雷公藤甲素衍生物在制备治疗肿瘤耐药药物中的应用、治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物

1.本发明属于肿瘤药物制备技术领域，具体涉及雷公藤甲素衍生物在制备治疗肿瘤耐药药物中的应用、治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物。


背景技术：

2.肿瘤多药耐药(multi-drug resistance,mdr)所导致的癌症化疗失败，依旧是目前肿瘤治疗中存在的难点。mdr可分为两种类型，一些药物虽然对肿瘤早期具有良好的治疗效果，但在后期治疗中产生耐药，称之为获得性耐药；而在另一方面，在开始使用该药物时就表现出抗药性称为原发性耐药。肿瘤多药耐药发生的机制十分复杂，进一步研究发现肿瘤多药耐药与肿瘤细胞自噬、周期调控与dan损伤修复有关。虽然针对mdr，已经成功开发了三代靶向三磷酸腺苷结合盒转运体(atp binding cassette transporter,abc)的抑制剂，也有mdr调节剂、化学增敏剂、多功能纳米载体和rna干扰等方法可有效逆转mdr，但是由于肿瘤多药耐药机制的复杂性，mdr依然是肿瘤治疗中面临的难题。
3.目前已经证实抑制或者诱导自噬的植物小分子药物包括水飞蓟宾(silibinin)、黄连素(berberine)、喜树碱(camptothecin)、葫芦素(cucurbitacin)、粗糠紫苦素(rottlerin)、天冬酰胺(aspalathin)等通过抑制mtor活性促进自噬起始；紫杉醇(paclitaxel)、人参皂苷(ginsenoside)、小檗碱(berberine)、γ生育三烯酚(γ-tocotrienol)、大蒜素(alicin)、木犀草素(luteolin)、熊果酸(ursolic acid)和辣椒素(capsaicin)，这些分子可以靶向beclin1诱导自噬。但是与这些植物分子相比，雷公藤甲素表现出不同的自噬诱导效应，雷公藤甲素通过刺激白血病、骨肉瘤、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和神经母细胞瘤细胞系自噬诱导细胞死亡。例如通过激活mtor/erk/p38 mapk信号通路并调节bax和caspase-3，从而在mcf-7细胞中诱导caspase蛋白级联反应和自噬共同促进肿瘤细胞死亡。然而，雷公藤甲素通过诱导靶向自噬的pi3k/akt、mtor、p38、mapk、p53和foxo3a蛋白途径，诱导人宫颈癌细胞的保护性自噬。雷公藤甲素诱导胶质瘤细胞的自噬可通过激活ros/jnk和抑制akt/mtor信号通路来调节细胞凋亡和自噬。但目前雷公藤甲素衍生物在肿瘤耐药细胞中研究还属于空白。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了雷公藤甲素衍生物在制备治疗肿瘤耐药药物中的应用、治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物。本发明中，雷公藤甲素衍生物能够直接靶向chk1/2/cdc25a蛋白双靶点调控，诱导肿瘤耐药细胞自噬和周期阻滞，抑制耐药蛋白abcg2表达，具有药效强，作用靶点新，药物毒性低的特点。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了雷公藤甲素衍生物在制备治疗与肿瘤耐药相关药物中的应用，所述雷公藤甲素衍生物具有式1所示结构通式：
[0006][0007]
所述式1中，r1、r2、r3和r4独立地为氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或羟基；
[0008]
x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7和x8中至多两个为羟基，其余为氢；所述式1中连接r1、r2、r3、r4、x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7和x8的“—”键代表键或键。
[0009]
优选的，所述治疗与肿瘤耐药相关药物包括治疗与肺肿瘤耐药相关药物、治疗与胃肿瘤耐药相关药物、治疗与肝肿瘤耐药相关药物、治疗与宫颈癌耐药相关药物或治疗与乳腺癌耐药相关药物。
[0010]
优选的，所述雷公藤甲素衍生物包括20-羟基雷公藤甲素、1β,5α-二羟基-14-甲氧基雷公藤甲素、2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤甲素、5α,19β-二羟基-16-甲基雷公藤甲素、16-羟基雷公藤甲素、15-羟基雷公藤甲素、1β-羟基雷公藤甲素、2β-羟基雷公藤甲素、5α-羟基雷公藤甲素、7β-羟基雷公藤甲素、7α-羟基雷公藤甲素和6-羟基雷公藤甲素中的一种或多种。
[0011]
优选的，所述雷公藤甲素衍生物包括20-羟基雷公藤甲素、1β,5α
–
二羟基-14-甲氧基雷公藤甲素、2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤甲素和5α,19β-二羟基-16-甲基雷公藤甲素中的一种或多种；
[0012]
所述20-羟基雷公藤甲素具有式1-1所示结构，所述1β,5α-二羟基-14-甲氧基雷公藤甲素具有式1-2所示结构，所述2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤甲素具有式1-3所示结构，所述5α,19β-二羟基-16-甲基雷公藤甲素具有式1-4所示结构：
[0013][0014]
所述式1-1中与x8相连的的“—”键代表键或键；
[0015]
所述式1-2中与x1相连的“—”键为键，与x5相连的“—”键为键；
[0016]
所述式1-3中与x2相连的“—”键为键，与x5相连的“—”键为键；
[0017]
所述式1-4中与x7相连的“—”键为键，与x5相连的“—”键为键。
[0018]
本发明提供了一种治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物，包括药物活性组分和药物辅料，所述药物活性组分包括雷公藤甲素衍生物。
[0019]
优选的，所述药物活性组分还包括parp1抑制剂。
[0020]
优选的，所述雷公藤甲素衍生物和parp1抑制剂的质量比为1:(1～100)。
[0021]
优选的，所述雷公藤甲素衍生物和parp1抑制剂的质量比为1:(1～10)。
[0022]
本发明提供雷公藤甲素衍生物在制备治疗与肿瘤耐药相关药物中的应用，所述雷公藤甲素衍生物具有式1所示结构通式：
[0023]
[0024]
所述式1中，r1、r2、r3和r4独立地为氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或羟基；
[0025]
x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7和x8中至多两个为羟基，其余为氢；所述式1中连接r1、r2、r3、r4、x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7和x8的“—”键代表键或键。
[0026]
本发明首次公开了雷公藤衍生物在诱导肿瘤耐药细胞凋亡和自噬方面的作用以及两者之间的关系，雷公藤衍生物可以靶向parp1/chk1，抑制耐药cdc25a蛋白表达，激活阻滞在g0期耐药细胞，增强药物的敏感性，靶向抑制cdc25a蛋白表达，使药物作用后的细胞从g1期进入s期。与此同时抑制耐药细胞的dna损伤修复，增强细胞的自噬性死亡。雷公藤衍生物和雷公藤甲素相比具有药效强，作用靶点新，药物毒性低的特点；而且，本发明首次发现雷公藤新衍生物可以通过激活ampk/tsc2途径诱导肿瘤耐药细胞自噬，增强细胞的自噬性死亡，和雷公藤甲素相比具有药物毒性降低，在安全的剂量下，对正常细胞无毒性。
[0027]
本发明提供一种治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物，包括药物活性组分和药物辅料，所述药物活性组分包括雷公藤甲素衍生物。
[0028]
进一步，本发明提供的治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物还包括parp1抑制剂；本发明将雷公藤衍生物协同parp1抑制剂，能够有效提高顺铂药物对顺铂耐药肿瘤细胞的敏感性。
附图说明
[0029]
图1为本发明实施例1a549细胞cd338蛋白含量测定结果；
[0030]
图2为本发明实施例1a549/ddp细胞cd338蛋白含量测定结果；
[0031]
图3为本发明实施例1nci-h1299细胞cd338蛋白含量测定结果；
[0032]
图4为本发明实施例1nci-h1299/ddp细胞cd338蛋白含量测定结果；
[0033]
图5为tp和hqu4x-8对a549/cddp细胞耐药蛋白abcg2和mvp的调控作用与con组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；
[0034]
图6为tp和hqu4x-8对nci-h1299/cddp细胞耐药蛋白abcg2和mvp的调控作用与con组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；
[0035]
图7为激光共聚焦显微镜观察hqu4x-8诱导a549/ddp细胞中自噬小体和自噬溶酶体的形成，黄色斑点表示自噬小体，红色斑点表示自噬溶酶体,实验组与con组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；
[0036]
图8为激光共聚焦显微镜观察hqu4x-8诱导nci-h1299/cddp细胞中自噬小体和自噬溶酶体的形成，黄色斑点表示自噬小体，红色斑点表示自噬溶酶体,实验组与con组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；
[0037]
图9为tp和hqu4x-8诱导肺癌耐药细胞a549/ddp发生自噬；
[0038]
图10为tp和hqu4x-8诱导肺癌耐药细胞nci-h1299/ddp发生自噬；
[0039]
图11为0.3125μmol/l hqu4x-8作用a549/ddp细胞12h、24h和48h；作用nci-h1299/ddp细胞12h和24h，检测tsc2及mtor表达变化；
[0040]
图12为0.3125μmol/l hqu4x-8作用a549/ddp细胞12h、24h和48h；作用nci-h1299/ddp细胞12h和24h，检测ulk1复合体及class iii pi3k复合体表达变化；
[0041]
图13为雷公藤甲素和hqu4x-8对a549/ddp细胞和nci-h1299/ddp细胞用药物浓度为1.25μmol/l分别处理2h、4h和6h，检测atm-p53途径及myc途径相应蛋白表达变化；
[0042]
图14为雷公藤甲素和hqu4x-8对a549/ddp细胞和nci-h1299/ddp细胞用药物浓度为0.3125μmol/l分别处理2h、4h和6h对parp1的靶点调控效应；
[0043]
图15为激光共聚焦显微镜观察hqu4x-8诱导a549/ddp细胞，单个细胞中形成自噬小体以及自噬溶酶体的数量柱形图。
具体实施方式
[0044]
本发明提供雷公藤甲素衍生物在制备治疗与肿瘤耐药相关药物中的应用，所述雷公藤甲素衍生物具有式1所示结构通式：
[0045][0046]
所述式1中，r1、r2、r3和r4独立地为氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或羟基；
[0047]
x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7和x8中至多两个为羟基，其余为氢；所述式1中连接r1、r2、r3、r4、x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7和x8的“—”键代表键或键。
[0048]
在本发明中，所述雷公藤甲素衍生物优选包括20-羟基雷公藤甲素、1β,5α-二羟基-14-甲氧基雷公藤甲素、2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤甲素、5α,19β-二羟基-16-甲基雷公藤甲素、16-羟基雷公藤甲素、15-羟基雷公藤甲素、1β-羟基雷公藤甲素、2β-羟基雷公藤甲素、5α-羟基雷公藤甲素、19β-羟基雷公藤甲素、19α-羟基雷公藤甲素和6-羟基雷公藤甲素中的一种或多种。
[0049]
在本发明中，所述雷公藤甲素衍生物更优选包括20-羟基雷公藤甲素、1β,5α-二羟基-14-甲氧基雷公藤甲素、2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤甲素和5α,19β-二羟基-16-甲基雷公藤甲素中的一种或多种；
[0050]
在本发明中，所述20-羟基雷公藤甲素具有式1-1所示结构，所述1β,5α-二羟基-14-甲氧基雷公藤甲素具有式1-2所示结构，所述2β,5α
–
二羟基-14-甲基雷公藤甲素具有式1-3所示结构，所述5α,19β-二羟基-16-甲基雷公藤甲素具有式1-4所示结构：
[0051][0052]
所述式1-1中与x8相连的的的“—”键代表键或键；
[0053]
所述式1-2中与x1相连的“—”键为键，与x5相连的“—”键为键；
[0054]
所述式1-3中与x2相连的“—”键为键，与x5相连的“—”键为键；
[0055]
所述式1-4中与x
19
相连的“—”键为键，与x5相连的“—”键为键。
[0056]
本发明对所述雷公藤甲素衍生物的制备方法没有特殊要求。
[0057]
在本发明中，所述雷公藤甲素衍生物的制备方法优选参考中国专利cn103627772a，发明名称为“一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用”中公开的雷公藤内酯醇衍生物的制备方法进行制备。
[0058]
在本发明的具体实施例中，式1-1所示的20-羟基雷公藤甲素的制备方法优选为：
[0059]
在100ml土豆液体培养基中接种5ml(108个/ml)短刺小克银汉霉(cunninghamella blakesleana)asas 3.153孢子液，在ph至6.0，温度30℃
±
1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2μg的接种量，加入各重量比为(4:1:3)的茉莉酸甲酯(meja，0.5m mol/ml)、地塞米松(dxm，0.9m mol/ml)以及2,6-二甲基-β-环糊精(dimeb，1.5m mol/ml)，继续培养12h后，再按4％的接种量加入雷公藤甲素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2ml丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,洗脱液依次用石油醚，体积比为10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯，以及100％乙酸乙酯洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用乙腈：水(10:90(0min)；16:84(10min)；30:70(36min)；30:70(50min)，10:90(53min)；10:90(60min)梯度洗脱、收集保留时间为55～56min洗脱液，减压干燥后，用丙酮-乙醚重结晶，得到淡黄色粉末，式1-1所示的20-羟基雷公藤甲素；雷公藤甲素的转化率为64.23％。
[0060]
高分辨质谱给出分子离子峰[m 1]

在m/z 377.1656。
13
c-nmr谱和1h-nmr如下：
[0061]
13
c nmr(151mhz，dmso)δ173.20(s，c-18)，152.35(s，c-4)，133.06(s，c-3)，71.80(s，c-13),70.71(t，c-19)，68.99(s，c-8)，68.71(d，c-14)，63.11(s，c-9)，62.79(t，c-20)，
55.35(d，c-12)，53.92(d，c-11)，49.17(d，c-7)，34.89(s，c-10)，29.06(d，c-5)，26.15(d，c-15)，25.39(t，c-1)，24.16(t，c-2)，23.77(t，c-6)，14.01(q，c-20)，12.56(q，c-17)。
[0062]1hnmr(600mhz，dmso)δ4.92(2h，q，j＝7.4hz，h-19)，4.58(20-oh)，4.56(1h，ddd,j＝4.6hz，14-oh)，3.79(1h，s，h-14)，3.45(1h，m，h-20)，3.18(1h，d，j＝3.6hz，h-11)，3.06(1h，d，j＝3.6hz，h-12)，2.86(1h，d，j＝4.9hz，h-7)，2.14(1h，m，h-15)，2.10(1h，ddd，h-5)，1.96(1h，m,h-2)，1.81(2h，t，h-1)，1.57(2h，m，h-6)，0.91(3h，d，16-ch3)，0.81(3h，d，j＝7.4hz，17-ch3)。
[0063]
在本发明的具体实施例中，式1-2所示的1β，5α
–
二羟基-14-甲氧基雷公藤甲素的制备方法优选为：
[0064]
在100ml土豆液体培养基中接种5ml(108个/ml)短刺小克银汉霉(cunninghamella blakesleana)as as3.156孢子液，在ph至6.0，温度30℃
±
1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2μg的接种量，加入各重量比为(5:2:4)的茉莉酸甲酯(meja，0.25mmol/ml)、地塞米松(dxm，1.30mmol/ml)以及2,6-二甲基-β-环糊精(dimeb，1.80mmol/ml)，继续培养12h后，再按5％的接种量加入雷公藤甲素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min，离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2ml丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离，洗脱液依次用石油醚，体积比为10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯，以及乙酸乙酯进行洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用乙腈：水(10：90(0min)；16：84(10min)；30：70(36min)；30：70(50min)，10：90(53min)；10：90(60min)梯度洗脱、收集保留时间为43-43.7min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到无色结晶，即得式1-2所示的1β,5α-二羟基-14-甲氧基雷公藤甲素；雷公藤甲素的转化率为78.23％。
[0065]
高分辨质谱给出分子离子峰[m 1]

在m/z407.1932。
13
c-nmr谱和1h-nmr如下：
[0066]
13
c nmr(151mhz，dmso)δ171.08(s，c-18)，151.46(s，c-4)，130.67(s，c-3)，74.44(d，c-14)，69.73(s，c-13)，68.24(s，c-5)，66.69(d，c-1)，65.75(s，c-8)，64.53(t，c-19)，57.23(s，c-9)，55.83(d，c-12)，54.21(d，c-11)，51.74(q，c-21)，46.96(s，c-10)，43.22(s，c-7)，31.70(t，c-2)，30.32(t，c-6)，26.48(d，c-15)，16.48(t，c-16)，16.30(q，c-17)，13.99(q，c-20)。
[0067]1hnmr(600mhz，dmso)δ7.48(1h，s，1-oh)，7.31(1h，s，5-oh)，4.92(2h，d，j＝7.5hz，h-19)，3.41(d，j＝5.5hz，h-14)，3.36(1h，t，j＝6.4hz，h-1)，3.24(3h，s，j＝6.9hz，21-ch3)，3.17(1h，d，j＝3.3hz，h-11)，3.15(1h，d，j＝3.4hz，h-12)，2.86(1h，d，j＝5.5hz，h-7)，2.14(1h，m，h-15)，2.11(2h，m，h-2)，1.72(2h，m，h-6)，1.16(3h，s，20-ch3)，1.08(3h，d，j＝6.9hz，17-ch3)，1.01(3h，d，j＝6.9hz，16-ch3)。
[0068]
在本发明的具体实施例中，式1-3所示的2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤甲素的制备方法优选为：
[0069]
在100ml土豆液体培养基中接种5ml(108个/ml)短刺小克银汉霉(cunninghamella blakesleana)as 3.910孢子液，在ph至6.0，温度30℃
±
1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2μg的接种量，加入各重量比为(3:2:7)的茉莉酸甲酯(meja，0.35mmol/ml)、地塞米松(dxm，1.50mmol/ml)以及2,6-二甲基-β-环糊精(dimeb，1.20m mol/ml)，继续培养
12h后，再按5％的接种量加入雷公藤甲素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2ml丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离，洗脱液依次用石油醚，体积比为10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯，以及乙酸乙酯进行洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用乙腈：水(10：90(0min)；16：84(10min)；30：70(36min)；30：70(50min)，10：90(53min)；10：90(60min)梯度洗脱、收集保留时间为40-40.5min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到无色结晶，即为式1-3所示的2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤甲素，雷公藤甲素的转化率为51.35％。
[0070]
高分辨质谱给出分子离子峰[m 1]

在m/z407.1959。
13
c-nmr谱和1h-nmr如下：
[0071]
13
cnmr(151mhz，dmso)δ172.24(s，c-18)，149.56(s，c-4)，131.36(s，c-3)，74.45(d，c-14)，74.78(s，c-5)，69.34(s，c-13)，66.45(s，c-8)，64.83(t，c-19)，63.73(s，c-9)，63.42(d，c-2)，55.83(d，c-12)，53.91(d，c-11)，51.74(q，c-21)，43.22(s，c-7)，32.90(t，c-1)，32.67(s，c-10)，30.32(t，c-6)，26.48(d，c-15)，16.48(t，c-16)，16.30(q，c-17)，13.99(q，c-20)。
[0072]1hnmr(600mhz，dmso)δ7.15(1h，s，2-oh)，7.02(1h，s，5-oh)，4.73(2h，d，j＝7.5hz，h-19)，3.41(d，j＝5.5hz，h-14)，3.69(1h，t，j＝6.4hz，h-2)，3.24(3h，s，j＝6.9hz，21-ch3)，3.18(1h，d，j＝3.3hz，h-11)，3.17(1h，d，j＝3.4hz，h-12)，2.86(1h，d，j＝5.5hz，h-7)，2.14(1h，m，h-15)，1.98(2h，m，h-1)，1.83(2h，m，h-6)，1.09(3h，s，20-ch3)，1.04(3h，d，j＝6.9hz，17-ch3)，1.01(3h，d，j＝6.9hz，16-ch3)。
[0073]
在本发明的具体实施例中，式1-4所示的5α,19β
–
二羟基-16-甲基雷公藤甲素的制备方法优选为：
[0074]
在100ml土豆液体培养基中接种5ml(108个/ml)短刺小克银汉霉(cunninghamella blakesleana)as 3.154孢子液，在ph至6.0，温度30℃
±
1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2μg的接种量，加入各重量比为(4:3:5)的茉莉酸甲酯(meja，0.45mmol/ml)、地塞米松(dxm，0.86mmol/ml)以及2,6-二甲基-β-环糊精(dimeb，1.45mmol/ml)，继续培养12h后，再按5％的接种量加入雷公藤甲素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2m l丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,洗脱液依次用石油醚，体积比为10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯，以及100％乙酸乙酯进行洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用乙腈：水(10：90(0min)；16：84(10min)；30：70(36min)；30：70(50min)，10：90(53min)；10：90(60min)梯度洗脱、收集保留时间为38～39.7min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到无色结晶，即为式1-4所示的5α,19β-二羟基-16-甲基雷公藤甲素；雷公藤甲素的转化率为92.36％。
[0075]
高分辨质谱给出分子离子峰[m 1]

在m/z407.1736。
13
c-nmr谱和1h-nmr如下：
[0076]
13
c nmr(151mhz，dmso)δ170.58(s，c-18)，160.46(s，c-4)，126.76(s，c-3)，97.23(d，c-19)，71.14(d，c-14)，69.64(s，c-5)，64.73(s，c-13)，64.13(s，c-9)，60.95(s，c-8)，59.92(s，c-7)，55.11(d，c-11)，54.23(d，c-12)，35.26(s，c-10)，29.12(t，c-6)，27.38(d，
c-15)，24.39(t，c-1)，22.20(t，c-2)，17.48(t，c-16)，16.30(q，c-17)，13.69(q，c-20)，12.54(q，c-21)。
[0077]1hnmr(600mhz，dmso)δ7.80(1h，s，19-oh)，7.61(1h，s，5-oh)，6.03(h，d，j＝7.5hz，h-19)，4.82(1h，d，j＝7.5hz，14-oh)，3.37(1h，d，j＝3.3hz，h-11)，3.55(1h，d，j＝3hz，h-12)，3.38(1h，d，j＝5.5hz，h-7)，3.34(d，j＝5.5hz，h-14)，2.24(1h，dd，j＝15，13hz，h-6)，2.16(1h，m，h-15)，2.14(1h，brd)，2.01(1h，m，h-2)，1.90(1h，m，h-6)，1.27(1h，td，j＝12.1，6.4hz，h-1)，1.20(1h，dd，j＝12.3，5.6hz，h-1)，0.97(3h，s，20-ch3)，0.89(3h，d，j＝6.9hz，17-ch3)，0.86(3h，t，j＝6.9hz，21-ch3)，0.76(2h，d，j＝6.9hz，16-ch2)。
[0078]
本发明首次发现雷公藤衍生物通过激活ampk/tsc2途径诱导肿瘤耐药细胞自噬。本发明首次发现雷公藤衍生物可以直接靶向chk1/2/cdc25a双靶点调控，诱导肿瘤耐药细胞自噬和周期阻滞，抑制耐药蛋白abcg2表达，逆转肿瘤顺铂耐药，和雷公藤甲素相比具有药效强，作用靶点新，药物毒性低的特点。
[0079]
在本发明中，所述治疗与肿瘤耐药相关药物优选包括治疗与肺肿瘤耐药相关药物、治疗与胃肿瘤耐药相关药物、治疗与肝肿瘤耐药相关药物、治疗与宫颈癌耐药相关药物或治疗与乳腺癌耐药相关药物，更优选为治疗与肺肿瘤耐药相关药物。
[0080]
本发明发现雷公藤衍生物通过ampk/tsc2途径，抑制mtor蛋白的表达，促进自噬的起始，激活ulk1复合体和class iii pi3k复合体的活化。促进atg7表达诱导自噬。在本发明中，所述雷公藤衍生物通过影响激活ampk/tsc2途径诱导肿瘤耐药细胞自噬。
[0081]
在本发明中，所述治疗与肿瘤耐药相关药物优选为肿瘤耐药细胞自噬诱导剂药物。在本发明中，所述雷公藤衍生物对癌细胞自噬的诱导作用是通过抑制tsc2 ser1387位点磷酸化，抑制mtor蛋白表达，促进自噬的起始；促进ampkthr172位点的磷酸化，对下游ulk1复合体class iii pi3k复合体进行活化诱导自噬。
[0082]
本发明提供一种治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物，包括药物活性组分和药物辅料，所述药物活性组分包括雷公藤甲素衍生物。
[0083]
本发明对所述药物辅料没有特殊要求，采用药学上课接收的辅料即可。
[0084]
在本发明中，所述药物活性组分优选还包括parp1抑制剂。
[0085]
在本发明的具体实施例中，所述parp1抑制剂具体优选为奥拉帕利。
[0086]
在本发明中，所述雷公藤甲素衍生物和parp1抑制剂的质量比优选为1:(1～100)，更优选为1:(1～10)。
[0087]
在本发明中，所述治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物优选为治疗肿瘤耐顺铂相关的药物组合物。
[0088]
在本发明中，所述治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物优选为肿瘤耐药细胞自噬诱导剂药物。
[0089]
在本发明中，所述肿瘤耐药细胞自噬诱导剂药物优选为p-tsc2蛋白激活剂、cdc25a蛋白抑制剂、mtor蛋白抑制剂或p-ampk蛋白激活剂。
[0090]
本发明对上述治疗与肿瘤耐药相关的药物组合物的制备方法没有特殊要求。
[0091]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的雷公藤甲素衍生物在制备治疗与肿瘤耐药相关药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0092]
实施例1
[0093]
本实施例针对顺铂耐药肺癌细胞细胞性能进行研究。
[0094]
步骤一：采用顺铂高浓度间歇诱导法建立耐药细胞模型：
[0095]
本实施例将a549、h460和nci-h1299细胞分别传代于培养瓶中，待第二天细胞融合率在80％左右时，加入600μl，浓度为100μg/ml的顺铂(cddp)溶液，使培养基中顺铂浓度为15μg/ml，2天后换液，换液前用pbs冲洗3次，间隔1天换新鲜1640完全培养基。经过高浓度顺铂冲击后，持续换液直到出现新的耐药克隆细胞。待新耐药克隆细胞聚集成团后，使用fcm running buffer清洗细胞，再加80μl fcm running buffer重悬混匀。向细胞悬液中加入10μl fcr，4℃条件下避光静置10min。加入10μl cd338-pe抗体，以及igg-2b-pe抗体(同型对照)。4℃避光静置20min，1000r/min条件下离心10min，用fcm running buffer重复洗涤3次。加入600μl fcm running buffer，轻柔混匀细胞，fcm上机检测。检测耐药蛋白的表达。
[0096]
在未进行顺铂刺激的亲本a549细胞中，abcg2蛋白阳性表达率仅为2.62％；检测用顺铂刺激的a549/ddp细胞中，发现abcg2阳性表达率为95.70％。在未进行顺铂刺激的亲本nci-h1299细胞中，abcg2蛋白阳性表达率仅为1.02％；顺铂刺激后，在nci-h1299/ddp细胞中，abcg2蛋白阳性表达率为57.84％。以上数据表明a549细胞株相比于nci-h1299细胞对于顺铂刺激更为敏感，abcg2蛋白阳性表达率相对更高，但两株耐药细胞abcg2蛋白阳性表达率对比其亲本细胞均显著提高，实验结果如图1～4所示：图1为本发明实施例1a549细胞cd338蛋白含量测定结果，图2为本发明实施例1a549/ddp细胞cd338蛋白含量测定结果；图3为本发明实施例1nci-h1299细胞cd338蛋白含量测定结果；图3为本发明实施例1nci-h1299/ddp细胞cd338蛋白含量测定结果。其中，图1～4中的(a)为阴性对照，图1～4中的(b)为同型对照；图1～4中的(c)为cd338蛋白含量测定结果。
[0097]
步骤二：耐药指数的测定
[0098]
分别培养亲本细胞a549、nci-h1299和耐药细胞a549/cddp、nci-h1299/cddp细胞，待细胞长至对数期时，将细胞以4
×
104个/ml的密度种于96孔板中，每孔加入100μl培养基。
[0099]
待细胞贴壁后加入不同浓度的顺铂(3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)和不同浓度一线的肺癌化疗药物依托泊苷(vp-16，120μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，20μg/ml，5μg/ml，1μg/ml)，以检测细胞对这两种药物的耐受程度。顺铂作用其亲本细胞与耐药细胞48h，mtt测得a549细胞ic50为1.167μg/ml，a549/ddp细胞ic50为6.123μg/ml，耐药指数5.2。nci-h1299细胞ic50为1.601μg/ml，nci-h1299/ddp细胞ic50为16.196μg/ml，耐药指数为10，依托泊苷作用其亲本细胞与耐药细胞48h，mtt测得a549细胞ic50为12.644μg/ml，a549/ddp细胞ic50为50.171μg/ml，耐药指数3.96。nci-h1299细胞ic50为7.99μg/ml，nci-h1299/ddp细胞ic50为32.169μg/ml，耐药指数为4.08，结果如表1所示，由表1可以得出：顺铂高浓度间歇诱导法构建的a549/ddp细胞和nci-h1299/ddp细胞对依托泊苷同样具有耐药性。
[0100]
表1cddp和vp-16对顺铂耐药的肺癌细胞及其亲本细胞的ic50
[0101][0102]
实施例2
[0103]
本实施例针对新雷公藤甲素衍生物对肺癌耐药细胞增殖的影响进行研究。
[0104]
将处于对数期的亲本非小细胞肺癌a549、nci-h1299细胞株和顺铂耐药的a549/cddp、nci-h1299/cddp细胞以4
×
104个/ml的密度种于96孔板中，每孔加入100μl培养基。待细胞贴壁后分别加入不同浓度的雷公藤甲素tp及雷公藤甲素衍生物hqu4x-8处理。对于a549和nci-h1299细胞、以及a549/cddp和nci-h1299/cddp耐药细胞，hqu4x-8作用于四种细胞的浓度均为：0.3125μmol/l，0.625μmol/l，1.25μmol/l，2.5μmol/l，5μmol/l，10μmol/l；tp作用于四种细胞的浓度均为：0.390625μmol/l，0.78125μmol/l，3.125μmol/l，6.25μmol/l，12.5μmol/l。作用48h，检测计算细胞相对存活率：细胞相对存活率＝(药物处理组od490－药物处理组od630)
÷
(对照组od490－对照组od630)
×
100％；耐药指数(ri)＝耐药细胞ic50
÷
亲本细胞ic50。
[0105]
测试结果为：hqu4x-8对a549和nci-h1299细胞48h的ic50分别为1.939μmol/l，1.117μmol/l；tp对a549和nci-h1299细胞48h的ic50分别为2.183μmol/l，1.104μmol/l；hqu4x-8对a549/cddp、nci-h1299/cddp细胞48h的ic50分别为2.249μmol/l，1.868μmol/l，tp对a549/cddp和nci-h1299/cddp细胞48h的ic50分别为1.511μmol/l，1.831μmol/l。结果表明，hqu4x-8同样具有抑制肺癌细胞以及耐药细胞增殖的作用，并且药效与tp相当。
[0106]
实施例3
[0107]
本实施例对hqu4x-8对人肺支气管上皮细胞(16hbe)的毒性大小进行研究。
[0108]
实验方法实施例1步骤二的耐药指数的测定方法基本相同，不同之处在于：以16hbe细胞为模型，以半数抑制率浓度(ic50)为指标，以tp为阳性对照药物，采用mtt法检测hqu4x-8对16hbe细胞增殖的影响。结果显示，hqu4x-8作用16hbe48h的ic50为2.681μmol/l，而tp的为0.418μmol/l，tp对16hbe细胞的毒性是hqu4x-8的6.4倍，hqu4x-8对正常细胞的毒性明显低于tp。
[0109]
实施例4
[0110]
本实施例针对hqu4x-8对耐药靶蛋白abcg2和mvp表达的变化进行研究。
[0111]
实验方法：取耐药细胞a549/cddp和nci-h1299/cddp，待细胞长至对数期时，将细
胞以4
×
104个/ml的密度种于6孔板中，24h后，用不同浓度的hqu4x-8(0.3125μmol/l、1.25μmol/l和2.5μmol/l l)处理细胞24h或用对照雷公藤甲素(0.3125μmol/l、1.25μmol/l和2.5μmol/l l)处理细胞2，4、6、8、12h后，收集细胞，提取蛋白，用western blotting法检测凋亡相关蛋白的变化。测试结果如图5所示。由图5得出：在a549/cddp细胞中，tp和hqu4x-8均能下调abcg2的表达(p＜0.001)，并且hqu4x-8的效果与tp相当(p＞0.05)。而在nci-h1299/cddp细胞中，hqu4x-8则均能抑制abcg2和mvp蛋白的表达。tp在6h时才表现出抑制nci-h1299/cddp细胞abcg2和mvp的表达作用，hqu4x-8在2h时就能发挥对这两种耐药蛋白的抑制表达的作用，起效时间比tp短，表明hqu4x-8对于下调nci-h1299/cddp细胞abcg2和mvp的表达比tp敏感。
[0112]
实施例5
[0113]
本实施例针对hqu4x-8诱导顺铂耐药的肺癌细胞凋亡的作用进行研究。
[0114]
将a549/cddp细胞和h1299/cddp细胞消化离心并重悬浮于相应培养液中，以2.5
×
105/孔的密度种植于6孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中过夜培养。第二天，用不同浓度的hqu4x-8处理细胞24h后，用fitc annexin v/pi双染法检测细胞凋亡的发生。
[0115]
实验结果如表2和表3所示：由表2和表3可以得出：tp作用于a549/cddp细胞4h，8h，12h，24h后早期凋亡率分别为：21.32％，39.81％，48.26％，57.53％；hqu4x-8组的分别为：21.45％，34.04％，30.74％，40.09％；tp作用于h1299/cddp细胞4h，8h，12h，24h后早期凋亡率分别为：18.80％，54.54％，61.15％，73.94％；hqu4x-8组的分别为：12.73％，16.02％，53.18％，51.68％。hqu4x-8对于诱导h1299/cddp细胞凋亡，作用更明显。tphqu4x-8对于同种细胞的差异主要表现在h1299/cddp细胞上。tp作用于h1299/cddp细胞后，在8h时就能明显的诱导细胞凋亡(早期凋亡率54.54％)，而hqu4x-8达到同样的效果则在12h。这可能与两种药物起效快慢以及毒性大小有关，tp起效较急但毒性较大，而hqu4x-8作用较为缓慢但毒性较小。
[0116]
表2tp和hqu4x-8诱导a549/cddp细胞各个时间点的凋亡率
[0117][0118]
表3tp和hqu4x-8诱导nci-h1299/cddp细胞各个时间点的凋亡率
[0119][0120]
实施例6
[0121]
本实施采用共聚焦显微镜检测hqu4x-8对肺癌耐药细胞自噬的诱导作用。
[0122]
本实施例使用共聚焦显微镜对hqu4x-8诱导的肺癌耐药细胞自噬的自噬进行检测。将a549/ddp，nci-h1299/ddp细胞消化计数，加入激光共聚焦培养皿中，每孔1.5
×
105个细胞，放入培养箱过夜，保证病毒感染时细胞汇合率为40％左右。将病毒置于冰上融化，取moi＝4对nci-h1299/ddp细胞进行病毒感染。加入腺病毒4h后，补加700μl 1640完全培养基。感染6h后，吸去含病毒的培养基，于第2天早上9点取出a549/ddp细胞，于第2天晚上9点取出nci-h1299/ddp细胞，移除废弃培养基，加入含药物的1640完全培养基(c＝0.3215μmol/l)，置于培养箱中继续培养12h和24h。观察自噬体和自噬溶酶体荧光强度。测试结果如图7、图8和图15所示，图7和图8为激光共聚焦显微镜观察hqu4x-8诱导a549/ddp细胞中自噬小体和自噬溶酶体的形成。0.3125μmol/l hqu4x-8分别加入转染mrfp-gfp-lc3腺病毒基因的a549/ddp和nci-h1299/ddp细胞12h和24h。图7和图8中黄色斑点表示自噬小体，红色斑点表示自噬溶酶体。柱形图图15(注：图15中，autophagosomes代表自噬小体，autophagolysosomes代表自噬溶酶体)表示单个细胞中形成自噬小体以及自噬溶酶体的数量，结果与con组相比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0123]
由图7、图8和图15显示：选用0.3125μmol/l hqu4x-8可以同时促进a549/ddp和nci-h1299/ddp肺癌耐药细胞自噬小体和自噬溶酶体的生成，增强自噬流的发生，而对照药物tp在此浓度诱导效应弱于新雷公藤衍生物hqu4x-8。
[0124]
实施例7
[0125]
本实施采用lc3/p62蛋白标记法检测hqu4x-8对细胞自噬的诱导作用。
[0126]
在自噬发生过程中，微管相关蛋白lc3合成后立即在其羧基端被自噬相关基因atg4所剪切，产生细胞浆定位的lc3-i，atg7和atg3进一步将lc3-i加工为lc3-ii，并包裹于自噬小体中。lc3-ii的含量与自噬的发生程度成正比，lc3-ii/lc3-i的比值可用于评价自噬。p62也被称为sqstm1，作为连接lc3和泛素化的底物，因此，本实施例选用lc3-ii/lc3-i和p62为指标，确认新雷公藤甲素衍生物hqu4x-8诱导耐药肺癌细胞发生自噬药物效应。
[0127]
实验方法：以新雷公藤衍生物hqu4x-8为实验药物，设置药物的浓度梯度为0.3125μmol/l、1.25μmol/l和2.5μmol/l，时间梯度为12h、24h和48h，实验独立重复3次，检测两种药物对自噬小体的标志分子lc3-ii、自噬底物标志物p62以及自噬流的调控效应western blotting法检测上述自噬相关蛋白的表达量的变化。
[0128]
检测结果如图9和图10，图9为雷公藤甲素和hqu4x-8(0.3125μmol/l、1.25μmol/l、2.5μmol/l)作用a549/ddp细胞12h，检测p62和lc3ii表达变化。图10为雷公藤甲素和hqu4x-8(0.3125μmol/l、1.25μmol/l、2.5μmol/l)作用nci-h1299/ddp细胞12h，检测p62和lc3ii表达。
[0129]
由图9和图10可以得出：hqu4x-8对细胞具有较强的选择性，对nci-h1299/ddp敏感性更强，hqu4x-8在12h，就表现出上调lc3ii和下调p62蛋白的显著效应。hqu4x-8在加药12h几乎完全降解p62蛋白，显示了更强的调控效应.
[0130]
实施例8
[0131]
本实施针对hqu4x-8通过ampk/tsc2激活效应来诱导肺癌耐药细胞自噬进行研究。
[0132]
实验方法；取耐药细胞a549/cddp和nci-h1299/cddp，待细胞长至对数期时，将细胞以4
×
104个/ml的密度种于6孔板中，置于37℃，5％co2培养箱中过夜培养。第二天，移除原培养基，用ampk/tsc2抑制剂预处理2h后，0.3125μmol/l hqu4x-8作用a549/ddp细胞12h、24h和48h；作用nci-h1299/ddp细胞12h和24h，检测tsc2及mtor表达变化，分别用western blotting检测ampk/tsc2相关蛋白的表达变化。检测结果如图11和图12所示。
[0133]
由图11和图12可以得出：hqu4x-8对nci-h1299/ddp细胞敏感，hqu4x-8可以在12h显著促进tsc2 s1387位点磷酸化，抑制mtor蛋白表达，在a549/ddp细胞中发现，药物干预24h后，可以激活ampk thr172位点的磷酸化，同时促进atg13和ulk1表达，激活ulk1 ser317位和beclin1 ser93/96位点的磷酸化，此外还上调pi3k class iii蛋白表达，进而促进ulk1复合体和class iii pi3k复合体的活化。而对照组和tp组对ampk/tsc2激活效应较弱，雷公藤新衍生物显示了不同的药物效应。
[0134]
实施例9
[0135]
本实施针对6hqu4x-8对g1/s期cdc25a靶蛋白的调控效应进行研究。
[0136]
实验方法：以雷公藤衍生物hqu4x-8和tp为实验药物，设置药物的浓度梯度为0.3125μmol/l、1.25μmol/l和2.5μmol/l，时间梯度为12h、24h和48h，实验独立重复3次，检测两种药物对自噬小体的g1/s期cdc25a靶蛋白调控效应，western blotting法检测上述相关蛋白的表达量的变化。检测结果如图13，图13为雷公藤甲素和hqu4x-8对a549/ddp细胞和nci-h1299/ddp细胞用药物浓度为1.25μmol/l分别处理2h、4h和6h，检测atm-p53途径及myc途径相应蛋白表达变化。
[0137]
由图13可以得出：对于a549/ddp细胞，tp呈现靶向atm/p53/c-myc/cdc25a的调控作用，hqu4x-8呈现c-myc/cdc25a的调控作用；对于nci-h1299/ddp，tp靶向chk2/c-myc/cdc25a的作用，hqu4x-8呈现chk1/2/cdc25a的负调控作用，体现了不同的调控效应。在nci-h1299/ddp细胞，hqu4x-8靶向chk1/2/cdc25a的直接负调控要强于tp，显示了二者在诱导肺癌耐药细胞周期阻滞方面的不同机制。
[0138]
实施例10
[0139]
本实施针对hqu4x-8对parp1的靶点调控效应进行研究。
[0140]
实验方法：以新雷公藤衍生物hqu4x-8和tp为实验药物，设置药物的浓度梯度为0.3125μmol/l、1.25μmol/l和2.5μmol/l，时间梯度为12h、24h和48h，实验独立重复3次，检测两种药物对自噬小体的parp1的靶点调控效应，western blotting法检测上述相关蛋白的表达量的变化。检测结果如图14，图14为雷公藤甲素和hqu4x-8对a549/ddp细胞和nci-h1299/ddp细胞用药物浓度为0.3125μmol/l分别处理2h、4h和6h对parp1的靶点调控效应。
[0141]
由图14可以得出：hqu4x-8对两种耐药细胞都有显著促进parp1剪切的调控效应，具有一定的时间依赖性，虽然tp也有类似调控作用，但是在调控的效应上，hqu4x-8的促剪切作用比tp更为显著。表明hqu4x-8在通过靶向促进parp1剪切，促进肿瘤耐药细胞凋亡方面相比tp具有更强的活性，显示了一定的优势。
[0142]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。