组织蛋白酶C抑制剂在治疗肿瘤转移中的应用的制作方法

组织蛋白酶c抑制剂在治疗肿瘤转移中的应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤医学领域。更具体地，本发明涉及组织蛋白酶c抑制剂在治疗肿瘤转移中的应用。


背景技术：

2.众多肿瘤中，转移是造成病人死亡的主要诱因，90％肿瘤病人的死亡是癌细胞转移导致的。肺是最常见的乳腺癌远端转移靶器官，也是人体气体交换的场所，发生肺转移对肿瘤病人具有致命的威胁。
3.乳腺癌是国内外发病率和死亡率最高的女性肿瘤。在目前治疗效果最差的三阴性乳腺癌亚型中，肺转移是导致治疗失败和病人死亡的主要原因。肿瘤细胞对微环境的调控在肿瘤细胞形成远端转移的各个步骤中起着重要作用。大量研究表明，在癌细胞调控肿瘤微环境的过程中，肿瘤细胞分泌的胞外蛋白，包括蛋白酶、细胞因子、生长因子、细胞外基质蛋白等，起着关键作用。
4.蛋白酶作为一类重要的肿瘤微环境调控分子，参与了一系列和肿瘤细胞转移密切相关的过程。因此，肿瘤相关的分泌蛋白，尤其是具有蛋白酶活性的分泌因子，是如何调控转移的研究具有重要的生物学意义和临床应用价值。
5.ctsc，全称为半胱氨酸组织蛋白酶c(cathepsin c)，也被称为二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase 1，dpp1)，于1984年被gutman和fruton发现，位于11号染色体11q14.1-q14.3，是一种重要的常见蛋白酶。但ctsc在肿瘤转移中相关作用的报道却非常少。
6.因此，本领域迫切需要研究蛋白酶对于肿瘤转移的影响，尤其是ctsc对于肿瘤转移的影响并以此为基础开发抑制肿瘤转移的新型药物制剂，从而延长肿瘤患者的生存时间，并改善生存质量。


技术实现要素：

7.本发明的目的是研究ctsc对于肿瘤转移的影响，并在此基础上提供一种抑制肿瘤转移的新型药物制剂。所述肿瘤优选地为乳腺癌。
8.具体地，本发明发现了ctsc促进乳腺癌转移的机理，并提供了一种ctsc的抑制剂(azd7986)，通过这种抑制剂达到抑制乳腺癌或肺癌的转移(包括肺转移、肝转移、骨转移)从而帮助延长肿瘤患者的生存时间，改善生存质量。
9.在本发明的第一方面，提供了一种组织蛋白酶c抑制剂的用途，所述组织蛋白酶c抑制剂用于制备抑制肿瘤转移的药物。
10.在另一优选例中，所述组织蛋白酶c为半胱氨酸组织蛋白酶c(ctsc)。
11.在另一优选例中，所述肿瘤选自：乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌或其组合在另一优选例中，所述转移选自：肺转移、肝转移、骨转移或其组合。
12.在另一优选例中，所述组织蛋白酶c抑制剂为式i所示的azd7986，或其药学上可接
受的盐，或其前药。
[0013][0014]
在另一优选例中，所述肿瘤转移为乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移或肺癌的骨转移。
[0015]
在另一优选例中，所述抑制剂的给药方式为口服或非口服形式。
[0016]
在另一优选例中，所述抑制剂包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂、含片、或滴丸。
[0017]
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：
[0018]
(a1)作为第一活性成分的组织蛋白酶c抑制剂，其中所述组织蛋白酶c抑制剂选自：azd7986、(2s)-n-[(1s)-1-氰基-2-苯基乙基]-1，4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺类化合物、bi-9740、gsk-2793660、gly-phe-chn2、或其衍生物或类似化合物、或其组合；其中，(2s)-n-[(1s)-1-氰基-2-苯基乙基]-1，4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺类化合物为式ii所示的化合物：
[0019][0020]
式中，r选为苯基或其衍生基团；
[0021]
(a2)药学上可接受的载体、赋形剂。
[0022]
在本发明的第三方面，提供了一种第二方面所述的药物组合的用途，所述药物组合物用于制备抑制肿瘤转移的药物。
[0023]
在另一优选例中，所述肿瘤包括：乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌或其组合。
[0024]
在另一优选例中，所述转移包括：肺转移、肝转移、骨转移或其组合。
[0025]
在另一优选例中，所述药物组合物给药方式为口服或者非口服。
[0026]
在另一优选例中，所述药物组合物包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂、含片、或滴丸。
[0027]
在本发明的第四方面，提供了一种调控肿瘤细胞微环境的方法，包括步骤：将组织蛋白酶c抑制剂或第二方面所述的药物组合物和肿瘤细胞接触，从而降低中性粒细胞的浸润和/或中性粒细胞胞外陷阱(nets)的形成，调控肿瘤微环境。
[0028]
在另一优选例中，所述组织蛋白酶c抑制剂包括：azd7986、(2s)-n-[(1s)-1-氰基-2-苯基乙基]-1，4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺类化合物、bi-9740、gsk-2793660、gly-phe-chn2、上述化合物的衍生物或类似化合物、或其组合；其中(2s)-n-[(1s)-1-氰基-2-苯基乙基]-1，4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺类化合物如上所述。
[0029]
在另一优选例中，所述方法用于治疗肿瘤转移。
[0030]
在另一优选例中，所述肿瘤包括：乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌或其组合。
[0031]
在另一优选例中，所述转移包括：肺转移、肝转移、骨转移或其组合。
[0032]
在另一优选例中，所述的方法为体外的。
[0033]
在另一优选例中，所述的方法为非治疗性非诊断性的。
[0034]
在本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞转移的方法，包括步骤：在含有有效量的第二方面所述的药物组合物或组织蛋白酶c抑制剂的培养体系下，培养所述肿瘤细胞。
[0035]
在另一优选例中，所述组织蛋白酶c抑制剂包括：：azd7986、(2s)-n-[(1s)-1-氰基-2-苯基乙基]-1，4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺类化合物、bi-9740、gsk-2793660、gly-phe-chn2、上述化合物的衍生物或类似化合物、或其组合；其中(2s)-n-[(1s)-1-氰基-2-苯基乙基]-1，4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺类化合物如上所述。
[0036]
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞来自乳腺癌、肺癌、结肠癌或胃癌。
[0037]
在另一优选例中，所述肿瘤包括：乳腺癌、肺癌、结肠癌或胃癌。
[0038]
在另一优选例中，所述转移包括：肺转移、肝转移、骨转移。
[0039]
在本发明的第六方面，提供了一种抑制肿瘤转移的方法，包括步骤：给受试者施用有效量的组织蛋白酶c抑制剂或第二方面述的药物组合物。
[0040]
在另一优选例中，所述组织蛋白酶c抑制剂包括：azd7986、(2s)-n-[(1s)-1-氰基-2-苯基乙基]-1，4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺类化合物、bi-9740、gsk-2793660、gly-phe-chn2、上述化合物的衍生物或类似化合物、或其组合；其中(2s)-n-[(1s)-1-氰基-2-苯基乙基]-1，4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺类化合物如上所述。
[0041]
在另一优选例中，所述肿瘤包括：乳腺癌、肺癌、结肠癌或胃癌。
[0042]
在另一优选例中，所述转移包括：肺转移、肝转移、骨转移。
[0043]
在另一优选例中，所述的方法为体外的。
[0044]
在另一优选例中，所述的方法为非治疗性非诊断性的。
[0045]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0046]
图1显示的是在乳腺癌临床样本中ctsc蛋白表达水平与肺转移相关。其中，a-b为免疫荧光检测7例乳腺癌病人配对原位肿瘤和肺转移灶样本中ctsc蛋白的代表性图片及统计图，图中的标尺为100μm。c为乳腺癌病人的原位瘤(74例)和肺转移灶(29例)样本中ctsc的蛋白表达水平分析。d为不同肺转移状态的乳腺癌病人血清ctsc水平。e为血清ctsc水平不同的乳腺癌病人的无肺转移生存率分析。f为据原位组织ctsc水平分组后高/低ctsc组乳腺癌病人的生存曲线分析。
[0047]
图2显示的是ctsc过表达促进乳腺癌肺转移。其中，a为scp28细胞系中ctsc过表达的mrna、蛋白水平验证；b-d为scp28细胞对照组以及过表达ctsc组尾静脉注射后肺部的荧光信号(b)、肺表面转移结节数(c)和小鼠的生存曲线分析(d)，(每组n＝10)。
[0048]
图3显示的是ctsc敲低抑制乳腺癌肺转移。其中，a为lm2-4175细胞系中敲低ctsc的mrna、蛋白水平验证。b-d为lm2-4175细胞对照组或敲低ctsc组尾静脉注射后肺部的荧光信号(b)、肺表面转移结节数(c)和小鼠的无肺转移生存曲线分析(d)，(每组n＝10)。
[0049]
图4显示的ctsc是在免疫完全小鼠中促进乳腺癌肺转移。其中，a为4to7细胞系中过表达ctsc和4t1中敲除ctsc的mrna、蛋白水平验证。b-c为4to7细胞对照组或过表达ctsc组尾静脉注射后肺部的荧光信号(b)、肺表面转移结节数(c)(每组n＝10)。d-e为4t1细胞系原位注射对照组和敲低ctsc组分别脂肪垫原位注射后，观察两组小鼠肿瘤生长(d)和肺转移灶结节数(e)(每组n＝10)。
[0050]
图5显示了azd7986抑制乳腺癌肺转移。其中，a为原位注射4t1细胞后第7天，施用azd79867(ctsc抑制剂)，并观察肿瘤细胞生长情况得到的肿瘤体积随时间变化的曲线图。b-d为原位注射4t1细胞的小鼠施用azd7986后肺转移结节数量图(b)、小鼠体重随时间变化图(c)、小鼠生存率图(d)。e为施用azd7986后，肺转移灶中性粒细胞发生nets数统计及示意图。标尺为50μm。
[0051]
图6显示了azd7986抑制各种靶器官转移性的乳腺癌和肺癌细胞招募中性粒细胞及诱导nets发生的能力。其中，a为对肺转移性乳腺癌细胞lm2-4175施用azd79867后，通过nets分子标记物(mpo,myeloperoxidase；ci-h3,citrullinated histone h3)的免疫荧光染色观察在癌细胞条件培养液刺激下中性粒细胞形成nets的情况。b为ctsc在弱(mda-mb-231，简称为231)、中(sp16)及强(sp16-liver)肝转移性乳腺癌细胞中的表达水平。c为ctsc在弱或强骨转移性肺癌细胞中的表达水平。d为对不同肝转移性乳腺癌细胞施用azd79867后，通过免疫荧光染色观察在癌细胞条件培养液刺激下中性粒细胞形成nets的情况。e为对不同骨转移性肺癌细胞施用azd79867后，通过免疫荧光染色观察在癌细胞条件培养液刺激下中性粒细胞形成nets的情况。f为对不同肝转移性乳腺癌细胞施用azd79867后，分析癌细胞条件培养液招募中性粒细胞的情况。g为对不同骨转移性肺癌细胞施用azd79867后，分析癌细胞条件培养液招募中性粒细胞的情况。
具体实施方式
[0052]
本发明人经过广泛而深入的研究发现了一种抑制肿瘤(优选的乳腺癌)转移的抑制剂，在此基础上完成了本发明。
[0053]
具体地，本发明发现了ctsc通过调控转移微环境中中性粒细胞的浸润和中性粒细胞胞外陷阱(nets)的形成，促进乳腺癌细胞发生肺转移、肝转移，并以此为基础发明了一种抑制ctsc的药物抑制剂，通过抑制ctsc，从而减少中性粒细胞的浸润，降低中性粒细胞胞外陷阱(nets)的形成，从而改善乳腺癌肿瘤微环境来抑制乳腺癌的转移。
[0054]
术语
[0055]
本文所用，术语“转移性乳腺癌”指有转移风险的乳腺癌，包括未发生或已发生转移的乳腺癌类型，具体地，包括骨转移性乳腺癌、肺转移性乳腺癌、脑转移性乳腺癌、肝转移性乳腺癌等转移类的乳腺癌。
[0056]
表达
[0057]
如本文所用，术语“表达”包括mrna从基因或基因部分的产生，并且包括由rna或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cdna，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
[0058]
ctsc
[0059]
ctsc，全称为半胱氨酸组织蛋白酶c(cathepsin c)，也被称为二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase 1，dpp1)，于1984年被gutman和fruton发现，位于11号染色体11q14.1-q14.3，是一种重要的调常见蛋白酶。
[0060]
ctsc对免疫细胞中表达的丝氨酸激活至关重要(korkmaz et al.,2018)。如ctsc可以激活中性粒细胞的ne、pr3、ctsg、nsp4(perera et al.,2013)，肥大细胞中类糜蛋白酶(chymase)类胰蛋白酶(tryptaseαii/βii/γ)，淋巴细胞中颗粒酶a/b(granzymes a/b)等。
[0061]
以ctsc激活中性粒细胞的ne、pr3、ctsg、nsp4过程为例，溶酶体或高尔基体定位的ctsc，通过切除n端的2个氨基酸激活中性粒细胞ne、pr3、ctsg这三个丝氨酸蛋白酶，进而发挥了调控炎症反应的作用。在中性粒细胞成熟过程的早期，即形态学原始粒细胞(myeloblasts)、早幼粒细胞(promyelocytes)期，nsps以酶原的形式被瞬时的表达，中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(ne、pr3、ctsg和nsp4)酶原n端包含封闭自身酶活的二肽在高尔基体运输过程或在初级颗粒(azurophilic granules)内被ctsc剪切，从而以活性的形式存储在初级颗粒中，然而也有文献报道，pr3以未激活状态组成性的表达的细胞膜上。
[0062]
虽然ctsc对中性粒细胞发挥正常的免疫功能起重要作用，但ctsc在癌症中的报道却非常少。
[0063]
本发明中发现，ctsc通过提高病灶部位中性粒细胞的浸润，增加中性粒细胞胞外陷阱的数量，从而改善肿瘤微环境，促进乳腺癌的肺转移。
[0064]
组织蛋白酶c抑制剂
[0065]
如本文所用，“本发明的化合物”，“本发明的药物抑制剂”，“本发明的抑制剂”，“ctsc抑制剂”，“本发明的组织蛋白酶c抑制剂”可互换使用，均指的是包括azd7986在内的ctsc抑制剂。
[0066]
本发明优选地的组织蛋白酶c抑制剂及其结构式如下：
[0067]
[0068][0069]
药物组合物及施用方法
[0070]
由于本发明的抑制剂及其药学上可接受的无机或有机盐，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗肿瘤转移。本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药学上可接受的盐及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-100mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
[0071]“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0072]
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。
[0073]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、
和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0074]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0075]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0076]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0077]
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0078]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0079]
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
[0080]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0081]
本发明的主要优点包括：
[0082]
(a)本发明的药物抑制剂可以广泛、有效地抑制肿瘤转移，优选地，不仅能抑制乳腺癌的肺转移还能抑制乳腺癌的肝转移,以及肺癌骨转移。
[0083]
(b)本发明的药物抑制剂在发挥抑制肿瘤转移作用的同时能缓解肿瘤转移带来的受试者体重下降。
[0084]
(c)本发明的药物抑制剂应用范围广，无论是免疫缺陷或者免疫完全的受试者，施用本发明的药物抑制剂后都可以有效抑制肿瘤转移，尤其是乳腺癌的肺转移、肝转移。
[0085]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0086]
实施例1高肺转移潜能的乳腺癌细胞中ctsc表达
[0087]
方法：
[0088]
我们获取了103例乳腺癌原位灶和肺转移灶样本，其中包括7例乳腺癌病人配对的原位灶和肺转移灶样本。通过免疫荧光染色分析样本中ctsc蛋白的表达水平，得到结果如图1a-c所示。
[0089]
为了验证在临床上ctsc与乳腺癌病人肺转移是否具有相关性，我们通过酶联免疫吸附试验(elisa)检测了ctsc在原位乳腺癌病人血清中的水平，然后根据ctsc蛋白在病人血清中的水平或者在肿瘤样本中的表达水平将病人分为ctsc高、低表达两组，通过kaplan-meier分析方法比较两组病人的预后(无转移存活期及总存活期)
[0090]
结果：
[0091]
分析发现，相比原位灶，ctsc在相同病人的配对肺转移灶中的蛋白水平均显著上调(图1a-b)。扩大样本量后发现，ctsc在大部分原位灶样本中低表达或不表达，在肺转移灶中却普遍高表达(图1c)。
[0092]
由图1d发现，相比不发生转移的病人，发生肺转移的病人血清ctsc的水平显著更高。
[0093]
由图1e发现，血清ctsc表达水平高的病人，无肺转移生存时间明显缩短。
[0094]
由图1f发现，对原位灶的病人样本进行生存分析发现，ctsc高表达组的病人明显具有更差的预后。
[0095]
综上，我们发现ctsc的分泌水平与乳腺癌肺转移潜能呈显著正相关，提示ctsc可以作为乳腺癌肺转移风险的标记基因。
[0096]
实施例2 ctsc促进乳腺癌肺转移
[0097]
2.1 ctsc过表达对于乳腺癌肺转移影响
[0098]
方法：
[0099]
为了验证ctsc是否能在功能上促进乳腺癌的肺转移，我们在弱肺转移潜能的mda-mb-231亚系scp28上过表达ctsc。利用异种移植尾静脉注射引发肺转移的模型，由于肿瘤细胞预先标记了荧光素酶，通过给小鼠注射荧光素酶底物进行活体成像就可以追踪肿瘤细胞在肺组织内的生长。
[0100]
设置2组scp28细胞系，分别为空白对照scp28细胞系和ctsc过表达组的scp28细胞系，将两组细胞系分别通过尾静脉注射进小鼠体内，得到两组小鼠肺组织的荧光信号、肺表面结节数，并统计生存率，结果如图2所示。
[0101]
结果：
[0102]
由图2b可知，相比对照组，ctsc过表达组小鼠乳腺癌肺转移更为明显；
[0103]
由图2c可知，相比对照组，ctsc过表达组小鼠的肺表面结节数显著上调；
[0104]
由图2d可知，相比对照组，ctsc过表达组小鼠生存率显著降低。
[0105]
综上所述，ctsc的过表达可以在功能上促进乳腺癌的肺转移。
[0106]
2.2 ctsc敲低对于乳腺癌肺转移的影响
[0107]
方法：
[0108]
同样地为了验证ctsc敲低对于乳腺癌肺转移的功能上的影响，我们在高肺转移潜能的mda-mb-231亚系lm2-4175上敲低ctsc，并设置对照组和敲低组的两组细胞系，分别将两组细胞系通过尾静脉注射进小鼠体内，得到得到两组小鼠肺组织的荧光信号、肺表面结节数，并统计生存率，结果如图3所示。
[0109]
结果：
[0110]
由图3b、c发现，相比对照组ctsc敲低后肿瘤细胞在小鼠肺组织的生长和在肺表面形成的转移灶个数显著下调；
[0111]
由图3d发现，小鼠的无肺转移生存时间明显延长。
[0112]
2.3 ctsc对于免疫完全小鼠的乳腺癌肺转移的影响
[0113]
方法：
[0114]
在验证ctsc对于乳腺癌肺转移的影响中，为了排除小鼠免疫系统的影响，我们采用了免疫系统完整的balb/c小鼠模型。设置了两类实验，一类中设置了4to7小鼠乳腺癌细胞系的空白对照组和ctsc过表达组，并将两组细胞系分别通过尾静脉注射进免疫完全的balb/c小鼠体内。得到两组小鼠的肺组织的荧光信号、肺表面结节数，结果如图4b、c所示。
[0115]
另一类中设置了4t1细胞系的空白对照组以及ctsc敲低组，将两组细胞系分别通过脂肪垫原位注射进免疫完全的balb/c小鼠体内。得到两组小鼠体内的肿瘤生长体积，以及肺结节数，结果如图4d、e所示。
[0116]
结果：
[0117]
由图4b发现，尽管在免疫完全的小鼠体内，ctsc过表达组的bli(生物荧光成像)显示肿瘤在肺部生长速度快，表明ctsc过表达显著促进了肿瘤细胞在肺部的生长，且这种促进作用不受免疫系统的影响；
[0118]
由图4c发现，尽管在免疫完全的小鼠体内，ctsc过表达组的小鼠体内肺结节数目明显高于空白对照组，表明ctsc过表达显著增加小鼠肺表面转移灶的数目，且这种增加促进作用不受免疫系统的影响。
[0119]
由图4d发现，尽管在免疫完全的小鼠体内，相比于空白对照组，ctsc敲低组的小鼠体内肿瘤体积的生长速度更慢，体积更小；
[0120]
由图4e发现，尽管在免疫完全的小鼠体内，ctsc的敲低并不影响4t1细胞的原位生长，但著降低了小鼠肺组织表面的转移结节数的形成。
[0121]
综上，无论在免疫系统缺陷的还是完整的小鼠体内，我们证明了ctsc能促进乳腺癌细胞的肺转移能力。
[0122]
实施例3 azd7986(ctsc抑制剂)抑制乳腺癌肺转移
[0123]
方法：
[0124]
结合ctsc促进乳腺癌肺转移的功能，我们进一步探讨运用ctsc抑制剂治疗乳腺癌肺转移的可能性。azd7986是ctsc的特异性抑制剂，用于治疗非囊性纤维化支气管扩张症(non-cystic fibrosis bronchiectasis)，目前已经进入二期临床试验(doyle et al.,2016)。我们利用原位脂肪垫注射4t1细胞观察肺转移的模型，在注射4t1细胞7天后，对小鼠进行药物(azd7986)处理，设置给药组合空白对照组。得到的肿瘤体积随时间变化图，肺结节数量图，小鼠体重随时间变化图，小鼠存活率图，病灶中性粒细胞胞外陷阱数统计图以及示意图如图5所示。
[0125]
结果：
[0126]
由图5a可知，和4t1敲低ctsc表型一致，azd7986给药组与空白组的原位瘤体积随时间变化是一致的，这表明azd7986给药不影响原位瘤的生长；
[0127]
由图5b可知，azd7986给药组与空白组相比，肺结节数显著降低，这表明azd7986给
药能抑制肿瘤细胞在肺部表面形成转移灶；
[0128]
由图5c可知，azd7986给药组与空白组相比，小鼠体重下降幅度较低，这表明，azd7986给药能缓解肺转移带来的小鼠体重下降；
[0129]
由图5d可知，azd7986给药组与空白组相比，小鼠生存率显著提高，这表明，azd7986给药明显延长小鼠的生存时间；
[0130]
由图5e可知，azd7986给药组与空白组相比，由图5e可知，azd7986给药组与空白组相比，病灶中性粒细胞的浸润降低，中性粒细胞胞外陷阱的产生更少，这表明azd7986给药显著地抑制肺转移灶中中性粒细胞的浸润和中性粒细胞胞外陷阱的产生。
[0131]
综上说明，ctsc可以作为临床上治疗乳腺癌肺转移的新靶点。ctsc促进乳腺癌肺转移的机理在于提高病灶部位中性粒细胞的浸润，增加中性粒细胞胞外陷阱的数量，从而改善肿瘤微环境，促进乳腺癌的肺转移。而azd7986作为ctsc抑制剂可以很好地抑制病灶部位中性粒细胞的浸润，减少中性粒细胞胞外陷阱的产生，从而抑制乳腺癌的肺转移。
[0132]
实施例4 azd7986(ctsc抑制剂)抑制各种转移性肿瘤的中性粒细胞招募及nets形成
[0133]
方法：
[0134]
结合中粒细胞及nets形成对肿瘤转移的促进作用及ctsc抑制剂对中性粒细胞功能的抑制作用，我们进一步探讨在其他肿瘤转移(包括乳腺癌向肝转移及肺癌向骨转移)病症中运用ctsc抑制剂的可能性。
[0135]
我们分析了向各种靶器官转移能力不同的肿瘤细胞(包括乳腺癌向肝转移及肺癌向骨转移)中ctsc的蛋白分泌水平，发现ctsc均在高转移性肿瘤细胞中表达水平升高。另外，我们利用这些细胞的分泌物(条件培养液)及药物(azd7986)处理骨髓来源中性粒细胞，然后transwell可穿透性细胞培养小室试验观察肿瘤分泌物吸引中性粒细胞的能力，并通过nets分子标记物(mpo及瓜氨酸化组蛋白3)的免疫荧光染色分析nets的形成，发现与无药物处理组相比，药物处理后肿瘤细胞分泌物吸引(招募)中性粒细胞及诱导nets形成的能力显著减弱。ctsc蛋白表达、nets形成及中性粒细胞招募数据图如图6所示。
[0136]
这表明ctsc抑制剂(azd7986)不仅能够降低乳腺癌肺早期转移病灶部位的中性粒细胞的浸润，降低中性粒胞外陷阱(nets)的形成，在其他的转移病症中，例如乳腺癌的肝转移，骨转移，肺癌的骨转移等，ctsc抑制剂(azd7986)都能够帮助降低早期转移病灶部位的中性粒细胞的浸润以及中性粒胞外陷阱(nets)的形成，从而达到抑制肿瘤转移的效果。
[0137]
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