一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1及其应用

一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用。


背景技术：

2.烟草青枯病是由茄科罗尔氏菌引起的细菌性土传植物病害，能够寄生于50多个科、数百种植物，给许多农作物及经济作物生产造成严重损失。烟草青枯病自首次在我国报道以来，其发生范围和危害程度就在不断蔓延和加重，每年给烟草行业带来巨大的经济损失，田间烟株一旦感染青枯病，伴随高温高湿的有利发病条件，病株就会迅速发病萎蔫死亡。目前烟草青枯病的防治以化学防治为主，辅以其他防治方法(包括抗病品种筛选、农艺措施管理、化学防治等)。尽管化学防治对烟草青枯病具有较好的防治效果，但会提高致病菌抗药性、减少烟田土壤生物群落多样性，影响烟田土壤环境质量。
3.近年来，烤草品质及烟田土壤质量越来越受到重视，减少化学防治的食物和使用是必然的趋势，因此，烟草青枯病防治剂的开发及其推广应用对土壤改良及烤烟产质提升具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用。所述贝莱斯芽孢杆菌lgt-1抑制烟草青枯病菌作用强，其可以直接使用或发酵成菌剂，用于制备烟草青枯病的防治菌剂。
5.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
6.本发明提供了一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis，保藏编号为cgmcc no.24342。
7.进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的16s rdna核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的gyra核苷酸序列如seq id no.2所示，其gyrb核苷酸序列如seq id no.3所示。
9.本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1在用于制备抑制土壤病原菌的防治菌剂中的应用。
10.进一步的，所述防治菌剂中包含活菌含量不低于109cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1或其菌剂。
11.进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌lgt-1菌剂的制备步骤为：
12.(1)将活化的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1接种到种子培养基中，25℃～35℃，培养20h～24h，制成lgt-1种子液；
13.(2)将lgt-1种子液转入发酵罐中，25℃～35℃发酵培养40h～50h，制成lgt-1发酵液；
14.(3)将lgt-1发酵液再次转入发酵罐中，25℃～35℃发酵培养40h～50h，制得的二次发酵液，直接包装或离心后取沉淀进行干燥，包装后得到防治菌剂。
15.进一步的，所述lgt-1种子液或lgt-1发酵液转入发酵罐的接种量均为1％-5％。
16.优选的，所述lgt-1种子液或lgt-1发酵液转入发酵罐的接种量均为2％。
17.进一步的，所述种子培养基的配方为：蛋白胨10g
·
l-1
，酵母粉5g
·
l-1
，氯化钠10g
·
l-1
，ph值7.2～7.4。
18.进一步的，所述发酵罐中的发酵培养基的配方为：可溶性淀粉6g
·
l-1
～12g
·
l-1
，大豆蛋白胨10g
·
l-1
～15g
·
l-1
，cacl
2 5g
·
l-1
～10g
·
l-1
，ph为7～7.5。
19.优选的，所述发酵罐中的发酵培养基的配方为：可溶性淀粉10g
·
l-1
，大豆蛋白胨14g
·
l-1
，cacl
2 6g
·
l-1
，ph为7.5。
20.优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌lgt-1菌剂的制备步骤为：
21.(1)将活化的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1接种到种子培养基中，30℃，200r/min培养24h，制成lgt-1种子液；
22.(2)将lgt-1种子液以2％的接种量转入发酵罐中，30℃，180r/min发酵培养48h，制成lgt-1发酵液；
23.(3)将lgt-1发酵液以2％的接种量再次转入发酵罐中，30℃，180r/min发酵培养48h，制得的lgt-1二次发酵液，直接包装或离心后取沉淀进行干燥，包装后得到贝莱斯芽孢杆菌lgt-1菌剂。
24.进一步的，所述土壤病原菌为烟草青枯病病菌。
25.进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌lgt-1明显地抑制烟草青枯病病菌的活性。
26.本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1在用于制备降低或抑制烟草致病菌抗药性的制剂中的应用。
27.与现有技术相比，本发明具有的有益效果和优点是：
28.本发明从湖北恩施烟区被青枯病感染的土壤中健康植株的根际土中分离筛选出了一株高效拮抗烟草青枯病菌(ralstonia solanacearum)的芽孢杆菌贝莱斯芽孢杆菌lgt-1。该菌株具有高效抑制烟草青枯病活性的特点，对烟草青枯病病原菌的抑菌圈直径达到47.9mm，能够直接阻止青枯菌的定植；同时该菌株活力高，培养方法简单，可直接用于烟草青枯病的防治，也可制备成多种剂型的菌剂用于制备土壤病原菌防治剂，并且能够降低烟草对致病菌抗药性。因此，应用前景广阔。
附图说明
29.图1为贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的菌落特征图；
30.图2为贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的16s rrna系统发育树；
31.图3为贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的gyra系统发育树；
32.图4为贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的gyrb系统发育树；
33.图5为不同培养基对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1发酵液活菌数量的影响；
34.图6为不同c源培养基对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1活菌数的影响；
35.图7为不同n源培养基对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1活菌数的影响；
36.图8为无机盐种类对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1活菌数量的影响；
37.图9为不同发酵温度对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1活菌数量的影响；
38.图10为不同发酵初始ph对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1活菌数量的影响；
39.图11为不同接种量对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1活菌数量的影响；
40.图12为不同装液量对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1活菌数量的影响；
41.图13为贝莱斯芽孢杆菌lgt-1对青枯菌的拮抗性效果。
具体实施方式
42.下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
44.实施例1：菌株lgt-1的分离筛选和鉴定
45.一、菌株lgt-1的分离筛选
46.在湖北省恩施州植烟种植基地，从受青枯病侵染的土地中，选取健康植株，取附着于根上的根际土100g左右，放于灭菌的自封袋中，带回实验室。采用常规稀释平板法进行菌株分离，以烟草青枯病病原菌(ralstonia solanacearum)为指示菌，筛选拮抗菌株，结果得到一株拮抗性较强的菌株，命名为lgt-1。
47.二、菌株lgt-1的鉴定
48.1.形态学鉴定
49.将菌株接种在lb平板(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，nacl 1％，琼脂粉18％，ph＝7)上，30℃恒温培养12-48h，观察菌落特征。挑取培养12h的菌株，进行革兰氏染色，挑取培养48h的菌株进行芽孢染色。
50.结果如图1表明，菌落初期无色透明，表面光滑、湿润、粘稠、边缘不整齐，后期为乳白色，表面有明显凸起、褶皱。菌体杆状，产芽孢，革兰氏阳性。
51.2.生理生化鉴定
52.参阅《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对筛选出的菌株进行生理生化测定。结果见表1，结合形态学观察，初步将lgt-1鉴定为芽孢杆菌属菌株。
53.表1：lgt-1生理生化反应特性鉴定
[0054][0055]
注：“ ”为阳性，
“‑”
为阴性。
[0056]
3.分子生物学鉴定
[0057]
利用购自艾科睿(上海)股份有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取菌株lgt-1的基因组dna，采用通用引物进行16s rrna基因序列和gyra、gyrb基因序列扩增。反应条件见表2。
[0058]
表2：基因序列扩增反应条件
[0059][0060]
将pcr扩增产物送至生物工程(上海)股份有限工程公司检测，得到菌株lgt-1的16s rrna片段为1041bp，gyra片段986bp，gyrb基因片段1028bp。
[0061]
测序得到的lgt-1的16srdna基因序列如seq id no.1所示；测序得到的gyra基因序列如seq id no.2所示；测序得到的gyrb基因序列如seq id no.3所示。
[0062]
将16srdna、gyra、gyrb基因序列提交ncbi进行在线比对，lgt-1与贝莱斯芽孢杆菌相似度分别为96.89％、99.17％和98.73％，利用mega x软件构建系统发育树。如图2-4所示，lgt-1均与贝莱斯芽孢杆菌聚类一起。结合菌株的形态学特征、生理生化鉴定，确定菌株lgt-1为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)。
[0063]
将菌株lgt-1进行菌种保藏，所述贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的保藏单位：中国微生物
菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2022年01月19日；贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis的保藏编号为：cgmcc no.24342。
[0064]
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的培养
[0065]
一、种子液的制备
[0066]
供试菌株：贝莱斯芽孢杆菌lgt-1菌株由青岛农业大学光合固碳产能研究中心实验室提供。
[0067]
供试培养基：lgt-1菌株种子培养基：蛋白胨10g
·
l-1
，酵母粉5g
·
l-1
，氯化钠10g
·
l-1
，ph值7.2～7.4。
[0068]
lgt-1菌株的活化：将实验室保存的lgt-1菌种移接到平板固体培养基中，在恒温培养箱30℃恒温培养24h待用。
[0069]
种子液制备：取一环活化后的lgt-1菌株接种于盛有40ml种子培养基的100ml三角瓶中，30℃、200r
·
min-1
条件下摇床振荡培养24h。
[0070]
摇瓶发酵初始条件：按5％的接种量将lgt-1菌株的种子液接种到有40ml发酵培养基的100ml三角瓶里，在30℃、200r
·
min-1
的条件下摇床振荡培养24h。进行单因素试验、培养基正交优化试验和发酵条件的优化试验。
[0071]
lgt-1发酵液活菌计数：活菌数的测定采用稀释平板计数法。
[0072]
二、基础培养基筛选
[0073]
选择4种不同的培养基(见表3)，将lgt-1菌株在不同的基础培养基中进行摇瓶发酵，分别测定lgt-1菌株发酵液的活菌数。
[0074]
表3：培养基成分
[0075][0076]
实验结果如图5所示，菌株lgt-1在2号培养基中摇瓶发酵培养下，单位体积的活菌数量最高，为10.20
×
108cfu
·
ml-1
，1号培养基单位体积发酵液的活菌数量为8.62
×
108cfu
·
ml-1
，3号培养基单位体积发酵液的活菌数量为7.83
×
108cfu
·
ml-1
，4号培养基发酵液对应的单位体积内活菌数量为8.96
×
108cfu
·
ml-1
。所以，选择2号培养基作为贝莱斯芽孢杆菌菌株lgt-1摇瓶发酵的基础培养基。
[0077]
三、单因素试验
[0078]
(1)碳源种类及其浓度筛选
[0079]
分别用等量的葡萄糖、玉米粉、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇替代基础培养基中的碳源(c源)，以不加c源的基础培养基为对照(ck)，其他发酵条件不变，进行摇瓶发酵，每处理重复3次。采用活菌计数法测定不同c源发酵液的活菌数，筛选最佳c源。在筛选出最
佳c源种类的基础上，在相同条件下设置0.4％，0.6％，0.8％，1.0％，1.2％，1.4％即4，6，8，10，12，14g
·
l-1
6种不同浓度c源的培养基进行摇瓶发酵，以筛选出最佳c源浓度。
[0080]
结果如图6所示，不同c源对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的活菌数量有较大的影响，其中，以可溶性淀粉作为培养基c源时，单位体积的活菌数量达到最大值，为17.53
×
108cfu
·
m l-1
，所以选择可溶性淀粉作为贝莱斯芽孢杆菌lgt-1摇瓶发酵培养基的c源。
[0081]
(2)氮源种类及其浓度筛选
[0082]
在c源筛选的基础上，分别用等量的蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸铵、大豆蛋白胨、玉米浆干粉、酵母粉代替发酵培养基中的氮源(n源)，以不加n源的培养基为对照(ck)，其他发酵条件不变，进行摇瓶发酵，每处理重复3次。用活菌计数法计算不同n源发酵液的活菌数，筛选最佳n源。在筛选出最佳n源的基础上，在相同条件下设置0.4％，0.6％，0.8％，1.0％，1.2％，1.4％即4，6，8，10，12，14g
·
l-1 6种不同浓度n源的培养基进行摇瓶发酵，以筛选出最佳n源浓度。
[0083]
结果如图7所示，贝莱斯芽孢杆菌lgt-1以不同的n源为培养基成分时，对单位体积的活菌数量影响显著。其中，以大豆蛋白胨作为单一n源时活菌数量最大，为17.5
×
108cfu
·
m l-1
，因此，选择大豆蛋白胨作为贝莱斯芽孢杆菌lgt-1摇瓶发酵培养基的n源。
[0084]
(3)无机盐种类及其浓度筛选
[0085]
在c源、n源优化的基础上，分别添加0.6％的znso4，nacl，cacl2，mnso4，mgso4，kcl代替发酵培养基中的无机盐，以不加无机盐的培养基作为对照(ck)，其他发酵条件不变，每处理重复3次。采用活菌计数法计算不同无机盐发酵液的活菌数，筛选最佳无机盐。在筛选出最佳无机盐的基础上，在相同条件下考察在大量元素无机盐不同浓度(0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％即2，3，4，5，6，7g
·
l-1
)发酵液中的活菌数，筛选出最佳无机盐的浓度。
[0086]
结果如图8所示，无机盐种类对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1单位体积发酵液的活菌数量影响显著，以cacl2为无机盐时，lgt-1对无机盐的利用最好，单位体积发酵液的活菌数量达到最大值，为20.06
×
108cfu
·
ml-1
，以znso4，mnso4，mgso4为无机盐时，单位体积发酵液的活菌数量都小于不加无机盐的对照组。因此，选择cacl2作为贝莱斯芽孢杆菌lgt-1摇瓶发酵培养基的无机盐。
[0087]
四、发酵培养基正交试验优化
[0088]
筛选得到的培养基最佳c源为可溶性淀粉，最佳n源为大豆蛋白胨，最佳无机盐为cacl2。将可溶性淀粉(a)、大豆蛋白胨(b)和cacl2(c)三因素按l9(33)设计正交试验的因素与水平，如表4所示，见表4。按正交验设计，在30℃、200r
·
min-1
、ph 7.2的条件下振荡培养24h，以发酵液的活菌数为优化指标，比较不同组合发酵液的活菌数，确定最佳培养基配方。
[0089]
表4：正交因素与水平
[0090]
[0091]
结果如表5所示，正交试验结果通过极差分析可知，n源大豆蛋白胨对贝莱斯芽孢杆菌lgt-1单位体积发酵液中的活菌数量影响最大，其次是无机盐cacl2，c源可溶性淀粉，对应的组合为4号培养基a2b1c2，其单位体积发酵液中的活菌数量为32.23
×
108cfu
·
ml-1
。因此，确定贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的发酵培养基配方为可溶性淀粉10g
·
l-1
，大豆蛋白胨14g
·
l-1
，cacl
2 6g
·
l-1
。
[0092]
表5：发酵培养基正交实验结果
[0093][0094][0095]
五、摇瓶发酵条件优化
[0096]
在培养基的优化基础上，对摇瓶发酵的发酵温度、初始ph、接种量、装液量进行优化。每个试验组设置3次重复，进行一个因素优化期间保证其他条件不变，计数不同条件下摇瓶发酵液的活菌数。发酵温度：将lgt-1菌株接种后分别在25，28，31，34，37℃条件下摇床发酵；初始ph：用hcl和naoh调节培养基的初始ph值分别为6.5，7.0，7.5，8.0，8.5；接种量：将lgt-1菌株按照体积分数分别为为1％，2％，3％，4％，5％的接种量进行接种；装液量：将lgt-1菌株分别接种到按体积分数为10％，20％，30％，40％，50％装液量的培养基中(即100ml三角瓶分别装入盛有10，20，30，40，50ml培养基)摇瓶发酵。
[0097]
发酵温度如图9所示，在28℃时摇瓶得到发酵液中最大单位体积的活菌数量，为37.4
×
108cfu
·
m l-1
；发酵初始ph如图10所示，在发酵初始ph 7.5时单位体积发酵液中的含菌量最高，其活菌数量为37.03
×
108cfu
·
m l-1
；发酵接种量如图11所示，在2％接种量时单位体积发酵液中的活菌数量达到最大值，为34.17
×
108cfu
·
m l-1
；发酵装液量如图12所示，培养基为20％的装液量时，单位体积发酵液中的活菌数量显著高于其他装液量的活菌数，其有效含菌量最高值为37.4
×
108cfu
·
m l-1
。
[0098]
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的抑菌性
[0099]
1、病原菌活化
[0100]
将烟草青枯病病原菌接到na平板上进行活化，用nb发酵培养48h后待用。
[0101]
2、拮抗实验
[0102]
将培养好的烟草青枯病病原菌，按照1％的量稀释为菌悬液。将实施例2制备的50μl lgt-1种子液经过12000rpm离心10min，取上清液加入5mm打孔的lb平板中，在板上均匀喷洒病原菌稀释液，培养观察。
[0103]
结果如图13所示，贝莱斯芽孢杆菌lgt-1对烟草青枯病病原菌的抑菌圈直径达到了47.9mm。
[0104]
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌lgt-1菌剂的制备
[0105]
(1)挑取贝莱斯芽孢杆菌lgt-1的单菌落接种在装有10～30ml lb液体培养基(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，nacl 1％，ph＝7.2-7.4)的三角瓶中，在30℃温度下，200r/min振荡培养24h左右，培养至od600值大于0.6，制成种子液；
[0106]
(2)将种子液以2％的接种量转入发酵罐发酵(发酵培养基配方：可溶性淀粉10g
·
l-1
，大豆蛋白胨14g
·
l-1
，cacl
2 6g
·
l-1
，蒸馏水1000ml，ph调至7.5)，30℃，180r/min，培养48h左右，制成发酵液；
[0107]
(3)根据不同的应用方面制备不同的菌剂剂型：
[0108]
a)液体制剂：将发酵液再次以2％的接种量转入发酵罐发酵，30℃，180r/min，培养48h后中止发酵，发酵菌液达到每毫升菌液含有109～10
10
个活菌数，再采用塑料瓶或者塑料袋包装发酵液，即为贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂。
[0109]
b)固体粉剂：将发酵液再次转入发酵罐发酵，30℃，180r/min，培养48h后中止发酵，离心发酵液，向得到菌体中加入木炭粉吸附菌体，菌体个数每克菌剂含有10
12
～10
14
个活菌数，再用塑料袋进行密封包装，即为贝莱斯芽孢杆菌固体菌剂。
[0110]
上述制备的菌剂能够作为生物防治制剂用来防治植物病原菌，该菌剂中菌株活力高，且培养方法简单。
[0111]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。