一种表达靶向NR4A1抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用的制作方法

一种表达靶向nr4a1抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达靶向nr4a1抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用。


背景技术：

2.nr4a1是核受体nr4a家族中的重要一员，其可通过对靶细胞基因转录的调节，参与细胞的增殖、凋亡调控，在肿瘤发生、血管重塑以及类固醇合成等重要生命活动过程中发挥重要作用，其功能受到磷酸化、蛋白质相互作用等多种途径的调控。nr4a1在耐受性t细胞中稳定性高表达，nr4a1的过表达可以抑制效应细胞的功能，而当缺失nr4a1基因后后，t细胞的耐受状态可以得到纠正，并增强了对抗肿瘤和慢性病毒感染的能力。在机制上，nr4a1能被招募结合于转录因子ap-1的结合位点从而通过抑制ap-1的功能抑制效应性基因的表达。nr4a1的结合也能够促进h3k27ac的乙酰化，从而导致耐受基因的表达。在癌症治疗中，其功能活性可通过敲低或过表达在癌细胞系进行相关应用，且结果已表明nr4a1在肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌和胃癌细胞系中，能调节癌细胞增殖、存活、细胞周期进程、迁移和侵袭，具有作为肿瘤免疫治疗的靶点的潜力。
3.外泌体是指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。目前已经尝试用外泌体携带sirna、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。
4.另一方面，在细胞治疗领域，同种异体的免疫兼容问题依然是一大难题。近年已有许多报道通过敲除b2m、ciita等基因，实现hla-i和hla-ii细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸t/b细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型pscs，为更广泛的通用型pscs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达ctla4-ig、pd-l1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除b2m、ciita的同时，敲入cd47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸nk等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种多能干细胞或其衍生物；
6.本发明的另一目的在于提供上述多能干细胞或其衍生物及其分泌的外泌体在制备抗肿瘤治疗制剂或药物中的应用。
7.本发明的另一目的在于提供一种外泌体。
8.本发明所采取的技术方案是：
9.本发明的第一个方面，提供：
10.一种多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有nr4a1抑制因子的表达序列；该nr4a1抑制因子为靶向nr4a1的shrna和/或shrna-mir中的至少一种。
11.发明人发现，在多能干细胞或其衍生物中导入nr4a1抑制因子的shrna/shrna-mir表达序列后，多能干细胞或其衍生物中分泌的外泌体中包含高丰度的靶向nr4a1的nr4a1抑制因子的shrna/shmirna以及加工成熟的sirna，外泌体携带这些抑制因子与靶细胞结合，然后将其释放，从而阻断nr4a1通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复t细胞活性，其能够有效清除肿瘤细胞。
12.进一步地，所述靶向nr4a1的shrna和/或shrna-mir的序列如seq id no.1～seq id no.10所示。
13.本发明的第二个方面，提供：
14.一种多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有nr4a1抑制因子的表达序列；该nr4a1抑制因子为靶向nr4a1的shrna和shrna-mir中的至少一种。
15.上述多能干细胞或其衍生物基因组的b2m基因和/或ciita基因被敲除。
16.当b2m和ciita基因被敲除后，其完全消除hla-i和hla-ii类分子产生的影响，因此，其肿瘤治疗效果最佳。
17.本发明的第三个方面，提供：
18.一种多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有nr4a1抑制因子的表达序列；该nr4a1抑制因子为靶向nr4a1的shrna和shrna-mir中的至少一种。
19.上述多能干细胞或其衍生物的基因组中导入有第一核酸分子；且，上述多能干细胞或其衍生物中的免疫应答相关基因的3’utr区域导入有第二核酸分子；上述第一核酸分子编码介导rna干扰的小核酸分子，上述小核酸分子特异性靶向第二核酸分子的转录产物，且上述小核酸分子不靶向所述多能干细胞或其衍生物的任何其他的mrna或lncrna。
20.本技术方案中，所述第一核酸分子编码的小核酸分子能够与免疫应答相关基因3’utr区域导入的第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动rna干扰程序，将免疫应答相关基因的mrna降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达，进而使得此类细胞具有免疫兼容的特性，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答反应。而且，该rna干扰程序只作用于此类被改造过的多能干细胞或其衍生物，因此，当此类细胞或衍生物被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与免疫应答相关基因的3’utr处导入的第二核酸分子所介导的免疫应答相关基因的rna干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。
21.进一步地，上述小核酸分子包括短干扰核酸、短干扰rna、双链rna，优选为mirna、shrna、shrna-mir中的至少一种。
22.进一步地，上述多能干细胞或其衍生物来源于人类；上述小核酸分子的序列为不靶向人类任何mrna或lncrna的非人类物种的随机序列。
23.上述小核酸分子优选来源于秀丽隐杆线虫。例如：
[0024]5’‑
ttgtactacacaaaagtactg-3’(seq id no.102)
[0025]5’‑
tcacaacctcctagaaagagtaga-3’(seq id no.103)。
[0026]
进一步地，上述第二核酸分子包括至少3个重复的小核酸分子序列的反向互补序列，优选为6～10个重复的小核酸分子序列的反向互补序列。
[0027]
进一步地，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有诱导型基因表达系统，用于调控第一核酸分子的表达。
[0028]
本技术方案中，诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，从而控制小核酸分子的表达量。
[0029]
当诱导型基因表达系统开启时，正常表达的小核酸分子和免疫应答相关基因3’utr区域导入的第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动rna干扰程序，将免疫应答相关基因的mrna降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达。因此，此类细胞或衍生物被移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。
[0030]
当移植物发生病变后，可以通过添加外源诱导物来关闭诱导型基因表达系统，进而关闭小核酸分子的表达，中止小分子核酸对免疫应答相关基因mrna的干扰作用，恢复免疫应答相关基因的正常表达，进而恢复移植物细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的移植物，从而提高了这类多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。
[0031]
而且，该rna干扰程序只作用于此类被改造过的多能干细胞或其衍生物，因此，当此类细胞或衍生物被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与免疫应答相关基因的3’utr处导入的第二核酸分子所介导的免疫应答相关基因的rna干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。
[0032]
本发明的第四个方面，提供：
[0033]
一种多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有nr4a1抑制因子的表达序列；该nr4a1抑制因子为靶向nr4a1的shrna和shrna-mir中的至少一种。
[0034]
上述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，上述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。
[0035]
本技术方案中，免疫兼容分子可以调控多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，将其移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。移植物可以在受体内源源不断地表达靶向nr4a1的shrna/shrna-mir，这些抑制因子被外泌体包裹后，外泌体携带其与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断nr4a1通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复t细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。
[0036]
进一步地，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子的表达。
[0037]
本技术方案中，诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，进一步控制免疫兼容分子表达序列的表达量，从而实现多能干细胞或其衍生物免疫兼容的可逆性调控。当
免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，从而使得进行同种异体细胞治疗时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高供体细胞与受体之间的免疫兼容能力。而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆地使供体细胞表面重新表达hlaⅰ类分子，恢复供体细胞的抗原提呈能力，进而受体免疫系统通过识别不匹配的hlaⅰ类分子或通过交叉hlaⅰ类分子抗原提呈(经典非兼容hla之间的抗原提呈/识别)突变的分子，使受体能够清除病变的细胞，从而提高了这类通用型多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。
[0038]
关于本发明的第三个和第四个方面，进一步地，所述与免疫应答相关的基因包括：
[0039]
(1)主要组织相容性复合体基因，包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-dra、hla-drb1、hla-drb3、hla-drb4、hla-drb5、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dpa1和hla-dpb1中的至少一种；
[0040]
(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括b2m和ciita中的至少一种。
[0041]
关于本发明的第四个方面，进一步地，所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：
[0042]
(1)免疫耐受相关基因，包括cd47和hla-g中的至少一种；
[0043]
(2)hla-c类分子，包括人群中比例合计超过90％的hla-c复等位基因，或者超过90％的hla-c复等位基因与b2m构成的融合蛋白基因；
[0044]
(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shrna和/或shrna-mir，该主要组织相容性复合体基因包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-dra、hla-drb1、hla-drb3、hla-drb4、hla-drb5、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dpa1和hla-dpb1中的至少一种；
[0045]
(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shrna和/或shrna-mir，该主要组织相容性复合体相关基因包括b2m和ciita中的至少一种。
[0046]
更进一步地，上述靶向b2m的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.10～seq id no.12中的一种；
[0047]
靶向ciita的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.13～seq id no.15中的一种；
[0048]
靶向hla-a的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.16～seq id no.18中的一种；
[0049]
靶向hla-b的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.19～seq id no.21中的一种；
[0050]
靶向hla-c的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.22～seq id no.24中的一种；
[0051]
靶向hla-dra的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.25～seq id no.27中的一种；
[0052]
靶向hla-drb1的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.28～seq id no.30中的一种；
[0053]
靶向hla-drb3的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.31～seq id no.32中的一种；
[0054]
靶向hla-drb4的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.33～seq id no.35中的一种；
[0055]
靶向hla-drb5的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.36～seq id no.38中的一种；
[0056]
靶向hla-dqa1的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.39～seq id no.41中的一种；
[0057]
靶向hla-dqb1的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.42～seq id no.44中的一种；
[0058]
靶向hla-dpa1的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.45～seq id no.47中的一种；
[0059]
靶向hla-dpb1的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.48～seq id no.51中的一种。
[0060]
关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shrna和/或mirna加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子，其中：shrna和/或mirna加工复合体相关基因包括drosha、ago1、ago2、dicer1、exportin-5、trbp(tarbp2)、pact(prkra)、dgcr8中的至少一种；上述抗干扰素效应分子为靶向pkr、2-5as、irf-3和irf-7中的至少一种的shrna和/或shrna-mir。
[0061]
更进一步地，上述靶向pkr的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.51～seq id no.53中的一种；
[0062]
靶向2-5as的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.54～seq id no.62中的一种；
[0063]
靶向irf-3的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.63～seq id no.65中的一种；
[0064]
靶向irf-7的shrna和/或shrna-mir的靶序列选自seq id no.66～seq id no.68中的一种。
[0065]
关于本发明的第三个和第四个方面，所述诱导型基因表达系统包括tet-off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。
[0066]
当采用的诱导型基因表达系统为tet-off系统时，可通过添加外源诱导物四环素(doxycycline，dox)来控制细胞或其衍生物中小核酸分子的表达。当所述的多能干细胞或其衍生物被移植到供体中后，甚至可以通过调整dox的添加量，来逐步降低小核酸分子的表达量，使得细胞能够逐步地表达低浓度的免疫相关基因来刺激供体，从而使得供体对移植的细胞或其衍生物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。通常情况下，dox的添加量为0-100um。
[0067]
关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，上述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入外泌体加工合成基因，所述外泌体加工合成基因包括steap3、syndevan-4、l-天冬氨酸氧化酶片段、cd63-l7ae和cx43 s368a中的至少一种。
[0068]
在干细胞或其衍生物的基因组中导入外泌体加工合成基因可以提高外泌体的分泌效率，及其对shrna、shrna-mir和加工成熟的sirna的包裹效率。
[0069]
二聚体诱导表达系统具体指：运用二聚化的诱导剂或者二聚体在无活性的融合蛋白上重组有活性的转录因子。最常用的体系是将天然产物雷帕霉素(rapamydn)或者无生物活性的类似物作为二聚化的药物。雷帕霉素(或类似物)同胞质蛋白fkbp12(fkbp与fk506结
合的蛋白)和一种大的丝-苏氨酸蛋白激酶，称为frap(frbp-雷帕霉素相关蛋白，即mtor(哺乳动物的雷帕霉素靶点))有高度亲和性，又与这两种蛋白质相结合的功能，因此作为异源性二聚体将这两种蛋白质聚到一起。为调控靶基因转录，将dna结合区域融合到一个或多个fkbp结构域，将转录抑制域融合到frap的93位氨基酸部位，称为frb，这样足以结合fkbp-雷帕霉素复合物。只有在雷帕霉素存在的情况下，这两种融合蛋白才能发生二聚化。因而抑制具有与dna结合区域相结合的位点的基因进行转录。
[0070]
关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述靶向nr4a1的shrna和/或shrna-mir、主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、抗干扰素效应分子的表达框架如下：
[0071]
所述shrna表达框架：自5’到3’依次包括shrna序列、茎环序列、shrna序列的反向互补序列、poly t；
[0072]
其中，所述shrna序列、茎环序列与所述shrna序列的反向互补序列形成发夹结构；poly t为rna聚合酶iii的转录终止子；
[0073]
shrna-mir表达框架：使用shrna-mir序列替换所述shrna表达框架中的shrna靶序列得到。
[0074]
关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述nr4a1抑制因子的表达序列、第一核酸分子、免疫兼容分子的表达序列、shrna和/或mirna加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统、外泌体加工合成基因的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法，所述基因编辑的方法优选为基因敲入。
[0075]
关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述nr4a1抑制因子的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shrna和/或mirna加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统、外泌体加工合成基因的导入位点为基因组安全位点，优选为aavs1安全位点、egsh安全位点、h11安全位点中的一种或多种。
[0076]
关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；
[0077]
所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；
[0078]
所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。
[0079]
本发明的第五个方面，提供：
[0080]
上述多能干细胞或其衍生物及其分泌的外泌体在制备抗肿瘤治疗制剂或药物中的应用。
[0081]
进一步地，上述多能干细胞或其衍生物及其分泌的外泌体在制备nr4a1高表达肿瘤治疗制剂或药物中的应用。
[0082]
本发明的第六个方面，提供：
[0083]
一种外泌体，由上述的多能干细胞或其衍生物分泌得到。
[0084]
本发明的有益效果是：
[0085]
1.本发明第一个方面所提供的多能干细胞或其衍生物，可应用于自体细胞诱导的ipscs或者mscs低免疫源性细胞。其通过在自体细胞诱导的ipscs基因组中导入靶向nr4a1的nr4a1抑制因子的shrna/shrna-mir的表达序列后，ipscs能够大量表达靶向nr4a1的
shrna/shrna-mir，并被细胞分泌的外泌体包裹。外泌体携带这些抑制因子与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断nr4a1通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复t细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。
[0086]
2.本发明第二个方面所提供的多能干细胞或其衍生物，还可以应用于同种异体细胞治疗。由于本发明中的多能干细胞或其衍生物中的b2m、ciita基因被敲除，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，当其被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与第二核酸分子的转录产物所介导的针对免疫应答相关基因的rna干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。移植物可以在受体内源源不断地表达靶向nr4a1的shrna/shrna-mir，这些抑制因子被外泌体包裹后，外泌体携带其与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断nr4a1通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复t细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。
[0087]
3.本发明第三个方面所提供的多能干细胞或其衍生物具有免疫兼容的特性，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答反应。而且，该多能干细胞或其衍生物的rna干扰程序只作用于此类被改造过的多能干细胞或其衍生物。因此，当此类细胞或衍生物被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与第二核酸分子的转录产物所介导的针对免疫应答相关基因的rna干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体细胞的基因组产生干扰。
[0088]
更进一步地，进一步地，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有诱导型基因表达系统，用于调控第一核酸分子的表达，从而实现此类多能干细胞或其衍生物的免疫兼容可逆。
[0089]
4.本发明第四个方面所提供的多能干细胞或其衍生物，其基因组中导入了免疫兼容分子表达序列，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，当其被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与第二核酸分子的转录产物所介导的针对免疫应答相关基因的rna干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。移植物可以在受体内源源不断地表达靶向nr4a1的shrna/shrna-mir，这些抑制因子被外泌体包裹后，外泌体携带其与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断nr4a1通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复t细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞
[0090]
更进一步地，本发明第四个方面所提供的多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入了诱导型基因表达系统，诱导型基因表达系统可以调控免疫兼容分子的表达，而诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，进一步控制免疫兼容分子表达序列的表达量，从而实现多能干细胞或其衍生物免疫兼容的可逆性调控。当诱导型基因表达系统开启时，正常表达的小分子核酸和免疫应答相关基因3’utr区域导入的第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动rna干扰程序，将免疫应答相关基因的mrna降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达。因此，此类细胞或衍生物被移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。当移植物发生病变后，可以通过添加外源诱导物来关闭诱导型基因表达系统，从而停止小核酸分子的表达及小分子核酸对免疫应答相关基因mrna的干扰作用，恢复免疫相关基因的正常表达，进而恢复移植物细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的移植物，从而提高了这类多能干细胞或其衍生物
的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。
[0091]
5.本发明中的多能干细胞或其衍生物还可以通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间，来逐步降低多能干细胞或其衍生物中小核酸分子的表达量，使得供体细胞能够逐步地表达低浓度的免疫相关基因来刺激供体，从而使得供体对移植的细胞或其衍生物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。此时，即使移植物细胞表面表达不匹配的hlaⅰ类分子，也能够被受体免疫系统兼容。
附图说明
[0092]
图1为cas9(d10a)的质粒图谱。
[0093]
图2为sgrna clone aavs1-1的质粒图谱。
[0094]
图3为sgrna clone aavs1-2的质粒图谱。
[0095]
图4为sgrna clone b2m-1的质粒图谱。
[0096]
图5为sgrna clone b2m-2的质粒图谱。
[0097]
图6为sgrna clone b2m-3的质粒图谱。
[0098]
图7为sgrna clone b2m-4的质粒图谱。
[0099]
图8为sgrna clone ciita-1的质粒图谱。
[0100]
图9为sgrna clone ciita-2的质粒图谱。
[0101]
图10为sgrna clone ciita-3的质粒图谱。
[0102]
图11为sgrna clone ciita-4的质粒图谱。
[0103]
图12为aavs1 ki vector(shrna,组成型)的质粒图谱。
[0104]
图13为aavs1 ki vector(shrna,诱导型)的质粒图谱。
[0105]
图14为aavs1 ki vector(shrna-mir,组成型)的质粒图谱。
[0106]
图15为aavs1 ki vector(shrna-mir,诱导型)的质粒图谱。
[0107]
图16为b2m ki vector的质粒图谱。
[0108]
图17为ciita ki vector的质粒图谱。
具体实施方式
[0109]
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
[0110]
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
[0111]
实验材料：
[0112]
1.nr4a1抑制因子的选择
[0113]
nr4a1抑制因子：靶向nr4a1的shrna或shrna-mir。
[0114]
本发明实施例中使用的靶向nr4a1的shrna或shrna-mir序列的靶序列如表1所示。
[0115]
表1靶向nr4a1的shrna或shrna-mir序列的靶序列
[0116][0117]
2.小核酸分子的构建
[0118]
小核酸分子的序列为不靶向人类任何mrna或lncrna的非人类物种的随机序列，优选来源于秀丽隐杆线虫。
[0119]
本实施例所采用的小核酸分子的序列为
[0120]5’‑
ttgtactacacaaaagtactg-3’(seq id no.102)；
[0121]
根据上述小核酸分子设计第一核酸分子和第二核酸分子，分别如下：
[0122]
第一核酸分子(即小核酸分子的shrna表达框架或shrna-mir表达框架)：
[0123]
(1)小核酸分子的shrna表达框架的序列组成为：
[0124]5’‑
ccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctgctagcgccacc(seq id no.4)n1...n
21
ttcaagaga(seq id no.5)n
22
...n
42
tttttt-3’。
[0125]
其中，
[0126]
a)n1...n
21
为上述小核酸分子序列，n
22
...n
42
为上述小核酸分子序列的反向互补序列；
[0127]
b)如果质粒需要表达多个基因的shrna，则每个基因分对应一个shrna表达框架，然后无缝连接起来；
[0128]
c)带不同抗性基因的组成型shrna质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；
[0129]
d)n表示a或t或g或c碱基。
[0130]
(2)小核酸分子的shrna-mir表达框架：将小核酸分子序列替换microrna-30或者microrna-155中的靶序列得到。具体序列如下：
[0131]5’‑
gaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcttcaggttaacccaacagaaggctaaagaaggtatattgctgttgacagtgagcg(seq id no.6)m1n1...n
21
tagtgaagccacagatgta(seq id no.7)n
22
...n
42
m2tgcctactgcctcggacttcaaggggctactttaggagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaat-3’(seq id no.8)。
[0132]
其中，
[0133]
a)n1...n
21
为小核酸分子序列，n
22
...n
42
为小核酸分子序列的反向互补序列；
[0134]
b)如果质粒需要表达多个基因的shrna-mir，则每个基因分对应一个shrna-mir表达框架，然后无缝连接起来；
[0135]
c)带不同抗性基因的组成型shrna-mir质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；
[0136]
d)n表示a或t或g或c碱基，m碱基表示a或c碱基；
[0137]
e)若n1为g碱基，则m1为a碱基；否则m1为c碱基；
[0138]
f)m1碱基与m2碱基互补。
[0139]
第二核酸分子：包括至少3个重复的小核酸分子序列的反向互补序列，优选为6～10个重复的小核酸分子序列的反向互补序列。小核酸分子序列的反向互补序列可通过随机的linker序列连接。
[0140]
作为本发明的一个实施例，所述第二核酸分子由开头10nt的随机序列、及8个重复的小核酸分子序列的反向互补序列通过随机的linker序列(cgta)连接而成：
[0141]5’‑
attctagatacagtacttttgtgtagtacaacgtacagtacttttgtgtagtacaacgtacagtacttttgtgtagtacaacgtacagtacttttgtgtagtacaacgtacagtacttttgtgtagtacaacgtacagtacttttgtgtagtacaacgtacagtacttttgtgtagtacaacgtacagtacttttgtgtagtacaacgta-3’(seq id no.9)。
[0142]
3.免疫兼容分子的选择
[0143]
本发明实施例中使用的免疫兼容分子的种类及序列如表2和表3所示。
[0144]
表2免疫兼容分子的种类及作用
[0145]
[0146][0147]
表3免疫兼容分子的靶序列
[0148]
[0149]
[0150][0151][0152]
下面表8-表9各实验组别的shrna或shrna-mir免疫兼容分子序列均为采用表3中的靶序列1构建得到的shrna或shrna-mir免疫兼容分子。本领域的技术人员可以理解：以其
他靶序列构建得到的shrna或shrna-mir免疫兼容分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。
[0153]
4.shrna/mirna加工复合体基因和抗干扰素效应分子的选择
[0154]
(1)shrna/mirna加工复合体基因的选择
[0155]
本发明中使用的shrna/mirna加工复合体基因包括可诱导关闭表达的shrna和/或mirna加工机器。所述可诱导关闭表达的shrna和/或mirna加工机器具体包括：drosha(accession number:nm_001100412)、ago1(accession number:nm_012199)、ago2(accession number:nm_001164623)、dicer1(accession number:nm_001195573)、exportin-5(accession number:nm_020750)、trbp(accession number:nm_134323)、pact(accession number:nm_003690)和dgcr8(accession number:nm_022720)。
[0156]
(2)抗干扰素效应分子的选择
[0157]
本发明中使用的抗干扰素效应分子包括可诱导关闭表达的针对抑制pkr、2-5as、irf-3和irf-7基因的shrna和/或shrna-mir表达序列，以降低dsrna诱发的干扰素反应，从而避免产生细胞毒性。
[0158]
其中，所述抗干扰素效应分子的靶序列如表4所示。
[0159]
表4抗干扰素效应分子的靶序列
[0160]
eb1培养7天，隔天换液。7天后转移到matrigel包被的培养板中使用biociso培养基进行贴壁培养7天，即可获得具有内、中、外三胚层结构的拟胚体(ebs)。具体构建方法参见：stem cell res ther.2017nov 2；8(1):245。
[0173]
所述多能干细胞衍生物还包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。
[0174]
构建质粒载体
[0175]
本发明实施例中使用的质粒载体包括：cas9(d10a)质粒、sgrna质粒、donor片段。
[0176]
上述质粒中的基因编辑均采用crispr-cas9基因编辑系统，使用的cas 9蛋白为cas 9(d10a)，cas 9(d10a)与sgrna结合，sgrna负责特异识别靶序列(细胞载体的基因组dna)，然后cas 9(d10a)对该靶序列进行单链切割。基因组dna发生双链断裂(dna double strand break,dsb)，必须有两组cas9(d10a)/sgrna分别对细胞载体的基因组dna的两条链进行切割，且切割的距离不能太远。cas 9(d10a)/sgrna方案与cas 9/sgrna方案相比，优点是特异性更高，脱靶的概率更低。
[0177]
其中，所述sgrna的具体序列为：
[0178]
sgrna-aavs1-1：5
’‑
tataaggtggtcccagctcg-3’(seq id no.71)；
[0179]
sgrna-aavs1-2：5
’‑
agggccggttaatgtggctc-3’(seq id no.72)；
[0180]
sgrna-b2m-1：5
’‑
ctcctgttatattctagaac-3’(seq id no.73)；
[0181]
sgrna-b2m-2：5
’‑
tttcagcatcaatgtaccct-3’(seq id no.74)；
[0182]
sgrna-b2m-3：5
’‑
cgcgagcacagctaaggcca-3’(seq id no.75)；
[0183]
sgrna-b2m-4：5
’–
actctctctttctggcctgg-3’(seq id no.76)；
[0184]
sgrna-ciita-1：5
’‑
ggcactcagaagacactgat-3’(seq id no.77)；
[0185]
sgrna-ciita-2：5
’–
aaggtgtctggtcggagagc-3’(seq id no.78)；
[0186]
sgrna-ciita-3：5
’–
acccagcagggcgtggagcc-3’(seq id no.79)；
[0187]
sgrna-ciita-4：5
’–
gtcagagccccaaggtaaaa-3’(seq id no.80)。
[0188]
构建上述质粒载体的具体方法为：
[0189]
(1)cas9(d10a)质粒：直接从addgene(plasmid 41816，addgene)订购获得。
[0190]
(2)sgrna质粒：通过在原始空白质粒(plasmid 41824，addgene)中分别放入不同的靶序列构建得到。
[0191]
其中，放入sgrna质粒中的靶序列包括上述的免疫兼容分子的序列、shrna/mirna加工复合体基因的序列、抗干扰素效应分子的序列、外泌体加工合成基因的序列。
[0192]
(3)donor片段(ki质粒)：
[0193]
a)设计pcr引物，以puc18质粒(takara，code no.3218)为模板，使用高保真酶(南京诺唯赞生物，p505-d1)通过pcr的方法扩增得到amp(r)-puc origin片段；
[0194]
b)提取人细胞的基因组dna并设计对应的引物，然后以人的基因组dna为模板，使用高保真酶通过pcr的方法扩增得到重组臂；
[0195]
c)设计ki(knock-in)质粒元件的pcr扩增引物，然后以含该ki质粒元件的质粒为模板，使用高保真酶扩增得到ki质粒元件(亚克隆)；
[0196]
d)使用多片段重组酶(南京诺唯赞生物，c113-02)或overlap pcr连接上述扩增得到的amp(r)-puc origin片段、重组臂、ki质粒元件，形成一个完整的环状质粒。
[0197]
其中，所述重组臂包括b2m重组臂、ciita重组臂、aavs1重组臂。
[0198]
所述b2m重组臂的序列如b2m-hr-l(seq id no.81)和b2m-hr-r(seq id no.82)所示。
[0199]
所述ciita重组臂的序列如ciita-hr-l(seq id no.83)和ciita-hr-r(seq id no.84)所示。
[0200]
所述aavs1重组臂的序列如aavs1-hr-l(seq id no.85)和aavs1-hr-r(seq id no.86)所示。
[0201]
本发明实施例制备得到的质粒可根据质粒中的表达框架类型分为组成型质粒和诱导型质粒。
[0202]
上述组成型质粒中的表达框架包括shrna组成型表达框架、shrnamir组成型表达框架。酶切上述组成型质粒获取的donor片段，在敲入干细胞载体基因组dna后，该片段的表达功能不可以进行调控。
[0203]
上述诱导型质粒中的表达框架包括shrna诱导型表达框架、shrnamir诱导型表达框架。酶切上述诱导型质粒获取的donor片段，敲入干细胞载体基因组dna后，该片段的表达功能可以通过添加诱导物的方法来调控，相当于对表达功能添加了一个开启或者关闭的开关。
[0204]
上述表达框架的具体序列要求与结构组成如下所示。
[0205]
(1)shrna组成型表达框架的序列组成为：
[0206]5’‑
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgctagcgccacc(seq id no.87)n1...n
21
ttcaagagan
22
...n
42
tttttt-3’；
[0207]
其中，
[0208]
a)n1...n
21
为上述靶序列的shrna靶序列，n
22
...n
42
为上述靶序列的shrna靶序列的反向互补序列；
[0209]
b)当使用上述shrna组成型表达框架构建的质粒需要表达多个基因的shrna时，则每个基因分别对应一个shrna表达框架，然后无缝连接起来；
[0210]
c)当上述shrna组成型表达框架需要带不同抗性基因时，所述shrna组成型表达框架中只有抗性基因序列不同，其它序列均保持一样；
[0211]
d)n表示a或t或g或c碱基。
[0212]
(2)shrnamir组成型表达框架的序列组成为：
[0213]5’‑
gaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcttcaggttaacccaacagaaggctaaagaaggtatattgctgttgacagtgagcgm1n1...n
21
tagtgaagccacagatgtan
22
...n
42
m2tgcctactgcctcggacttcaaggggctactttaggagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaat-3’；
[0214]
其中，
[0215]
g)n1...n
21
为上述靶序列的shrnamir靶序列，n
22
...n
42
为上述靶序列的shrnamir靶序列的反向互补序列；
[0216]
h)当使用上述shrnamir组成型表达框架构建的质粒需要表达多个基因的shrnamir时，则每个基因分别对应一个shrnamir表达框架，然后无缝连接起来；
[0217]
i)当上述shrnamir组成型表达框架需要带不同抗性基因时，所述shrnamir组成型表达框架中只有抗性基因序列不同，其它序列均保持一样；
[0218]
j)n表示a或t或g或c碱基，m碱基表示a或c碱基；
[0219]
k)若n1为g碱基，则m1为a碱基；否则m1为c碱基；
[0220]
l)m1碱基与m2碱基互补。
[0221]
(3)shrna诱导型表达框架的序列组成为：
[0222]5’‑
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggactttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctgctagcgccacc(seq id no.88)n1...n
21
ttcaagagan
22
...n
42
tttttt-3’；
[0223]
其中，
[0224]
e)n1...n
21
为上述对应靶序列的shrna靶序列，n
22
...n
42
为上述对应靶序列的shrna靶序列和/或小核酸分子的反向互补序列；
[0225]
f)当使用上述shrna组成型表达框架构建的质粒需要表达多个基因的shrna时，则每个基因分别对应一个shrna表达框架，然后无缝连接起来；
[0226]
g)当上述shrna组成型表达框架需要带不同抗性基因时，所述shrna组成型表达框架中只有抗性基因序列不同，其它序列均保持一样；
[0227]
h)n表示a或t或g或c碱基。
[0228]
(4)shrnamir诱导型表达框架的序列组成如shrnamir组成型表达框架的序列组成所示。
[0229]
上述方法构建的cas9(d10a)质粒图谱如图1所示，aavs1安全位点的sgrna质粒图谱如图2-3所示，b2m基因的sgrna质粒图谱如图4-7所示，ciita基因的sgrna质粒图谱如图8-11所示，构建的aavs1ki质粒图谱(组成型和诱导型)如图12-15所示，b2m ki质粒图谱如图16所示，ciita ki质粒图谱如图17所示。
[0230]
构建干细胞载体：
[0231]
本发明技术方案中，在上述的干细胞载体的基因组中敲入的安全位点包括aavs1安全位点、egsh安全位点、h11安全位点。
[0232]
aavs1基因敲入的单细胞克隆操作包括以下步骤：
[0233]
a)电转程序：
[0234]
供体细胞准备：人多能干细胞；
[0235]
试剂盒：human stem cellkit 1；
[0236]
仪器：电转仪；
[0237]
培养基：biociso；
[0238]
诱导质粒：上述实施例构建的相应质粒。
[0239]
b)电转后的人多能干细胞进行含g418和puro的双抗生素培养基进行筛选。
[0240]
c)进行单细胞克隆筛选及培养，获得单细胞克隆株。
[0241]
d)将获得的单细胞克隆株进行培养。
[0242]
其中，单细胞克隆株培养试剂包括：
[0243]
培养基为：biociso培养基、300μg/ml g418和0.5μg/ml puro。培养基需提前置于室温，避光条件放置30～60分钟，直至恢复到室温，但不可以置于37℃进行预热，以避免生物分子活性降低。
[0244]
基质胶：hesc级matrigel。传代或复苏细胞前，将matrigel工作液加入细胞培养瓶皿中并摇匀，确保matrigel完全没过培养瓶皿底部，且在使用前任意一处matrigel都不能干掉。为保证细胞能够更好的贴壁和存活，matrigel放入37℃培养箱包被时间：1:100x matrigel不能低于0.5小时；1:200x matrigel不能低于2小时。
[0245]
消化液：使用dpbs溶解edta至终浓度为0.5mm，ph7.4。所述edta不能使用水稀释，否则细胞会因渗透压降低而死亡。
[0246]
冻存液：60％biociso、30％escs级fbs和10％dmso。
[0247]
单细胞克隆株培养步骤采用本领域常规维持传代培养过程。
[0248]
其中，传代最佳时刻为细胞整体汇合度达到80％～90％。
[0249]
传代最佳比例为1:4～1:7，传代后次日最佳汇合度应维持在20％～30％。
[0250]
本发明中的具体传代操作步骤如下：
[0251]
a)弃去包被好的细胞培养瓶皿中的matrigel，加入适量上述培养基放入37℃、5％co2培养箱中孵育；
[0252]
b)待细胞符合上述传代要求，弃去培养基上清，加入适量的0.5mm edta消化液到细胞瓶皿中；
[0253]
c)将细胞放入37℃、5％co2培养箱中孵育5～10分钟(消化至镜下观察到大部分细胞收缩变圆但还未漂浮即可)，吹打细胞使其从壁上脱离，将细胞悬液吸到离心管内，200g离心5分钟；
[0254]
d)离心后，弃去上清，用培养基重悬细胞，反复吹打细胞至混匀，然后将细胞转移至包被有matrigel的瓶皿中，摇匀，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％co2培养箱中进行培养；
[0255]
e)次日观察细胞贴壁存活状态，吸掉培养基，每天按时换液。
[0256]
基因敲入检测方法：
[0257]
1.单细胞克隆aavs1基因敲入检测。
[0258]
(1)aavs1基因敲入检测说明。
[0259]
检测原理：
[0260]
pcr检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的
donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子。
[0261]
检测方法：
[0262]
在donor质粒(ki质粒)内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在细胞的基因组(非重组臂部分)设计另一条引物。如果donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现。
[0263]
其中，上述引物的具体序列及扩增条件如下表所示。
[0264]
表5 aavs1基因敲入检测引物的具体序列及扩增条件
[0265][0266][0267]
(2)b2m和ciita基因敲入检测说明。
[0268]
b2m和ciita基因3’utr处第二核酸分子敲入的检测方法与aavs1的检测原理相同，采用的pcr检测条件如表6和7所示：
[0269]
表6 b2m基因敲入检测引物的具体序列及扩增条件
[0270][0271]
表7 ciita基因敲入检测引物的具体序列及扩增条件
[0272][0273]
利用本领域常规技术将选取的质粒敲入干细胞载体基因组：
[0274]
按照下述表8和表9中的分组，分别将nr4a1抑制因子的序列、免疫兼容分子的序列、shrna/mirna加工复合体基因的序列、抗干扰素效应分子的序列、外泌体加工合成基因采用本领域常规技术敲入到所述干细胞表达载体(干细胞载体)安全位点中，获得不同类型的组成型干细胞表达载体和诱导型干细胞表达载体，以检测其表达可行性。
[0275]
表8组成型敲入表达实验分组
[0276]
[0277][0278]
其中，“ ”号表示基因或核酸序列的敲入，
“‑”
号表示基因敲除。
[0279]
总体原则：靶向抑制因子的shrna(或shrna-mir)放入对应质粒的shrna(或shrna-mir)表达框架2内，其余抑制因子的shrna(或shrna-mir)放入对应质粒的shrna(或shrna-mir)表达框架1内，基因序列放入mcs内。
[0280]
b2m-3’utr-mirna-locus或ciita-3’utr-mirna-locus即第二核酸分子(seq id no.8)，分别敲入b2m和ciita基因的3’utr区域。
[0281]
b2m/ciita-3’utr-shrna为小核酸分子的shrna表达框架，也即第一核酸分子，特异性靶向b2m基因和ciita基因3’utr区域第二核酸分子的转录产物，敲入位点为基因组安全位点aavs1。
[0282]
b2m/ciita-3’utr-shrna-mir为小核酸分子的shrna-mir表达框架，也即第一核酸分子，靶向b2m基因和ciita基因3’utr区域第二核酸分子的转录产物，敲入位点为基因组安全位点aavs1。
[0283]
cd47表示cd47表达序列，其敲入位点为基因组安全位点aavs1。
[0284]
若表达框或者mcs需要插入多个片段，可先使用emcv ireswt(seq id no.101)连接起来，然后插入。
[0285]
基因敲入的sgrna质粒为：sgrna clone b2m-1、sgrna clone b2m-2,、sgrna clone ciita-1和sgrna clone ciita-2。
[0286]
基因敲除使用的sgrna质粒为：sgrna clone b2m-3、sgrna clone b2m-4、sgrna clone ciita-3、sgrnaclone ciita-4。
[0287]
(1)aa1分组：
[0288]
aavs1 ki vector(shrna，组成型)质粒的shrna表达框架2放入靶向nr4a1的shrna序列。
[0289]
(2)aa2分组：
[0290]
aavs1 ki vector(shrna，组成型)质粒的shrna表达框架2放入靶向nr4a1的shrna序列，shrna表达框架1放入其余的shrna序列(包括b2m/ciita-3’utr-shrna的靶序列)，mcs放入基因序列。
[0291]
b2m ki vector放入b2m-3’utr-mirna-locus。
[0292]
ciita ki vector放入ciita-3’utr-mirna-locus。
[0293]
(3)aa3分组：
[0294]
aavs1 ki vector(shrna，组成型)质粒的shrna表达框架2放入靶向nr4a1的shrna序列，shrna表达框架1放入其余的shrna靶序列，敲除b2m和ciita，mcs放入基因序列。
[0295]
(4)aa4分组：
[0296]
aavs1 ki vector(shrna，组成型)质粒的shrna表达框架2放入靶向nr4a1的shrna序列，shrna表达框架1放入其余的shrna靶序列，mcs放入基因序列。
[0297]
(5)ab1分组：
[0298]
aavs1 ki vector(shrna-mir，组成型)质粒的shrna-mir表达框架2放入靶向nr4a1的shrna-mir序列。
[0299]
(6)ab2分组：
[0300]
aavs1 ki vector(shrna-mir，组成型)质粒的shrna-mir表达框架2放入靶向nr4a1的shrna-mir序列，shrna-mir表达框架1放入其余的shrna-mir靶序列(包括b2m/ciita-3’utr-shrna-mir的靶序列)，mcs放入基因序列。
[0301]
b2m ki vector放入b2m-3’utr-mirna-locus。
[0302]
ciita ki vector放入ciita-3’utr-mirna-locus。
[0303]
(7)ab3分组：
[0304]
aavs1 ki vector(shrna-mir，组成型)质粒的shrna-mir表达框架2放入靶向nr4a1的shrna-mir序列，shrna-mir表达框架1放入其余的shrna-mir靶序列，敲除b2m和ciita，mcs放入基因序列。
[0305]
(8)ab4分组：
[0306]
aavs1 ki vector(shrna-mir，组成型)质粒的shrna-mir表达框架2放入靶向nr4a1的shrna-mir序列，shrna-mir表达框架1放入其余的shrna-mir靶序列，mcs放入基因序列。
[0307]
表9诱导型敲入表达实验分组
[0308][0309][0310]
其中，“ ”号表示基因或核酸序列的敲入，
“‑”
号表示基因敲除。
[0311]
总体原则如上述组成型敲入表达实验分组所示。
[0312]
(1)b1分组：
[0313]
aavs1 ki vector(shrna，诱导型)质粒的shrna表达框架2放入靶向nr4a1的shrna序列，shrna表达框架1放入其余的shrna靶序列(包括b2m/ciita-3’utr-shrna的靶序列)，mcs放入基因序列。加入tet-off系统诱导系统。
[0314]
b2m ki vector放入b2m-3’utr-mirna-locus。
[0315]
ciita ki vector放入ciita-3’utr-mirna-locus。
[0316]
(2)b2分组：
[0317]
aavs1 ki vector(shrna-mir，诱导型)质粒的shrna-mir表达框架2放入靶向nr4a1的shrna-mir序列，shrna-mir表达框架1放入其余的shrna-mir靶序列(包括b2m/ciita-3’utr-shrna-mir的靶序列)，mcs放入基因序列。加入tet-off系统诱导系统。
[0318]
b2m ki vector放入b2m-3’utr-mirna-locus。
[0319]
ciita ki vector放入ciita-3’utr-mirna-locus。
[0320]
(3)b3分组：
[0321]
aavs1 ki vector(shrna，诱导型)质粒的shrna表达框架2放入靶向nr4a1的shrna序列，shrna表达框架1放入其余的shrna靶序列(包括b2m/ciita-3’utr-shrna的靶序列)，mcs放入基因序列。加入tet-off系统诱导系统。
[0322]
(4)b4分组：
[0323]
aavs1 ki vector(shrna-mir，诱导型)质粒的shrna-mir表达框架2放入靶向nr4a1的shrna-mir序列，shrna-mir表达框架1放入其余的shrna-mir靶序列(包括b2m/ciita-3’utr-shrna-mir的靶序列)，mcs放入基因序列。加入tet-off系统诱导系统。
[0324]
其中，上述组成型和诱导型敲入在进行免疫兼容改造的时候，可以先在hpscs上进行进行改造，改造完成后再分化成多能干细胞的衍生物进行运用；也可以在hpscs分化成多能干细胞的衍生物后再进行免疫兼容改造。
[0325]
本发明中的tet-off系统具体为：
[0326]
在没有四环素存在时，tta蛋白持续作用在tet启动子上，使基因持续表达。在需要转基因保持在一个持续表达状态下，该系统是非常有用。加入四环素时，四环素可使tta蛋白的结构变化，使其不能与启动子结合，从而使其驱动的基因表达水平下降。为了使该系统保持“关闭”状态，必须连续添加四环素。
[0327]
tet-off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。
[0328]
表达靶向nr4a1抑制因子的多能干细胞或其衍生物对nr4a1的抑制效果检测：
[0329]
将表8和表9各实验组方案敲入ipscs、mscs、nscs、ebs细胞的基因组安全位点，37℃，0.5％co2培养箱培养，收集培养基上清，含有敲入外泌体加工合成基因序列的细胞利用外泌体提取试剂盒(bestbio，lot#bb-3901)提取培养上清中的外泌体。培养上清37℃条件下3000g离心15min，收集上清后在4℃条件下10000g离心20min，收集上清，按4:1比例加入提取液a，上下颠倒1min，37℃过夜。37℃条件下10000g离心60min，收集沉淀即可。接着在培养表达nr4a1的cho细胞的培养基中添加提取的nr4a1抑制因子或含nr4a1抑制因子的外泌体进行培养72h，然后进行qpcr检测，检测nr4a1的表达量。
[0330]
n(对照)组是指没有添加nr4a1抑制因子或含nr4a1抑制因子的外泌体进行培养的表达nr4a1的cho细胞。
[0331]
各实验组的检测结果如表10所示。
[0332]
表10 qpcr检测表达nr4a1的细胞的nr4a1表达结果
[0333][0334][0335]
从上表可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的nr4a1抑制因子能有效抑制靶细胞的nr4a1表达。而且其抑制程度在各组中表达相对恒定，所以多能干细胞衍生物所表达的nr4a1抑制因子不受细胞分化形态及其他外源基因(免疫兼容改造)所影响。
[0336]
表达靶向nr4a1抑制因子的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果检测：
[0337]
将表8和表9各实验组方案敲入ipscs、mscs、nscs、ebs细胞的基因组安全位点，得到表达nr4a1抑制因子细胞。使用cfse(5,6-carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester，羟基荧光素二醋酸盐琥铂酰亚胺酯)测试试验检验其抗肿瘤效果。
[0338]
cfse试验：
[0339]
原理：t细胞先用表达nr4a1抑制因子的多能干细胞的培养基上清培育72h，再与肿瘤细胞接触时，t就会攻击肿瘤细胞造成肿瘤细胞死亡。而未经表达nr4a1抑制因子的多能干细胞的培养基上清培育的会发生肿瘤细胞不被t细胞所识别，会发生免疫逃逸。所以通过
检测cfse

pi

细胞(死亡的靶细胞)，即可反应出t细胞杀伤肿瘤的能力。
[0340]
具体步骤为：
[0341]
1)效应细胞的准备：
[0342]
t细胞分离：使用ficoll密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,pbmc)，再使用dynabeads
tm
cd3(invitrogen
tm
，货号：11151d)试剂盒分离出t细胞。将细胞重悬在含10％fbs的rpmi1640培养基中，通过台盼蓝染色计数细胞，并浓缩至1
×
107细胞/ml。
[0343]
2)靶细胞的准备：
[0344]
靶细胞选择为肿瘤细胞(nic肺癌)，将其消化重悬，通过台盼蓝染色计数细胞，配成1
×
107细胞/ml的细胞悬液。
[0345]
3)在靶细胞中加入cfse工作液(终浓度为5μmol/l cfse)，于37℃，5％co2培养孵育10min，洗涤2次。台盼蓝染色计数后用培养基重悬，配成1x106细胞/ml备用。
[0346]
4)将靶细胞及效应细胞加入5ml流式管中，每管加100μl靶细胞(1
×
105ml-1
)及效应细胞(e/t＝1:2、1:5、1:10，e/t为靶细胞与效应细胞t的比)，并以只加靶细胞作为对照。将流式管中的效应细胞与靶细胞轻轻混匀。加入pi，放置37℃，5％co2培养孵育4h。流式细胞检测cfse

pi

细胞(死亡的靶细胞)的百分率。
[0347]
靶细胞死亡率(％)＝加t细胞刺激的靶细胞死亡率(％)-靶细胞自然死亡率(％)
[0348]
结果如表11所示。
[0349]
表11各实验组表达的nr4a1抑制因子对t细胞杀伤肿瘤细胞的影响
[0350]
[0351][0352]
其中，n(对照)组是指未用表达nr4a1抑制因子的多能干细胞的培养基上清处理t细胞。独立样本t检验(*p《0.01)。
[0353]
通过以上实验，可以证明本发明制备的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的nr4a1抑制因子起到抗肿瘤作用。
[0354]
表达靶向nr4a1抑制因子的多能干细胞在多种肿瘤治疗中进行应用：
[0355]
选择b2m和ciita基因敲除方案组(aa3、ab3)的免疫兼容细胞(hpscs、mscs、nscs、ebs)中进行测试。
[0356]
在人源化nsg小鼠肿瘤模型中，注射各组实验细胞，观察其对mc结肠癌，mm黑色素瘤，mm黑色素瘤的治疗的效果。为避免免疫兼容问题，所使用的免疫细胞与hpscs及hpscs源衍生物均来源于同一人的。
[0357]
具体步骤包括：
[0358]
在人源化nsg小鼠(the jackson laboratory(jax))中，对其右腋下皮下注射5
×
106肿瘤(mc结肠癌，mm黑色素瘤，mm黑色素瘤)细胞，待肿瘤长到60mm3大小时，进行尾静脉注射200ul pbs(含人免疫细胞和106的表达被外泌体包裹的nr4a1抑制因子的多能干细胞衍生物)进行肿瘤治疗，其中只注射含人免疫细胞的组作为对照组。20天后处死小鼠，然后比较各组之间肿瘤大小，并进行差异性统计分析。
[0359]
结果如表12所示。
[0360]
表12各实验组多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果
[0361]
[0362][0363]
独立样本t检验(*p《0.01)。
[0364]
通过以上实验，可以证明本发明制备的表达nr4a1抑制因子的干细胞或其衍生物能有效阻断nr4a1而起到抗肿瘤作用。
[0365]
表达靶向nr4a1抑制因子的多能干细胞的免疫兼容性测试：
[0366]
利用mscs的低免疫源性的特点，在人源化nsg小鼠肿瘤模型中，对其进行注射能够表达nr4a1抑制因子(靶向nr4a1的shrna)的hpscs源免疫兼容mscs，观察其肿瘤(mm黑色素瘤)治疗的效果。其中，所使用的免疫细胞与hpscs源mscs来源于为非同一人。
[0367]
对照组为未注射mscs细胞的nsg小鼠肿瘤模型；
[0368]
加dox组为：从注射表达抑制因子的细胞开始，持续在小鼠饮食中添加0.5mg/ml的
dox饲养小鼠，直至试验结束。
[0369]
免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果如表13所示。
[0370]
表13免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果
[0371][0372]
独立样本t检验(*p《0.01)。
[0373]
以上实验表明：仅表达抑制因子的mscs(组2)，其具有低免疫源性，可以在异体内存在一定时间，所以其能够发挥一定的肿瘤治疗效果，而进行免疫兼容改造的(组3-7，包括组成型和可逆诱导型免疫兼容)，其免疫兼容效果更佳，比没有经免疫兼容改造的mscs在体内存在时间更长(或能做到长期共存)，其发挥肿瘤治疗效果更佳，而组4为b2m和ciita基因敲除组，其完全消除hla-i和hla-ii类分子产生的影响，因此其肿瘤治疗效果最佳。但由于其组成型免疫兼容改造(基因敲入/敲除)，无法在移植物产生变异或不需要时进行清除，从而有组6-9方案设定。组8-9中在进行注射表达抑制因子细胞进入小鼠的同时，对小鼠使用dox诱导剂(一直使用)，注射表达抑制因子细胞的小鼠的免疫兼容效果将被消除，其在体内存在时间与未经免疫兼容改造的mscs相当，其肿瘤治疗效果也与未经免疫兼容改造的mscs相当。
[0374]
所述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。