预测甲状腺癌术后复发的糖链标志物及其应用

1.本发明属于医学检测技术领域，具体涉及预测甲状腺癌术后复发的糖链标志物及其应用。


背景技术：

2.甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤。近年来，发病率呈显著上升趋势。在我国，年新增甲状腺癌病例超19万，严重威胁我国人口健康。甲状腺癌主要分四种病理类型。90％以上为甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，ptc)，ptc具有较好的总体预后。ptc的治疗策略包括手术切除，术后放射性碘的治疗及促甲状腺素的抑制治疗，5年的总生存率约为98.2％。尽管ptc是一种惰性肿瘤，但常在手术前已出现颈部区域淋巴结的转移。手术方式包括甲状腺切除，如存在颈部淋巴结转移癌，同时应行颈淋巴结区域清扫术，从而避免残留肿瘤灶。但即使采用手术切除甚至术后加以放射性碘治疗，仍有20％的患者在初次手术后会仍会出现复发。早期识别哪些患者具有复发的风险是至关重要的。具有早期预测复发不仅可为患者提供术后随访的咨询，而且可帮助医生指导临床决策。在术后随访期，常是依靠甲状腺及颈部淋巴结超声、超声引导下颈部淋巴结的穿刺细胞学检查和血清甲状腺球蛋白(tg)的水平测定是否有复发倾向。然而，这些方法都存在一定的局限性。超声检查对淋巴结转移(lnm)检测的敏感性较低，约为41.3～61％。选择穿刺颈部异常淋巴结的细胞学来确认可疑淋巴结的性质，但细胞学的不确定性约为20％～30％。在有区域和远处转移证据的甲状腺癌患者中，已有多项研究报告了tg的假阴性率，约4％～35％。综上所述，迫切需要寻找新的、非侵袭性的生物标志物，与超声、超声引导下穿刺和血清tg水平相互补充，以进一步提高甲状腺癌切除术后ptc患者复发预测的准确性。临床医生常基于现有检查方法及个人经验判断是否出现复发，以期待能早期发现复发的同时，又能避免过度治疗带来的副损伤。因此，寻求一种更加准确、无创的甲状腺癌术后复发的预测指标，对临床决策和患者本身具有重要意义。临床实践表明，生物标志物已在肿瘤的鉴别诊断、探索发病机制等方面具有重要的应用价值，目前尚未有针对预测复发的标志物，这为提高预测复发的灵敏度、特异度和准确性提供了新的途径和思路，在提高患者预后、实现个体化治疗中具有重要潜力。这些将会对甲状腺癌术后复发患者的诊断、治疗和预后带来新的曙光，将为解决上述临床问题提供新钥匙。
3.糖基化是最普遍和最重要的蛋白翻译后修饰之一。糖蛋白糖基化参与癌变、癌症进展和癌症转移等很多关键的生理和病理过程。由于糖链参与癌症相关的各种过程(细胞分化、粘附、侵袭、转移、细胞信号传导等)，异常糖基化被认为是癌症的标志之一。临床上已应用的多种肿瘤标志物如ca125(应用于卵巢癌、子宫内膜癌等)、ca19-9(应用于胰腺癌、食管癌)等均受糖链修饰。美国fda于2005年批准了糖基化(岩藻糖基化)的afp试剂盒用于肝癌的临床诊断。因此，糖链是癌症患者体液循环中，与系统性失调相关的潜在的生物标志物。鉴于此，分析体液中相关糖蛋白的糖基化谱图，为无创血清肿瘤标志物的发现提供了新的途径。然而，糖链作为监测或预后生物标志物的潜力尚未被研究。分析蛋白的糖基化在发
现甲状腺癌术后复发相关的标志物、实现患者精确预测以进一步实现个体化治疗方面意义重大。但目前尚缺少评估甲状腺癌的蛋白糖基化是否能用于甲状腺癌术后预测复发的研究。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种用于诊断甲状腺癌的标志物。
5.本发明的第二目的在于提供一种用于预测甲状腺癌术后复发的标志物。
6.为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.本发明一方面提供了一种用于诊断甲状腺癌、或预测甲状腺癌术后复发的产品，所述的产品包括能够测量样本中标志物的表达量的试剂和/或仪器，所述的标志物包括n-糖链，所述的n-糖链包括h4n3f1l1和/或h4n6f1e1。
8.如本文中在诸如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括a和b两者；a或b；a(单独)；以及b(单独)。同样地，在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
9.术语“糖链”指由连接在一起的一个或多个单元糖(unit sugars)(单糖和/或其衍生物)形成的化合物。当两个或多个单元糖连接时，各个单元糖通过脱水缩合基于糖苷键来连接。所述糖链的实例包括生物体中存在的多糖(己糖、岩藻糖、木糖、n-乙酰基葡糖胺、n-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和其复合物和衍生物)，以及大量的降解自或衍生自复杂生物分子的糖链例如降解的多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、葡糖胺聚糖和糖脂，但是实例不限于所述的那些。
10.作为一种优选的实施方式，所述的标志物还包括甲状腺球蛋白(tg)。
11.如本文所用，术语“样本”是指从如本文所述的目的来源获得或衍生的生物样本。在一些实施方案中，目的来源包含生物体，诸如动物或人。在一些实施方案中，生物样本包含生物组织或液体。在一些实施方案中，生物样本可以是或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样本；含有细胞的体液；游离漂浮核酸；痰液；唾液；尿液；脑脊液腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；皮肤拭子；口服拭子；鼻拭子；洗涤物(washings)或灌洗物，诸如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；吸出物；刮屑；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；粪便，其他体液，分泌物和/或排泄物；和/或其中的细胞等。在一些实施方案中，生物样本是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样本是通过任何合适的手段直接从目的来源获得的“初级样本”。例如，在一些实施方案中，通过选自以下的方法获得初级生物样本：活组织检查(例如，细针抽吸或组织活组织检查)、手术组织、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)的收集等。在一些实施方案中，如从上下文将显而易见的，术语“样本”是指通过加工(例如，通过去除初级样本的一种或多种组分和/或通过向初级样本添加一种或多种试剂)获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这类“经处理的样本”可以包含例如从样本中提取的或通过对初级样本进行诸如某些组分的分离和/或纯化等技术而获得的糖链或蛋白质。
12.作为一种优选的实施方式，所述的样本包括体液样本、细胞样本、或组织样本。
13.作为一种更为优选的实施方式，所述的体液样本包括血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水。
14.作为一种更为优选的实施方式，所述的细胞样品包括分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品。
15.作为一种更为优选的实施方式，所述的组织样品包括新鲜组织样品、固定化组织样品。
16.作为一种优选的实施方式，所述的n-糖链包括游离糖链、从糖复合物中释放的糖链。
17.作为一种更为优选的实施方式，所述的游离糖链通过酶法和/或化学法获得；
18.作为一种更为优选的实施方式，所述的酶法中使用的试剂包括糖苷酶。在本发明的具体实施例中，所述的糖苷酶为糖苷酶pngasef。
19.作为一种更为优选的实施方式，所述的化学法为β消除反应。
20.作为一种更为优选的实施方式，所述的化学法中采用的试剂包括糖蛋白肼解试剂。
21.作为一种优选的实施方式，所述的试剂和/或仪器包括在以下一种或多种方法中用到的试剂和/或仪器：免疫测定法、质谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、糖芯片技术或核磁共振。
22.术语“质谱法”指将粒子例如原子、分子或簇转化成气态离子(也就是说，电离)并让其在真空中移动，并且根据质荷比(m/z)利用电磁力分离和检测所述离子。基于根据m/z分离和检测的离子得到的谱图(横轴表示m/z且纵轴表示离子相对强度)是质谱。通常将提供有关于分子量信息的离子称作分子量相关的离子(可用的有：中性分子m失去一个电子得到的m ；增加一个电子得到的m-；增加质子得到的[m h] ；失去质子得到的[m-h]-；失去氢负离子得到的[m-h] ；增加碱金属(例如na)得到的[m na] ；等)。根据样品或电离方法(尤其是在ei方法中)，分子量相关的离子可能从不出现；然而，在所述情况下，可以通过使用温和电离方法来确认分子量相关的离子。与分子离子相比，将那些在较低质量一侧出现的离子称作碎片离子，并且这些碎片离子是分子离子的降解产物且提供样品分子的结构信息。将谱中具有最高离子强度的离子称作基峰，并且通过将该相对强度作为100％，用该峰将谱图标准化。
[0023]
作为一种更为优选的实施方式，所述的质谱法包括基质辅助激光解吸附电离质谱、快原子轰击质谱、电喷雾质谱、多级质谱，优选的，所述的基质辅助激光解吸附电离质谱包括基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱、基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱。
[0024]
作为一种优选的实施方式，所述的试剂和/或仪器还包括以下一种或多种方法中用到的试剂和/或仪器：多重邻位延伸分析、酶联免疫吸附、放射免疫测定、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定或蛋白质芯片测量。
[0025]
作为一种优选的实施方式，所述的试剂包括抗体、配体。
[0026]
在本发明中，术语“抗体”是本领域中公知的术语，是指针对抗原性位点指示的特异蛋白分子。为了本发明的目的，抗体是指与作为本发明标志物特异性结合的抗体，上述抗体可以使用公知的方法来制备。对本发明的抗体的形式没有特别限制，如果多克隆抗体，单克隆抗体或具有抗原结合特性的任何一种，则其一部分也包括在本发明的抗体中，并且包
括所有的免疫球蛋白抗体。
[0027]
作为一种优选的实施方式，所述的试剂和/或仪器还包括选自以下的一种或多种试剂和/或仪器：
[0028]
(1)用于n-糖链衍生化的试剂和/或仪器；
[0029]
(2)用于n-糖链纯化和/或富集的试剂和/或仪器。
[0030]
作为一种更为优选的实施方式，所述的n-糖链衍生化通过甲胺化、酯化、甲基化、还原氨化、和/或乙酰化来实现。
[0031]
作为一种更为优选的实施方式，所述的n-糖链纯化和/或富集通过离心、过滤、萃取、吸附、毛细管电泳和/或色谱法来实现。优选的，所述的n-糖链纯化和/或富集通过色谱法来实现。更为优选的，所述的色谱法包括采用cotton hilic spe分离小柱富集纯化n-糖链。优选的，所述的采用cotton hilic spe分离小柱富集纯化n-糖链包括如下步骤：
[0032]
(1)活化分离柱；
[0033]
(2)平衡分离柱；
[0034]
(3)洗脱糖链。
[0035]
作为一种更为优选的实施方式，所述的活化分离柱的试剂为水。
[0036]
作为一种更为优选的实施方式，所述的平衡分离柱的试剂为水、乙腈溶液，优选的，水和乙腈的体积比为15：85。
[0037]
作为一种更为优选的实施方式，所述的洗脱糖链的试剂为水。
[0038]
本发明另一方面提供了如下任一项所述的应用：
[0039]
(1)测量样本中标志物的表达量的试剂和/或仪器在制备用于诊断甲状腺癌的产品中的应用；
[0040]
(2)测量样本中标志物的表达量的试剂和/或仪器在制备用于预测甲状腺癌术后复发的产品中的应用。
[0041]
所述的标志物包括n-糖链，所述的n-糖链包括h4n3f1l1和/或h4n6f1e1。作为一种优选的实施方式，所述的标志物还包括甲状腺球蛋白。
[0042]
本发明还提供了标志物在制备诊断甲状腺癌、或预测甲状腺癌术后复发的系统中的应用，所述的系统包括：
[0043]
1)检测单元：包括标志物检测模块；
[0044]
2)分析单元：将检测单元检测得到的标志物的表达量作为输入变量，输入甲状腺癌的诊断或预测术后复发模型进行分析；
[0045]
3)评估单元：输出样本对应的个体患甲状腺癌，或甲状腺癌术后复发的风险值。
[0046]
所述的标志物包括n-糖链，所述的n-糖链包括h4n3f1l1和/或h4n6f1e1，作为一种优选的实施方式，所述的标志物还包括甲状腺球蛋白。
[0047]
在本发明中，术语“受试者”、“个体”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于，人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等。
[0048]
本发明中，对糖链分析数据进行进一步计算和处理以获得所需的糖组相关信息。例如，可获得样品中每种糖链峰面积相对于所有峰面积和的比值，从而获得每种糖链的相对定量值，可以避免平行样品的预处理等操作过程产生的偏差，确保分析的高准确性；根据检测到的每个糖链的组成特点和生物相关性，计算出派生特征，包括岩藻糖糖基化的水平
(fucosylation，f)、平分型糖链的水平(bisection，b)、末端半乳糖糖基化水平(galactosylation，g)、唾液酸化水平(sialylation，s)等。这些数据可直接用于相对含量比较或定性分析，用于监控目标糖链或糖链派生特征的丰度的变化。
[0049]
糖链分析数据进行进一步计算和处理可采用各种相关的糖链分析软件、数据库、算法等对所得的数据进行分析，可用的糖链分析软件包括但不限于：massytools、progenesis maldi、lassytools、glycoworkbench、glycanmass、glycomod、glycofragment、glycosearchms等。可用的糖链分析数据库包括但不限于：ccsd、glycomedb、carbbank、eurocarbdb等。
[0050]
本发明中，糖链的检测方法优选是高通量检测方法，例如：可同时处理和检测96、192、288、384个或更多个样品，这大大减少了样品制备的时间。
[0051]“模型”是任何数学方程式，算法，分析或程序化过程或统计技术，其采用一个或多个连续或分类输入并计算输出值，有时称为“索引”，“索引值”，“预测器”，“预测值”，“概率”或“概率得分”。“公式”的非限制性示例包括和、比率以及回归算子，例如系数或指数，标志物值转换和标准化，规则和指南，统计分类模型以及对历史群体进行训练的神经网络。在组(panel)和组合构造中，特别有趣的是结构和句法统计分类算法，以及利用模式识别特征的风险指数构建方法，包括已建立的技术，例如互相关，主成分分析(pca)，因子旋转，对数回归(logreg)，线性判别分析(lda)，特征基因线性判别分析(eigengene lineardiscriminant analysis,elda)，支持向量机(support vector machines，svm)，随机森林(random forest,rf)，递归分区树(rpart)、xgboost(xgb)以及其他相关的决策树分类技术，shrunkencentroids(sc)，stepaic，最近的kth邻居(kth-nearest neighbor)，boosting，决策树(decision trees)，神经网络，贝叶斯网络，支持向量机和隐马尔可夫模型(hidden markovmodels)等。还进一步实现了许多此类算法技术，以执行特征(基因座)选择和规则化(regularization)规则化，例如在岭回归(ridge regression)，lasso和elastic net等中。其他技术可用于生存和事件前时间危险分析(time to event hazard analysis)中，包括本领域技术人员众所周知的cox，weibull，kaplan-meier和greenwood模型。这些技术中的许多技术都可以与标志物选择技术结合使用，例如正向选择，后向选择或逐步选择，给定大小的所有潜在标志物集或组的完整枚举，遗传算法或它们本身可以包括标志物选择方法。这些可以与信息标准结合使用，例如akaike的信息标准(akaike'sinformation criterion，aic)或贝叶斯信息标准(bayes information criterion，bic)，以便量化其他标志物和模型改进之间的权衡，并有助于最小化过度拟合。生成的诊断模型可以在其他研究中进行验证，或在它们最初进行培训的研究中交叉验证，使用诸如bootstrap，leave-one-out(loo)和10倍交叉验证(10-fold cross-validation)(10倍cv)等技术进行。在各个步骤，可以根据本领域已知的技术通过值排列来估计错误发现率。
[0052]
在本发明中，曲线下面积被用来判断标志物的诊断效能，其是指本技术领域中所众所周知的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve；roc)的下面积。曲线下面积(auc)测定有助于经由整体数据范围来比较分类器的准确性。具有更大的曲线下面积(auc)的分类器具有更大的能力以在两个感兴趣的组(例如，甲状腺癌样本及正常或对照样本)之间准确分类未知物。在于区别两个群体(例如，具有甲状腺癌的组与非甲状腺癌的对照组)方面上，受试者工作特征曲线(roc)有用于以图表形式来表现特定的特征
(例如，本发明中所描述的生物标志物和/或额外的生物医学信息的任意项目)的性能。通常，基于单一特征值，经由整个群体(例如，患者组及对照组)的上述特征数据被升序排列。然后，针对上述特征的每个值，计算对于数据的真阳性率(true positi ve rate)及假阳性率(false positive rate)。通过计算高于针对其特性的值以上的病例数之后，除以总病例数来测定上述真阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的对照组数之后，除以总对照组数来测定上述假阳性率。尽管该定义是指患者组的特性相对于对照组高的情况，但该定义还适用于患者组的特性相对于对照组低的情况(在这种情况下，可计算出低于上述特性的值的样本的数)。受试者工作特征曲线(roc)可以针对其他单一计算，还可针对单一特性生成，为了提供单一和值，例如，可数学性地组合两个以上的特性(例如，加、减、乘等)，该单一和值可由受试者工作特征曲线(roc)来表示。附加地，能够以受试者工作特征曲线(roc)来画出可导出单一计算值的多重特性的组合。这些特性组合可构成测试。上述受试者工作特征曲线(roc)为表示相对于测试的假阳性率(1-特异性)的测试的真阳性率(灵敏度)的图表。
附图说明
[0053]
图1是ptc患者和健康人群之间差异表达的n-糖链的统计图，其中，图a是h4n3f1l1，图b是h4n6f1e1；
[0054]
图2是n-糖链用于诊断ptc的roc曲线图，其中，图a是h4n3f1l1，图b是h4n6f1e1；
[0055]
图3是分析n-糖链在预测ptc复发中的应用的统计图，其中，图a是h4n3f1l1，图b是h4n6f1e1；
[0056]
图4是本发明所涉及的标志物或标志物组在预测ptc复发中的roc曲线图，其中，图a是h4n3f1l1，图b是h4n6f1e1，图c是tg h4n3f1l1，图d是tg h4n6f1e1，图e是tg h4n3f1l1 h4n6f1e1；
[0057]
图5是本发明所涉及n-糖链的结构图，图a是h4n3f1l1，图b是h4n6f1e1，图c是结构说明。
具体实施方式
[0058]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
[0059]
样本信息
[0060]
一、样本数量：甲状腺癌患者80例，甲状腺癌术后随访患者86例，健康人群80例，术后复发人群9例
[0061]
二、样本来源：北京协和医院甲状腺癌患者血清
[0062]
三、纳排标准：
[0063]
甲状腺癌(ptc)患者经甲状腺超声及术前穿刺诊断，再次经术后病理证实，且无远处转移。
[0064]
甲状腺癌术后随访期患者(ps)的入选标准为:(a)术后超声检查无淋巴结转移的临床证据；(b)行甲状腺癌根治术(行双侧全切)并预防性行中央颈部淋巴结清扫术的患者，术后病理提示至少有10个清扫的淋巴结；(c)随访期血清tg和tsh水平较低；(d)至少随访12个月。
[0065]
术后复发的患者(pr)的纳入标准是:(a)行甲状腺癌根治术(行双侧全切)并预防性行中央颈部淋巴结清扫术的患者，术后病理提示至少有10个清扫的淋巴结；(b)通过影像学、穿刺活检发现并证实为可疑的转移淋巴结；(c)定期随访甲状腺超声及甲状腺功能。
[0066]
ptc、ps和pr组采用以下排除标准:(a)有系统性、自身免疫性、传染性或血液系统疾病；(b)糖耐量受损或糖尿病患者；(c)有垂体疾病或其他恶性肿瘤病史。
[0067]
健康人群(hc)组的所有志愿者均由全科医生评估，甲状腺功能正常，甲状腺超声检查正常，生化指标正常，凝血指标正常，无系统性疾病、肿瘤史。
[0068]
实验方法
[0069]
1、糖苷酶释放n-糖链
[0070]
用糖苷酶pngase f将n-糖链从全血清/血浆糖蛋白上游离释放。具体步骤如下：从每个样本中取5μl血清，加入10μl的2％sds，60℃孵育10分钟；然后加入10μl酶解液(含2％np-40,2.5
×
pbs和1u pngase f)，37℃孵育12-16h。
[0071]
2、n-糖链衍生化
[0072]
用已知的衍生化技术对上述游离得到的n-糖链衍生化，经过衍生化可以将α2,3和α2,6连接键的唾液酸区分。具体步骤如下：1μl上述酶解后的血清，加入20μl衍生化试剂(250mm edc和250mm hobt，溶剂为无水乙醇)，37℃孵育60分钟。
[0073]
2、n-糖链hilic-spe富集纯化
[0074]
将上述得到的衍生化的糖链用hilic-spe进行富集纯化。hilic利用棉线作为固定相，棉线自行填充在20μl的枪头，制成纯化小柱，首先，用15μl超纯水(mq)活化柱子3次；接着，用15μl的85％乙腈平衡(acn)柱子3次；再将上述衍生化糖链混合液加入柱子，上样30次，保证衍生化的n-糖链尽可能完全地被吸附在柱子上；接着用15μl的85％乙腈 1％三氟乙酸(tfa)淋洗柱子3次，再用15μl的85％乙腈淋洗柱子3次；最后，将糖链洗脱于10μlmq中。
[0075]
4、n-糖链的质谱分析
[0076]
检测前，用已知分子质量的肽段混合物标准品(bruker peptide calibration standard ii)对质谱仪器进行校正。将基质super-dhb溶于含1mm naoh的50％乙腈(水)溶液中，浓度为5mg/ml。取上述1μl纯化的n-糖链，点样于质谱靶板上，然后将1μl基质溶液加滴在样品上，室温下晾干。应用maldi-tof ms进行分析，质谱配备smartbeam 3d激光源，并在正离子反射模式(reflection positive，rp)下采集信号离子，应用flexcontrol软件进行控制，样本检测时m/z范围设置为：1000至5000。谱图采集设置为：对于质谱靶板上的每个样本点，激光在该样本点范围内完全随机采集信号，累积10k laser shots，采集一张质谱谱图，激光频率为5000hz。
[0077]
5、数据预处理和统计分析
[0078]
使用flexanalysis和massytools软件对采集到的质谱图进行预处理，并导出到microsoft excel进行进一步分析。应用glycoworkbench的糖链解析功能辅助人工解析来解析质谱数据，糖链结构的鉴定主要基于质荷比、二级质谱碎片归属及已经发表的文献。单
个糖链定量由单个糖链的峰面积/检测到的所有糖链的峰面积和得到。除了直接检测到的糖链结构外，派生糖链特征(derived glycan traits)由直接检测到的n-糖链依据其结构特点和生物相关性通过rstudio计算所得。派生糖链特征包括：复杂型n-糖链的天线数量(antennae of complex-type glycans，ca)、岩藻糖糖基化的水平(fucosylation，f)、平分型糖链的水平(bisection，b)、末端半乳糖糖基化水平(galactosylation，g)、唾液酸化水平(sialylation，s)等。ptc和健康对照之间，ptc各亚组之间的n-糖基化的差异以及n-糖基化特征与临床参数之间的关系，通过统计检验、回归分析、受试者工作特征曲线进行评价。研究队列的质谱数据质量通过样本检测过程中随机分布在靶板上的标准品以及计算所得到的多个标品每种糖链的平均值、变异系数和标准偏差来评估。
[0079]
6、结果及讨论
[0080]
质量控制标品所得top30的糖链平均cv值为4.49％，说明本发明中得到的数据可靠。
[0081]
实施例1 ptc和健康人群(hc)之间差异表达的n-聚糖
[0082]
为了评估ptc和健康人群(hc)之间血清n-聚糖的差异表达，比较了96个直接检测到的糖链结构性状和91个派生糖链结构性状。在ptc、术后随访患者(ps)和hc中发现了一系列差异表达的聚糖性状。为了进一步探究ptc和hc之间的差异表达的n-聚糖性状是否对初始手术切除治疗有反应，本发明根据上述差异表达的聚糖性状对ptc组和ps组进行了比较。
[0083]
16个直接检测到的糖链性状和7个派生的糖链性状在ptc和ps之间存在显著差异。在直接检测的糖链性状中，h4n3f1l1、h4n6f1e1在ps患者中均低于ptc患者，且在治疗后显示出向正常水平(hc组)的趋势(如图1所示)。
[0084]
实施例2 h4n3f1l1、h4n6f1e1用于诊断ptc的诊断效能分析
[0085]
为了评估h4n3f1l1、h4n6f1e1是否可用于诊断ptc，本发明进行了roc曲线分析，如图2所示，h4n3f1l1(auc值为0.718，灵敏度为71.3％、特异度为65.0％)、h4n6f1e1(auc值为0.686，灵敏度为72.5％，特异度为66.2％)具有作为ptc的诊断标志物的潜力。
[0086]
实施例3 h4n3f1l1、h4n6f1e1在预测ptc复发中的应用
[0087]
为了研究对手术治疗有反应的糖链是否有预测ptc复发的潜力，本发明通过比较术后复发患者人群(pr)组和ps组来筛选这些性状。本发明发现2个直接检测到的糖链性状(h4n3f1l1和h4n6f1e1)具有作为监测和预测ptc患者复发的标志物的潜力(如图3所示)。与hc相比，ptc中这2个聚糖性状均呈上调趋势，且在甲状腺初次切除后呈向正常水平靠拢的趋势。复发时，2个糖链的水平再次升高到接近ptc组水平(如图3所示)。这些结果表明，h4n3f1l1和h4n6f1e1这两个直接检测到的糖链可能作为新的血清生物标志物用于监测和预测甲状腺切除术后ptc的复发。
[0088]
为了评估2个直接检测到的糖链在预测甲状腺切除术后ptc复发的准确性，本发明进行了roc曲线分析(如图4所示)。h4n3f1l1和h4n6f1e1独立显示了中等程度的预测能力，h4n3f1l1的auc值为0.712、灵敏度为66.7％、特异度为特异度75.6％；h4n6f1e1的auc值为0.777、灵敏度为66.7％，特异度为86.0％。
[0089]
本发明将这些糖链与临床上已存在的可用于提示术后复发的血清tg水平参数相结合评估其是否能进一步提高预测复发效果。通过基于两个糖链和血清tg水平建立的预测模型的roc曲线，结果显示tg与h4n3f1l1结合时的auc值为0.802、灵敏度为75.0％，特异度
为94.4％；tg联合h4n6f1e1的auc值为0.799、灵敏度为75.0％，特异度为91.5％。将tg与h4n3f1l1和h4n6f1e1这2个聚糖性状结合后，性能进一步提高，auc值为0.803、灵敏度为75.0％，特异度为94.0％。
[0090]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。