一种靶向多模式协同治疗的pH/近红外光双重响应性纳米载药系统及其制备方法与应用

一种靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及纳米医学技术领域，特别涉及一种靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统及其制备方法与应用。


背景技术：

2.最新数据显示，乳腺癌已经正式取代肺癌成为了人类最大的癌症威胁。手术切除、化疗和放疗是目前治疗乳腺癌的主要方法。但不可避免的是，这一类方法往往存在全身毒性、患者依从性差、多药耐药等问题。为了克服单一治疗的这些局限性，人们广泛采用多种治疗策略的联合治疗来实现协同抗癌效果。
3.在多种联合治疗技术中，光热疗法(ptt)结合化疗，通过精确控制药物释放、降低多药耐药、提高治疗效果，已成为一种很有前景的乳腺癌治疗策略。光热试剂(ptas)可在近红外光照射下有效的将光能转化为热能，最终诱导肿瘤组织局部温度升高进而杀死肿瘤细胞，并可以减轻对正常组织造成的损伤。更重要的是，光热治疗可以提高肿瘤组织细胞膜的通透性，进而促进细胞对抗癌药物的摄取。
4.四氧化三铁是一种较为常见的磁性材料。近年来，其作为光热试剂在肿瘤治疗中也得到了广泛应用。更重要的是，研究表明，铁基nps可被高浓度gsh还原fe
3
触发材料解体，并释放大量fe
2
，进一步参与细胞内fenton反应产生活性氧(ros)。然而，其芬顿反应活性往往受到肿瘤组织内过氧化氢含量不足的限制，因此，研究者们选择了各种不同的催化剂以增加肿瘤部位h2o2水平，其中葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,gox)或类gox最受关注。
5.在催化剂作用下，葡萄糖可以有效转化为葡萄糖酸与过氧化氢，一方面切断了癌细胞的能量供应，产生肿瘤的饥饿治疗(starvation therapy,st)效果，并有效降低肿瘤内的atp 水平，从而提高组织的热敏感性，另一方面产生的过氧化氢可进一步用于化学动力学疗法 (cdt)，这种多模式治疗可以克服单一疗法的局限性，进而得到比单一治疗更强的治疗效果。然而，如何将催化剂和化疗药物有效整合仍然是一大挑战。另外，由于缺乏分子识别靶向性，光热剂、催化剂和化疗药物在递送过程中容易被正常组织摄取或者经体内代谢清除，这也导致了机体毒副作用以及抗肿瘤效果不佳等问题的出现，如何将其高效地传递到肿瘤细胞又是一大挑战。
6.因此，迫切需要一种开发能将催化剂和化疗药物有效整合且分子识别靶向性高的纳米系统。


技术实现要素：

7.本发明目的是提供一种靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统及其制备方法与应用，制备得到的纳米载药系统具有ph敏感性，被载药物能够特异性地在肿瘤内环境释放；所述纳米载药系统具有近红外光响应性，在近红外光照射下产生羟基自由基及热量；所述纳米载药系统能大量消耗肿瘤内的葡萄糖，切断能量供应，达到饥饿
治疗效果。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.在本发明的第一方面，提供了一种靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统的制备方法，所述方法包括：
10.获得四氧化三铁磁性纳米颗粒；
11.将多巴胺溶于弱碱性缓冲液中加入到所述四氧化三铁磁性纳米颗粒中反应，后加入抗肿瘤药物反应，获得表面装载药物的聚多巴胺磁性纳米颗粒；
12.将所述表面装载药物的聚多巴胺磁性纳米颗粒与催化剂混合进行交联反应，获得表面装载有抗肿瘤药物和催化剂的聚多巴胺磁性纳米颗粒；
13.将所述表面装载有抗肿瘤药物和催化剂的聚多巴胺磁性纳米颗粒分散于超纯水中，加入靶向分子反应，获得可实现靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统。
14.进一步地，所述四氧化三铁磁性纳米颗粒、盐酸多巴胺、抗肿瘤药物的质量比为70： (7～10)：(2～4)。
15.进一步地，所述负载抗肿瘤药物聚多巴胺磁性纳米颗粒和催化剂的质量比为20：(3～ 5)。
16.进一步地，所述表面装载药物的聚多巴胺磁性纳米颗粒与所述靶向分子的质量比为15： (3～5)。
17.进一步地，所述抗肿瘤药物包括盐酸阿霉素(dox)或顺铂类药物(cdpp)。
18.进一步地，所述催化剂包括葡萄糖氧化酶(gox)或金纳米粒子(au nps)。
19.进一步地，所述的靶向分子包括透明质酸(ha)或叶酸(fa)。
20.在本发明的第二方面，提供了一种采用所述方法制备得到的靶向多模式协同治疗的ph/ 近红外光双重响应性纳米载药系统。
21.在本发明的第三方面，提供了所述的靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统在制备协同治疗产品中的应用，所述协同治疗包括肿瘤光热治疗、化学动力学治疗、饥饿治疗、化学治疗协同治疗中的一种。
22.进一步地，所述光热治疗的光照射波长为750～1350nm的近红外光；所述肿瘤包括4t1 乳腺癌肿瘤。
23.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
24.本发明实施例提供的一种靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统及其制备方法与应用，制备得到的纳米载药系统具有ph敏感性，被载药物能够特异性地在肿瘤内环境释放；所述纳米载药系统具有近红外光响应性，在近红外光照射下产生羟基自由基及热量；所述纳米载药系统能大量消耗肿瘤内的葡萄糖，切断能量供应，达到饥饿治疗效果。与现有技术相比，具有如下优点：
25.(1)本发明制备的纳米药物载体具有磁靶向和透明质酸靶向双重靶向，精准控制药物释放。ph及光热敏感性测定结果如图5所示，可以清晰的看到fdpgh具有良好的酸性以及光热释药的能力，这也为肿瘤药物靶向释放提供了支持。
26.(2)本发明制备的纳米药物载体通过肿瘤微环境和近红外光触发，可实现肿瘤光热治疗、化学动力学治疗、饥饿治疗、化学治疗协同治疗。细胞毒性研究结果如图6所示，
fdpgh 在施加808nm的激光照射之下，由于能够同时发挥光热治疗、饥饿疗法、化学动力学治疗以及化疗，具有最强的细胞杀伤能力。
27.(3)本发明制备的纳米药物载体具有mri成像功能，在肿瘤诊断与治疗中具有良好的应用前景。
28.(4)本发明制备的纳米药物载体包封率高(30％～90％)，载药量高(5％～20％)，在肿瘤酸性环境中降解，释放所负载的化疗药物和催化剂。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
30.图1为本发明实施例中1所述纳米药物载体的合成路线及其治疗机制；
31.图2a为实施例1制备的fdpgh的扫描电镜图，图2b为实施例1制备fdpgh的透射电镜图，且插图为局部放大；图2a、图2b以及插图的标尺分别为：20nm、20nm、2nm；
32.图3为实施例1中ha和fdpgh的红外光谱图；
33.图4a为实施例1中fdpgh的xps全谱图，图4b为实施例1中fdpgh的fe 2p窄谱图；
34.图5a为实施例1制备的fdpgh中dox在不同ph条件下药物释放曲线，图5b为实施例1制备的fdpgh中dox在不同ph及施加激光条件下药物释放曲线；
35.图6为4t1细胞与不同浓度梯度的游离dox、fph、fdpgh、fph l和fdpgh l(实施例1)培养12h后的细胞存活率；
36.图7为经过不同材料处理的4t1细胞的摄取评价。
具体实施方式
37.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
38.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
39.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
40.本发明的总体思路如下：
41.根据本发明一种典型的实施方式，提供一种靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统的制备方法，所述方法包括：
42.步骤s1、获得四氧化三铁磁性纳米颗粒；
43.所述步骤s1具体包括：
44.将fecl3·
6h2o、feso4·
7h2o以及超纯水超声使其充分溶解；35～45℃通入n2,而后缓慢加入nh3·
h20,继续搅拌反应；待温度升至70～80℃，加入一水合柠檬酸水溶液继续搅
拌，离心收集沉淀，依次用乙醇与水洗涤数次，最后分散于超纯水中以备进一步使用。
45.在其他实施方式中，也可采用现有技术中的其他方法制备得到四氧化三铁磁性纳米颗粒。
46.步骤s2、将多巴胺溶于弱碱性缓冲液中加入到所述四氧化三铁磁性纳米颗粒中反应，后加入抗肿瘤药物反应，获得表面装载药物的聚多巴胺磁性纳米颗粒；
47.上述技术方案中，所述四氧化三铁磁性纳米颗粒、盐酸多巴胺、抗肿瘤药物的质量比为70：(7～10)：(2～4)。
48.所述质量比范围有利于形成高光热转换效率、高药物装载量、尺寸满足epr效应的纳米粒，若所述质量比不合适，比如盐酸多巴胺添加过多存在合成纳米粒子尺寸过大，难以实现在靶部位的聚集等不利影响，添加过少则存在光热性能不佳、药物装载量低下等不利影响；
49.所述抗肿瘤药物包括盐酸阿霉素(dox)或顺铂类药物(cdpp)。
50.步骤s3、将所述表面装载药物的聚多巴胺磁性纳米颗粒与催化剂混合进行交联反应，获得表面装载有抗肿瘤药物和催化剂的聚多巴胺磁性纳米颗粒；
51.上述技术方案中，
52.所述负载抗肿瘤药物聚多巴胺磁性纳米颗粒和催化剂的质量比为20：(3～5)。所述质量比范围有利于在保证尺寸合乎要求的同时装载尽可能多的催化剂，若所述质量比过小会导致催化剂装载效率低等不利影响，若过大则导致合成的粒子尺寸过大等而降低药物分子在靶部位的聚集不利影响；
53.所述催化剂包括葡萄糖氧化酶(gox)或金纳米粒子(au nps)。
54.步骤s4、将所述表面装载有抗肿瘤药物和催化剂的聚多巴胺磁性纳米颗粒分散于超纯水中，加入靶向分子反应，获得可实现靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统。
55.所述表面装载药物的聚多巴胺磁性纳米颗粒与所述靶向分子的质量比为15：(3～5)。所述质量比范围有利于充分利用纳米载体的epr效应和主动靶向性，若所述质量比过小有靶向性不佳的不利影响，若过大有纳米粒尺寸过大，无法满足epr效应，进而导致摄取受限等不利影响；
56.所述的靶向分子包括透明质酸(ha)或叶酸(fa)。
57.本发明还提供了采用所述方法制备得到的靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统。
58.本发明还提供了所述的靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统在制备协同治疗产品中的应用。所述协同治疗包括肿瘤光热治疗、化学动力学治疗、饥饿治疗、化学治疗协同治疗中的一种。
59.靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统联合化疗药物进行应用，具体地，所述光热治疗的光照射波长为750～1350nm的近红外光；所述肿瘤包括4t1乳腺癌肿瘤。
60.下面将结合实施例及实验数据对本技术的一种靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统进行详细说明。
61.实施例1、靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统及其制备
方法
62.(1)制备四氧化三铁磁性纳米颗粒；
63.具体包括：在100ml三口烧瓶中加入0.3g fecl3·
6h2o、0.2g feso4·
7h2o以及20ml超纯水超声使其充分溶解；40℃通入n2，而后缓慢加入5ml nh3·
h2o,继续搅拌反应15min；待温度升至75℃，加入1ml一水合柠檬酸水溶液(0.16g
·
ml-1
),继续搅拌1h，离心(10000 rpm,15min)收集沉淀，依次用乙醇与水洗涤数次，最后分散于超纯水中以备进一步使用。
64.(2)在弱碱性环境下，向四氧化三铁磁性纳米颗粒悬浮液中加入盐酸多巴胺及药物，反应获得所述的表面装载药物的聚多巴胺磁性纳米颗粒；
65.具体包括：称取多巴胺2.5mg溶于tris-hcl buffer缓冲液中(10mm ph 8.50),加入上述合成的四氧化三铁水溶液中，超声反应30min，加入1mg dox，室温反应过夜，离心(10000 rpm，15min)收集沉淀(记为fdp)，用超纯水洗涤数次以除去游离dox,分散于超纯水中。
66.(3)将所述的载药聚多巴胺磁性纳米颗粒与催化剂混合，经交联反应获得表面装载有药物及催化剂的聚多巴胺磁性载药纳米颗粒；
67.具体包括：称取3mg gox溶于tris-hcl buffer缓冲液，缓慢加入至上述所得的fdp水溶液中，室温反应过夜，离心收集沉淀(记为fdpg)，而后分散于超纯水中，于4℃冰箱中保存。
68.(4)将步骤(3)制备的负载抗肿瘤药物和催化剂的聚多巴胺磁性纳米颗粒分散于超纯水中，加入靶向分子，反应获得可实现靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统。
69.具体包括：称取3mg ha溶于超纯水中，缓慢加入至上述所得负载dox和gox的聚多巴胺磁性纳米颗粒水溶液中，室温反应过夜，离心收集即得最终产物，记为fdpgh。
70.实验例2、微观形貌表征
71.将实施例1制备得到的可实现靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统的微观形貌测定：
72.具体地，将fdpgh磁性纳米颗粒粉末置于硅片上，用导电胶将硅片固定在样品台上，采用场发射扫描电子显微镜对样品表面的微观形貌进行观察。
73.如图2a所示，fdpgh磁性纳米颗粒均呈球状，尺寸较为均匀；且fdpgh磁性纳米颗粒的粒径为10
±
5nm。用类似的方法对fdpgh进行了tem观察(图2b)，结果与sem一致。
74.实验例3、化学结构测定
75.将实施例1制备得到的靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统的化学结构测定：
76.具体地，采用傅里叶红外谱图(ft-ir)对fdpgh进行测定。通过对比透明质酸(ha) 和fdpgh的红外吸收光谱，以证明实施例1中fdpgh表面是否成功包裹ha。
77.在图3中可以发现fdpgh在3310cm-1
(羟基)、1200cm-1
等处有吸收峰，对比标准品而言，其特征吸收峰有轻微蓝移现象，推测是由于ha与pda络合引起的。
78.实验例4、元素组成测定
79.对本发明实施例1制备得到的可实现靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响
应性纳米载药系统的元素组成测定：
80.具体地，用x射线光电子能谱，对fdpgh磁性纳米颗粒样品的表面元素进行扫描分析，结果如图4所示。
81.由图4可知，fdpgh磁性纳米颗粒在400ev的位置出现了n1s特征峰，这是由于含氨基的多巴胺引入造成的，表明聚多巴胺已经成功包覆在fe3o4纳米颗粒表面。同时s2s特征峰的出现也表明了葡萄糖氧化酶的成功装载。另外，图4b中可以看到所合成的铁为多价态形式，表明其有作为cdt试剂的优良潜力。
82.实验例5、ph及光热敏感性测定
83.对本发明实施例1制备得到的可实现靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统的ph及光热敏感性测定：
84.为验证化疗药物dox在不同ph及nir辐照下的释放行为，我们模拟了体液环境为ph 7.4、肿瘤内环境为ph 5.5的缓冲液，并施加nir辐照，根据dox在不同时间点的浓度，从而绘制出药物dox的体外释放曲线。
85.具体地，取浓度为3mg
·
ml-1
的fdpgh复合纳米颗粒溶液放入两个透析袋中，透析袋分别置于ph 7.4和ph 5.5的缓冲液中，在37℃和避光条件下缓慢搅拌，转速为100rpm。分别于不同时间点时取出2ml缓冲液，利用荧光分光光度计在不同时间点检测dox的荧光强度，绘制释放曲线图。利用相似的方法测定nir辐照下ph 7.4和ph 5.5的dox释放曲线(见图5b)。
86.如图5所示，可以清晰的看到fdpgh具有良好的酸性以及光热释药的能力，这也为肿瘤药物靶向释放提供了支持。
87.实验例6、细胞毒性研究
88.对本发明实施例1制备得到的可实现靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统的细胞毒性研究：
89.为研究fdpgh对肿瘤细胞生长的抑制效果，我们采用了不同材料对4t1细胞的毒性进行了比较。
90.具体地，将处于对数生长期的乳腺癌4t1细胞，以2
×
104个/孔接种于96孔板中，每孔加入1ml细胞悬液，于37℃培养箱中(含5％co2)孵育24小时后，将实施例1获得的复合纳米颗粒用培养基稀释到一定浓度后加入到细胞中，同时设置不同对照组，继续孵育12小时后，将96孔板中需要激光处理的孔置于激光发射器下，激光照射(2w
·
cm-2
)5min，继续放置于培养箱中培养12小时后，加入mtt，4小时后去掉旧培养基，加入150-200μl dmso，然后放置于摇床震荡混匀15-20min，最后用多功能酶标仪检测od(490)值，进行肿瘤细胞的杀伤活性评价。
91.结果如图6所示，fdpgh在施加808nm的激光照射之下，由于能够同时发挥光热治疗、饥饿疗法、化学动力学治疗以及化疗，具有最强的细胞杀伤能力。
92.实验例7、细胞靶向摄取评价
93.对本发明实施例1制备得到的可实现靶向多模式协同治疗的ph/近红外光双重响应性纳米载药系统的细胞靶向摄取评价：
94.为了证明透明质酸包裹磁性载药纳米颗粒具有4t1乳腺癌细胞的靶向作用，我们以 fdpg作为对照，研究了纳米载体与细胞共孵育6h的摄取情况。
95.具体地，将处于对数生长期的乳腺癌4t1细胞，以2
×
104个/孔接种于12孔板中，每孔加入2ml细胞悬液，于37℃培养箱中(含5％co2)孵育24小时后，将实施例1获得的复合纳米颗粒用培养基稀释到一定浓度后加入到细胞中，同时设置对照组(fdpg)，分别于0、1、3、6h弃去相应孔培养基，pbs洗一次，加入固定液固定10min，pbs清洗两次，加入dapi，染色10min，pbs洗涤一次，加入1ml pbs，在倒置荧光显微镜下观察细胞摄取情况。结果如图7所示。
96.由图7可知，fdpg经ha表面改性后，在相同时间点的材料摄取明显高于另一组，证明了ha修饰可以增强细胞主动靶向作用，从而促进细胞对材料的有效摄取。
97.最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
98.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
99.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。