用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法

1.本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法。


背景技术：

2.近年来，食品安全问题越来越受人们的关注。在国内过氧化氢(h2o2)作为氧化还原剂、漂白剂以及和抗菌剂等被广泛应用于临床治疗、生物和食品加工等各个领域。过氧化氢是生物系统中的一种重要化学物质，参与细胞生长调节、重要物质的合成和代谢、能量转化及细胞内信号转导，但是高浓度的h2o2可能会引起细胞死亡。国外发达国家已经将其用于环境保护，应用规模也呈增长趋势，而我国由于成本问题在这方面的应用较少。由于过氧化氢应用广泛，监察难度大，其残留问题是安全工作者首先要考虑的问题。为有效降低安全风险，必须对h2o2的浓度进行有效监测。因此需要开发一种快速高效检测过氧化氢的方法。
3.目前，过氧化氢的检测方法有许多，如紫外分光光度法、滴定法、电化学法以及比色法等，但是还是有很大局限性，例如这些方法需要复杂的样品制备、高昂的设备和专业的技术人员，这限制了它们在快速检测中的应用。近年来许多分子和离子传感器被固定在固体支撑材料上，但他们大部分都有一个共同的缺点，例如在实时检测过程中探针易破损、成本高、选择性低和可循环性差等。荧光传感器是利用被测物与某种荧光分子或材料之间的特定的相互作用引发荧光强度的增加或降低，或者是引起所发射的荧光波长的变化来实现对被测物质的检测与信号的传递。
4.pv-co-pe纳米纤维膜是一种比表面积大，结构稳定，富含大量羟基，可以和很多官能团作用赋予其一些特殊功能，本身是一种很好地固载材料，因此，基于pv-co-pe纳米纤维膜用于检测生物样本中h2o2含量的具有高选择性和灵敏度的新型荧光传感器具有重要意义。但是用于h2o2检测的荧光分子取代掉pv-co-pe纳米纤维膜上的羟基后，会降低其亲水性，从而影响过氧化氢溶液的浸润速率，进而降低检测响应时间。因此，如何制备一种用于h2o2快速和高灵敏度检测的荧光固体检测膜是亟待解决的问题。
5.有鉴于此，有必要设计一种改进的用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，将改性的硼酸酯类荧光分子通过酰胺化反应接枝到pv-co-pe纳米纤维膜上，得到用于检测生物样本中h2o2含量的荧光传感器，具有检测速率快、灵敏度高和可视化的优点。
7.为实现上述发明目的，本发明提供了一种用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
8.s1.将4-溴-1，8-萘二甲酸酐和6-氨基己酸溶于有机溶剂中，在氮气保护下反应预
设时间，然后趁热抽滤，滤液重结晶得到浅黄色固体；
9.s2.将步骤s1得到的所述浅黄色固体与双(频哪醇合)二硼在乙酸钾和催化剂作用下，于1,4-二氧六环溶剂中反应预设时间，然后减压旋蒸、提纯，得到荧光检测分子；
10.s3.将步骤s2得到的所述荧光检测分子和n,n
’‑
羰基二咪唑加入到四氢呋喃溶剂中，活化1-5h，然后将pva-co-pe纳米纤维膜加入到溶液中接枝反应1-8h后，取出洗涤干燥得到过氧化氢荧光检测纤维膜。
11.作为本发明的进一步改进，在步骤s3中，所述pva-co-pe纳米纤维膜的pva链段的质量含量为60％-80％；所述pva链段与所述荧光检测分子的摩尔比为1：(0.5-0.8)。
12.作为本发明的进一步改进，在步骤s3中，所述pva-co-pe纳米纤维膜中乙烯醇和乙烯链段为1:1交替共聚；pva-co-pe纳米纤维的直径为100-200nm。
13.作为本发明的进一步改进，步骤s1中的所述有机溶剂为无水乙醇。
14.作为本发明的进一步改进，在步骤s1中，4-溴-1，8-萘二甲酸酐和6-氨基己酸的摩尔比为1：(1-1.5)，所述反应的温度为70-90℃，预设时间为8-12h。
15.作为本发明的进一步改进，在步骤s2中，所述浅黄色固体与双(频哪醇合)二硼的摩尔比为1：(1-1.5)。
16.作为本发明的进一步改进，在步骤s2中，所述催化剂为1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯，所述催化剂与所述浅黄色固体的摩尔比为(0.01-0.1)：1；所述乙酸钾与所述浅黄色固体的摩尔比为(2.5-3.5)：1。
17.作为本发明的进一步改进，在步骤s2中，所述反应在氮气保护下进行，反应温度为105-120℃，预设时间为10-15h。
18.作为本发明的进一步改进，在步骤s2中，所述提纯包括：将减压旋蒸后的产物以体积比为60:1的二氯甲烷和甲醇淋洗液常压过柱。
19.作为本发明的进一步改进，在步骤s3中，所述荧光检测分子和n,n
’‑
羰基二咪唑的摩尔比为1：(2-3)；所述活化的温度为50-70℃，所述接枝反应的温度为40-60℃。
20.本发明的有益效果是：
21.1.本发明提供的用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，将羧基化的硼酸酯类荧光分子通过酰胺化反应接枝到pv-co-pe纳米纤维膜上，得到用于检测h2o2含量的荧光传感器，具有检测速率快、灵敏度高和可视化的优点。相比常规的采用荧光分子溶液检测过氧化氢的方法，能够将荧光分子定点接枝于纤维膜表面，使得检测位点更集中，荧光分子的检测有效使用率更高，而且无需有机溶剂；而荧光分子在溶液中分散性较大，因此有效使用率和响应速率均不如本发明。此外，纤维膜的比表面积高，亲水性好，便于快速浸润和捕获溶液中的过氧化氢分子，从而提高响应速率。
22.2.本发明合成的荧光小分子，结构比较稳定，暴露在空气中不易氧化分解，遇过氧化氢时荧光变化显著。先将4-溴-1，8-萘二甲酸酐与6-氨基己酸发生酰胺化反应，实现羧基化改性，便于与后续pva-co-pe纳米纤维膜上的羟基发生酯化接枝反应；而且选用6-氨基己酸进行改性，烷基链长度适中，既不会过度降低膜表面的亲水性，又便于减小接枝位阻，接枝后还能保证荧光分子的链段活动性，从而便于捕获过氧化氢分子发生反应，从而加快响应速率，提高灵敏度。
23.3.本发明优选乙烯醇和乙烯链段为1:1交替共聚，便于提高膜表面羟基分布的均
匀性，进而保证荧光分子接枝的均匀性，能够使得荧光分子与剩余羟基相间分布，保证膜表面任意一处既有活性检测位点，又有亲水基团保证亲水性，从而提高检测速率和灵敏度。本发明相比常规的采用荧光分子溶液检测过氧化氢的方法，能够将荧光分子定点接枝于纤维膜表面，使得检测位点更集中，荧光分子的检测有效使用率更高，而荧光分子在溶液中分散性较大，因此有效使用率和响应速率均不如本发明。
附图说明
24.图1为过氧化氢荧光检测纤维膜的制备结构流程示意图；
25.图2为实施例1制备的荧光分子的核磁共振图谱。
26.图3中a、b分别为未接枝的pva-co-pe纳米纤维膜和实施例1制备的过氧化氢荧光检测纤维膜未接触含有h2o2的溶液时，在356nm紫外灯照射下的实物图，c为实施例1制备的过氧化氢荧光检测纤维膜接触过含有h2o2的溶液后，在356nm紫外灯照射下的实物图。
27.图4为实施例1制备的过氧化氢荧光检测纤维膜接触含有h2o2的溶液前后的可见光状态下的实物图。
28.图5为实施例1制备的过氧化氢荧光检测纤维膜在过氧化氢的pbs缓冲液中，在356nm紫外灯照射下的荧光强度随时间的变化曲线。
具体实施方式
29.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
30.在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在具体实施例中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
31.另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
32.请参阅图1所示，本发明提供的用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
33.s1.将4-溴-1，8-萘二甲酸酐和6-氨基己酸溶于有机溶剂中，在氮气保护下反应预设时间，然后趁热抽滤，滤液重结晶得到浅黄色固体；步骤s1中的有机溶剂为无水乙醇。4-溴-1，8-萘二甲酸酐和6-氨基己酸的摩尔比为1：(1-1.5)，反应的温度为70-90℃，预设时间为8-12h。
34.s2.将步骤s1得到的所述浅黄色固体与双(频哪醇合)二硼在乙酸钾和催化剂作用下，于1,4-二氧六环溶剂中反应预设时间，然后减压旋蒸、提纯，得到荧光检测分子；在步骤s2中，浅黄色固体与双(频哪醇合)二硼的摩尔比为1：(1-1.5)。催化剂为1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯，催化剂与浅黄色固体的摩尔比为(0.01-0.1)：1；乙酸钾与浅黄色固体的摩尔比为(2.5-3.5)：1。反应在氮气保护下进行，反应温度为105-120℃，预设时间为10-15h。提纯包括：将减压旋蒸后的产物以体积比为60:1的二氯甲烷和甲醇淋洗液常压过柱。
35.s3.将步骤s2得到的所述荧光检测分子和n,n
’‑
羰基二咪唑加入到四氢呋喃溶剂中，活化1-5h，然后将pva-co-pe纳米纤维膜加入到溶液中接枝反应1-8h后，取出洗涤干燥得到过氧化氢荧光检测纤维膜。
36.如此操作，先将4-溴-1，8-萘二甲酸酐与6-氨基己酸发生酰胺化反应，实现羧基化改性，便于与后续pva-co-pe纳米纤维膜上的羟基发生酯化接枝反应；而且选用6-氨基己酸进行改性，烷基链长度适中，既不会过度降低膜表面的亲水性，又便于减小接枝位阻，接枝后还能保证荧光分子的链段活动性，从而便于捕获过氧化氢分子发生反应，从而加快响应速率，提高灵敏度。其次，将荧光分子接枝到pva-co-pe纳米纤维膜上，纤维膜的比表面积高，亲水性好，便于快速浸润和捕获溶液中的过氧化氢分子，实现过氧化氢的可视化检测，而且荧光光谱强度变化显著，灵敏性高；将溶液检测转化为固体膜检测，使用和携带更方便。
37.在步骤s3中，pva-co-pe纳米纤维膜的pva链段的质量含量为60％-80％；pva链段与荧光检测分子的摩尔比为1：(0.5-0.8)。如此操作，在保证荧光分子接枝率的情况下，还能剩余部分羟基，保证膜表面的亲水性，从而保证对过氧化氢水溶液的浸润性，便于捕获过氧化氢分子。
38.在步骤s3中，pva-co-pe纳米纤维膜中乙烯醇和乙烯链段为1:1交替共聚；pva-co-pe纳米纤维的直径为100-200nm。如此操作，便于提高膜表面羟基分布的均匀性，进而保证荧光分子接枝的均匀性，能够使得荧光分子与剩余羟基相间分布，保证膜表面任意一处既有活性检测位点，又有亲水基团保证亲水性，从而提高检测速率和灵敏度。本发明相比常规的采用荧光分子溶液检测过氧化氢的方法，能够将荧光分子定点接枝于纤维膜表面，使得检测位点更集中，荧光分子的检测有效使用率更高，而荧光分子在溶液中分散性较大，因此有效使用率和响应速率均不如本发明。
39.在步骤s3中，荧光检测分子和n,n
’‑
羰基二咪唑的摩尔比为1：(2-3)；活化的温度为50-70℃，接枝反应的温度为40-60℃。
40.实施例1
41.一种用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
42.1.荧光小分子的合成
43.第一步：称取化合物a(4-溴-1，8-萘二甲酸酐)5.54g(20mmol)、6-氨基己酸2.623g(22mmol)、150ml无水乙醇于干燥的250ml圆底烧瓶中，n2气体保护3次。加入搅拌子，在80℃油浴条件下回流10h。稍冷却后趁热抽滤，滤液重结晶得到浅黄色固体，浅黄色固体于40℃真空烘箱干燥7h得到干燥的浅黄色固体(化合物b，产率80％)。
44.第二步：称取化合物b 390mg(1mmol)，双(频哪醇合)二硼305mg(1.2mmol)，乙酸钾294mg(3mmol)，pd(dppf)cl
2 36.58mg(0.05mmol)，20ml 1,4-二氧六环于干燥的100ml圆底烧瓶中，加入搅拌子，n2保护3次，110℃油浴条件下回流12h。tlc监测反应进程，反应完毕后冷却得到混合溶液，将混合溶液旋干后，以二氯甲烷/甲醇＝60:1(0.5％乙酸)的淋洗液常压过柱，得到荧光小分子(化合物c，产率76％)。
45.如图2所示，表明本发明成功合成了硼酸酯类荧光小分子。
46.2.荧光传感器的制备
47.称取化合物c 200mg(0.457mmol)，cdi(n,n
’‑
羰基二咪唑)81.6mg(1.1mmol)，10ml
无水thf于干燥的25ml圆底烧瓶中，加入搅拌子，在60℃条件下活化4h。称取100mg pva-co-pe纳米纤维膜(乙烯醇和乙烯链段为1:1交替共聚，纤维平均直径150nm，pva-co-pe纳米纤维膜的pva链段的质量含量为70％；pva链段与荧光检测分子的摩尔比为1：0.6)，剪切成1*1cm大小，投到活化后的溶液中，摇床中45℃条件下震荡4h。然后取出震荡后的pva-co-pe纳米纤维膜用丙酮冲洗3次，烘干得到接枝后的荧光纳米纤维膜(荧光传感器)。
48.配制h2o2的pbs缓冲溶液，h2o2的浓度为10μmol/l。
49.将荧光纳米纤维膜在h2o2的pbs缓冲溶液中浸渍1min，然后取出。
50.如图3所示，可以看出，未接枝的纤维膜(a)和接枝的纤维膜(b)在紫外光照射下，颜色略有不同。接枝的纤维膜在h2o2的pbs缓冲溶液中浸渍后(c)，在365nm的紫外光照射下，显示为荧光绿，可见接枝的荧光分子能够快速与过氧化氢反应产生颜色变化。
51.如图4所示，即使未采用紫外光照射，浸渍前后也能肉眼观察到颜色变化，因此本发明能够实现可视化的定性检测。
52.如图5所示，为紫外光照射下荧光发射强度随荧光纳米纤维膜在h2o2的pbs缓冲溶液中的浸渍时间的变化曲线。可以看出，纤维膜表面在550nm左右的初始荧光发射强度为15左右，浸渍3分钟时，荧光发射强度就迅速增至2000左右，可见荧光分子与过氧化氢的反应速率快，短时间内就能产生较强的荧光发射强度变化。
53.实施例2-6
54.一种用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，pva链段的质量含量以及pva链段与荧光检测分子的摩尔比如表1所示，其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。
55.表1实施例1-5的制备条件和测试数据
[0056][0057]
表中最短响应时间为：将纤维膜浸渍到10μmol/l的h2o2的pbs缓冲溶液中，荧光发射强度达到500的时间。
[0058]
从表1可以看出，在荧光检测分子接枝量一定时，随着pva链段含量的增加，荧光传感器的接触角有所减小，即亲水性增加，使得纤维膜表面的浸润性提高，能够快速捕捉水溶液中的荧光检测分子，从而使得最短响应时间显著缩短，但pva链段含量过多，会影响纤维的纺丝性能，因此实际使用时需要根据综合性能要求，选择合适的含量。在pva链段含量一定时，随着荧光检测分子接枝量的增加，荧光传感器的接触角有所增大，但响应时间先减小后增大，当pva链段与荧光检测分子的摩尔比为1:0.6时，响应速率最优。这是因为荧光检测
分子接枝量增加，虽然能够提高反应位点数，但由于荧光检测分子为疏水性分子，过多的接枝量会导致纤维膜表面亲水性变差，因此不易快速捕捉溶液中的过氧化氢分子，使得响应速率减慢。而荧光检测分子接枝量过少时，反应位点减少，也使得响应速率减慢。由此可见，本发明通过将硼酸酯类荧光分子接枝到pv-co-pe纳米纤维膜上，实现了绿色无污染且快速的固体膜检测，无需配制检测分子的有机溶液，使用便捷。
[0059]
对比例1
[0060]
一种用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，将6-氨基己酸替换为氨基乙酸。其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。
[0061]
对比例2
[0062]
一种用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，将6-氨基己酸替换为8-氨基辛酸。其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。
[0063]
对比例3
[0064]
一种用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，乙烯醇和乙烯链段为嵌段共聚。其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。
[0065]
表2对比例1-3的测试数据
[0066]
对比例水接触触角(
°
)最短响应时间(min)177.10.6282.40.8379.00.7
[0067]
从表2可以看出，当选用其他种类的氨基乙酸时，效果均不如本发明，可见在本发明构造的改性纤维膜基础上，氨基乙酸的结构对纤维膜表面性能及荧光检测分子的反应性均有重要影响。本发明的h2o2纳米纤维荧光传感器，相对于其他荧光检测，具有亲水性好，响应时间短的优点。
[0068]
综上所述，本发明提供的用于过氧化氢荧光检测的纳米纤维膜的制备方法，将羧基化的硼酸酯类荧光分子通过酰胺化反应接枝到pv-co-pe纳米纤维膜上，得到用于检测h2o2含量的荧光传感器，具有检测速率快、灵敏度高和可视化的优点。相比常规的采用荧光分子溶液检测过氧化氢的方法，能够将荧光分子定点接枝于纤维膜表面，使得检测位点更集中，荧光分子的检测有效使用率更高，而荧光分子在溶液中分散性较大，因此有效使用率和响应速率均不如本发明。此外，纤维膜的比表面积高，亲水性好，便于快速浸润和捕获溶液中的过氧化氢分子，从而提高响应速率。
[0069]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。