SmMYB76基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用

smmyb76基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用
技术领域
1.本发明涉及smmyb76基因，通过crispr/cas9技术手段敲除smmyb76基因可以提高丹参中酚酸的含量，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.丹参(salvia miltiorrhizabunge)是一种唇形科多年生草本植物，作为一种传统中药在我国沿用已久。在《神农本草经》、《本草经疏》和《本草纲目》中亦有丹参药效记载。丹参目前被广泛应用于治疗心脑血管疾病、月经不调及各种炎症等，也因此被纳入《中华人民共和国药典》。目前市场上以丹参为原料生产的剂型包括注射剂、冲剂、糖浆剂、片剂等，其中包含复方丹参片、复方丹参滴丸、丹参注射液、丹参酮胶囊、冠心丹参片、丹参保心茶、丹参红花茶等上百种中成药。
3.丹参中主要药效成分包含脂溶性的丹参酮类化合物及水溶性的酚酸类化合物。其中水溶性成分主要包含咖啡酸、迷迭香酸以及丹酚酸a，b，c等。由于丹参植株生长周期长，丹参中丹酚酸含量较低，化学合成成本高等问题而导致市场上丹酚酸供不应求的现状日益明显。如何提高丹参中丹酚酸产量已成为近些年的研究热点。
4.诱导剂处理丹参是提高丹参中药效产物的有效策略。研究表明茉莉酸(ja)及其衍生物茉莉酸甲酯(meja)处理丹参毛状根，可显著促进丹参药效成分积累尤其是丹酚酸的积累。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服常规技术中的不足，提供了一条smmyb76基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用。
6.本发明综合应用酵母双杂交筛选，载体构建、遗传转化、分子检测、qrt-pcr分析、靶点探究、化合物的提取及含量测定等手段，以ja信号途径的抑制因子smjaz9为诱饵，筛选到一条与smjaz9互作的转录抑制因子smmyb76。其全长为696bp，基因序列如seq id no.1所示。
7.进一步地，设计sgrna序列，构建smmyb76基因的crispr/cas9表达载体；通过遗传转化丹参外植体获得成功敲除smmyb76基因的毛状根系；使用qrt-pcr分析转基因丹参毛状根中smmyb76以及丹酚酸生物合成途径中的相关基因的表达；高效液相色谱法(hplc)测定转基因丹参毛状根中丹酚酸的含量，发现敲除株系总酚酸含量最高可达50.68mg/g dw，是对照组的2.32倍。利用基因工程手段研究smmyb76在丹酚酸生物合成中的调控作用，为丹酚酸代谢工程提供了重要的转录因子基因，为深入了解丹酚酸合成与调控提供了科学支持，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
8.其中，在丹参中敲除smmyb76基因步骤如下：
9.(1)将根据smmyb76基因设计好的sgrna序列构建于含有crispr/cas9表达框的中间载体上；
[0010][0011]
(2)将含有sgrna序列的crispr/cas9表达框构建到植物表达载体上获得敲除载体；
[0012]
(3)将步骤(2)所得的敲除载体转入到发根农杆菌中；
[0013]
(4)利用步骤(3)所转化的发根农杆菌菌株遗传转化丹参外植体，最后经过利用pcr鉴定
[0014]
及测序确定敲除成功株系。
[0015]
进一步地，所述sgrna序列是根据g-19base-ngg原则在smmyb76基因第一外显子区设计的sgrna序列，其基因序列如seq id no.22所示。
[0016]
进一步地，所述步骤(1)中，所述含有crispr/cas9表达框的中间载体为18t-crispr/cas9，18t-crispr/cas9上包含有ecori，hindiii酶切位点。
[0017]
进一步地，所述步骤(2)中，植物表达载体为pcambia1300；限制性内切酶ecori，hindiii对pcambia1300载体进行双酶切获得线性载体片段，将含有sgrna序列的crispr/cas9表达框插入，其中含有sgrna序列的crispr/cas9表达框由atu6启动子驱动表达。
[0018]
进一步地，所述步骤(3)中，发根农杆菌菌株为c58c1。
[0019]
进一步地，所述步骤(4)具体为：
[0020]
(4.1)预培养：剪切下丹参无菌苗的叶片以及茎制备成带伤口的外植体，平铺于1/2ms固体培养基上，黑暗放置培养2天；
[0021]
共培养：将预培养2天的外植体与步骤(3)获得的发根农杆菌共同混合进行侵染10分钟，之后吸干表面菌液，置于1/2ms固体培养基继续黑暗培养2天；
[0022]
降抗：将共培养的外植体放在含有羧苄青霉素的1/2ms固体培养基上，每隔15天降一次抗生素浓度，直至无抗；
[0023]
单克隆毛状根分离：将不同的单克隆毛状根系分别剪下置于单独的1/2ms固体培养基上进行培养；
[0024]
继代培养：将单克隆剪下一部分用于继代培养；
[0025]
(4.2)敲除成功株系鉴定：在smmyb76基因中的sgrna序列位置上下游150bp位置设计特异性引物，以提取到的单克隆毛状根基因组dna为模板进行扩增，所扩增产物进行测序从而鉴定敲除成功的株系。
[0026]
进一步地，采用茉莉酸甲酯处理所述丹参，在丹参中降低或抑制smmyb76基因表达。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0028]
1、显著提高丹参毛状根中酚酸的含量。
[0029]
2、深度解析smmyb76在生物合成丹酚酸的调控机制，为深入了解丹酚酸合成与调控提供了科学支持，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。。
[0030]
3、发明方法效果可靠。
[0031]
4、获取丹酚酸的成本低。
附图说明
[0032]
图1是利用酵母双杂交筛选到与smjaz9互作的转录抑制因子smmyb76，并多种实验
id no.4～7)将其构建到酵母双杂交载体上形成pgadt7-smmyb76和pgbkt7-smjaz9重组载体用于后续酵母双杂交实验。同时，利用引物(seq id no.8～9)在pxy106-nyfp载体上形成pxy106-smmyb76-nyfp，以及利用引物(seq id no.10～11)在pxy104-cyfp形成pxy104-smjaz9-nyfp用于bifc实验。采用的引物序列如下表所示。
[0049][0050][0051]
2.2.smmyb76可与smjaz9蛋白互作
[0052]
为了验证smmyb76是否与smjaz9蛋白互作，首先将质粒pgadt7-smmyb76和pgbkt7-smjaz9共转入酵母菌株ah109中，将转化后的酵母置于筛选培养基上(sd/-trp/-leu/-his/-ade)进行筛选如图1a所示，只有共同转入质粒pgadt7-smmyb76和pgbkt7-smjaz9的酵母可以在四缺筛选培养基上生长，而阴性对照组没有发现酵母生长痕迹，结果表明smmyb76可以与smjaz9互作。同时，还使用了pulldown实验对smmyb76和smjaz9互作情况进行了验证，实验结果显示只有在smmyb76蛋白和smjaz9蛋白混合的实验组才能被检测到条带，而smmyb76和对照蛋白gst混合的组无法检测到蛋白条带，表明smmyb76在体外能与smjaz9互作(图1b)。此外，还利用bifc验证上述结果，将含有pxy106-nyfp-smmyb76和pxy104-smjaz9-cyfp载体的农杆菌混合共同转化生长良好的烟草叶片，将混合菌液注射进烟草，黑暗培养24小时，再光照培养24小时。利用打孔器取1cm直径的烟草叶片于载玻片上，背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固定叶片(避免产生气泡)，于激光共聚焦显微镜下观察，发现只有nyfp-smmyb76和smjaz9-cyfp共同存在的情况下，黄色荧光信号才能检测倒，这些结果表明在smmyb76可分别与smjaz9蛋白在体内互作(图1c)。
[0053]
实施例3丹参smmby76基因的作用靶点
[0054]
3.1.双荧光素酶报告实验(dual-luc)
[0055]
为了确定smmyb76的直接调控靶点，扩增参与酚酸生物合成途径关键酶基因启动子，并构建到pgreen0800载体上获得pgreen0800-promotor载体作为报告子(图4a)，转入农杆菌gv3101(含psoup19)中。构建phb-smmyb76-yfp载体(引物为：phb-myb76-yfp-f、phb-myb76-yfp-r)作为效应子(图4a)，转入农杆菌gv3101。用渗透液悬浮菌体，两种菌液之间按照1:1等体积混合，并且注射烟草进行dual-luc实验。dual-luc实验检测表明smmyb76在转录水平上可抑制smpal1，sm4cl2以及smras1(图4b)。
[0056]
primerssequence(5
’‑3’
)phb-myb76-yfp-f(seq id no.12)ctctctctcaagcttggatccatgggaaggtctccttgctphb-myb76-yfp-r(seq id no.13)gcccttgctcaccatactagttttcatctccaatcttctgtaatc
[0057]
3.2.酵母单杂交实验
[0058]
如图2所示，系统进化树结果表明smmyb76与拟南芥s4 myb亚家族成员同源性较
高，且多重序列比对发现myb76含有s4亚家族的ear保守结构域。研究报道发现s4亚家族为转录抑制因子家族，并且该亚家族的myb成员可结合启动子区域的mbs元件。通过plantcare分析，发现了存在于smpal1，sm4cl2以及smras1启动子区域上的mbs元件(图4c所示)。将3个重复的mbs构建到placz载体上(引物分别为：pal1-mbs-f、pal1-mbs-r、4cl2-mbs-f、4cl2-mbs-r、ras1-mbs-f、ras1-mbs-r)，将smmyb76构建到pb42ad载体(引物为：pb42ad-myb76-f、pb42ad-myb76-r)，进行酵母单杂交实验。结果表明，smmyb76可结合丹酚酸合成通路中的关键酶基因smpal1，sm4cl2以及smras1启动子区域的中的mbs元件(图4d)，说明smpal1，sm4cl2以及smras1是smmyb76的直接调控靶点。
[0059]
primerssequence(5
’‑3’
)pb42ad-myb76-f(seq id no.14)gattatgcctctcccgaattcatgggaaggtctccttgctgtpb42ad-myb76-r(seq id no.15)agtccaaagctttccctcgagtcatttcatctccaatcttctgtaatcpal1-mbs-f(seq id no.16)aattcccaccaaccaccgcccaccaaccaccgcccaccaaccaccgccpal1-mbs-r(seq id no.17)tcgaggcggtggttggtgggcggtggttggtgggcggtggttggtggg4cl2-mbs-f(seq id no.18)aattctcaccaaccacacttcaccaaccacacttcaccaaccacactc4cl2-mbs-r(seq id no.19)tcgagagtgtggttggtgaagtgtggttggtgaagtgtggttggtgagras1-mbs-r(seq id no.20)aattcgtaacaaccaaggtgtaacaaccaaggtgtaacaaccaaggtcras1-mbs-r(seq id no.21)tcgagaccttggttgttacaccttggttgttacaccttggttgttacg
[0060]
实施例4丹参smmyb76生物信息学分析，亚细胞定位
[0061]
4.1.丹参smmyb76基因生物信息学分析
[0062]
利用smmyb76氨基酸序列和拟南芥所有r2r3的myb转录因子氨基酸序列进行比对如图2a所示，发现smmyb76和atmyb4被分在s4家族，这说明smmyb76和拟南芥的atmyb4同源关系最近，多重序列比对结果发现smmyb76和atmyb4结构相似，拥有一个r2r3保守结构域，一个ear保守结构域以及一个sid结构域(图2b)。
[0063]
4.2.smmyb76亚细胞定位分析
[0064]
将3.1中含有phb-smmyb76-yfp质粒的gv3101菌株扩大培养，将空载体phb-yfp转入gv3101中作为对照。无菌注射器吸取渗透液悬浮的工程菌株注射生长状态良好的烟草叶片，注射完毕后，黑暗培养1天，再光照培养1天。取直径1cm的烟草叶片于载玻片上，背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固定叶片(避免产生气泡)，于激光共聚焦显微镜下观察。结果表明smmyb76蛋白定位在细胞核中(图2c)，这与其作为转录因子的功能是一致的。
[0065]
实施例5 smmyb76基因表达模式分析
[0066]
5.1组织表达分析
[0067]
取实验基地中生长2年的丹参成熟植株的茎，嫩叶，成熟叶，主根，侧根，韧皮部和木质部组织进行rna提取，使用天根植物总rna提取试剂盒进行提取。提取的rna配合天根cdna第一链合成试剂盒转化成cdna，并进行qrt-pcr对smmyb76基因表达进行检测，引物为：myb76-qf(seq id no.26)和myb76-qr(seq id no.27)。实验结果显示smmyb76在主根中的相对表达量是最高的，其次是在茎中(图3a)。
[0068]
5.2诱导表达分析
[0069]
使用100μm的茉莉酸甲酯(meja)对c58c1农杆菌侵染发出的毛状根进行处理，每隔一段时间取20mg毛状根进行rna提取，取材时间分别为处理后0h，1h，2h，4h，6h，8h，12h和
24h。提取的rna配合天根cdna第一链合成试剂盒转化成cdna，并进行qrt-pcr对smmyb76基因表达进行检测，引物为：myb76-qf(seq id no.26)和myb76-qr(seq id no.27)。实验结果表明，通过meja处理以后，smmyb76的表达量有明显减少，从1h开始减少，到6h的时候降低到最低点，这个结果说明smmyb76表达受到meja负调控(图3b)。
[0070]
实施例6丹参smmyb76基因敲除毛状根系的获得
[0071]
6.1.crispr/cas9载体构建
[0072]
如图5a所示，依据g-19base-ngg原则在smmyb76基因第一外显子区域寻找sgrna序列(seq id no.14)，设计引物(myb76sgrna-f、myb76sgrna-r)将sgrna整合至含有crispr/cas9表达框的中间载体18t-crispr/cas9上。用限制性内切酶ecori和hindiii进行酶切，将sgrna-crispr/cas9片段整合到pcambia1300载体，构建好的pcambia1300-smmyb76sgrna-crispr/cas9质粒；其中sgrna-crispr/cas9表达盒由拟南芥u6启动子驱动表达。
[0073]
primerssequence(5
’‑3’
)myb76sgrna-f(seq id no.22)gattggaagaagacgatcggctggmyb76sgrna-r(seq id no.23)aaacccagtcgatcgtcttcttcc
[0074]
6.2.侵染丹参外植体获得毛状根
[0075]
将构建好的pcambia1300-smmyb76sgrna-crispr/cas9质粒转化发根农杆菌c58c1，挑取单克隆菌落进行pcr验证。将剪下的丹参无菌苗外植体平铺于1/2ms固体培养基上暗培养2天。之后用含有pcambia1300-smmyb76sgrna-crispr/cas9质粒的c58c1农杆菌侵染预培养的丹参外植体，无菌纸吸干表面菌液，再次放置在1/2ms固体培养基上暗处共培养2天。将共培养的外植体转到含有羧苄抗生素(300mg/ml)的1/2ms固体培养基上，两周后转到含有头孢抗生素(500mg/ml)的1/2ms固体培养基上，之后每隔两周降低头孢的浓度(300mg/ml，100mg/ml，0mg/ml)，直至不溢菌，并转移到1/2ms固体培养基。分离毛状根单克隆(图5d)用于阳性鉴定。
[0076]
6.3.敲除成功株系的鉴定
[0077]
采用ctab法提取6.2中得到的转基因毛状根基因组dna，具体操作流程参看ctab操作说明书。在sgrna靶标上下游设计特异性引物sgrna-鉴定f、sgrna-鉴定r，可扩增300bp左右的片段，以dna为模板扩增，将pcr产物送公司测序，分析峰图确定是否成功敲除。
[0078]
提取毛状根rna，并用试剂盒进行反转录得到cdna，用于后期的定量实验。在本实施例中，共获得60个毛状根系，用sgrna靶标上下游特异性引物(myb76-qf、myb76-qr)扩增后进行pcr测序，其含有不同方式的突变。根据qrt-pcr结果，发现smmyb76的表达有不同程度的变化，选择表达下降较明显4个的株系，编号分别为10，74，83，和92(图5e)进行下一步研究，图5b-c是4个株系的测序峰图及突变位点图。
[0079]
primerssequence(5
’‑3’
)sgrna-鉴定f(seq id no.24)aagtactccatgaagggccgsgrna-鉴定r(seq id no.25)ttgatctcgttgtccgtccgmyb76-qf(seq id no.26)ctggatcaactacctccgccmyb76-qr(seq id no.27)gcgtagtgggatcaatgcct
[0080]
实施例7 smmyb76影响关键酶基因的表达
[0081]
7.1.毛状根培养
[0082]
将挑选的3个crispr/cas9株系及对照株系扩大培养，在摇床中25℃黑暗培养60天收根。取20mg新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包装好进入液氮中冷冻后保存于-80℃用于rna提取，其余毛状根烘干后用于丹酚酸含量的提取。
[0083]
7.2.rna的提取及cdna第一链的合成
[0084]
抽提总rna，并分别进行纯度和浓度检测。然后反转录成cdna，用于定量pcr分析。
[0085]
7.3.定量pcr引物设计及合成
[0086]
根据丹酚酸生物合成途径关键酶基因smpal1、smtat1、smc4h、sm4cl1、sm4cl2、smhppr、smras1、smcyp98a14的编码序列设计其定量引物，由上海生工生物工程公司合成。序列如下：
[0087][0088][0089]
7.4.转基因丹参毛状根的定量pcr检测
[0090]
以相同量的上述反转录得到的cdna为模板稀释10倍，分别用上述设计的引物对稀释后的模板进行定量pcr扩增。定量pcr反应体系用tiangen公司提供的superrealpremix(sybr green)试剂盒，smactin基因用来作为内参。qrt-pcr结果(图6)显示：crispr/cas9株系中，大部分参与酚酸生物合成的关键酶基因均有不同程度上调，其中smpal1，sm4cl2上升最显著。
[0091]
实施例8 hplc法测定丹参毛状根中酚酸含量
[0092]
精密称取迷迭香酸(ra)、丹酚酸b(sab)以及咖啡酸(ca)标准品用色谱级甲醇分别配置成1mg/ml的标准品贮备液，保存于-20℃备用。
[0093]
丹酚酸提取：将收获的毛状根于烘箱中烘干至恒重，研磨成粉末，称取0.1g毛状根粉末于50ml离心管中，加入10ml混合溶液(乙醇：水(v/v)＝4：1)，超声30min，8000rpm，离心10min，取上清液于旋转蒸发仪中65℃真空干燥，蒸干后的残余物重新用2ml的双蒸水溶解，将样品用0.45μm的水相滤膜过滤后待测。
[0094]
色谱条件：色谱柱为c-18反相硅胶柱，流动相为乙腈：酸水(体积比30：70)，酸水为
含有0.03％的三氟乙酸的水，检测波长281nm，柱温30℃，流速1ml/min。
[0095]
将上述标准品贮备液配制不同浓度，在相应色谱条件下进样，不同的酚酸成分完全分离，且峰型良好，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(y)对标准品浓度(x，mg/ml)进行分析得到不同酚酸的标准曲线。上述0.45μm滤膜过滤后的丹酚酸粗提物各取100μl，用高效液相色谱仪检测，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品水溶性成分的含量。
[0096]
如图7所示，本发明中crispr/cas9株系所产的丹酚酸含量相对于对照明显上调，最高可达50.68mg/g dw(干重)，为对照组的2.32倍。
[0097]
本发明采用敲除smmyb76基因的代谢工程策略获得了高产丹酚酸的丹参转基因毛状根根系，为商业化大量生产丹酚酸提供了可能，也为满足市场对丹酚酸需求提供了新策略。
[0098]
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用该发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。