格列本脲组合物在制备治疗脊髓出血药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及药物用途领域，具体涉及格列本脲组合物在制备治疗或预防脊髓损伤引起的脊髓出血药物中的应用。


背景技术：

2.脊髓损伤(spinal cord injury，sci)是指外力直接或间接作用于脊髓，引起脊髓功能性或器质性损害，以及继发一系列病理改变进一步加重脊髓损伤，从而出现不可逆性的损伤平面以下感觉、运动、括约肌功能障碍、肌张力异常及病理反射。脊髓损伤因治疗费用高、伤情严重复杂、处理难度大、并发症多和治愈率低等特点，给患者、家属及社会带来沉重的负担。
3.脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤包括机械性压迫、出血、电解质平衡紊乱等，继发性损伤包括水肿、炎症反应、局部缺血、生长因子和细胞因子浸润、再灌注、钙离子超负荷及脂质过氧化等。
4.临床研究证实由于sci病程反复迁延难愈，病情错综复杂多变，目前已有的治疗药物已经不能完全改善病人的生活质量和预后，而sci一旦进展到感觉、运动及括约肌功能障碍则很难用药物改变已经恶化的脊髓结构和功能。
5.正确的治疗可以改善原发损伤灶周围幸存神经组织的命运和功能，可以阻断继发性损害的病理学恶性循环链，减轻脊髓损伤的后遗症，延长脊髓损伤患者的寿命和患者的生活质量。由此可见，任何减轻脊髓损伤的可能性措施都具有吸引性。
6.脊髓损伤会引起脊髓出血、脊髓神经元数量减少等。发明人从事格列本脲制剂及治疗作用的研究，在研究中发现了格列本脲组合物在治疗或预防脊髓损伤引起的脊髓出血、脊髓神经元数量减少中效果显著，可延长脊髓损伤患者的寿命和患者的生活质量。


技术实现要素：

7.本发明的主要目的在于提供格列本脲环糊精组合物减少脊髓损伤引起的脊髓出血、改善脊髓神经元数量减少作用。
8.更具体的，本发明提供了格列本脲组合物在制备治疗或预防脊髓损伤引起的脊髓出血药物中的应用。
9.本发明提供了格列本脲组合物在制备治疗或预防脊髓损伤引起的脊髓神经元数量减少药物中的应用。
10.优选的，所述脊髓损伤为原发性脊髓损伤。
11.更优选的，所述脊髓损伤为由于道路交通事故、坠落和暴力导致的原发性脊髓损伤。
12.在此将公开号为wo2018108111a1的发明内容引入本技术发明内容中。
13.优选的，所述格列本脲组合物为格列本脲环糊精注射用组合物。
14.优选的，所述格列本脲环糊精注射用组合物包括格列本脲、环糊精和附加剂。
15.优选的，格列本脲与环糊精的重量比为1:25～1000；优选为1:50～1000；优选为1:25～250；优选为1:25～50。
16.优选的，格列本脲与附加剂的重量比为1:0.5～100；优选为1:0.5～50，优选为1:0.5～25，优选为1:0.5～10。
17.优选的，所述附加剂为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠和/或葡甲胺；优选为碳酸钠、氢氧化钠和葡甲胺；更优选为碳酸钠、葡甲胺
18.优选的，所述环糊精选自β-环糊精及药学上可接受的β-环糊精衍生物。
19.优选的，所述附加剂与环糊精的重量比为1:1～100，优选为1:5～50，优选为1:10～25。
20.优选的，所述格列本脲、附加剂和环糊精的重量比为1:0.5～50:25～250。
21.优选的，所述环糊精选自β-环糊精、二甲基-β-环糊精、2-羟乙基-β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、3-羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精和三甲基-β-环糊精。
22.优选的，所述环糊精选自2-羟丙基-β-环糊精和/或磺丁基醚-β-环糊精。
23.更优选的，所述环糊精选自2-羟丙基-β-环糊精。
24.本发明中，除特别说明外，羟丙基-β-环糊精指《中国药典》2020版收载的羟丙基倍他环糊精，即为2-羟丙基-β-环糊精。磺丁基醚-β-环糊精指磺丁基倍他环糊精钠(中国国家药品管理部门认可的药用辅料通用名称)。
25.优选的，所述格列本脲环糊精注射用组合物还包括ph调节剂和/或水。
26.优选的，组合物为粉针剂或溶液型注射剂。
27.优选的，所述药物组合物中所述环糊精浓度为0.5％～40％(w/v)，优选为2.5％～40％(w/v)，优选为5％～20％(w/v)，优选为1％～5％(w/v)。
28.优选的，所述药物组合物中所述附加剂浓度为0.01％～20％(w/v)，优选为0.01％～15％(w/v)，优选为0.01％～10％(w/v)，优选为0.01％～5％(w/v)，优选为0.1％～5％(w/v)。
29.优选的，所述药物组合物中所述格列本脲的浓度小于或等于该格列本脲在所述溶液型注射剂中的饱和浓度，优选为0.01～50mg/ml，优选为1～30mg/ml，优选为3～20mg/ml，优选为5～15mg/ml，优选为8～10mg/ml。
30.优选的，所述药物组合物ph为5～11，优选为6～10，优选为7～9，优选为8～8.5。
31.优选的，ph调节剂为盐酸溶液，更优选为0.1～2mol/l盐酸。
32.与现有技术相比，本发明的效果在于：提供了一种新的治疗或预防脊髓损伤引起的脊髓出血、脊髓神经元数量减少的格列本脲组合物，该用途是格列本脲、环糊精注射用组合物的新适应症，具有延长脊髓损伤患者的寿命和患者的生活质量的作用。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
34.在此将公开号为wo2018108111a1的实施例引入本发明实施例中。
35.实施例1格列本脲注射用组合物的制备(冻干粉针)
36.处方：
[0037][0038]
制备方法如下：按照处方，将无水碳酸钠和环糊精溶解在50～70ml体积的水中，再加入格列本脲粉末，搅拌溶解，获得第一溶液。向第一溶液中加入2mol/l盐酸溶液调节ph至8.0～8.5，定容至100ml，获得第二溶液。将第二溶液分装至西林瓶中，每个西林瓶3ml，对西林瓶中的第二溶液实施冷冻干燥，得到冻干粉针。按下表所述冻干程序冷冻干燥。
[0039]
冻干程序
[0040][0041]
实施例2：格列本脲注射用组合物的制备(冻干粉针)
[0042]
处方：
[0043][0044]
制备方法：先将无水碳酸钠和磺丁基醚-β-环糊精溶解在80ml体积的水中，再加入格列本脲粉末，搅拌溶解，获得第一溶液。向第一溶液中加入2mol/l盐酸溶调节溶液ph至8.0～8.5，定容至100ml，获得第二溶液。将第二溶液分装至西林瓶中，每个西林瓶3ml，对西林瓶中的第二溶液实施冷冻干燥(冻干程序同实施例1)，得到冻干粉针。
[0045]
实施例3：格列本脲注射用组合物的制备(冻干粉针)
[0046]
处方：
[0047][0048]
制备方法：先将葡甲胺和磺丁基醚-β-环糊精溶解在80ml体积的水中，再加入格列本脲粉末，搅拌溶解，获得第一溶液。向第一溶液中加入0.1m盐酸溶调节溶液ph至8.0～8.5，定容至100ml，获得第二溶液。将第二溶液分装至西林瓶中，每个西林瓶3ml，对西林瓶中的第二溶液实施冷冻干燥(冻干程序同实施例1)，得到冻干粉针。
[0049]
实施例4：大鼠脊髓损伤(sci)模型的药效学研究
[0050]
(1)实验规范：本实验中所涉及到的所有动物实验操作，均按照实验机构的iacuc(实验动物使用与管理委员会，institutional animal care and use committee)规定来开展，并符合aaalac(国际实验动物评估和认可委员会，association for assessment and accreditation of laboratory animal care)原则。
[0051]
(2)实验动物：雌性sprague-dawley(sd)大鼠，清洁级，体重250-320g。动物饲养间的温度维持在20～24℃，湿度维持在30～70％；每天采用开灯12小时/关灯12小时循环(06：00am开，18：00pm关)。实验过程中，动物单笼饲养，自由饮水，自由采食。
[0052]
(3)受试药
[0053]
格列本脲环糊精注射用组合物溶液：取实施例1格列本脲环糊精注射用组合物冻干粉针，加适量生理盐水，分别配制成浓度为150μg/ml、75μg/ml、3.3μg/ml、10μg/ml的溶液。
[0054]
vehicle：参照实施例1制备的不含格列本脲空白制剂，加适量生理盐水配制。
[0055]
10％水合氯醛：称取10g水合氯醛，加生理盐水定容至100ml，配制成10％溶液。
[0056]
(4)实验动物
[0057]
1)脊髓损伤(sci)模型的建立
[0058]
手术过程执行无菌操作；手术器械(剪刀，镊子，手术刀，手术棉，缝合线，撑开器)在手术前已消毒；使用戊巴比妥钠(50mg/kg,腹腔注射)麻醉动物；挤压动物脚趾以确认动物手术前已经完全麻醉；在动物眼部涂抹眼用软膏以防止动物角膜干燥；剃去动物手术区域毛发，使用碘伏和70％乙醇对手术区域皮肤消毒三遍；待皮肤干燥后开始手术；切除椎板，暴露t9-t10段脊髓，使用脊髓打击器(force:225k dynes；velocity:1mm/s；dwell time:1s)造成损伤；缝合伤口；清洁手术器械，使用热珠灭菌器灭菌；手术后将动物放置在电热毯上，皮下注射5ml生理盐水以防止脱水；等动物完全苏醒后将动物放回笼中。
[0059]
2)动物的分组及给药
[0060]
本实验目标模型成功72只动物，各组情况如下表：
[0061]
实验一：
[0062][0063]
实验二：
[0064][0065]
备注：渗透泵埋植：首先在肩胛骨间的皮肤处切一小口，然后用止血钳将皮肤和皮下结缔组织分开，形成一个小的袋，将渗透压泵插入，流量调节器朝里，缝合皮肤开口。
[0066]
3)监测指标
[0067]
①
行为评分；
[0068]
②
病灶体积；
[0069]
③
脊髓神经元定量分析；
[0070]
④
脊髓出血量测定。
[0071]
4)实验方法
[0072]
实验一：大鼠随机分组，在脊髓损伤造模后，即刻给药和埋植渗透泵，在第1天，第3天和第7天，进行斜坡实验，rearing评分。在脊髓损伤造模后第7天，对大鼠进行灌流取样，进行病灶体积和脊髓神经元定量分析。
[0073]
实验二：大鼠随机分组，在脊髓损伤造模后，即刻给药和埋植渗透泵，术后24h进行脊髓出血量测定。
[0074]
5)实验指标的测定
[0075]
评分(n＝8)：在脊髓损伤造模后第1天，第3天和第7天，进行斜坡实验，rearing评
分。
[0076]
病灶体积(n＝8)：脊髓损伤造模后第7天，将动物深度麻醉后，使用10％中性福尔马林灌流预固定。对脊髓连续切片每隔250μm进行he染色。计算病灶面积和体积。
[0077]
脊髓神经元定量分析(n＝8)：前述用于病灶体积测定的另一部分切片用尼氏染色法观察脊髓及神经元组织学改变并进行半定量分析。
[0078]
脊髓出血测定(n＝10)：脊髓损伤造模24h后，将动物深度麻醉后，使用肝素化的生理盐水灌流。取出损伤部位中心5mm脊髓进行匀浆，检测匀浆液中的血红蛋白含量，根据血红蛋白含量分析脊髓出血量。
[0079]
(5)数据处理
[0080]
所有的数据被录入到excel文档中，并以平均值
±
标准误的方式表示。实验数据统计采用单因素方差分析方法(one-way anova)附加fisher’s lsd检验和双因素方差分析(two-way anova)附加dunnet多重比较检验将各组数据进行分析比较。统计分析结果p《0.05认为有显著差异，用*表示；p《0.01，为非常显著性差异，用**表示；p《0.001，为极显著性差异，用***表示。
[0081]
(6)实验结果
[0082]
1)格列本脲环糊精注射用组合物对脊髓损伤(sci)模型大鼠行为学的影响
[0083]
表1格列本脲环糊精注射用组合物改善脊髓损伤(sci)模型大鼠斜坡实验评分**p《0.01,***p《0.001与vehicle组比较，使双因素方差分析附加dunnet多重比较检验。
[0084][0085]
根据表1的结果显示，斜坡实验评分中，给药后第三天和第七天，格列本脲环糊精注射用组合物高剂量组与vehicle组相比有显著性差异(p《0.01，p《0.001)，说明格列本脲环糊精注射用组合物高剂量能改善斜坡实验评分结果。
[0086]
表2格列本脲环糊精注射用组合物改善脊髓损伤(sci)模型大鼠rearing评分
[0087][0088]
*p《0.05,***p《0.001与vehicle组比较，使双因素方差分析附加dunnet多重比较检验。
[0089]
根据表2的结果显示，rearing评分中，给药后第三天，格列本脲环糊精注射用组合物高剂量组与vehicle组相比有显著性差异(p《0.001，p《0.05)，说明格列本脲环糊精注射用组合物高剂量能改善rearing实验评分结果。
[0090]
2)格列本脲环糊精注射用组合物对脊髓损伤(sci)模型大鼠脊髓损伤体积的影响
[0091]
表3格列本脲环糊精注射用组合物对脊髓损伤(sci)模型大鼠脊髓损伤体积的影响
[0092][0093]
*p《0.05与模型对照组比较，使单因素方差分析附加dunnet多重比较检验。
[0094]
根据表3的结果显示，大鼠在脊髓损伤体积测定中，给药7天后，格列本脲环糊精注射用组合物高剂量组与vehicle组相比有显著性差异(p《0.05)，说明格列本脲环糊精注射用组合物高剂量对脊髓损伤模型引起的脊髓损伤均有明显改善作用。
[0095]
3)格列本脲环糊精注射用组合物对脊髓损伤(sci)模型大鼠脊髓神经元数量的影响
[0096]
表4格列本脲环糊精注射用组合物对脊髓损伤(sci)模型大鼠脊髓神经元数量的影响
[0097][0098]
*p《0.05，**p《0.01与模型对照组比较，使单因素方差分析附加dunnet多重比较检验。
[0099]
根据表4的结果显示，大鼠在脊髓神经元数量统计中，给药7天后，格列本脲环糊精注射用组合物高剂量组与vehicle组相比有显著性差异(p《0.01，p《0.05)，说明格列本脲环糊精注射用组合物高剂量对脊髓损伤模型引起的脊髓神经元数量减少均有明显改善作用。
[0100]
4)格列本脲环糊精注射用组合物对脊髓损伤(sci)模型大鼠脊髓出血量的影响
[0101]
表5格列本脲环糊精注射用组合物对脊髓损伤(sci)模型大鼠脊髓出血量的影响
[0102][0103]
*p《0.05,**p《0.01与模型对照组比较，使单因素方差分析附加fisher’s lsd检验。
[0104]
根据表5结果显示，大鼠在脊髓出血测定实验中，给药24小时后，格列本脲环糊精注射用组合物高剂量组与vehicle组相比有显著性差异(p《0.01，p《0.05)，说明格列本脲环糊精注射用组合物高剂量对脊髓损伤模型引起脊髓出血均有明显改善作用。
[0105]
结果显示：
[0106]
(1)斜坡实验评分中，给药后第三天和第七天，格列本脲环糊精注射用组合物高剂量能改善斜坡实验评分结果(p《0.01，p《0.001)。rearing评分中，给药后第三天，格列本脲环糊精注射用组合物高剂量能够显著改善rearing实验评分结果(p《0.001，p《0.05)。
[0107]
(2)大鼠在脊髓损伤体积测定中，给药7天后，格列本脲环糊精注射用组合物高剂量对脊髓损伤模型引起的脊髓损伤均有明显改善作用(p《0.05)。
[0108]
(3)大鼠在脊髓神经元数量统计中，给药7天后，格列本脲环糊精注射用组合物高剂量对脊髓损伤模型引起的脊髓神经元数量减少均有明显改善作用(p《0.05，p《0.01)。
[0109]
(4)大鼠在脊髓出血测定实验中，给药24小时后，格列本脲环糊精注射用组合物高
剂量对脊髓损伤模型引起脊髓出血均有明显改善作用(p《0.05，p《0.01)。
[0110]
表明：格列本脲环糊精注射用组合物能显著改善脊髓损伤大鼠的斜坡实验和rearing评分结果，减小脊髓损伤的体积，减少脊髓出血量，增加脊髓神经元数量。