一种白术多糖-纳米氧化锌复合物及其制备方法和用途

1.本发明属于药物制备及免疫技术领域，涉及一种白术多糖-纳米氧化锌复合物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.白术(atractylodes macrocephala koidz)隶属于菊科草本植物。白术作为一种药食同源的植物，具有补气养血、健脾、止汗等作用。其活性成分包括黄酮类化合物、白术精油、白术内酯、氨基酸、白术多糖等。其中最受关注的是多糖类的药用价值，多糖是地球可再生的天然有机物，具有广泛的应用前景。目前已有研究证明白术多糖(amp)有明显的降血糖、抗氧化以及调节肠道菌群等作用。但是多糖在体内代谢速度快，因此存在生物利用度低，用药量大等问题。
3.锌是机体必需的微量元素之一，对细胞内环境稳定至关重要，也是调节细胞信号转导过程数量的信号分子。锌影响免疫系统的多个方面，并且可以在机体通过汗液，尿液和粪便等途径排泄，从而降低机体内的蓄积。氧化锌(zno)是一种安全的金属氧化物，是美国食品和药物管理局(fda)批准作为食品和药物添加剂。氧化锌纳米粒子(znonps)广泛应用于各种领域，可作为药物载体、医疗材料和营养补充剂的填充。但是氧化锌纳米颗粒表面能极大，易团聚且生物相容性差。


技术实现要素：

4.针对多糖生物利用度低、氧化锌相容性差和易团聚的问题，通过对氧化锌纳米颗粒进行氨基化修饰，并和白术多糖中的醛基发生反应，成功构建白术多糖-纳米氧化锌，实现白术多糖和纳米氧化锌协同应用并显著增强免疫作用。
5.氧化锌纳米颗粒表面能极大，易团聚且生物相容性差，因此要对其进行表面改性。在本技术中，同时利用kh550中的硅氧负离子和氨基，对znonps改性，并和白术多糖中的醛基发生反应，成功制备amp-znonps。
6.巨噬细胞作为机体重要的免疫细胞类型之一，可通过直接吞噬病原菌或呈递抗原等途径参与到天然免疫反应和特异性免疫反应中。鉴于巨噬细胞在机体免疫系统中的重要地位，本研究以raw264.7为靶细胞，通过评估no，il-6和il-1β因子的含量，吞噬能力，测定amp-znonps对raw264.7细胞的免疫调节作用。
7.技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
8.第一方面，提供一种白术多糖-纳米氧化锌复合物amp-znonps的制备方法，
9.包括：
10.步骤(1)、采用硅烷偶联剂kh550对纳米氧化锌znonps进行改性得到氨基化修饰的改性纳米氧化锌kh550-znonps，其中硅烷偶联剂kh550、kh550-znonps的结构式分别为：
[0011][0012]
步骤(2)、kh550-znonps上的氨基和白术多糖amp上的醛基发生还原胺化反应生成白术多糖-纳米氧化锌复合物amp-znonps，其中白术多糖amp、amp-znonps的结构式为：
[0013][0014]
其中，n为正整数。
[0015]
在一些实施例中，所述步骤(1)包括：在醇和水存在下，硅烷偶联剂kh550发生硅烷水解反应生成硅醇，再与纳米氧化锌znonps反应，得到氨基化修饰的改性纳米氧化锌kh550-znonps；
[0016]
所述步骤(2)包括：在还原剂存在下，kh550-znonps上的氨基和白术多糖amp上的醛基发生还原胺化反应生成amp-znonps。
[0017]
在一些进一步的实施例中，所述步骤(1)包括：在醇和水的混合液中，加入硅烷偶联剂kh550进行水解，ph调至6.5-7.0，进行硅醇反应，生成硅氧负离子；加热至60～90℃(优选为80℃)加入纳米氧化锌znonps搅拌反应，离心、冷冻干燥后，得到kh550-znonps；
[0018]
所述步骤(2)包括：将所述kh550-znonps溶于水中，加入白术多糖amp和还原剂，还原胺化反应生成amp-znonps。
[0019]
在一些实施例中，所述步骤(1)中，纳米氧化锌znonps的粒径为20～40nm。
[0020]
在一些实施例中，所述步骤(1)中，所述醇优选为乙醇。
[0021]
在一些实施例中，所述步骤(2)中，所述还原剂选自硼氢化钠、氰基硼氢化钠中的一种或几种。更优选为硼氢化钠。
[0022]
在一些实施例中，所述步骤(2)中，反应液ph调至5.5-6.5。
[0023]
第二方面，提供一种白术多糖-纳米氧化锌复合物，由上述的制备方法制备得到。
[0024]
在一些实施例中，白术多糖-纳米氧化锌复合物的粒径范围为1400-1420nm。
[0025]
第三方面，提供所述的白术多糖-纳米氧化锌复合物在制备免疫佐剂或免疫增强剂中的用途。
[0026]
有益效果：本发明提供的白术多糖-纳米氧化锌复合物amp-znonps，采用kh550的氨基和硅氧负离子，成功将znonps连接至amp的表面，与znonps组合amp组相比，稳定性更好。amp-znonps可显著提高巨噬细胞分泌no，il-6和il-1β因子的含量，增强其吞噬能力，具有作为免疫佐剂的潜力，为新型食品安全级动物免疫佐剂或免疫增强剂的研发奠定了基础。
[0027]
本发明的创新点：1.利用我国中药多糖资源丰富的特色，结合当前国际生物技术领域中的前沿热点—纳米生物技术，从而发挥交叉学科的优势。2.首次通过对氧化锌纳米颗粒进行氨基化修饰，并连接白术多糖，实现白术多糖和纳米氧化锌协同应用并显著增强免疫作用，拟联合发挥两者的优势，并通过实验验证了具有1 1大于2的协调效果。
附图说明
[0028]
图1本发明实施例znonps和amp-znonps扫描电镜结果；
[0029]
图2本发明实施例znonps，kh550-znonps和amp-znonps透射电镜结果；
[0030]
图3本发明实施例amp-znonps(a),amp(b),kh550-znonps(c)和znonps(d)的傅里叶红外光谱结果；
[0031]
图4本发明实施例znonps，kh550-znonps和amp-znonps粒径结果；
[0032]
图5本发明实施例amp-znonps对raw264.7细胞活性的影响；
[0033]
图6本发明实施例amp-znonps对raw264.7 no含量释放的影响；
[0034]
图7本发明实施例amp-znonps对raw264.7吞噬能力的影响；
[0035]
图8本发明实施例amp-znonps对raw264.7 il-6和il-1βmrna表达水平的影响。
具体实施方式
[0036]
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0037]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0038]
出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有陈述，否则所有表达量、百分数
或比例的数字及本说明书和所附权利要求书中所用的其它数值被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。此外，本文公开的所有范围都包括端点在内且可独立组合。
[0039]
在一些实施例中，amp-znonps的合成机理如下反应包括：
[0040][0041]
本发明实施例中纳米氧化锌znonps来源商品化氧化锌(麦克林，粒径30
±
10nm，纯度99.9％)。
[0042]
实施例1
[0043]
白术多糖-纳米氧化锌复合物amp-znonps的制备方法，包括：
[0044]
步骤(1)、采用kh550硅烷偶联剂改性znonps：取4ml硅烷偶联剂kh550，将其加入200ml无水乙醇和200ml水的混合液中进行水解，超声10min，搅拌20min，用0.2m的hcl调节ph值为6.5-7.0左右，进行硅醇反应，生成硅氧负离子；在80℃的搅拌器上加入4.5g纳米氧化锌znonps，超声波30min，搅拌30min，离心3次，冷冻干燥后，得到改性纳米氧化锌kh550-znonps；
[0045]
步骤(2)、称取10mg kh550-znonps溶于20ml水中，超声1h后，加入10mg白术多糖amp和1mg nabh4，用0.2m的hcl调节ph值为5.5-6.5左右，搅拌24h，即得amp-znonps。
[0046]
实施例2
[0047]
扫描电镜和透射电镜结果分析
[0048]
znonps和amp-znonps扫描电镜结果和透射电镜结果见图1和图2。100倍电镜下，znonps呈杆状，成团聚集在一起。30倍电镜时，amp大部分呈球状，表面粗糙，有裂缝，结构较松散。znonps修饰amp之后，可以发现，amp表面的裂缝充满了znonps。30倍透射电镜下观察znonps是呈团聚集，而amp修饰后，明显其周围布满了znonps。初步证明amp成功修饰znonps。
[0049]
实施例3
[0050]
傅里叶红外光谱结果分析
[0051]
znonps和amp-znonps傅里叶红外光谱结果见图3。znonps在571.1cm-1
处有特征峰，是锌和氧的结合键。用kh550改性znonps后，特征峰不受影响，在2910cm-1
处有吸收峰，是c-h的伸缩运动，在1582.6cm-1
处，出现氨基峰，说明kh550改性成功。amp-znonps在3600-3200cm-1
处有一较宽的吸收峰为o-h的伸缩振动，在2932.0cm-1
处有吸收峰，是c-h的伸缩运动，在1411.2cm-1
处为羟基的伸缩振动，在1200-1000cm-1
的吸收峰为吡喃环结构的伸缩振动峰，这些是多糖的特征峰，氨基峰和氧化锌的特征峰发生蓝移，分别在1629.8cm-1
和
551.1cm-1
出现。说明kh550-znonps的氨基和amp的羟基发生反应，从而使znonps成功修饰amp。
[0052]
实施例4
[0053]
粒径分析和zeta电位分析
[0054]
分别把znonps、kh550-znonps和amp-znonps溶于水，采用malvern粒度分析仪测定znonps、kh550-znonps和amp-znonps的平均粒径，粒径分析结果见表1和图4：
[0055]
表1 znonps，kh550-znonps和amp-znonps粒径和zeta电位结果
[0056][0057]
znonps改性后，粒径从1040.33
±
0.58nm降低至553.23
±
6.64，znonps易团聚的现象得到改善，kh550-znonps连接amp之后，粒径增加至1412.33
±
5.77nm，表明znonps成功连接amp的表面。多分散指数(pdi)的变化不明显，表明amp-znonps稳定性好。zeta电位是溶液中颗粒之间相互排斥或吸引力强度的度量值，也是表征悬浮液体系分散稳定性的一个重要参数，易受溶液的ph值和离子浓度的影响。znonps改性后，电位从-33.2
±
1.11增加至-10.97
±
0.32，原因可能是kh550中的氨基在水中呈正电荷，因此增加了电位。kh550-znonps连接amp之后，zeta电位绝对值升高，说明amp-znonps相对稳定。kh550-znonps连接amp之后，多糖中的羟基被去除，kh550的氨基连接多糖上碳端，正电荷减少，故而zeta电位轻微降低。
[0058]
实施例5
[0059]
amp-znonps对raw264.7细胞活性的影响
[0060]
如图5所示，相比空白组以及amp组，amp-znonps浓度在0.12-3.91μg/ml之间时，对raw264.7细胞没有毒性，且可以显著促进细胞增殖(p《0.05)。当浓度高于3.91μg/ml时，amp-znonps开始抑制细胞增长。综上，amp-znonps选取0.49μg/ml、0.98μg/ml和1.95μg/ml为后期实验浓度。
[0061]
实施例6
[0062]
amp-znonps对raw264.7 no含量释放的影响
[0063]
nano2标准品在0-100μg/ml的范围内与od值成正比关系，r2值大于0.99，说明此曲线可用。回归方程为y＝54.454x-1.5645(r2＝0.9973)。
[0064]
no是一种寿命较短的气态自由基，具有较强的杀伤力，可导致肿瘤细胞的凋亡，增强巨噬细胞的裂解和吞噬作用，no是一把双刃剑，含量过多时，也会导致组织损伤。由图6可知，相比空白组、znonps组以及amp组，amp-znonps组和lps组的raw264.7 no释放量显著升高(p《0.05)，znonps组无明显变化。表明amp-znonps组可增强巨噬细胞的免疫作用。
[0065]
实施例7
[0066]
amp-znonps对raw264.7吞噬能力的影响
[0067]
巨噬细胞的激活反映了先天免疫反应的上调，而巨噬细胞激活的显着特征是吞噬作用增强。如图7所示，流式细胞术结果表明，与空白组、znonps组以及amp组相比，amp-znonps组能显著促进细胞吞噬作用(p《0.05)，且吞噬作用与浓度呈反比，而lps组吞噬细胞阳性率高达93.1％左右，显著增强了细胞的吞噬作用(p《0.05)。与znonps组和amp组相比，amp-znonps组能显著促进细胞吞噬作用(p《0.05)。说明amp-znonps可以上调先天免疫反应，增强机体免疫力。
[0068]
实施例8
[0069]
amp-znonps对raw264.7 il-6和il-1βmrna表达水平的影响
[0070]
当宿主受到外源病原体的威胁时，巨噬细胞可以通过il-1β和il-6等细胞因子激活t细胞、nk细胞等其它免疫效应细胞发挥免疫功能。如图8所示，qrt-pcr结果表明，相比空白组、znonps组以及amp组，amp-znonps和lps组可显著增加il-1β和il-6的表达水平(p《0.05)，znonps组变化不显著，与znonps组和amp组相比，amp-znonps和lps组可显著增加il-1β和il-6的表达水平(p《0.05)。说明amp-znonps能对巨噬细胞产生免疫调节作用，从而使机体的免疫功能有效地增强，且不会引起机体过度炎症。
[0071]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。