酸亚砜类物质之一的s-甲基-l-半胱氨酸亚砜为底物测定s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶比酶活；选择比酶活最高的培养液组的另两份，一份将菌泥离心下来送至美吉生物测细菌宏基因组，另一份离心菌泥后破碎，制得粗酶液送样至华大基因进行宏蛋白质谱分析检测。
9.结合宏基因组信息进行搜库比对，分析宏蛋白质谱结果，选择其中所有的高丰度、plp依赖型酶编码基因分别进行大肠杆菌异源表达，表达的细胞破碎液利用dnph法进一步测定比酶活，比较比酶活大小，选择最高比酶活序列为筛选获得的目标蛋白，结合宏基因组信息确定其蛋白序列以及核酸序列。经比对发现此酶为细菌硒代半胱氨酸裂解酶，本发明发现该酶具有的s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶活性之前从未见报道，故此酶具有β位裂解s-烷基-l-半胱氨酸亚砜类物质的新型催化功能。将此细菌酶命名为s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1。
10.将获得的目标蛋白s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的核酸序列设计引物，在大肠杆菌中进行异源表达，分别测定胞内粗酶液以及his标签镍柱纯化后的比酶活，同时利用sds-page电泳来鉴定酶的纯度。结果表明，该酶能够在大肠杆菌中实现高产量表达，在20℃过夜诱导10 h后表达量可达12 g/l，sds-page分析显示蛋白均为可溶性表达，没有包涵体形成。
11.取重组酶液与底物s-烷基-l-半胱氨酸亚砜类物质之一的s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜纯品进行反应，采用gcms鉴定产物，高温加热后，主产物为二烯丙基硫代亚磺酸酯的分解产物二烯丙基三硫醚。这与植物源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶酶促反应产物一致，s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜为植物源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的天然底物，因此确定分离获得的细菌源s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1确为植物源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的同工酶。
12.一种细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的双组学筛选鉴定方法为：（1）将油气田含硫污水作为菌液，以10 %的接种量接种至不同的培养基中培养。培养后，各取部分全细胞培养液破碎后测定比酶活；（2）取比酶活最高的培养液样品送测宏基因组分析，同时取比酶活最高的破碎液样品送测宏蛋白组分析；
（3）在已测得的宏基因组中进行蛋白质谱结果的搜库比对，根据plp依赖型酶表达丰度高低筛选获得数个目标酶的基因序列；（4）将筛选的基因序列在e. coli bl21中进行异源表达，菌体收集破碎后，通过测定比酶活验证催化功能强弱，选择催化能力最强的酶为目标蛋白进行酶学功能研究。
13.以s-甲基-l-半胱氨酸亚砜为标准底物，利用dnph法测得该酶的km=6.07 μm，ks=20.3/s。由此数据可得，这是一种新型的、具有高效催化能力的细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶，催化产生二烷基硫代亚磺酸酯类抑菌活性物质，在抑菌药物的研发上具有很大的应用潜力。
14.本发明的有益效果为：（1）与现有技术相比，本发明综合宏基因组和宏蛋白质组双组学的生物信息学方法筛选目标功能酶，避免了从样品中大量筛菌的繁复工作，最终成功获得了一种细菌源的新型s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1，显示了该方法的有效性。
15.（2）筛选获得的s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1能够高效催化s-烷基-l-半胱氨酸亚砜，产生抑菌物质二烷基硫代亚磺酸酯，该酶在抑菌物质的研发上具有很大的应用开发潜力。
16.（3）由于所筛到的酶序列来源于细菌，所以易于在大肠杆菌等异源宿主中实现异源、可溶性高表达。表达过程操作简便，为后续酶的大规模应用提供了酶原料，克服了植物酶复杂的高成本提取过程及在异源宿主中的难表达的技术瓶颈。
附图说明
17.图1为半胱氨酸亚砜裂解酶反应方程式；图2为丙酮酸标准曲线；图3为异源表达酶液各级纯化sds-page；图4为镍柱纯化后的重组s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1对各种s-烷基-l-半胱氨酸亚砜的酶活及比酶活测定图5为重组硒代半胱氨酸裂解酶km及ks的计算；图6为酶促反应产物的gcms鉴定；图7为gcms主峰的搜库鉴定结果。
具体实施方式
18.为了使本发明的技术手段、技术特征、发明目的与技术效果易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
19.实施例1：s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解lcc1的酶活及比酶活测定如图1所示，为s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶反应方程式，副产物为丙酮酸。r基为烷基，其碳链长度为c1-c8，包括甲基、乙基、丙基、烯丙基、丙烯基、丁基等，以及所述基团的同分异构体中的任一一种。
20.酶活测定的方法采用dnph（2,4-二硝基苯肼）法，本方法首先制作丙酮酸的标准曲线，在4 ml反应体系中加入1 ml不同浓度的丙酮酸溶液，1 ml 0.1%的dnph，2 ml 2.5 m的
naoh溶液后进行反应。反应液在od
515nm
下测光吸收值。测定时先用参比调零，参比将丙酮酸替换为1 ml纯水。最终得到了丙酮酸的标准曲线计算公式：丙酮酸含量（μg）=(deltaod
515nm
0.0902)/3.0321，标准曲线如图2所示。
21.将1个酶活单位定义为：在37 ℃，ph=7.0的条件下，每分钟内催化生成1 μg丙酮酸所需要的酶量。因此测酶活时的体系与丙酮酸标准曲线的体系体积保持一致均为4 ml。酶活测定的体系为：1 ml反应液，1 ml dnph和2 ml 2.5 m的氢氧化钠溶液。其中1 ml反应液包括：150 μl 0.05 g/l的plp溶液、100 μl的酶液、20 μl浓度位0.23g/ml的底物，以及ph为7.0的tris-hcl缓冲液。参比组的反应液中不加底物用等量蒸馏水代替。反应时间为1分钟，1分钟后加入1 ml dnph灭活，dnph溶在了1 m的盐酸中，因此能终止反应使酶瞬间失活。
22.酶活的计算公式为u=(delta od
515nm
0.0902)/3.0321，与丙酮酸的含量计算方式保持了一致。比酶活为酶活与蛋白浓度的比值，单位是u/mg。
23.实施例2：环境样品富集培养基于筛选目标蛋白的催化底物为含硫物质，因此选择在在不同油田中取样油气田含硫污水进行富集和筛选。分别在装有灭过菌的50 ml完全培养基、mm培养基的三角瓶中，加入5 ml污水，即10 %的接种量，以此作为菌液进行富集培养。其中mm培养基的配方如下，mm培养基：取m9母液200 ml，加水700 ml，2 ml 1 mol/l已灭菌的硫酸镁，5 g葡萄糖。其中m9母液配方为（每升）：64 g磷酸氢二钠，15 g磷酸二氢钾，2.5 g氯化钠，5.0 g氯化铵，用水定容到1 l，自然ph。
24.富集液在30℃摇床、200 rpm培养一周后，可得一次富集液，以此为菌液，按照10%的接种量转接到同样的灭过菌的培养基中，30℃摇床200 rpm继续培养一周。取第二次富集的培养液10 ml，超声波破碎，细胞破碎液利用dnph法测定酶活，进一步计算比酶活。比较不同样品富集培养液的酶活和比酶活的高低，选择最高比酶活的富集培养液送测序公司，分别进行宏基因组和宏蛋白组测序。
25.实施例3：宏基因组测序与分析选择最高比酶活的富集培养液，离心收集菌体，用tris-hcl缓冲液悬浮并洗涤2~3次。液氮速冻后送测序公司，构建宏基因组文库测序并进行分析。
26.环境样品dna抽提：利用dna提取试剂盒（qiagen）进行富集培养液的dna抽提，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组dna质量和产量。进一步利用covaris m220对抽提的dna片段化（约400 bp）。
27.构建pe文库：1) 接头连接；2) 使用磁珠筛选去除接头自连片段；3) 利用pcr扩增进行文库模板的富集；4) 利用nextflex
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rapid dna-seq kit试剂盒进行磁珠回收pcr产物，得到最终的文库。
28.桥式pcr和测序：1) 文库分子一端与引物碱基互补，经过一轮扩增，将模板信息固定在芯片上；2) 固定在芯片上的分子另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥 (bridge)”；3) pcr扩增，产生dna簇；4) dna扩增子线性化成为单链。5) 加入改造过的dna聚合酶和带有4种荧光标记的dntp，每次循环只合成一个碱基；6) 用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；7) 将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；8) 统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板dna片段的序列。所用的试剂盒为novaseq reagent kits/hiseq x reagent kits。
29.生物信息学分析：数据分析从下机原始序列开始，首先对原始序列进行拆分、质量剪切以及去除污染等优化处理。然后使用优化序列进行拼接组装和基因预测，对得到的基因进行物种和功能上的注释以及分类，包括nr，eggnog，kegg等。
30.实施例4：细菌s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶序列信息的确定取最高比酶活的富集培养液，送测序公司进行宏蛋白质谱测定。蛋白质谱测定方法流程如下：富集培养液样品经高压破碎仪破碎，破碎样品经洗胶脱色、还原和烷基化、胶内酶解和c18 ziptip提纯后在abi 4800 maldi-tof/tof串联质谱仪（abi）中上样。本步样品送至北京六合华大基因进行qe蛋白质谱鉴定，以实施例3中获得的宏基因组信息为数据库，将质谱片段测序结果中的肽段信息搜库比对，获得系列高丰度plp依赖型酶的蛋白序列及核酸序列信息。
31.将筛选的不同蛋白序列分别设计引物进行pcr扩增，pcr产物经酶切连接到表达载体pet24a上，重组质粒经化学转化方法转化到大肠杆菌bl21中，挑取转化子并进行测序验证。测序正确的转化子分别在含有1
‰
的量加入卡那霉素抗性的lb培养基中进行培养及诱导表达。取相同体积的发酵液经4℃、8,000转离心10 min收集菌体。使用破壁缓冲液（50 mm tris-hcl，ph 7.0，50 mm nacl）悬浮收集菌体，用高压破碎仪破碎后12,000转离心10 min，取上清液即为粗酶液。以s-甲基-l-半胱氨酸亚砜为底物，用dnph法测定酶活，比较不同蛋白的酶活高低，成功获得一个编号为lcc1、来源于细菌的高酶活蛋白序列。其蛋白序列如序列表中的序列1所示，其核酸序列如序列表中的序列2所示。
32.实施例5：s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1在大肠杆菌bl21（de3）中的异源表达根据s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1编码的基因序列设计引物进行pcr扩增，pcr产物经酶切连接到表达载体pet24a上,重组质粒经化学转化方法转化到大肠杆菌bl21中，挑取转化子并进行测序验证。将带有正确重组质粒的表达菌在含有500 μl的lb培养基的摇管中过夜培养， lb培养基中按1
‰
的量加入卡那霉素抗性。培养液按照1％的接种量接种到摇瓶中进行蛋白诱导表达。将菌体培养到od
600nm
在0.6~0.8之间，加入浓度0.1~1 mm iptg（异丙基-β-d-硫代半乳糖苷）在16~25℃培养10 h左右。发酵液经4℃、8000转离心10 min收集菌体。使用破壁缓冲液（50 mm tris-hcl，ph 7.0，50 mm nacl）悬浮收集菌体，用高压破碎仪破碎后12,000转离心10 min，取上清液即为粗酶液。进一步采用镍柱（洗脱缓冲液a液：500 mm tris-hcl，ph 7.0，500 mm nacl。b液：500 mm tris-hcl，ph 7.0, 500 mm nacl，500 mm imidazole）纯化，经过梯度洗脱获得纯化峰，经检测具有高酶活。进一步利用sds-page凝胶电泳来检测蛋白纯化结果。蛋白表达及纯化结果如图3所示，可见蛋白条带大小与理论值一致，表达量高且均为可溶性表达。另外，蛋白纯化简单，经镍柱一步纯化即可达到很好的纯度和纯化效果。说明细菌源的s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶易于实现在大肠杆菌宿主中的高表达和可溶性表达，与植物源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶相比具有明显的异源表达量高、易于纯化等优势。
33.实施例6：s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1催化功能及催化反应km及ks的测定为了验证重组酶是否为s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶，采用了几种不同的半胱氨酸亚砜类底物对其进行酶活测试。将s-甲基、乙基、丙基和烯丙基-l-半胱氨酸亚砜这四种底物均配置成0.23 g/ml的溶液，在测酶活体系中加入820 μl ph 7.0的缓冲液，150 μl 0.05 g/l的磷酸吡哆醛溶液，20 μl底物，以及10 μl镍柱纯化后的酶，参比组将酶液换成等量的清水。反应体系分别在37℃下反应1 min后测定其酶活及比酶活。酶液的蛋白浓度采用bradford法进行测定。测量结果如图4所示，重组酶对于所有测试的半胱氨酸亚砜类底物均有高酶活，说明表达的细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1确为s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶，且具有高效催化功能。
34.以s-甲基-l-半胱氨酸亚砜为标准底物，准确配置一系列浓度的底物，加入一定量的酶，在37℃，ph=7.0的反应条件下反应1min后测得其反应速度。将底物浓度与反应速度的倒数整理成双倒数表，做出底物浓度的倒数1/s和反应速度的倒数1/v的拟合曲线，如图5所示。可得方程1/v=0.03553(1/s) 5.84958, r2=0.99903，由此我们可以计算得出该酶的km=6.07 μm，ks=20.3/s。因此是一种活性高的s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶，在抑菌物质的研发上具有很大的应用潜力。
35.实施例7：酶促反应产物的gcms鉴定取100 μl过镍柱的酶液，0.23 g/ml的s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜溶液40 μl，在37℃，ph 7的条件下反应30min。之后加入3 ml无水乙醇在4℃萃取1 h，过0.25 μm滤膜后用无水乙醇稀释10倍，取1 ml稀释后的溶液再加入500 μl无水乙醇即配成样品。上样时的分流比为20：1。色谱质谱条件参考文献0254-1793(2011)09－1699－04。具体如下：采用db-5ms毛细管色谱柱（30 m
×
0.25 mm
×
0.25 μm）；载气：he；流速1.0 ml/min；柱温：起始温度60℃，保持5 min，以10℃/min升至220℃，保持5 min；进样口温度：220℃；接口温度：220℃；进样量：1 μl；分流比：1:20；ei源温度：200℃；电子能量：70ev；扫描质量范围：45~600 u；扫描速率：710 u
·
s-1
。理论板数按二烯丙基三硫醚计算不低于20000，二烯丙基三硫醚峰与相邻杂质峰分离度均大于2.0。对有关物质进行分析，选择峰图中的最高峰并与nist谱库中的标准质谱图进行比对，检索出相似度（si）高于80的杂质，确定其结构。
36.如图6及图7所示，为酶促反应产物的gcms鉴定及gcms主峰的搜库鉴定结果。
37.结果表明此物质为二烯丙基硫代亚磺酸酯在高温下的分解产物二烯丙基三硫醚，这与天然百合科植物鳞茎破碎提取液gcms结果一致。因此，可以确定硒代半胱氨酸裂解酶lcc1为植物半胱氨酸亚砜裂解酶的同工酶。
38.综上所述仅为本发明较佳的实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化及修饰，皆应属于本发明的技术范围。
39.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶的筛选及其应用。将油气田含硫污水进行微生物富集，通过宏基因组及宏蛋白质组质谱鉴定，发现一种来源于细菌的硒代半胱氨酸裂解酶具有β位裂解s-烷基-l-半胱氨酸亚砜的新功能，其产物为抑菌活性物质二烷基硫代亚磺酸酯。对其进行酶学性质测定，发现此酶为高催化活性的s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶，并且可以在大肠杆菌中实现高表达，仅需
一步镍柱纯化即可得到较高纯度的酶。以s-烷基-l-半胱氨酸亚砜类物质为底物，该酶在高效催化合成抑菌活性物质方面具有很大的应用价值和开发潜力。