一种治疗中风的中药制剂指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及属于中成药成分分析检测领域，尤其具体涉及一种治疗中风的中药制剂指纹图谱的检测方法。


背景技术：

本发明所述治疗中风的中药制剂为龙生蛭胶囊，该药为陕西步长制药有限公司独家生产的中药品种，由黄芪、水蛭、川芎、当归、红花、桃仁、赤芍、木香、石菖蒲、地龙、桑寄生和刺五加浸膏组成，其中水蛭和地龙为全粉入药，刺五加浸膏粉碎入药，其余药味经水煎煮浓缩后入药，本品具有补气活血，逐瘀通络的功效，临床用于动脉硬化性脑梗死恢复期中医辨证为气虚血瘀型中风中经络者，证见半身不遂，偏身麻木，口角歪斜，语言不利等，是陕西步长制药有限公司的独家专利产品，其批准文号为：国药准字：z20010049，其主要功能主治为补气活血，逐瘀通络，用于治疗气虚血瘀型中风，该药目前执行的标准为2005年试行标准转正(标准号：ws
3-375(z-040)-2005(z))。该药品标准的薄层鉴别质量控制指标有：在薄层鉴别(tlc)鉴别项目中，以水蛭、地龙对照药材、异嗪皮啶、芍药苷对照品进行定性成分鉴定。而且在含量检测方面，仅对黄芪甲苷单一成分进行含量控制。本技术人对该产品已经布局多件专利申请(02114551.2、200510041937.4、200510043066.x、201010213671.8、201210228789.7、201210228897.4、201210228896.x、201811257744.6、202010132575.4)，上述专利保护的技术主题主要围绕从中药处方、制备工艺方法、治疗糖尿病的临床新用途、含量检测方法等方面。但因该本发明中药处方的药味较多，倘若仅以黄芪甲苷一个定量指标进行定性检测，无法全面评价该药的内在质量。其也不符合中药复方治疗是多组分多靶点的辩证论治整体观。随着中药质量检测技术的进一步发展，中药指纹图谱是将图谱中的某些重要特征信息或整体信息用于中药材真伪鉴别或中药质量整体控制，是一种综合可量化的质量控制手段，具有整体性和模糊性，这与中医理论的整体性原则相对应，本文首次采用hplc方法建立了龙生蛭胶囊的指纹图谱，以保证制剂质量稳定，临床用药安全有效。本技术人针对“本发明中药制剂含量测定方法”方面的技术文献检索梳理主要包括：高效液相色谱法，薄层扫描法，液相色谱串联质谱法等。如：王巧灵，雷亚贤，姚薇等。蒸发光散射检测-高效液相色谱法测定龙生蛭胶囊中黄芪甲苷的含量[j].时珍国医国药，2007,18(7):1686-1687.该文公开了，采用乙腈-水(33:67)，流速1.0ml/min，漂移管温度105℃，气体流量2.8ml/min，建立了蒸发光散射检测-高效液相色谱法测定龙生蛭胶囊中黄芪甲苷的含量。王晓宏，何念念,陈琳.薄层扫描法测定龙生蛭胶囊中黄芪甲苷的含量[j].基层中药杂志，2002,16(5):19-20，该文以三氯甲烷-甲醇-水(65:35:10)为展开剂，在硅胶g薄层板上分离黄芪甲苷，以10％硫酸乙醇为显色剂，采用双波长反射扫描测定其含量，最大吸收波长λs530nm，参比波长λr690nm，用薄层扫描法测定龙生蛭胶囊中黄芪甲苷的含量。魏紫奕,徐文娟,刘洁,等.基于hplc-qqq/ms的龙生蛭胶囊中19种代表性成分含量一致性分析[j].中国中药杂志，2019，44(5):948-953.该论文采用乙腈和0.1％甲酸水溶液梯度洗
脱，三重四级杆电喷雾离子源做为检测器，多反应检测，正负离子扫描，同时测定龙生蛭胶囊中19种代表性成分含量。杨洁,贾志鑫,刘洁,等.hplc-ms/ms测定龙生蛭胶囊在大鼠血浆中7个活性成分的含量及其药代动力学研究[j].药物分析杂志,2021,41(7):1176-1188.该论文采用乙腈-水(含0.1％甲酸)梯度洗脱，流速0.5ml
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，采用电喷雾离子源，分别选择正或负离子模式进行多反应监检测扫描(mrm)，分析时间正离子模式下6min，负离子模式下3min，完成龙生蛭胶囊在大鼠血浆中7个活性成分的含量测定及其药代动力学研究。以上多数文献研究的质量标准技术主要集中在对黄芪甲苷单一指标成分的含量测定方法上，虽然有多指标成分的含量测定，但是其是基于三重四级杆测定，在质量标准中相对较少，由于本发明的中药制剂是由黄芪、水蛭、川芎、当归、红花、桃仁、赤芍、木香、石菖蒲、地龙、桑寄生和刺五加浸膏等多种中药材经过加工、提取、干燥、粉碎、混合等加工步骤制备而成，其药物的活性成分是多种药材的复合成分的中药制剂。而本项目采用中药指纹图谱检测技术手段，它是建立在对中药制剂的众多有效成分研究基础上，该方法主要用于评价中药制剂质量的真实性、有良性和稳定性，为了更全面地评价本发明药物的内在质量。


技术实现要素：

本发明的目的是提供一种治疗中风中药制剂指纹图谱的检测方法，本发明采用hplc方法建立了本方面中药制剂的指纹图谱，并确定了槲皮素、没食子酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、芍药苷、刺五加苷e、异嗪皮啶和毛蕊异黄酮葡萄糖苷等9种指标性成分，以有效控制本发明中药制剂的内在质量，进一步保障临床用药安全有效。本发明所建立的hplc指纹图谱方法可有效评价本发明中药制剂的质量。本发明中药制剂不局限于本次研究对象所特指的龙生蛭胶囊药品，还包括含有以水蛭、地龙、黄芪、川芎、当归、红花、桃仁、赤芍、木香、石菖蒲、桑寄生等主要中药材制备而成的具有治疗心脑血管、脑梗、脑中风等功能相近的中药复方制剂。本发明所提供的技术方案如下：一种治疗中风的中药制剂指纹图谱检测方法，所述检测方法包括如下步骤：(1)、供试品溶液的制备：取本发明中药制剂，称定，加入10％～70％甲醇，超声处理20～40分钟，放冷，用10％～70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；(2)、混合对照品溶液的制备：分别称取槲皮素、没食子酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、芍药苷、刺五加苷e、异嗪皮啶和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，加甲醇溶解稀释制成混合对照品溶液；(3)、色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，以0.05～0.15％磷酸溶液为流动相b，乙腈为流动相a，梯度洗脱比例为：0～6min，3
→
5a％；6～7min，5
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7a％；7～13min，7
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8a％；13～26min，8
→
9a％；26～36min，9
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14a％；36～56min，14
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14.5a％；56～57min，14.5
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40a％；检测波长为210～310nm；柱温为20～40℃；流速为每分钟0.8ml～1.2ml；(4)、色谱峰测定：将上述步骤(1)和(2)所制得供试品溶液、混合对照品溶液，注入液相色谱仪，按照上述步骤(3)的色谱条件，测定记录色谱图，即得。优选的，所述检测方法步骤(1)供试品溶液的制备中，所述甲醇体积浓度为25％。优选的，所述检测方法步骤(1)供试品溶液的制备中，所述超声处理的功率400～
600w，频率30～50khz。作为本发明的最佳优选，所述检测方法步骤(1)供试品溶液的制备中，所述超声处理的功率500w，频率40khz。优选的，所述检测方法步骤(2)混合对照品溶液的制备中，槲皮素、没食子酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、芍药苷、刺五加苷e、异嗪皮啶和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品的浓度为70～130μg/ml。作为本发明的最佳优选，所述检测方法步骤(2)混合对照品溶液的制备中，槲皮素、没食子酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、芍药苷、刺五加苷e、异嗪皮啶和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品的浓度约为100μg/ml。优选的，所述检测方法步骤(3)色谱条件，所述色谱柱型号为：agilent zorbax。优选的，所述检测方法步骤(3)色谱条件，所述色谱流动相磷酸的浓度为0.10％。优选的，所述检测方法步骤(3)色谱条件，所述检测流速：1.0ml
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–1，所述检测波长为220nm，所述柱温：30℃。本发明指纹图谱在优化过程中本技术人付出大量的模式，终于得到较佳比例条件，并将本实验过程的部分实验提供如下，以证明本发明技术方案的创造性。
①
、检测波长的选择对于中药复杂体系的指纹图谱，检测波长的选择至关重要，试验通过二极管阵列检测器对上述对照品在200～600nm之间进行全波长扫描，各成分最大吸收波长相差较大，槲皮素、没食子酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、芍药苷、刺五加苷e、异嗪皮啶和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的最大吸收波长分别在360nm、273nm、260nm、265nm、326nm、230nm、210nm、344nm和260nm，由于大多数成分的吸收波长在260nm附近，同时根据本发明色谱峰图情况，因此，检测波长选择220nm。
②
、测定成分的选择本发明建立的指纹图谱共有模式中确认了20个共有峰，这20个成分来源于其原药材水蛭、地龙、刺五加浸膏、黄芪、川芎、当归、红花、桃仁、赤芍、木香、石菖蒲和桑寄生等12味药材中，该指纹图谱方法基本反映了本发明中药制剂的整体特征。
③
、色谱条件的选择流动相的确定本发明在确定色谱流动相摸索过程中，首先，采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液作为流动相进行考察，结果发现，选择乙腈-磷酸水流动相系统色谱分离较好，磷酸的比例为0.1％、0.2％、0.4％，其检测色谱行为无显著差异，为了保护延长色谱柱的寿命，选择0.1％低浓度的磷酸水溶液作为流动相，由于龙生蛭胶囊中的化学成分极性差异较大，有机酸类极性大，皂苷黄酮类极性小，因此选择梯度洗脱从而保证更多的化学成分极性分离，这样对本发明中药制剂中的主要药材进行定性鉴别，有利于该药内在质量及对生产过程中控制要求。本发明中药制剂指纹图谱检测方法具有以下有益效果：(1)、本发明建立的hplc指纹图谱，共确定了20个共有色谱峰，在与对照品溶液色谱相比较，并鉴定确认了9个指标成分，分别为槲皮素、没食子酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、芍药苷、刺五加苷e、异嗪皮啶和毛蕊异黄酮葡萄糖苷指标成分，利用相似度评价软件对
19批样品指纹图谱进行分析，各批样品相似度均在0.96以上，由此可知，本发明hplc指纹图谱可以对本发明中药制剂中的9种有效成分进行定性鉴别，以保证本发明中药制剂的内在质量稳定性。(2)、本发明建立的指纹图谱检测方法，并利用相似度评价软件对19批样品指纹图谱进行分析，各批样品相似度均在0.96以上，这也符合中成药多组分多靶点形成协同治疗的整体辩证观。综上所述，本发明中药制剂的指纹图谱检测方法可以对本发明中药制剂中所含刺五加浸膏、黄芪、川芎、当归、红花、赤芍的有效指标成分进行定性指纹图谱鉴别，本发明指纹图谱检测方法具有操作简单、准确、稳定的特点，这也可为本发明中药制剂(龙生蛭胶囊)的质量评价提供更加全面的科学依据。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。本发明所述供试品为龙生蛭胶囊。图1-19批本发明中药制剂hplc指纹图谱和对照指纹图谱(r)；图2-9种药品指标成分混合对照品hplc色谱图，其中，色谱峰1为槲皮素，色谱峰2为没食子酸，色谱峰3为原儿茶酸，色谱峰6为紫丁香苷，色谱峰7为绿原酸，色谱峰14为芍药苷，色谱峰16为刺五加苷e，色谱峰17为异嗪皮啶，色谱峰19为毛蕊异黄酮葡萄糖苷。图3-本发明中药制剂hplc液相色谱图。
具体实施方式
为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实例对本发明做进一步的说明。除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。实施例1：1仪器与试药lc-2010plus(日本岛津仪器公司)；labsolution工作站，agilent zorbax c184.6
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250mm，5μm色谱柱；bsa124scw万分之一天平(北京赛多利公司)；中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723版本)，kq-800kde超声波清洗器(江苏昆山舒美超声仪器公司)。对照品：槲皮素(批号c2016y1722，含量以98％计)，购于上海源叶生物科技有限公司；没食子酸(批号110831-201204，含量以89.9％计)；紫丁香苷(批号111574-201605，含量以95.2％计)；绿原酸(批号110753-202018，含量以96.1％计)；芍药苷(批号110736-201741，含量以95.7％计)；刺五加苷e(批号111713-201804，含量以97.9％计)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号111920-201606，含量97.6％计)，均购自中国食品药品检定研究院；原儿茶酸(批号must-19032102，含量以99.48％计)；异嗪皮啶(批号must-20070710，含量以99.5％计)，均购自成都曼斯特公司。龙生蛭胶囊19批(陕西步长制药有限公司，批号分别为：批号201201、201202、201203、201204、201205、201206、201207、201208、201209、201210、201006、201007、201008、
201009、201010、201011、191003、191004、191005)。
[0041]
色谱乙腈(fisher试剂公司)；磷酸、甲醇均为分析纯(上海国药化学试剂公司)；水为milli-q超纯水(milliore co.)。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：agilent zorbax c18(4.6
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250mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸溶液(b)，梯度洗脱比例为：0～6min，3
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5a％；6～7min，5
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7a％；7～13min，7
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8a％；13～26min，8
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9a％；26～36min，9
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14a％；36～56min，14
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14.5a％；56～57min，14.5
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40a％；检测波长为220nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。2.2溶液制备2.2.1混合对照品溶液的制备制备9种成分混合对照品溶液：分别精密称取槲皮素、没食子酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、芍药苷、刺五加苷e、异嗪皮啶和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加甲醇溶解稀释制成每1ml含槲皮素、没食子酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、芍药苷、刺五加苷e、异嗪皮啶和毛蕊异黄酮葡萄糖苷100μg左右的混合溶液，即的。2.2.2供试品溶液的制备取本品约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇25ml，称定重量，超声处理〔功率500w，功率40khz〕30分钟，放冷，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液即得。2.3hplc指纹图谱的建立2.3.1精密度试验分别精密吸取同一(批号201210)供试品溶液10μl，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，以紫丁香苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间的rsd均小于0.42％，相对峰面积的rsd均小于1.69％，表明仪器精密度良好。2.3.2稳定性试验分别精密吸取同一(批号201210)供试品溶液10μl，按“2.1”项下色谱条件，分别在0，1，2，4，8，12，16，20和24小时进行测定，记录色谱图，以紫丁香苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间的rsd均小于0.93％，相对峰面积的rsd均小于4.36％，表明供试品溶液在24h内稳定。2.3.3重复性试验取同一(批号201210)龙生蛭胶囊样，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取10μl，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，以紫丁香苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间的rsd均小于1.44％，相对峰面积的rsd均小于2.89％。表明该方法的重复性良好。2.3.4指纹图建立及相似度评价取龙生蛭胶囊19批(s1～s19)，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取20μl，按“2.1”项下色谱条件进样分析，将色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版本)，选择s3(批号191003)样品作为参照图谱，采用中位数法，时间宽度设定为
0.3，多点校正后，经全谱匹配共确定20个共有峰，并生成指纹图谱共有模式(r)。结果19批样品相对于共有模式的相似度分别为0.960、0.968、0.974、0.999、0.999、0.990、0.999、0.998、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.997、0.996、0.996、0.997，均大于0.96，说明各样品具有较好的一致性。指纹图谱叠加图谱及共有模式，参见说明书附图1。2.3.5色谱峰的指认、归属取9种成分混合对照品溶液、供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行分析，通过各色谱峰保留时间、紫外光谱信息并结合混合对照品色图信息，指认出其中9个色谱峰。其中6号紫丁香苷峰分离度良好，保留时间居中，峰面积较大，因此选择为参考峰。色谱峰指认信息及药味归属见表1，9种成分混合对照品及供试品色谱图，可参见说明书附图2～3。表1本发明中药制剂指纹图谱色谱峰指认及药味归属结果中药制剂指纹图谱色谱峰指认及药味归属结果综上所述，由表1的结果可知，本发明所建立的指纹图谱的色谱峰1号的保留时间4.975min，其色谱对应的色谱峰为槲皮素，色谱峰2的保留时间为7.868，其色谱峰成分为没食子酸，该药材的归属为当归、川芎药材，色谱峰3的保留时间为13.194min，其色谱峰成分为原儿茶酸，归属药味为当归、川芎、黄芪、红花，色谱峰6的保留时间为25.2min，色谱峰名称紫丁香苷，其归属药味为刺五加浸膏、木香药材。色谱峰7的保留时间为26.001min，色谱峰名称绿原酸，其归属药味为当归、川芎、刺五加浸膏药材。色谱峰14的保留时间为40.714min，色谱峰名称为芍药苷，其归属药味为赤芍药材。色谱峰16的保留时间为48.28min，色谱峰名称为刺五加苷e，其归属药味为刺五加浸膏药材。色谱峰17的保留时间为49.228min，色谱峰名称为异嗪皮啶，其归属药味为刺五加浸膏药材。色谱峰19的保留时
间为52.265min，色谱峰名称为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，其归属药味为黄芪药材。最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。