一种针对副猪嗜血杆菌的新型疫苗的制作方法

一种针对副猪嗜血杆菌的新型疫苗
1.发明的一般领域
2.本发明一般涉及针对病原菌副猪嗜血杆菌(haemohilus parasuis)的感染对猪的治疗。特别地，本发明涉及用于预防性治疗猪以针对该细菌的感染的新型疫苗，其中疫苗诱导针对最普遍的副猪嗜血杆菌血清型的保护。
3.发明背景
4.副猪嗜血杆菌是影响猪的最重要的细菌之一。由该病原体引起的疾病的特征在于多发性浆膜炎，并且其被称为格拉瑟氏病(disease)。副猪嗜血杆菌存在于所有主要的养猪国家中，并且仍然是当代猪生产系统中的重要病原体。除了引起疾病之外，副猪嗜血杆菌通常从健康猪的上呼吸道分离。已知存在不同的副猪嗜血杆菌血清型，这些中的每一种都可以使用免疫扩散技术得到鉴定(kielstein et al.in j.clin.microbiol.30:862-865；1992和rapp-gabrielson et al.in ajvr 53:659-664；1992)。通过各种类型的疫苗已经实现了导致死亡率降低的成功疫苗接种。
5.如今广泛使用灭活副猪嗜血杆菌(即菌苗)疫苗。所有市售的副猪嗜血杆菌疫苗都是灭活疫苗。大多数目前可获得的商业疫苗是通过繁殖毒性副猪嗜血杆菌菌株，然后将该菌株灭活而产生的。通过高速离心使细菌培养物沉淀，并再悬浮于无菌磷酸盐缓冲盐水中，随后用合适的佐剂一起配制，所述佐剂例如矿物油、氢氧化铝、卡波姆、皂苷、维生素e乙酸酯、角鲨烯、角鲨烯等。除了单价疫苗之外，还有二价、三价或四价副猪嗜血杆菌疫苗，其包括各种血清型。它们通常提供低水平的交叉保护，并且它们对同源血清型更有效。这些灭活疫苗，例如porcilis(msd，boxmeer，荷兰)在控制格拉瑟氏病全世界爆发中起重要作用。
6.稳定减毒的副猪嗜血杆菌菌株在理论上可以用作安全有效的疫苗。然而，减毒的副猪嗜血杆菌疫苗的开发受到限制，因为缺乏关于副猪嗜血杆菌的主要毒力因子的知识，这使得难以产生可用作潜在疫苗的副猪嗜血杆菌突变体。迄今为止，还没有基因工程化的活减毒或灭活副猪嗜血杆菌疫苗候选物。
7.已经研究了几种亚单位疫苗，但现有数据表明一些亚单位疫苗诱导高水平的抗副猪嗜血杆菌中和抗体，并且针对副猪嗜血杆菌攻击保护猪。然而，目前还没有市售的预防和控制格拉瑟氏病的亚单位疫苗。最近(huisheng liu et al,in veterinary immunology and immunopathology，第180卷，2016年11月1日，第53-58页)已经证明了包含新鉴定的保护性抗原的亚单位疫苗提供针对副猪嗜血杆菌攻击的部分保护，所述保护性抗原例如重组转铁蛋白结合蛋白b(tbpb)，富含tbpb、omp2和omp5的外膜蛋白(omp)制剂，转铁蛋白结合蛋白a(tbpa)，三聚体自转运蛋白(vtaa)，六种分泌蛋白(pfla，gcp，ndk，hsds，rnfc和haps_0017)，三种甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)，oapa和hps-0675融合蛋白，各种替代性omp(smpa、ygiw和fog)，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，细胞致死膨胀毒素亚基a、b和c，以及神经氨酸酶或脂蛋白。
8.迄今为止，dna疫苗也已经显示能够且提供针对副猪嗜血杆菌的一些部分保护。该疫苗包含编码副猪嗜血杆菌gapdh的dna。
9.然而，尽管疫苗可商购获得，但是抗微生物剂仍广泛用于治疗副猪嗜血杆菌感染，这主要是由于许多现有疫苗的功效不完全，特别是考虑到不同血清型同时存在于各种猪群中。在感染副猪嗜血杆菌的早期接受抗微生物剂的猪通常能够在全身性感染中存活。然而，减少用于生长猪的抗微生物剂的量存在许多压力。
10.发明目的
11.一个目的是提供一种预防性治疗猪以针对副猪嗜血杆菌的感染的替代性疫苗，该疫苗优选提供至少与常规菌苗疫苗同样好的保护，特别是针对副猪嗜血杆菌的两种最普遍的血清型，即血清型4和5。
12.发明概述
13.为了实现本发明的目的，发现与根据seq id no:1的蛋白具有至少69％序列同一性的蛋白或该蛋白的免疫原性片段可用于预防性方法中，以通过向猪施用疫苗来针对副猪嗜血杆菌血清型4的感染和副猪嗜血杆菌血清型5的感染保护猪，所述疫苗包含所述蛋白或其免疫原性片段作为抗原。
14.该蛋白或其免疫原性片段可用于治疗猪以针对副猪嗜血杆菌的感染的事实是基于以下令人惊讶的发现：天然蛋白，一种推定的丝氨酸蛋白酶，其在各种副猪嗜血杆菌血清型(包括毒性血清型4、5、12、13和15)中是保守的，在副猪嗜血杆菌的感染中起关键作用。这可以得到确定是因为用(部分)天然存在蛋白的疫苗接种导致针对致病性副猪嗜血杆菌的非常好的保护，其水平甚至优于常规和成熟的菌苗疫苗可以达到的保护。这表明该丝氨酸蛋白酶在细菌的致病性中起关键作用，并且中和该蛋白的功能有助于减少感染，包括由其导致的临床疾病。在这方面，本发明人的优点在于认识到这种丝氨酸蛋白酶在副猪嗜血杆菌的致病性中起关键作用。一旦认识到这一点，随后诱导针对该蛋白的抗体将有效地作为针对副猪嗜血杆菌的感染的治疗。其次，据发现这些抗体也可以提供异源保护，这可能是由于在各种血清型之间，特别是在最普遍的血清型4和5之间该蛋白的高水平保守性引起的。
15.诱导这样的抗体的最直接的方式是施用类似于野生型蛋白的蛋白或多肽。对于蛋白本身，在各种血清型中，相对于具有根据seq id no:1的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白在其全长上的天然变异为约69％。因此，使用满足该同一性水平的蛋白可用于达到针对天然产生相应蛋白的不同血清型的各种野生型副猪嗜血杆菌菌株的保护。
16.尽管为了找到本发明的要点，将根据(完整)seq id no:1的蛋白用作抗原以诱导针对天然蛋白的抗体，但是通常已知当需要针对某种(天然存在的)蛋白产生抗体时，通常不必使用完整蛋白。还可以使用该蛋白的免疫原性片段，其本身或与载体(例如klh)偶联能够诱导针对相应蛋白的免疫应答。这对于本发明的丝氨酸蛋白酶尤其如此。首先，根据seq id no:1的蛋白已经仅是天然存在的蛋白的一部分，其包括自转运蛋白β桶。其次，尽管其在副猪嗜血杆菌的致病性中的功能仍然未知，但是发现该蛋白与人mac-1蛋白同源。这可以经由所谓的cobalt比对来建立：一种多重序列比对工具，其使用rps-blast、blastp和phi-blast发现源自保守结构域数据库、蛋白质基序数据库和序列相似性的成对约束集合，其中然后将成对约束并入渐进性多重比对中(参见papadopoulos js and agarwala r,bioinformatics 23:1073-79,2007；pmid:17332019)。这通过在ncbi数据库中搜索“嗜血杆菌”细菌中的“mac-1家族”蛋白得到证实，这证实了在副猪嗜血杆菌中存在具有mac-1结构域同源物的蛋白。已知mac-1蛋白本身与猪病原菌猪链球菌(streptococus suis)的igm蛋
白酶同源，如wo 2015/181356(idt biologika gmbh)中所述。如wo 2015/181356中所教导的，针对全长蛋白或仅包含高度保守的mac-1结构域的片段的疫苗能够诱导针对全长天然存在的蛋白的抗体，从而提供针对相应细菌的保护。尽管副猪嗜血杆菌与猪链球菌完全无关，但是两种细菌都产生具有mac-1结构域同源物的蛋白的事实(已知其具有免疫球蛋白肽酶活性)(参见european molecular biology institute的pfam数据库，如wo 2015/181356中所证实)，结合疾病在临床上相似的事实(它们均导致多发性浆膜炎，通常仅对仔猪致病，并且均由如断奶和运输的应激诱导)，表明在副猪嗜血杆菌中，与在猪链球菌中相似，相应的天然蛋白质参与免疫逃避。此外，事实上在两种病原菌中，mac-1结构域在血清型之间是高度保守的，但对于其余的，副猪嗜血杆菌和猪链球菌蛋白是完全不相关的(包括mac-1结构域在内的整个蛋白的同一性水平低至13％)结合事实上在副猪嗜血杆菌血清型3、4、5、9、12、13和15之间，mac-1结构域的同一性甚至是100％(然而，对于蛋白的其余部分，这低得多，低至69％)，甚至有证据表明mac-1结构域含有主要免疫原性表位，因此其本身能够诱导中和包含该所谓的mac-1结构域的天然存在的丝氨酸蛋白酶的抗体。优选地，所述片段包含副猪嗜血杆菌的天然存在的mac-1结构域，即根据seq id no:2的序列。然而，如通常已知的，10-20％、甚至高达30％的序列同一性的小变化仍然可以用作有效抗原，并且能够诱导中和抗体。这些变异可以反映在整个序列中的氨基酸差异或通过所述序列中氨基酸的缺失、取代、插入、倒位或添加。基本上不改变生物学和免疫学活性的氨基酸取代已经由例如neurath等人在“the proteins”academic press new york(1979)中描述。相关氨基酸之间的氨基酸置换或在进化中频繁发生的置换尤其是ser/ala、ser/gly、asp/gly、asp/asn、ile/val(参见dayhof，m.d.，atlas of protein sequence and structure，nat.biomed.res.found.，washington d.c.，1978，第5卷，增刊3)。其他氨基酸取代包括asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、thr/phe、ala/pro、lys/arg、leu/ile、leu/val和ala/glu。基于该信息，lipman和pearson开发了一种快速和灵敏的蛋白比较方法(science 227，1435-1441，1985)并确定同源蛋白之间的功能相似性。本发明的示例性实施方案的这样的氨基酸取代以及具有缺失和/或插入的变化都在本发明的范围内。因此，用于本发明的片段应包含与根据seq id no:2的多肽至少70％同一性的多肽，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
17.总而言之，发现在疫苗中使用根据本发明的蛋白，能够诱导针对天然存在的血清型4和5的副猪嗜血杆菌丝氨酸蛋白酶的抗体。这意味着仅使用一种血清型的一种抗原能够治疗这些血清型的副猪嗜血杆菌的(疫苗接种后)感染，所述抗原可以是血清型5的抗原或血清型4的抗原。其次，基于与人mac-1蛋白和产生包含mac-1结构域的igm蛋白酶的猪链球菌的同源性，应当理解，当用作疫苗中的抗原时，包含(至少)本发明的丝氨酸蛋白酶的mac-1结构域(任选地与免疫原性载体例如klh偶联)的多肽足以诱导针对天然存在的蛋白的抗体。
18.本发明还体现在针对副猪嗜血杆菌血清型4的感染和副猪嗜血杆菌血清型5的感染保护猪的疫苗，所述疫苗包含与根据seq id no:1的蛋白具有至少69％序列同一性的蛋白或该蛋白的免疫原性片段，和可药用载体。
19.本发明还涉及与根据seq id no:1的蛋白具有至少69％序列同一性的蛋白或该蛋白的免疫原性片段作为抗原在制备疫苗中的用途，所述疫苗用于针对副猪嗜血杆菌血清型
4的感染和副猪嗜血杆菌血清型5的感染保护猪。
20.其次，本发明还涉及一种通过向猪施用疫苗来针对副猪嗜血杆菌血清型4的感染和副猪嗜血杆菌血清型5的感染保护猪的方法，所述疫苗包含作为抗原的与根据seq id no:1的蛋白具有至少69％序列同一性的蛋白或该蛋白的免疫原性片段。
21.定义
22.抗原是来源于微生物的抗原性物质，尽管抗原最终是人工产生的。抗原引发并介导针对相应的天然存在的化合物(通常为蛋白)起作用的抗体的形成。细菌、病毒、原生动物和其他微生物是抗原的重要来源。这些可以是例如来源于细胞外表面(荚膜抗原)、来源于细胞内部(体细胞或o抗原)、来源于鞭毛(鞭毛或h抗原)或来源于分泌产物(包括例如酶和毒素)的蛋白或多糖。
23.疫苗是适合应用于动物的构建物，其包含免疫有效量的一种或多种抗原，即能够刺激靶动物的免疫系统足以诱导针对抗原并由此针对相应的天然存在的蛋白的免疫应答，例如抗体，通常与可药用载体(即，生物相容性介质，即，在施用后不会在受试动物中诱导显著不良反应，在施用疫苗后能够将抗原呈递给宿主动物的免疫系统的介质)例如含水液体和/或任何其他生物相容性溶剂或固体载体(例如通常用于获得冷冻干燥疫苗(基于糖和/或蛋白)组合，任选地包含免疫刺激剂(佐剂)，其在施用于动物后诱导能够针对(疫苗接种后)感染保护动物的免疫应答。
24.预防性方法是设计为通过在感染实际发生之前起作用来针对感染或相应疾病进行保护的方法，通常通过在预期受试动物被感染之前用疫苗治疗受试动物。
25.针对副猪嗜血杆菌的感染保护猪指帮助预防、缓解或治愈副猪嗜血杆菌的致病性感染，或者帮助预防、缓解或治愈由该感染引起的病症，例如预防或减少由副猪嗜血杆菌的感染引起的一种或多种临床体征。
26.免疫原性片段是仍然保留其在宿主中诱导免疫应答的能力的蛋白片段，即包含b细胞或t细胞表位。通常多种技术可用于容易地鉴定免疫原性片段(决定簇)，特别是蛋白的免疫原性片段。geysen等人描述的方法(专利申请wo 84/03564、专利申请wo 86/06487、美国专利nr.4,833,092,proc.natl acad.sci.81:3998-4002(1984),j.imm.meth.102,259-274(1987)，所谓的pepscan方法是一种用于检测蛋白的免疫原性表位的容易进行、快速且成熟的方法。该方法在全世界使用，因而是本领域技术人员熟知的。该(经验)方法特别适合于检测b细胞表位。此外，编码任何蛋白的基因的给定序列，计算机算法能够基于其与现在已知的表位的顺序和/或结构一致性将特定蛋白片段指定为免疫学重要的表位。这些区域的确定是基于根据hopp和wood(proc.natl.acad.sci.78:38248-3828(1981))的亲水性标准和根据chou和fasman(advances in enzymology 47：45-148(1987)和美国专利4,554,101)的二级结构方面。同样可以通过计算机借助于berzofsky的两亲性标准(science 235,105 9-1062(1987)和美国专利申请ntis us 07/005,885)从序列预测t细胞表位。简要概述见于：shan lu on common principles：tibtech 9∶238-242(1991)，good et al on malaria epitopes；science 235：1059-1062(1987)，lu for a review；vaccine 10：3-7(1992)，berzofsky for hiv epitopes；the faseb journal 5:2412-2418(1991)。众所周知，为了具有免疫原性，肽需要具有最小长度；对于mhc i受体结合是8-11aa，对于mhc ii受体结合是11-15aa(综述于例如r.n.germain&d.h.margulies，1993，annu.rev.immunol.，第
11卷，第403-450页：the biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation)。
27.两个多肽(或核酸)之间的序列同一性指多肽(或核酸)的重叠区域中相同氨基酸(或核苷酸)的百分比，如使用具有默认参数的blastp算法用blast程序确定的(参见tatiana a.tatusova,thomas l.madden fems microbiol.letters 174:247-250；1999)。
28.本发明的其他实施方案
29.在进一步的实施方案中，所述蛋白与根据seq id no:1的蛋白具有至少90％的序列同一性，甚至与根据seq id no:1的蛋白具有至少95％的序列同一性，至多100％的序列同一性。
30.在另一个实施方案中，所述蛋白或免疫原性片段用于针对由于感染副猪嗜血杆菌血清型4和/或血清型5引起的死亡风险增加保护猪的方法中。
31.在仍然另一个实施方案中，所述蛋白或免疫原性片段用于针对由于副猪嗜血杆菌血清型4和/或血清型5的感染引起的一种或多种临床体征保护猪的方法中。
32.现在将使用以下具体实施例进一步说明本发明。
实施例
33.实施例1
34.目的
35.该比对实验的目的是发现丝氨酸蛋白酶在各种血清型的各种副猪嗜血杆菌菌株之间的序列同一性水平，以及鉴定丝氨酸蛋白酶中的mac-1结构域。
36.结果
37.在下表中，显示了对于其他副猪嗜血杆菌菌株中的相应丝氨酸蛋白酶，相对于seq id no:1的序列同一性。在常见血清型的各种菌株中，同一性水平显示至少为69％。对于已知的高致病性和最普遍的血清型4、5、12和13的组内的菌株，同一性水平甚至为90％或更高。
38.在上述之后，鉴定了副猪嗜血杆菌的mac-1结构域，并在此公开为seq id no:2。根据seq id no:1的蛋白来源于副猪嗜血杆菌血清型5，菌株sh0165(genbank no acl32961.1)的推定的细胞外丝氨酸蛋白酶，其具有780个氨基酸的长度。当去除自转运蛋白结构域(aa为521至780)并进行hmmr鉴定(参见www.hmmer.org；robert finn et al in nucleic acids research,2011jul 1；39,web server issue,w29
–
w37)时，指示mac-1家族结构域在aa 130处开始并在aa 221处结束。
39.表1对于各种副猪嗜血杆菌菌株，与seq id no:1的序列同一性
40.菌株开始结束％同一性血清型3-菌株sw1149169血清型4-菌株gx0147190血清型4-菌株hps152397血清型5-菌株297152399血清型5-菌株nag152398血清型5-菌株sh0152399
血清型9-菌株d74172770血清型12-菌株zj152398血清型13-菌株mn150395血清型15-菌株84152399
41.当比较副猪嗜血杆菌的mac-1结构域与猪链球菌的mac-1结构域时，只有17％的同一性(使用blastp)，这表明只有结构域的一小部分对于抗体结合和/或蛋白酶活性是必需的。其次，这表明尽管mac-1结构域在各种副猪嗜血杆菌血清型中以100％同一性存在(如上所述，尽管在其他菌株或血清型中同一性水平较低)，但是天然存在的蛋白的变化可能诱导针对天然蛋白的有效抗体，至少变化在70％同一性水平内或更高。
42.实施例2
43.目的
44.本研究的目的是在同种同血清型5攻击模型中测试亚单位疫苗与常规菌苗疫苗相比，针对副猪嗜血杆菌的效力。所述亚单位疫苗包含根据seq id no:1的多肽，其中相应的dna克隆自副猪嗜血杆菌血清型5，菌株sh0165(genbank no.acl32961.1)，在大肠杆菌表达载体系统(pet22b，具有pelb信号序列和his标签)中表达。该菌苗疫苗含有血清型5的副猪嗜血杆菌的灭活细胞。
45.研究设计
46.对于该研究，使用三十只4周龄的健康仔猪。将仔猪分成三组(均匀分布在不同窝中)，每组10只仔猪。第1组在4周和6周龄时两次肌内疫苗接种含有悬浮在水包油佐剂中的75μg/ml的亚单位的2ml疫苗。第2组两次肌内疫苗接种包含悬浮在水包油佐剂中的灭活细胞的菌苗疫苗，并且第3组未疫苗接种，作为攻击对照。在8周龄时，用副猪嗜血杆菌血清型5的毒性培养物气管内攻击猪。
47.在攻击后10天期间，每天观察猪的副猪嗜血杆菌感染的临床体征，例如抑郁、运动问题和/或神经体征，并使用标准评分系统进行评分。就在每次疫苗接种和攻击之前，收集血清血液用于抗体测定。在攻击之前和之后的定期时间，收集肝素血液用于重新分离攻击菌株。对在尸体解剖预定日之前剔除的所有动物以及所有存活的动物进行尸体解剖。
48.结果
49.在攻击之前，没有观察到异常，并且没有发生并发死亡。以天计的平均存活时间、平均临床得分、在研究结束之前需要处以安乐死的动物数量以及血液再分离结果在下文表2中示出。
50.表2疫苗接种-攻击研究的结果
51.组平均存活时间(天)平均临床得分#处以安乐死#血培养阳性亚单位7.727.13/103/10菌苗4.947.46/103/10对照2.071.09/106/10
52.结论
53.结果表明，重组亚单位疫苗诱导针对副猪嗜血杆菌攻击的非常好的保护。诱导的保护作用优于菌苗疫苗诱导的保护作用。
54.实施例3
55.目的
56.本研究的目的是在异种血清型4攻击模型中测试亚单位疫苗与常规菌苗疫苗相比针对副猪嗜血杆菌的效力。使用的疫苗是与实施例2中所述相同的疫苗。
57.研究设计
58.对于该研究，使用三十只3周龄的健康仔猪。将仔猪分成三组(均匀分布在不同窝中)，每组10只仔猪。第1组在3周和6周龄时两次肌内疫苗接种含有悬浮在水包油佐剂中的75μg/ml的亚单位的2ml疫苗。第2组两次肌内疫苗接种包含悬浮在水包油佐剂中的灭活细胞的菌苗疫苗，并且第3组未疫苗接种，作为攻击对照。在8周龄时，用副猪嗜血杆菌血清型4毒性培养物气管内攻击猪。
59.在攻击后10天期间，每天观察猪的副猪嗜血杆菌感染的临床体征，例如抑郁、运动问题和/或神经体征，并使用标准评分系统进行评分。就在每次疫苗接种和攻击之前，收集血清血液用于抗体测定。在攻击之前和之后的常规时间，收集肝素血液用于重新分离攻击菌株。对在尸体解剖预定日之前剔除的所有动物以及所有存活的动物进行尸体解剖。
60.结果
61.在攻击之前，没有观察到异常，并且没有发生并发死亡。以天计的平均存活时间、平均临床得分、在研究结束之前需要处以安乐死的动物数量以及血液再分离结果在下文表3中示出。
62.表3疫苗接种-攻击研究的结果
[0063][0064][0065]
结论
[0066]
结果表明，重组亚单位疫苗诱导针对副猪嗜血杆菌异源攻击的非常好的保护，因此已经显示了针对该亚单位抗原的血清型4和5之间的交叉保护。诱导的保护与菌苗疫苗诱导的保护同样好。