一种靶向B7-H3的抗体药物偶联物、其制备方法及应用与流程

一种靶向b7-h3的抗体药物偶联物、其制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种靶向b7-h3的抗体药物偶联物、其制备方法及应用。


背景技术：

2.b7-h3又名cd276，最早于2001年报道(chapoval ai等，nat immmunol 2001，2(3)：269-274)，因其蛋白缺少一个heptad结构以及b30.2结构域而被认为不属于嗜乳脂蛋白和髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白，并鉴定其属于免疫球蛋白超家族成员b7家族(chapoval ai等，nat immmunol 2001，2(3)：269-274)，与家族其它成员如pd-l1、b7-h4、cd80、cd86等不同的是：b7-h3在人体中以两种不同的变体形式存在即2igb7-h3和4igb7-h3，其中4igb7-h3为2igb7-h3的外显子复制，人体中主要以4igb7-h3的形式存在(sun m等，the journal of immunology 2002，168(12)：6294-6297；ling v等，genomics 2003，82(3)：365-377；steinberger p等，j immunol 2004，172(4)：2352-2359)，而在鼠中只含有2igb7-h3结构(sunm等，the journal of immunology 2002，168(12)：6294-6297)。研究结果显示天然小鼠的2igb7-h3与人的4igb7-h3显示出相似的功能且无功能差异(ling v等，genomics 2003，82(3)：365-377；hofmeyer ka等，proc natl acad sci u s a 2008，105(30)：10277-10278.)，晶体结构表明该蛋白igv区的fgloop是b7-h3发挥功能的重要表位(vigdorovich v等，structure 2013，21(5)：707-717)。
3.虽然b7-h3的mrna水平表达较为广泛，比如可在人体诸多组织器官中包括心脏、肝、胎盘、前列腺、睾丸、子宫、胰腺、小肠以及结肠中等检查到高水平的b7-h3的mrna水平，但蛋白表达水平相对局限在静息的成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、羊水干细胞等非免疫细胞，以及受诱导的抗原提呈细胞、nk细胞表面(hofmeyer ka等，proc natl acad sci us a 2008，105(30)：10277-10278；yikh等，immunol rev 2009，229(1)：145-151；picardae等，clin cancer res 2016，22(14)：3425-3431)。b7-h3蛋白水平在正常健康组织中低表达，比如可在正常人体的肝、肺、膀胱、睾丸、前列腺、乳房、胎盘、淋巴器官等组织可检测到b7-h3较低的蛋白水平，但b7-h3蛋白在大量的恶性肿瘤中过表达，是肿瘤细胞的一个标志性抗原，研究表明b7-h3可在前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、恶性神经胶质瘤以及骨肉瘤等诸多癌症中高表达，特别是在头颈部癌、肾癌、脑胶质瘤以及甲状腺癌等多种癌症中异常高表达(roth tj等，cancer res2007，67(16)：7893-7900；zang x等，modern pathol 2010，23(8)：1104-1112；ingebrigtsen va等，intjcancer2012，131(11)：2528-2536；sun j等，cancer immunology，immunotherapy 2010，59(8)：1163-1171；crispen pl等，clin cancer res 2008，14(16)：5150-5157；zhang g等，lung cancer 2009，66(2)：245-249；yamato i等，brj cancer 2009，101(10)：1709-1716；tekle c等，int j cancer 2012，130(10)：2282-2290；katayamaa等，intjoncol 2011，38(5)：1219-1226；wucp等，world j gastroenterol2006，12(3)：457-459；wud等，oncollett2015，9(3)：1420-1424)，b7-h3不仅表达肿瘤细胞上，在肿瘤新生血管内皮细胞
上同样高表达，是一个非常广谱的肿瘤标志性抗原。b7-h3蛋白高表达可促进癌症进展，与患者的不良预后及较差的生存获益有关。
4.虽然早期研究结果表明b7-h3可刺激活化t细胞功能，促进cd4及cd8细胞的增殖以及ifn-γ的分泌，但不断深入的研究已表明b7-h3作为一种免疫检查点，是t细胞的负调节分子，主要起着抑制t细胞功能、下调t细胞活性的作用。woong-kyung suh以及durbaka v.r.prasad的研究均表明鼠的b7-h3蛋白可剂量依赖性的显著抑制cd4、cd8细胞的增殖(suhw等，natimmunol 2003，4(9)：899-906；prasad dvr等，the journal of immunology 2004，173(4)：2500-2506)。judith leitner等人的研究同样表明人的4ig-b7-h3ig以及2ig-b7-h3ig在体外均可抑制t细胞的增殖，以及抑制cd4、cd8细胞的相关细胞因子(ifn-γ、il-2、il-10、il-13)的分泌(leitner j等，eurjimmunol 2009，39(7)：1754-1764)，进一步分析指出b7-h3主要是通过抑制il-2的产生从而介导抑制t细胞增殖。而在小鼠体内靶向中和b7-h3的抗体可显著促进实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)的进展以及促进cd4细胞的增殖，客观说明了b7-h3在体内抑制t细胞的功能(prasad dvr等，the journal of immunology2004，173(4)：2500-2506)。在woong-kyung sub的研究中b7-h3缺陷型小鼠相比野生型小鼠在免疫eae条件下同样显示更早地发生实验性自身免疫性脑脊髓炎(由th1细胞引起)，说明b7-h3主要抑制th1细胞(suhw等，nat immunol 2003，4(9)：899-906)。如上所述b7-h3对t细胞的功能存在争论，但b7-h3促进t细胞功能目前只出现在小鼠的研究中，而人b7-h3促进t细胞功能暂未有报道，虽然b7-h3的受体未确定，但目前学界主要观点认为b7-h3是t细胞的负调控分子。
5.基于b7-h3可抑制t细胞活性从而介导肿瘤细胞逃逸免疫监视，因此阻断b7-h3与未知受体的结合从而介导t细胞活化以及抑制肿瘤细胞活性是行之有效的，比如enoblituzumab的现有临床结果表明其对不同肿瘤均有不同程度的缓解，具有较好的疗效，但仍有多名患者发生疾病进展，因此单纯开发针对b7-h3的单克隆抗体仍有较大的临床未满足，现有临床结果表明其抗肿瘤效果有待进一步改善。
6.抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，adc)是新一代抗体靶向治疗药物，主要应用于癌症肿瘤的治疗。adc药物由小分子细胞毒性药物(drug)、抗体(antibody)以及连接抗体和细胞毒性药物的连接子(linker)三部分组成，小分子细胞毒性药物通过化学偶联的方法结合到抗体蛋白上。adc药物利用抗体特异地识别并引导小分子药物到达表达癌症特异性抗原的癌细胞靶点，并通过细胞内吞效应进入癌细胞。接头部分在胞内低ph值环境或溶酶体蛋白酶的作用下断裂，释放出小分子细胞毒性药物，从而达到特异杀死癌细胞而不损伤正常组织细胞的作用。因此，adc药物同时结合了抗体的靶向专一性和小分子毒素对癌细胞的高毒性的特点，大大扩展了药物的有效治疗剂量窗口(therapeutic window)。临床研究已证明，adc药物的药效高、在血液中相对稳定，能有效地降低小分子细胞毒性药物(化药)本身对循环系统以及健康组织的毒性，是目前国际上抗癌药物的研发热点。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是克服现有的抗体药物偶联物种类单一的缺陷，而提供了一种靶向b7-h3的抗体药物偶联物、其制备方法及应用。
8.本发明提供的抗体药物偶联物具有很好的靶向性，对阳性表达b7-h3的肿瘤细胞
具有很好的抑制效果，并且，具有很好的成药性和安全性。该抗体药物偶联物具有b7-h3的抑制效果，还对nci-n87、a375、ln-229、pa-1、mda-mb-468、calu-6和hs-700t细胞中的至少一种有良好的抑制效果。
9.本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
10.本发明提供了一种如式i所示的抗体药物偶联物或药学上可接受的盐；
[0011][0012]
其中，ab为b7-h3抗体；m为2～8；
[0013]
所述的b7-h3抗体中轻链的氨基酸序列如序列表seq id no：1所示，重链的氨基酸序列如序列表seq id no：2所示；
[0014]
d为
[0015]
r2和r5分别独立地为h、c
1-c6烷基或卤素；
[0016]
r3和r6分别独立地为h、c
1-c6烷基或卤素；
[0017]
r4和r7分别独立地为c
1-c6烷基；
[0018]
r1为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基、被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基、c1～c6烷基或c3～c
10
环烷基；所述的r
1-1
、r
1-2
和r
1-3
分别独立地为c1～c6烷基；
[0019]
l1独立地为苯丙氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基和缬氨酸残基中的一种或多种；p为2～4；
[0020][0021]
其中n独立地为1～12，c端通过羰基与l1相连，f端与所述的l3的d端相连；
[0022]
l3为其中b端和所述的ab相连，d端与所述的l2的f端相连。
[0023]
在本发明一优选实施方案中，上述的抗体偶联药物里，某些基团具有如下定义，未提及的基团的定义如上任一方案所述(本段内容以下简称为“在本发明一优选实施方案中”)：
[0024]
所述的l3的b端优选为与所述的抗体上的巯基以硫醚的形式相连。以为例，与所述的抗体中的半胱氨酸残基的连接形式为
[0025]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r2和r5分别独立地为c
1-c6烷基时，所述的c1～c6烷基优选为c1～c4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
[0026]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r2和r5分别独立地为卤素时，所述的卤素优选为氟、氯、溴或碘，进一步优选为氟。
[0027]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r3和r6分别独立地为c
1-c6烷基时，所述的c1～c6烷基优选为c1～c4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
[0028]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r3和r6分别独立地为卤素时，所述的卤素优选为氟、氯、溴或碘，进一步优选为氟。
[0029]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r4和r7分别独立地为c
1-c6烷基时，所述的c1～c6烷基优选为c1～c4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为乙基。
[0030]
在本发明一优选实施方案中，r2和r5分别独立地为c
1-c6烷基。
[0031]
在本发明一优选实施方案中，r3和r6分别独立地为卤素。
[0032]
在本发明一优选实施方案中，r4和r7为乙基。
[0033]
在本发明一优选实施方案中，d为
[0034]
在本发明一优选实施方案中，当所述的d为
时，所述的抗体药物偶联物可为所述的抗体药物偶联物可为
[0035]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r1为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基时，所述的c1～c6烷基优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，更优选为乙基。
[0036]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r1为被多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基时，所述的多个为两个或三个。
[0037]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r
1-1
和r
1-2
各自独立地为c1～c6烷基时，所述的c1～c6烷基优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，更优选为甲基。
[0038]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r1为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基时，所述的-nr
1-1r1-2
优选为-n(ch3)2。
[0039]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r1为被一个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基时，所述的被一个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基优选为
[0040]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r1为被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基时，所述的c1～c6烷基优选为c1～c4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为乙基。
[0041]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r1为被多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基时，所述的多个为两个或三个。
[0042]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r
1-3
为c1～c6烷基时，所述的c1～c6烷基优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，更优选为甲基。
[0043]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r1为被一个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基时，所述的被一个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基为
[0044]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r1为c1～c6烷基时，所述的c1～c6烷基优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
[0045]
在本发明一优选实施方案中所述的m为整数(例如2、3、4、5、6、7或8)或非整数，优选为4-8，更优选为6-8，进一步优选为7-8，再进一步优选地为7.4-7.85，例如7.47、7.48、7.52、7.62、7.64、7.65、7.67、7.72、7.78、7.83或7.85。
[0046]
在本发明一优选实施方案中，所述的l1优选为苯丙氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基和缬氨酸残基中的一种或多种，进一步优选为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基，所述的多种优选为两种或三种，所述的p优选为2。
[0047]
在本发明一优选实施方案中，所述的(l1)
p
优选为其中g端通过羰基和所述的l2的c端相连。
[0048]
在本发明一优选实施方案中，所述的n优选为8～12，例如8、9、10、11和12，再例如8或12。
[0049]
在本发明一优选实施方案中，当所述的r
1-1
、r
1-2
和r
1-3
独立地优选为c1～c6烷基时，所述的c1～c6烷基优选c1～c4烷基，进一步优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，最优选为甲基。
[0050]
在本发明一优选实施方案中，所述的r1为被一个或多个-nr
i-1r1-2
取代的c1～c6烷基、被一个或多个r
1-3
8(o)
2-取代的c1～c6烷基、或、c1～c6烷基；进一步优选为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基、或、被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基；最优选为被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基。
[0051]
在本发明中，当ab为b7-h3抗体时，所述的b7-h3抗体为b7-h3抗体的残基(b7-h3抗体中的一个巯基上的氢被取代形成的基团)。
[0052]
在本发明一优选实施方案中，所述的如式i所示的化合物为如下任一方案：
[0053]
方案一：
[0054]
r2和r5分别独立地为c
1-c6烷基；
[0055]
r3和r6分别独立地为卤素，d优选
[0056]
r1为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基、被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～6烷基、或、c1～c6烷基；
[0057]
l1为苯丙氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基和缬氨酸残基中的一种或多种；
[0058]
方案二：
[0059]
r2和r5分别独立地为c
1-ca烷基；
[0060]
r3和r6分别独立地为卤素，d优选
[0061]
m为7～8，
[0062]
r1为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基、被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～26烷基、或、c1～c6烷基；
[0063]
l1独立地为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基；
[0064]
方案三：
[0065]
d为
[0066]
r1为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基、被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基、或、c1～c6烷基；
[0067]
方案四：
[0068]
d为
[0069]
m为7～8，
[0070]
r1为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基、被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基、或、c1～c6烷基；
[0071]
l1独立地为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基。
[0072]
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物优选为
[0073][0074]
在本发明一优选实施方案中，所述的l2优选为
[0075]
在本发明一优选实施方案中，所述的ab为b7-h3抗体；d为
[0076]
l1为缬氨酸残基和/或丙氨酸残基，p为2，(l1)p优选为r1为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基、被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基或c1～c6烷基，优选为被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基、或、被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基，进一步优选为被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～c6烷基；所述的r
1-1
、r
1-2
和r
1-3
独立地为c1～c4烷基，优选为甲基；所述
的被一个或多个-nr
1-1r1-2
取代的c1～c6烷基优选为所述的被一个或多个r
1-3
s(o)
2-取代的c1～26烷基优选为l2为l3为
[0077]
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物优选为如下所示的任一化合物：
[0078]
[0079]
[0080][0081]
其中，ab为b7-h3抗体，m为7.47、7.48、7.52、7.62、7.64、7.65、7.67、7.72、7.78、7.83或7.85。
[0082]
在本发明一优选实施方案中，所述的抗体药物偶联物优选为如下所示的任一化合物：
[0083]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.64；
[0084]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.67；
[0085]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.83；
[0086]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.65；
[0087]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.78；
[0088]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.62；
[0089]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.48；
[0090]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.52；
[0091]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.47；
[0092]
ab为b7-h3抗体m优选为7.85；或
[0093]
ab为b7-h3抗体，m优选为7.72。
[0094]
本发明还提供了一种上述抗体药物偶联物的制备方法，其包括以下步骤：将如式ii所示的化合物与ab-氢进行如下所示的偶联反应即可；
[0095][0096]
其中，所述的l1、l2、l3、r1、p和ab的定义如上所述。
[0097]
本发明中，所述的偶联反应的条件和操作可为本领域该偶联反应常规的条件和操作。
[0098]
本发明还提供了一种药物组合物，其包括物质x和药用辅料，所述的物质x为上述抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐。
[0099]
所述的药物组合物中，所述的上述的物质x的用量可为治疗有效量。
[0100]
本发明还提供了一种上述的物质x或上述的药物组合物在制备b7-h3蛋白抑制剂中的应用。
[0101]
本发明还提供了一种上述的物质x或上述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用，所述的肿瘤优选b7-h3阳性肿瘤。所述的b7-h3阳性肿瘤优选b7-h3阳性肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、前列腺癌和胃癌的一种或多种。
[0102]
在本发明某些实施方案中，在所述的肺癌中，肺癌细胞为nci-1703细胞或calu-6
细胞；
[0103]
在本发明某些实施方案中，在所述的卵巢癌中，卵巢癌细胞为pa-1细胞；
[0104]
在本发明某些实施方案中，在所述的黑色素瘤中，黑色素瘤细胞为a375细胞；
[0105]
在本发明某些实施方案中，在所述的胰腺癌中，胰腺癌细胞为hs-700t细胞；
[0106]
在本发明某些实施方案中，在所述的乳腺癌中，乳腺癌细胞为mda-mb-468细胞；
[0107]
在本发明某些实施方案中，在所述的脑胶质瘤中，脑胶质瘤细胞为ln-229细胞；
[0108]
在本发明某些实施方案中，在所述的胃癌中，胃癌细胞为nci-n87细胞。
[0109]
除非另有说明，在本发明说明书和权利要求书中出现的以下术语具有下述含义：
[0110]
所述的药用辅料可为药物生产领域中广泛采用的辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物，还可以提供方法，使受试者接受给药后活性成分以所期望速率溶出，或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体ph值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可包括下列辅料中的一种或多种：缓冲剂、螯合剂、防腐剂、助溶剂、稳定剂、赋形剂和表面活性剂着色剂、矫味剂和甜味剂。
[0111]
术语“药学上可接受的”是指盐、溶剂、辅料等一般无毒、安全，并且适合于患者使用。所述的“患者”优选哺乳动物，更优选为人类。
[0112]
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与相对无毒的、药学上可接受的酸或碱制备得到的盐。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括但不限于：锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、镁盐、锌盐、铋盐、铵盐、二乙醇胺盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的药学上可接受的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。所述的药学上可接受的酸包括无机酸，所述无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、磷酸、亚磷酸、硫酸等。所述的药学上可接受的酸包括有机酸，所述有机酸包括但不限于：乙酸、丙酸、草酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、异烟酸、酸式柠檬酸、油酸、单宁酸、泛酸、酒石酸氢、抗坏血酸、龙胆酸、富马酸、葡糖酸、糖酸、甲酸、乙磺酸、双羟萘酸(即4，4
’‑
亚甲基-双(3-羟基-2-萘甲酸))、氨基酸(例如谷氨酸、精氨酸)等。当本发明的化合物中含有相对酸性和相对碱性的官能团时，可以被转换成碱加成盐或酸加成盐。具体可参见berge et al.，
″
pharmaceutical salts
″
，journal of pharmaceutical science 66：1-19(1977)、或、handbook of pharmaceutical salts：properties，selection，and use(p.heinrich stahl and camille g.wermuth，ed.，wiley-vch，2002)。
[0113]
天然或者天然序列的b7-h3可以分离自大自然，也可以用重组dna技术、化学合成法，或以上及类似技术的联合制得。
[0114]
抗体在此取其最广义的解释，其可透过位于该免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原辨认区特异性地与目标结合，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。具体包括完整的单克隆抗体，多克隆抗体，双特异抗体以及抗体片段，只要他们具有所需的生物活性。
[0115]
本发明的抗体可利用该领域广为周知的技术制备，例如杂交瘤方法、重组dna技
术、噬菌体展示技术、合成技术或该等技术的组合、或该领域己知的其它技术。
[0116]
关于术语“药物抗体偶联比率”(drug-antibody ratio，即dar)的说明。l-d是和抗体上的缀合点具反应性的基团，l是连接子，d是在连接l的抗体上进一步缀合的细胞毒剂，在本发明中d为dxd，每个抗体最终缀合d的dar数目用m表示或者m也可表示单个抗体缀合d的数量。在一些实施方式中，m实际上为介于2至8、4至8或6至8的平均值，或m为2、3、4、5、6、7或8中的某个整数；在一些实施方式中，m为2、4、6、或8的平均值；在其它实施方式中，m为2、3、4、5、6、7或8的平均值。
[0117]
连接子是指抗体与药物间的直接或间接连接。将连接子连接至mab可经由许多方式完成，诸如经由表面赖氨酸、还原偶合至经氧化的碳水化合物、及经由还原链间二硫键所释放的半胱氨酸残基。多种adc连接系统是该领域所知，包括以腙、双硫及肽为基底的连接。
[0118]
术语“治疗”或它的同等表达当用于例如癌症时，指用来减少或消除患者体内癌细胞数目或减轻癌症的症状的程序或过程。癌症或另外的增生性障碍的“治疗”不一定指癌症细胞或其它障碍会实际上被消除，细胞或障碍的数目会实际上被减少或者癌症或其它障碍的症状会实际上被减轻。通常，即使只具有低的成功可能性也会进行治疗癌症的方法，但是考虑到患者的病史和估计的生存预期，其仍然被认为诱导总体有益的作用过程。
[0119]
术语“预防”是指获得或发生疾病或障碍的风险降低。
[0120]
术语“环烷基”是指具有三到二十个碳原子的饱和的环烃原子团(例如c
3-c6环烷基)，包括单环环烷基。环烷基包含3至20个碳原子，优选包含3至10个碳原子，更优选包含3至6个碳原子。环烷基的实例包括但不仅限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基和环癸基。
[0121]
术语“烷基”是指具有指定的碳原子数的直链或支链烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基及其类似烷基。
[0122]
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
[0123]
术语“杂芳基”是指含有1、2、3或4个独立选自n、o和s的杂原子的芳基(或芳环)，其可以是单环的芳香体系，例如呋喃基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、异唑基、噁唑基、二唑基、咪唑基、吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、噻唑基、异噻唑基等。
[0124]
术语“芳基”是指任何稳定的的单环或者双环碳环，其中所有环均为芳香环。上述芳基单元的实例包括苯基或萘基。
[0125]
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0126]
如无特殊说明，本发明中的室温是指20-30℃。
[0127]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0128]
本发明的积极进步效果在于：
[0129]
1.本发明提供的包含有b7-h3抗体的抗体药物偶联物，具有很好的靶向性，对表达b7-h3等的多种肿瘤细胞具有很好的抑制效果。
[0130]
2.体内研究表明，本发明的抗体药物偶联物具有更佳的体外细胞毒性、体内抗肿瘤活性。
[0131]
3.本发明的抗体药物偶联物溶解性好，具有很好的成药性，偶联制备过程无沉淀
等异常现象发生，非常利于抗体药物偶联物的制备。
附图说明
[0132]
图1为fda016抗体的轻、重链表达载体构建，其中ab-l为抗体的轻链，ab-h为抗体的重链。
具体实施方式
[0133]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0134]
缩写说明：
[0135]
pcr
ꢀꢀꢀꢀꢀ
聚合酶链反应
[0136]
cho
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
中国仓鼠卵巢细胞
[0137]
htrf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
均相时间分辨荧光
[0138]
pb
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
磷酸缓冲液
[0139]
edta
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙二胺四乙酸
[0140]
tecp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三(2-羧乙基)膦
[0141]
dmso
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二甲基亚砜
[0142]
dmf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n，n-二甲基甲酰胺
[0143]
hatu
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2-(7-氧化苯并三氮唑)-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲六氟磷酸盐
[0144]
v/v
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
v/v，体积比
[0145]
uv
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
紫外可见光
[0146]
elisa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
酶联免疫吸附试验
[0147]
bsa
ꢀꢀꢀꢀꢀ
牛血清白蛋白
[0148]
rpm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
转/每分钟
[0149]
fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀ
胎牛血清
[0150]
实施例1：b7-h3抗体的制备
[0151]
本发明中选取高亲和力并特异性靶向b7-h3的单克隆抗体fda016，其轻链的氨基酸序列如seq id no：1所示，其重链的氨基酸序列如seq id no：2所示。fda016其轻重链核苷酸序列通过全基因合成(苏州金唯智)方式获得。通过ecor i和hind iii(购于takara)双酶切分别单独构建至pv81载体中(如图1)，通过连接转化至trans1-t1感受态细胞(购自北京全式金生物，货号：cd501-03)中，从中挑取克隆进行pcr鉴定并送检、测序确认，培养扩增阳性克隆进行质粒中抽，从而获得抗体轻链真核表达质粒fda016-l/pv81和抗体重链真核表达质粒fda016-h/pv81，对这两个质粒使用xbai(购自takara，货号：1093s)进行酶切线性化，轻、重链真核表达质粒比例1.5/1，通过电击转化至已适应悬浮生长的cho细胞中(购于atcc)，将电击后细胞以2000-5000细胞/孔接至96孔板中，培养3周后使用htrf法(均相时间分辨荧光)测定表达量，从中挑选表达量前十的细胞池扩增后冻存。复苏一支细胞至125ml摇瓶中(培养体积30m1)，37℃，5.0％co2，130rpm震荡培养，3天后扩至1000ml摇瓶中(培养体积300ml)，37℃，5.0％co2，130rpm震荡培养，第四天开始隔天补加起始培养体积5-8％的
补料培养基，培养至10-12天结束培养，收获液9500rpm离心15min，去除细胞沉淀，收集上清液，再用0.22μm滤膜过滤处理，处理好的样品使用mabselect亲和层析柱(购于ge公司)进行纯化得到抗体fda016。
[0152]
fda016的轻链氨基酸序列如下所示：
[0153]
seq id no：1：
[0154][0155]
fda016的重链氨基酸序列如下所示：
[0156]
seq id no：2：
[0157][0158]
实施例2：连接基-药物偶联物的合成
[0159]
实施例2-1：le12的合成
[0160][0161]
中间体2的合成：
[0162]
将(s)-2-叠氮丙酸(10g，86.9mmol)与4-氨基苄醇(21.40g，173.8mmol)溶于300ml二氯甲烷和甲醇混合溶剂中(体积比2∶1)，加入2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1，2-二氢喹啉(21.49g，86.9mmol)，室温反应5小时后，减压蒸干溶剂，然后，所得粗品用硅胶柱层析[二氯甲烷∶乙酸乙酯＝1∶1(v/v)]纯化得到中间体2(16.3g，收率85％)，esi-msm/z：221(m h)。
[0163]
中间体3的合成：
[0164]
将中间体2(15g，68.2mmol)与二(对硝基苯)碳酸酯(22.82g，75.02mmol)混合溶于200ml无水n，n-二甲基甲酰胺中，加入25ml三乙胺，室温反应2小时。通过液质联用色谱监测原料反应完毕后，加入甲胺盐酸盐(6.91g，102.3mmol)，继续室温反应1小时。反应完毕减压
蒸馏去除大部分溶剂，然后加入200ml水，200ml乙酸乙酯，分液后收集有机相，有机相经干燥后浓缩，所得粗品经过硅胶柱层析[二氯甲烷∶乙酸乙酯＝10∶1(v/v)]纯化得到中间体3(18.9g，收率100％)，esi-ms m/z：278(m h)。
[0165]
中间体5的合成：
[0166]
将中间体3(10g，36.1mmol)与多聚甲醛(1.63g，54.2mmol)混合溶于150ml无水二氯甲烷中，慢慢加入三甲基氯硅烷(6.28g，57.76mmol)，室温反应2小时得到中间体4的粗品溶液，通过取样加甲醇淬灭后液质联用监测反应，待反应完毕将反应液过滤然后向滤液中加入羟基乙酸叔丁酯(9.54g，72.2mmol)和三乙胺(10ml，72.2mmol)，继续室温反应2小时。反应完毕减压蒸馏去除大部分溶剂，所得粗品经过硅胶柱层析[石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1(v/v)]纯化得到中间体5(11.2g，收率74％)，esi-ms m/z：422(m h)。
[0167]
中间体6的合成：
[0168]
将中间体5(10g，23.8mmol)溶于80ml无水四氢呋喃中，加入80ml水，然后加入三(2-羧乙基膦)盐酸盐(13.6g，47.6mmol)，室温反应4小时。反应完毕减压蒸馏去除四氢呋喃，然后加乙酸乙酯萃取，所得有机相经干燥后减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(v/v)]纯化得到中间体6(8.1g，收率86％)，esi-ms m/z：396(m h)。
[0169]
中间体8的合成：
[0170]
将的中间体6(5g，12.7mmol)溶于60ml二氯甲烷和甲醇混合溶剂中(v/v＝2∶1)中，慢慢加入三氟乙酸3ml，室温反应30分钟。反应完毕加等体积水和乙酸乙酯，有机相干燥后浓缩，所得粗品直接用于下一步。
[0171]
将上述步所获得的粗品溶于50ml无水n，n-二甲基甲酰胺中，加入fmoc-缬氨酸羟基琥珀酰亚胺酯(8.3g，19.1mmol)，三乙胺(5ml)，室温反应2小时。反应完毕，减压蒸馏去除大部分溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(v/v)]纯化得到中间体8(5.4g，收率64％)，esi-msm/z：661(m h)。
[0172]
中间体9的合成：
[0173]
将中间体8(1g，1.5mmol)与exatecan甲磺酸盐(0.568g，1mmol)混合于30ml无水n，n-二甲基甲酰胺中，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n，n，n
′
，n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐(1.14g，3.0mmol)，三乙胺2ml，室温反应2h。反应完毕，减压蒸馏去除溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝10∶1(v/v)]纯化得到中间体9(0.94g，收率87％)，esi-ms m/z：1078(m h)。
[0174]
化合物le12的合成：
[0175]
将中间体9(1g，0.929mmol)溶于20ml无水dmf中，加入0.5ml 1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯，室温反应1小时。待原料反应完毕，直接加入6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(428.5mg，1.39mmol)，室温搅拌1小时。减压馏去溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝8∶1(v/v)]纯化得到标题化合物(0.7g，收率73％)，esi-ms m/z：1035(m h)。
[0176]
实施例2-2：化合物le13的合成
[0177][0178]
中间体14的合成
[0179]
将市售的中间体12(267mg，0.8mmol)与多聚甲醛(50mg，1.6mmol)混合溶于20ml无水二氯甲烷中，慢慢加入三甲基氯硅烷(0.3ml，3.4mmol)，加料完毕后室温反应2小时。然后通过取样加甲醇淬灭后液质联用监测反应，待反应完毕后将反应液过滤，然后向滤液中加入羟基乙酸叔丁酯(211mg，1.6mmol)和潘必啶0.5ml，继续室温反应约2小时，反应完后减压蒸馏去除大部分溶剂，所得粗品经过硅胶柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝20∶1(v/v)]纯化得到中间体14(260mg，收率68％)，esi-ms m/z：479(m h)。
[0180]
中间体15的合成
[0181]
将中间体14(238mg，0.50mmol)溶于6ml二氯甲烷和甲醇混合溶剂中(v/v＝2∶1)中，慢慢加入三氟乙酸0.3ml，室温反应30分钟。反应完毕加等体积水和乙酸乙酯，有机相干燥后浓缩，所得粗品直接用于下一步。
[0182]
中间体16的合成
[0183]
将上述步骤所获得的粗品与exatecan甲磺酸盐(170mg，0.30mmol)混合于5ml无水
n，n-二甲基甲酰胺中，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲六氟磷酸盐(341mg，0.90mmol)，三乙胺0.60ml，室温反应2h。反应完毕，减压蒸馏去除溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝10∶1(v/v)]纯化得到中间体16(210mg，83％)，esi-ms m/z：840(m h)。
[0184]
中间体17的合成
[0185]
将中间体16(100mg，0.12mmol)溶于15ml无水四氢呋喃中，加入3ml水，然后加入1摩尔/升的三乙基膦水溶液0.3ml，室温反应4小时。监测反应完毕后将反应液减压蒸馏去除四氢呋喃，向所余水溶液中加碳酸氢钠调节ph至中性，然后加二氯甲烷萃取，所得有机相干燥后减压蒸除溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(v/v)]纯化得到中间体17(69mg，收率71％)，esi-ms m/z：814(m h)。
[0186]
化合物le13的合成
[0187]
按照上步合成方法得到的中间体17(120mg，0.15mmol)与市售的原料mc-v(102mg，0.33mmol)混合于40ml二氯甲烷中，加入缩合剂2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1，2-二氢喹啉(82mg，0.33mmol)，室温反应过夜，反应完毕减压蒸干溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(v/v)]纯化得到化合物le13(116mg，收率70％)，esi-ms m/z：1106.5(m h)。
[0188]
实施例2-3：化合物le14的合成
[0189][0190]
中间体19的合成
[0191]
将市售的中间体18(300mg，0.8mmol)与多聚甲醛(50mg，1.6mmol)混合溶于20ml无水二氯甲烷中，慢慢加入三甲基氯硅烷(0.3ml，3.4mmol)，室温反应2小时，通过取样加甲醇淬灭后液质联用监测反应。待反应完毕将反应液过滤，然后向滤液中加入羟基乙酸叔丁酯(211mg，1.6mmol)和三乙胺(0.22m，1.6mmol)，继续室温反应约2小时，反应完后减压蒸馏去除大部分溶剂，所得粗品经过硅胶柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝20∶1(v/v)]纯化得到中间体19(349mg，收率85％)，esi-msm/z：514(m h)，1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.13(s，1h)，7.56(d，j＝
7.5hz，2h)，7.35(s，2h)，5.14(s，2h)，4.91(s，2h)，4.25(q，j＝7.1hz，1h)，3.99(d，j＝42.5hz，2h)，3.85(t，j＝6.2hz，2h)，3.40(dd，j＝18.5，7.6hz，2h)，2.89(d，j＝48.6hz，3h)，1.65(d，j＝6.8hz，3h)，1.46(s，9h)。
[0192]
中间体20的合成
[0193]
将中间体19(257mg，0.50mmol)溶于6ml二氯甲烷和甲醇混合溶剂中(v/v＝2∶1)中，慢慢加入三氟乙酸0.3ml，室温反应30分钟。反应完毕加等体积水和乙酸乙酯，有机相干燥后浓缩，所得粗品直接用于下一步。
[0194]
将所得粗品与exatecan甲磺酸盐(170mg，0.30mmol)混合于5ml无水n，n-二甲基甲酰胺中，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲六氟磷酸盐(341mg，0.90mmol)，三乙胺0.60ml，室温反应2h。反应完毕，减压蒸馏去除溶剂，所得粗品经过硅胶柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝20∶1(v/v)]纯化得到中间体20(212mg，收率81％)，esi-ms m/z：875(m h)。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.27(d，j＝34.7hz，1h)，7.63-7.35(m，5h)，7.21-7.10(m，1h)，5.71-5.48(m，2h)，5.24-4.95(m，3h)，4.95-4.72(m，4h)，4.45(s，1h)，4.33-3.97(m，3h)，3.75(s，2h)，3.39-2.99(m，4h)，2.76(d，j＝15.3hz，3h)，2.43-2.15(m，5h)，2.04(s，1h)，1.94-1.75(m，2h)，1.62(d，j＝6.6hz，3h)，1.11-0.89(m，3h)。
[0195]
中间体21的合成
[0196]
将中间体20(77mg，0.09mmol)溶于12ml无水四氢呋喃中，加入3ml水，然后加入1摩尔/升的三乙基膦水溶液0.3ml，室温反应4小时。反应完毕减压蒸馏去除四氢呋喃，向所余水溶液中加碳酸氢钠调节ph至中性，然后加二氯甲烷萃取，所得有机相干燥后减压蒸除溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(v/v)]纯化得到中间体21(53mg，收率69％)，esi-ms m/z：849(m h)。1h nmr(400mhz，dmso)δ8.52(s，1h)，7.79(d，j＝10.8hz，1h)，7.67-7.55(m，2h)，7.47-7.21(m，3h)，6.51(s，1h)，5.60(s，1h)，5.52-5.32(m，2h)，5.30-5.11(m，2h)，5.11-4.94(m，2h)，4.94-4.74(m，2h)，4.02(s，2h)，3.81-3.66(m，2h)，3.60-3.35(m，4h)，3.24-3.08(m，2h)，2.94(d，j＝30.8hz，3h)，2.39(s，3h)，2.28-2.04(m，2h)，2.00-1.73(m，2h)，1.22(d，j＝6.6hz，3h)，0.96-0.70(m，3h)。
[0197]
化合物le14的合成
[0198]
中间体21(134mg，0.16mmol)与市售的原料mc-v(102mg，0.33mmol)混合于40ml二氯甲烷中，加入缩合剂2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1，2-二氢喹啉(82mg，0.33mmol)，室温反应过夜，反应完毕减压蒸干溶剂，所得粗品经硅胶柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(v/v)]纯化得到化合物le14(137mg，收率75％)，esi-msm/z：1141.4(m h)。1h nmr(400mhz，dmso)δ9.97(s，1h)，8.52(s，1h)，8.27-8.09(m，1h)，7.88-7.70(m，2h)，7.63-7.51(m，2h)，7.28(s，3h)，6.99(s，2h)，6.51(s，1h)，5.59(s，1h)，5.50-5.32(m，2h)，5.17(s，2h)，4.98(s，2h)，4.85(d，j＝17.3hz，2h)，4.43-4.33(m，1h)，4.21-4.12(m，1h)，4.03(s，2h)，3.74-3.64(m，2h)，3.20-3.03(m，3h)，3.02-2.84(m，4h)，2.36(s，3h)，2.23-2.09(m，4h)，2.01-1.90(m，1h)，1.90-1.78(m，2h)，1.55-1.39(m，4h)，1.30(d，j＝6.7hz，3h)，1.23-1.11(m，2h)，0.93-0.77(m，9h)。
[0199]
实施例2-4：化合物le15-le20的合成
[0200][0201]
中间体vi可以以fmoc-l-缬氨酸-l-丙氨酸为起始原料，参照实施例2-1中中间体3的合成方法中的步骤a和b，将其中步骤b中的甲胺盐酸盐替换为相应的市售可得的氨基化合物制备而得。后续步骤从中间体vi出发，按照与实施例2-1中的步骤c、d、f和h相同的方法，得到与中间体9相似的中间体ix，然后按照实施例6中的步骤i和j相同的步骤处理，脱除氨基保护基，然后与市售可得的不同马来酰亚胺缩合得到终产物。所用氨基化合物及马来酰亚胺结构见表1。化合物le15：灰白色固体，esi-ms m/z：1121.2(m h)；化合物le16：淡黄色固体，esi-ms m/z：1167.1(m h)；化合物le17：黄色固体，esi-ms m/z：1132.3(m h)；化合物le18：淡黄色固体，esi-ms m/z：1305.4(m h)；化合物le19：淡黄色固体，esi-ms m/z：1307.4(m h)；化合物le20：淡黄色固体，esi-ms m/z：1337.6(m h)。
[0202]
表1.合成le15-le20所用的中间体
[0203][0204]
[0205][0206]
实施例2-5：化合物le21与le22的合成
[0207][0208]
化合物dxd-1的合成
[0209]
市售的exatecan甲磺酸盐(0.568g，1mmol)与市售的2-(叔丁基二甲基硅氧)乙酸(cas：105459-05-0，0.38g，2mmol)混合溶于20ml无水二氯甲烷中，加入缩合剂hatu(0.76g，2mmol)和1ml吡啶，室温搅拌2小时。待反应完毕后，减压蒸干溶剂，所得粗品经柱层析[二氯甲烷∶甲醇＝50∶1(v/v)]纯化得到标题化合物dxd-1(0.55g，收率90％)，esi-ms m/z：608.1(m h)。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.73(d，j＝10.5hz，1h)，7.64(s，1h)，7.05(d，j＝9.2hz，1h)，5.80-5.62(m，2h)，5.41-5.14(m，4h)，4.29-4.15(m，2h)，4.08-4.03(m，1h)，3.27-3.07(m，2h)，2.45(s，3h)，2.38-2.28(m，2h)，1.96-1.81(m，2h)，1.04(t，j＝7.4hz，3h)，0.80(s，9h)，0.11(s，3h)，0.03(s，3h).
[0210]
中间体v的制备
[0211]
中间体v可以参照实施例2-1中化合物4的制备方法，将其中步骤b中的甲胺盐酸盐替换为相应的市售可得的氨基化合物制备而得。
[0212]
le21-le22的合成
[0213]
中间体v与dxd-1反应，后续经过10％三氟乙酸/二氯甲烷溶液处理得到中间体x，
然后中间体x参照实施例2-1中化合物5的后续步骤e、g、i和j进行反应：中间体x经过还原得到氨基化合物，所得氨基化合物和fmoc-缬氨酸羟基琥珀酰亚胺酯缩合，然后脱去所得产物中氨基的fmoc保护基，所得氨基产物再和6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯反应得到最终产物。化合物le21：黄色固体，esi-ms m/z：1141.2(m h)；化合物le22：黄色固体，esi-ms m/z：1106.6(m h)。
[0214][0215]
实施例2-6：化合物ls13的合成
[0216]
参照实施例2-4中le15的合成方法，sn-38(7-乙基-10-羟基喜树碱)与中间体vii(r1为甲砜乙基)反应后，经脱保护，缩合等步骤得到化合物ls13：1h nmr(400mhz，dmso)δ9.92(d，j＝22.4hz，1h)，8.14(s，1h)，8.08(d，j＝9.1hz，1h)，7.81(d，j＝8.0hz，1h)，7.70-7.50(m，3h)，7.47(d，j＝7.2hz，1h)，7.34(d，j＝7.2hz，1h)，7.27(s，1h)，7.20(s，1h)，6.98(s，2h)，6.51(s，1h)，5.61(s，2h)，5.48-5.35(m，2h)，5.27(s，2h)，5.10(d，j＝20.6hz，2h)，4.36(s，1h)，4.21-4.07(m，1h)，3.84(s，2h)，3.48(s，2h)，3.21-2.92(m，6h)，2.25-2.04(m，2h)，2.04-1.78(m，3h)，1.55-1.36(m，4h)，1.36-1.10(m，9h)，0.95-0.71(m，10h)。
[0217][0218]
实施例2-7：化合物ggfg-dxd的合成
[0219]
化合物ggfg-dxd参照wo2015146132a1报道的已知的合成方法制备而得。esi-ms m/z：1034.5(m h)，1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.61(t，j＝6.4hz，1h)，8.50(d，j＝8.5hz，1h)，8.28(t，j＝5.1hz，1h)，8.11(d，j＝7.5hz，1h)，8.05(t，j＝5.7hz，1h)，7.99(t，j＝5.9hz，1h)，7.77(d，j＝11.0hz，1h)，7.31(s，1h)，7.25-7.16(m，5h)，6.98(s，2h)，6.51(s，
1h)，5.59(dt，j＝7.4，4.1hz，1h)，5.41(s，2h)，5.20(s，2h)，4.64(d，j＝6.1hz，2h)，4.53-4.40(m，1h)，4.02(s，2h)，3.74-3.37(m，8h)，3.18-3.00(m，2h)，3.04-2.97(m，1h)，2.77(dd，j＝13.5，9.4hz，1h)，2.38(s，3h)，2.19(dd，j＝14.9，8.5hz，2h)，2.11-2.05(m，2h)，1.86(dd，j＝14.0，6.7hz，2h)，1.45(s，4h)，1.20-1.14(m，2h)，0.87(t，j＝7.1hz，3h).
[0220][0221]
实施例3：抗体药物偶联物的制备
[0222]
将按照实施例1方法制备得到的b7-h3的抗体fda016使用g25脱盐柱将其置换至50mm pb/1.0mmedta缓冲液中(ph7.0)，加入12当量tecp，于37℃搅拌2个小时，以使抗体链间二硫键完全打开，随后使用磷酸将还原后的抗体溶液ph调至6.0，并将水浴温度降至25℃，以备偶联反应。将按照上述实施例2方法制备得到的连接基-药物偶联物le12-le22、ls13和ggfg-dxd分别用dmso溶解，从中吸取12当量连接基-药物偶联物逐滴加至还原后的抗体溶液中，并补加dmso至其终浓度为10％(v/v)，25℃搅拌反应0.5个小时，反应完成后，使用0.22um膜过滤样品。使用切向流超滤系统纯化去除未偶联小分子，缓冲液为50mmpb/1.0mmedta溶液(ph6.0)，纯化后添加终浓度6％蔗糖放置于-20℃冰箱中保存。使用uv法分别在280nm和370nm下测定其吸光度值，计算dar值，结果见下表2。
[0223]
按照与本实施例以上同样的操作步骤进行偶联反应，样品均按照最高dar制备(即过量偶联)，观察各偶联反应发生时沉淀的产生情况，并计算各偶联反应完成后的聚体比例和回收率，所得结果同样见表2。
[0224]
表2制备不同抗体药物偶联物(adc)的偶联情况
[0225]
[0226][0227]“/”表示未计算回收率
[0228]
在实际研究中发现连接基-药物偶联物ggfg-dxd与其他抗体偶联时也会产生沉淀，且聚体比例较高，不具有普适性。而本技术方案中的大部分连接基-药物偶联物均尝试与包括f016在内的不同抗体偶联，未产生沉淀，且聚体比例在正常范围，表明本发明的抗体药物偶联物具有很好的溶解性和成药性，偶联过程不发生沉淀也非常有利于抗体偶联药物的制备。
[0229]
效果实施例1：抗体药物偶联物的体外杀伤活性评价
[0230]
选择calu-6(atcc)细胞作为实验体外活性检测用细胞株，每孔2000个细胞接种于96孔细胞培养板中，培养20-24小时。将按照实施例3方法制备的抗体药物偶联物使用含10％fbs的l15细胞培养基配制成1000、166.7、55.6、18.6、6.17、2.06、0.69、0.23、0.08、0.008和0nm共11个浓度梯度的供试品溶液，取稀释好的供试品溶液100μl/孔加入到接种细胞的培养板内，置于37℃，5％co2培养箱培养144小时后加入luminescent cell viability assay reagent(promega，g9243)(50μl/孔)，500rpm室温振荡10分钟混匀，spectramaxl酶标仪读取数据(od570nm，2s间隔读数)后计算ic50结果见表3。
[0231]
利用上述同样的方法，分别测试各抗体药物偶联物对购自atcc的nci-n87、a375、hs-700t、ln-229、mda-mb-468、pa-1和raji多个肿瘤细胞的细胞毒杀伤活性，结果如表3所示。从表3的结果可以看出，本发明提供的抗体药物偶联物对calu-6、nci-n87、a375、hs-700t、ln-229、mda-mb-468和pa-1等细胞都具有极佳的体外杀伤活性。而对raji阴性细胞不具有杀伤活性，表明所制备的adc具有特异性的靶向杀伤活性。
[0232]
表3.抗体药物偶联物的体外杀伤活性
[0233]
[0234][0235]
效果实施例2：体外血浆稳定性试验
[0236]
本实施例评价按照实施例3方法制得的抗体偶联药物在人血浆中的稳定性。具体而言，在本实施例中，将实施例3的抗体偶联药物加入人血浆中，37℃水浴中放置1、3、7、14、21、28天加内标(依喜替康作为内标物质)并进行萃取然后通过高效液相色谱法检测游离药物的释放量，结果如表4所示。
[0237]
表4.不同adc在人血浆中的稳定性评价
[0238][0239][0240]
血浆稳定性结果表明本发明提供的抗体药物偶联物具有很好的血浆稳定性。
[0241]
效果实施例3：连接基-药物偶联物的体外酶切实验
[0242]
连接基-药物偶联物(le14和ggfg-dxd)与组织蛋白酶b在三个不同ph(5.0，6.0，7.0)缓冲液中共孵育，不同时间点取样进入高效液相色谱-质谱联用仪，外标法(以dxd为外标)确定药物的释放百分比。实验结果(如表5所示)表明ggfg-dxd在所用的ph范围内酶切速度较慢，而本发明采用的连接基-药物偶联物le14在ph 5.0至ph 7.0的范围内都能快速的酶切。
[0243]
表5.le14和ggfg-dxd体外在不同ph的酶切情况
[0244][0245]
效果实施例4：fda016-ls13的体外酶切实验
[0246]
选择nci-n87细胞株作为实验细胞株，样品在组织蛋白酶b体系(100mm醋酸钠-醋酸缓冲液，4mm二硫苏糖醇，ph 5.0)中37℃孵育4小时后，所得样品用培养基稀释至不同浓度，按照sn-38浓度70nm-0.003nm设定8个浓度(1.5-10倍稀释)，观察144小时对细胞株的杀伤(抑制)能力变化，并通过luminescent cell viability assay化学发光染色，读取荧光数据后计算ic50数值。
[0247]
将以上在组织蛋白酶b体系中37℃孵育4小时所得的酶切样品经过适量乙醇沉淀去除蛋白，通过高效液相色谱检测释放产生的小分子化合物，并以等量sn-38作为参比，测定4小时释放率，结果显示释放率达到99％。
[0248]
实验结果(如表6所示)显示，fda016-ls13经过酶切处理后细胞毒活性与等当量的sn-38几乎相同，也表明fda016-ls13在组织蛋白酶b作用下几乎完全释放出了sn-38并发挥作用，而fda016-ls13内吞进入溶酶体则可能发生了不可预知的变化导致sn-38不能有效发挥作用。
[0249]
表6.fda016-ls13被组织蛋白酶b体系酶切前后对nci-n87细胞株的杀伤活性变化
[0250][0251]
效果实施例5：测试fda016-le14在calu-6人肺癌模型中的抗肿瘤活性
[0252]
选择6-8周大的雌性balb/c nude小鼠右侧颈背部皮下注射溶于100ul pbs溶液的5
×
106人肺癌细胞(calu-6)，待肿瘤生长至平均体积150-200mm3时，根据肿瘤大小和小鼠体重随机分成5组，每组6只动物，分别为空白对照组、5mg/kg的fda016-ggfg-dxd组、10mg/kg的fda016-ggfg-dxd组、5mg/kg的fda016-le14组以及10mg/kg的fda016-le14组，腹腔给药，每周给药一次。每周两次测量实验动物体重和肿瘤体积并观察实验过程中动物生存状态。结果如表7所示，空白对照组小鼠在结束给药后时平均肿瘤体积为2107.51mm3。测试药5.0mg/kg的fda016-ggfg-dxd治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为72.35mm3，10mg/kg的fda016-ggfg-dxd治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为3.28mm3。测试药5.0mg/kg的fda016-le14治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为50.48mm3，10mg/kg的fda016-le14治疗组在结束给药后第14天平均肿瘤体积为0.00mm3。实验结果显示fda016-le14具有较好的体内抗肿瘤活性，同时所有实验小鼠无死亡情况，无体重减轻情况，表明fda016-le14具有很好的安全性。
[0253]
表7.fda016-le14在calu-6人肺癌模型中的抗肿瘤活性
[0254][0255]
注：01组为空白对照组；02组为5mg/kg的fda016-ggfg-dxd组；03组为10mg/kg的fda016-ggfg-dxd组；04组为5mg/kg的fda016-le14组；05组为10mg/kg的fda016-le14组。