用于治疗囊性纤维化的组合物和方法与流程

用于治疗囊性纤维化的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年4月15日提交的美国申请no.62/833,972、2019年10月25日提交的美国申请no.62/926,308和2020年1月29日提交的美国申请no.62/967,214的申请日权益，其公开内容通过引用并入本文。


背景技术：

3.使用腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)进行基因治疗是新兴的治疗方式，包括用于治疗单基因缺陷。囊性纤维化(cystic fibrosis，cf)是致命的常染色体隐性病症，仅在美国就有至少30,000人受到影响，并且全世界至少有70,000人受到影响。cf患者的平均存活年龄为约40岁。cf是由编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，cftr)的基因中的突变引起的，cftr是引导氯离子和碳酸氢根离子穿过上皮细胞膜的通道。受损的cftr功能导致气道炎症和进行性支气管扩张。由于cf的单基因病因学和患者群体中的多种cftr突变，基因治疗可能为cf提供普遍的治愈。
4.人细小病毒家族的成员腺相关病毒(aav)是非致病性病毒，其复制依赖于辅助病毒。因此，重组aav(recombinant aav，raav)载体是基因治疗临床前研究和临床试验中最频繁使用的载体之一。事实上，使用raav2的cf肺病临床试验表明，病毒基因组相对于其他基因转移剂(例如重组腺病毒)在气道组织中具有良好安全特性和长持久性(如通过活检评估的)二者。然而，基因转移未能在cf患者中改善肺功能，因为未检测到raav载体来源的cftr mrna的转录。
5.因此，本领域中仍然需要用于治疗cf的改进的组合物和方法。
6.发明概述
7.本公开内容尤其提供了raav、药物组合物、分离的多核苷酸以及制备和使用它们的方法，例如用于治疗cf。
8.在一个方面，本公开内容的特征在于重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，raav)，其包含(i)av.tl65衣壳蛋白；以及(ii)的多核苷酸，所述多核苷酸包含与cftrδr小基因(minigene)可操作地连接的f5增强子和tg83启动子。
9.在一些实施方案中，所述av.tl65衣壳蛋白包含seq id no：13的氨基酸序列或其与seq id no：13具有至少80％氨基酸序列同一性的变体。
10.在一些实施方案中，f5增强子包含seq id no：1或seq id no：14的多核苷酸序列，或其与seq id no：1或seq id no：14具有至少80％核酸序列同一性的变体。在一些实施方案中，f5包含seq id no：1的多核苷酸序列。在另一些实施方案中，f5增强子包含seq id no：14的多核苷酸序列。
11.在一些实施方案中，tg83启动子包含seq id no：2的多核苷酸序列。
12.在一些实施方案中，cftrδr小基因是人cftrδr小基因。
13.在一些实施方案中，人cftrδr小基因由包含seq id no：4的序列的多核苷酸编
码。
14.在一些实施方案中，所述多核苷酸在5
′
至3
′
方向上包含所述f5增强子、所述tg83启动子和所述cftrδr小基因。
15.在另一方面，本公开内容的特征在于包含本文中所述的任何raav和可药用载体的药物组合物。
16.在另一方面，本公开内容的特征在于治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本文中所述的任何raav，或本文中所述的任何药物组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象施用一种或更多种另外的治疗剂。
17.在另一方面，哺乳动物是人。在一个方面，人是新生儿。在一个方面，人是青少年。
18.在另一方面，本公开内容的特征在于用于在有此需要的对象中治疗囊性纤维化的raav，所述raav包含(i)av.tl65衣壳蛋白；以及(ii)多核苷酸，所述多核苷酸包含与cftrδr小基因可操作地连接的f5增强子和tg83启动子。在一些实施方案中，raav用于与一种或更多种另外的治疗剂组合使用。
19.在一些实施方案中，所述一种或更多种另外的治疗剂包括增强因子(例如，蛋白酶体调节剂例如蒽环类(例如，多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星或米托蒽醌)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米)、三肽基醛(例如，n-乙酰基-l-亮氨酰-l-亮氨酰-l-正亮氨酸(llnl))，或其组合)、抗生素、黏液稀释剂、cftr调节剂、黏液溶解剂、免疫抑制剂、生理盐水、高张盐水或其组合。在一些实施方案中，增强因子是多柔比星。在另一些实施方案中，增强因子是伊达比星。在一些实施方案中，所述一种或更多种另外的治疗剂包括免疫抑制剂(例如，皮质类固醇(例如，吸入皮质类固醇))。
20.在一些实施方案中，施用通过吸入、雾化(nebulization)、气溶胶化(aerosolization)、鼻内、气管内、支气管内、经口、静脉内、皮下或肌内进行。
21.在一些实施方案中，施用通过吸入、雾化、气溶胶化、鼻内、气管内和/或支气管内进行。
22.在另一个方面中，本公开内容的特征在于包含seq jd no：7序列的分离的多核苷酸。
23.在一些实施方案中，多核苷酸还在3
′
方向上包含3
′
非翻译区(3
′‑
utr)，所述3
′
非翻译区包含seq id no：5的序列。
24.在一些实施方案中，多核苷酸还在3
′
方向上包含合成的多腺苷酸化位点，所述合成的多腺苷酸化位点包含seq id no：6的序列。
25.在一些实施方案中，多核苷酸还在多核苷酸的5
′
末端处包含5
′
腺相关病毒(aav)末端反向重复序列(itr)并且在多核苷酸的3
′
末端处包含3
′
aav itr。在一些实施方案中，5’aav itr包含seq id no：15的序列，或其与seq id no：15具有至少80％核酸序列同一性的变体。在一些实施方案中，3’aav itr包含seq id no：16的序列，或其与seq id no：16具有至少80％核酸序列同一性的变体。
26.在一些实施方案中，多核苷酸包含seq id no：11或seq id no：17的序列，或其与seq id no：11或seq id no：17具有至少80％核酸序列同一性的变体。在一些实施方案中，多核苷酸包含seq id no：11的序列。在另一些实施方案中，多核苷酸包含seq id no：17的序列。
27.在另一方面，本公开内容的特征在于包含seq id no：18的序列的分离的多核苷酸。在另一方面，本公开内容的特征在于重组腺相关病毒(raav)，其包含本文中所述多核苷酸中任何一种(例如，包含seq id no：7、seq id no：11或seq id no：17的序列的多核苷酸)。
28.在一些实施方案中，raav对气道细胞具有向性(tropism)。
29.在一些实施方案中，raav对气道上皮细胞具有向性。
30.在一些实施方案中，raav对肺上皮细胞具有向性。
31.在一些实施方案中，raav包含av.tl65衣壳蛋白、aav1衣壳蛋白、aav2衣壳蛋白、aav5衣壳蛋白、aav6衣壳蛋白或aav9衣壳蛋白。
32.在一些实施方案中，raav包含av.tl65衣壳蛋白。
33.附图简述
34.图1a至1c示出了极化的人cf气道上皮中cftr介导的氯离子转运的功能性互补。图1a示出了raav2病毒基因组av.tl65-sp183-hcftrδr被包装成三种衣壳血清型(av.tl65、av.1和av.2)，并用于从顶端(av.tl65和av.1)或基底外侧表面(av.2)顶端感染极化的人cf ali培养物。使用aav2的基底外侧感染作为阳性对照，因为它从基底外侧表面高效地感染。向病毒接种物添加2.5μm多柔比星和20μm llnl，并感染ali培养物16小时。然后去除病毒，并在没有蛋白酶体抑制剂的情况下再饲喂培养物。图1b示出了每种条件下两种培养物的isc追踪。箭头标记ibmx/毛喉素(i和f)和cftr抑制剂(glyh101)的添加。图1c示出了感染之后12天时的平均值 /-semδisc。
35.图2a至2d是显示av.tl65-sp183-hcftrδr向雪貂气管和肺的基因转移效率的一系列图。图2a和2b示出了气管(图2a)和肺(图2b)中每500ng rna的hcftr和fcftr mrna的拷贝数。拷贝数使用每个物种的质粒cftr cdna的系列稀释液产生的标准曲线确定。图2c和2d示出了气管(图2c)和肺(图2d)中转基因来源的hcftr与内源性fcftr mrna的比值。c1至c3表示模拟感染组中的动物，a1至a3表示aav感染组中的动物。还显示出三只aav感染的动物的平均值。虚线表示内源性cftr水平(比值＝1)。数据描绘了每组中n＝3只动物的平均值 /-sem。
36.图3a至3d是显示av.tl65有效转导成熟雪貂气道的一系列图。图3a示出了载体和模拟处理的动物的人cftr mrna和内源性雪貂gapdh mrna的rna特异性pcr(rs-pcr)的结果。结果示出了hcftr/fgapdh mrna的比值。图3b示出了载体和模拟处理的动物的内源性雪貂cftr mrna和内源性雪貂gapdh mrna的rs-pcr。结果示出了fcftr/fgapdh mrna的比值。图3c示出了每个样品中每100ng dna的载体基因组数的q-pcr。图3d示出了每个样品hcftr/fcftr的mrna拷贝的比值。1等于内源性cftr水平(红色虚线)。肺样品包含平均3.0 /-0.5拷贝转基因来源的hcftr mrna/拷贝fcftr mrna。气管和鼻组织转导更加可变，但包含平均一个拷贝转基因来源的hcftr/fcftr mrna。结果描绘了经载体处理动物的平均值 /-sem。
37.图4是显示实施例5中所述实验的代表性cf轨迹的图。
38.图5是显示在实施例5中所述实验的cf供体或非cf供体的指定条件下的δisc(μa/cm2)的一系列图。误差棒指示平均值的标准误差(sem)。
39.图6是显示来自实施例6中所述实验的24孔transwell滤板的举个孔的代表性i
eq
轨迹(37℃)的一系列图。
40.图7是显示对于实施例6中所述实验的每种条件，毛喉素/ibmx刺激之后平均cftr介导的氯离子分泌的一系列图，n＝4。误差棒指示sem。
41.图8a至8d。raav载体性能的体外与体内比较。(a)在存在增强因子的情况下，将cf(f508del/f508del)人极化ali气道培养物用av1-sp183-hcftrδr或av.tl65-sp183-hcftrδr(moi＝100,000个drp/细胞)顶端感染。然后在感染之后12天时在ussing室中进行短路电流(isc)测量。显示的是对毛喉素(forskolin)/ibmx和glyh101(cftr抑制剂)的δisc响应。数据显示为来自两个供体的n＝4个transwell的平均值
±
sd。将未感染的ali培养物用作基线对照(来自两个供体的n＝4)。(b)isc测量之后，将来自每组的两个transwell插入物合并并裂解，以通过逆转录酶定量pcr(reverse transcriptase quantitative-pcr，rt-qpcr)量化载体来源的hcftrδr mrna拷贝，并相对于人gapdh mrna拷贝进行归一化。然后将值表示为hcftrδr/gapdh的比值。数据显示为n＝2的平均值
±
范围。(c)在存在增强因子的情况下，将人和雪貂极化ali气管支气管上皮细胞用av.tl65-sp183gluc以100,000个dna酶抗性颗粒(dnase-resistant particle，drp)/细胞的感染复数(multiplicity of infection，moi)顶端感染。在感染之后5天时，将高斯萤光素酶(gaussia luciferase)活性测量为相对发光单位(relative luminescence unit，rlu)。数据显示为来自每个物种的两个供体的n＝6个transwell的平均值
±
sd。(d)使三日龄雪貂或一月龄雪貂气管内感染与增强因子混合的av.tl65-sp183-hcftrδr(4
×
10
10
个drp/克体重)。对模拟感染组接种含增强因子的pbs。然后在感染之后11天时收获气管和肺，用于通过具有gapdh mrna拷贝数归一化的rt-qpcr量化载体来源的hcftrδr和内源性fcftr mrna拷贝。数据表示hcftrδr与fcftrδr的mrna拷贝的比值(hcftrδr/fcftr)。数据显示为每组中n＝3只动物的平均值 /-sd。ns，无显著性差异。
42.图9a至9c。在新生雪貂中重复给药av.tl65。(a)研究设计涉及三组新生雪貂，其通过气管内施用接受1
×
10
13
个drp/kg的0、1或2剂病毒。对接受一剂的雪貂在4周龄时施用报道载体av.tl65-sp183-gluc，而对接受两剂的雪貂在1周龄时施用av.tl65-sp183-fcftrδr并在4周龄时施用av.tl65-sp183-gluc。在指定的年龄时收集血浆和balf样品。(b)在av.tl65-sp183-gluc递送之后的指定时间点的血浆中的高斯萤光素酶活性。(c)在av.tl65-sp183-gluc递送之后14天时balf中的高斯萤光素酶活性。结果显示为每组n＝6只动物的平均值
±
sd。用单因素anova随后用tukey事后检验(tukey’s post-test)分析统计学显著性。ns，不显著。rlu，相对发光单位。
43.图10a至10c。在幼年雪貂中重复给药av.tl65。(a)研究设计涉及三组幼年雪貂，其通过气管内施用接受1
×
10
13
个drp/kg的0、1或2剂病毒。对接受一剂的雪貂在8周龄时施用报道载体av.tl65-sp183-gluc，而对接受两剂的雪貂在4周龄时施用av.tl65-sp183-fcftrδr并在8周龄时施用av.tl65-sp183-gluc。在指定的年龄时收集血浆和balf样品。(b)在av.tl65-sp183-gluc递送之后的指定时间点的血浆中的高斯萤光素酶活性。(c)在av.tl65-sp183-gluc递送之后14天时balf中的高斯萤光素酶活性。结果显示为每组n＝9至10只动物的平均值
±
sd。用单因素anova随后用tukey事后检验分析统计学显著性：**p＜0.01，****p＜0.0001。rlu，相对发光单位。
44.图11a至11d。感染的雪貂的balf和血浆中av.tl65中和抗体的滴度。(a、b)使用转导抑制测定评价如图9a中收集的新生雪貂样品在(a)balf和(b)血浆中的nab。将balf或血浆的连续稀释液与av.tl65-fluc一起孵育，然后感染a549细胞。将nab的滴度计算为如通过萤火虫萤光素酶活性评估的导致转导的50％抑制(ic50)的balf或血浆的浓度(稀释比例)。将仅感染av.tl65-fluc的细胞用作基线对照，并且将模拟感染细胞用作空白。(c、d)使用上述转导抑制测定评价如图10a中收集的幼年雪貂样品在(c)balf和(d)血浆中的nab。结果显示为每组n＝6只新生动物和每组n＝9至10只幼年动物的平均值
±
sd。用单因素anova随后用tukey事后检验分析统计学显著性：**p＜0.01，****p＜0.0001。ns，不显著。
45.图12a至12b。用于量化抗衣壳抗体同种型的基于elisa的测定的开发。从肺感染av-tl65四次(从1月龄开始以1至2个月的间隔)的雪貂产生免疫血浆。原初血浆来源于年龄相仿的雪貂。将elisa板用(a)aav5或(b)aav2包被，并随后评价免疫和原初雪貂血浆的结合。第二检测抗体针对igg。结果显示为对每个样品的两次技术重复的平均值
±
范围。
46.图13a至13f。av.tl65感染的雪貂血浆中igg、igm和iga衣壳结合抗体的量化。(a至f)(a至c)新生和(d至f)幼年雪貂血浆中(a、d)igg、(b、e)igm和(c、f)iga衣壳结合抗体的量化。结果显示为每组n＝6只新生动物和每组n＝9至10只幼年动物的平均值 /-sd。用单因素anova随后用tukey事后检验分析统计学显著性：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。单剂量组和重复剂量组之间的未标记比较没有显著性差异。
47.图14a至14f。av.tl65感染的雪貂balf中igg、igm和iga衣壳结合抗体的量化。(a至f)(a至c)新生和(d至f)幼年雪貂balf中(a、d)igg、(b、e)igm和(c、f)iga衣壳结合抗体的量化。结果显示为每组n＝6只新生动物和每组n＝9至10只幼年动物的平均值 /-sd。用单因素anova随后用tukey事后检验分析统计学显著性：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。单剂量组和重复剂量组之间的未标记比较没有显著性差异。
48.发明详述
49.基因治疗是治疗囊性纤维化(cf)的唯一与突变无关的方法。本公开内容至少部分基于以下发现：本文中所述raav载体(例如，av.tl65-sp183-hcftrδr)出乎意料地在补充极化的人cf气道上皮中cftr介导的氯离子转运方面有效。相对于现有的cf基因治疗方法，本文中所述的raav载体利用组分的组合来实现功能性载荷能力的改善、更有效的细胞递送和更有效的转基因表达。特别地，raav包括高功能性cftr小基因(cftrar)，短但高活性的183bp合成启动子(sp183，其包括f5增强子和tg83启动子)，以及对人气道具有高度向性的进化的嵌合raav载体av.tl65。在一个实施方案中，所述载体施用于人。在一个方面，人是新生儿。在一个方面，人是青少年。
50.定义
51.术语“aav”是指腺相关病毒，并且可用于指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。除非另有要求的情况，否则该术语涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在和重组形式二者。aav基因组由单链dna构成，并且包含在dna链两端处的末端反向重复序列(itr)和两个开放阅读框：分别编码复制和衣壳蛋白的rep和cap。外来多核苷酸可替代天然的rep和cap基因。aav可用多种不同血清型衣壳制成，这些衣壳具有不同的转导谱，或者如本文中所用，对不同组织类型具有“向性(tropism)”。如本文中所用，术语“血清型”是指通过衣壳蛋白与限定抗血清的反应性而被鉴定并且基于衣壳蛋白与限定抗血清的反应性而区别于
其他aav的aav，例如，aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9和aavrhl0。例如，血清型aav2用于指包含由aav2的cap基因编码的衣壳蛋白和包含来自相同aav2血清型的5
′
和3
′
itr序列的基因组的aav。假型aav是指包含来自一种血清型的衣壳蛋白和包括第二种血清型的5
′‑3′
itr的病毒基因组的aav。预期假型raav会具有衣壳血清型的细胞表面结合特性和与itr血清型一致的遗传特性。假型raav使用本领域中所述的标准技术产生。
52.术语“约”在本文中用于意指所列举值的
±
10％的值。
53.如本文中所用，“施用”意指将本文中所述的组合物(例如，raav或其药物组合物)的剂量给予对象的方法。在本文中所述的方法中使用的组合物可通过任何合适的途径施用，所述途径包括例如通过吸入、雾化、气溶胶化、鼻内、气管内、支气管内、经口、肠胃外(例如静脉内、皮下或肌内)、经口、经鼻、经直肠、表面或经颊。在一些实施方案中，使用雾化器喷雾器(atomizer sprayer)(例如，具有喉-气管黏膜雾化装置)以气溶胶化颗粒气管内和/或支气管内施用本文中所述的组合物。本文中所述方法中使用的组合物也可局部或全身施用。施用方法可取决于多种因素(例如，所施用组合物的组分和所治疗病症的严重程度)而变化。
54.术语“av.tl65”是指进化的嵌合aav衣壳蛋白，其对人气道具有高度的向性。excoffon et al.proc.natl.acad.sci.usa 106(10)：3865-3870，2009(其通过引用整体并入本文)描述了av.tl65，并且av.tl65在本领域中也称为aav2.5t。av.tl65是aav2(a.a.1至128)和aav5(a.a.129至725)之间的嵌合体，具有基于单点突变的替换(a581t)。av.tl65衣壳的氨基酸序列在下面显示：
[0055][0056]“控制元件”或“控制序列”是参与分子相互作用的核苷酸序列，其有助于多核苷酸的功能性调节，包括多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。调节可能影响过程的
频率、速度或特异性，并且本质上可能是增强的或抑制的。本领域已知的控制元件包括例如转录调节序列，例如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合rna聚合酶并启动通常位于该启动子下游(在3
′
方向)的编码区的转录的dna区。启动子包括aav启动子，例如p5、p19、p40和aav itr启动子，以及异源启动子。
[0057]“表达载体”是包含编码目的多肽的区域的载体，并且用于在预期的靶细胞中实现蛋白质的表达。表达载体还包含与编码区有效连接的控制元件，以促进蛋白质在靶标中的表达。控制元件和与其可操作地连接以进行表达的一个或更多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中许多是本领域已知和可用的，或者可以容易地从本领域可用的组分构建。
[0058]“基因”是指包含至少一个开放阅读框的多核苷酸，所述开放阅读框在转录和翻译后能够编码特定蛋白质。
[0059]
术语“基因递送”是指将外源多核苷酸引入细胞用于基因转移，并且可涵盖靶向、结合、摄取、转运、定位、复制子整合和表达。
[0060]
术语“基因转移”是指将外源多核苷酸引入细胞，其可涵盖靶向、结合、摄取、转运、定位和复制子整合，但与后续的基因表达不同且不暗示后续的基因表达。
[0061]
术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰的过程。
[0062]
aav的“辅助病毒”是指允许aav(例如，野生型aav)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。aav的多种这样的辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。腺病毒涵盖多种不同的亚组，但最常用的是亚组c的5型腺病毒。人、非人哺乳动物和禽来源的多种腺病毒是已知的并且可从保藏中心例如atcc获得。疱疹家族的病毒包括例如单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)和eb病毒(epstein-barr virus，ebv)，以及巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)和假狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)；其也可从保藏中心例如atcc获得。
[0063]“可检测标记基因”是允许携带该基因的细胞被特异性检测(例如区别于不携带该标记基因的细胞)的基因。多种这样的标记基因是本领域已知的。
[0064]“选择标记基因”是在存在相应选择性剂的情况下允许携带该基因的细胞被特异性选择或针对的基因。举例来说，抗生素抗性基因可用作阳性选择标记基因，其允许在存在相应抗生素的情况下宿主细胞被阳性选择。多种阳性和阴性选择标志物是本领域已知的，其中一些在下面描述。
[0065]“异源”意指来源于与与其进行比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。例如，通过遗传改造技术被引入不同细胞类型的多核苷酸是异源多核苷酸(并且当表达时，可编码异源多肽)。
[0066]“宿主细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”、“包装细胞系”和其他这样的术语表示可用于本公开内容的真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞。这些细胞可用作重组载体、病毒或其他转移多核苷酸的接受者，并且包括被转导的原始细胞的后代。应当理解，单细胞的后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组互补方面)。
[0067]“分离的”质粒、病毒或其他物质是指没有至少一些其他组分的物质的制备物，这些组分可能也存在于该物质或类似物质天然存在的地方或是最初制备该物质或类似物质的地方。因此，例如可通过使用纯化技术从源混合物富集分离的物质来制备该分离的物质。富集可在绝对基础(例如每体积溶液的重量)上进行测量，或者其可相对于源混合物中存在
的第二种潜在干扰物质进行测量。本公开内容实施方案的富集的提高越来越更加显著(some)。因此，例如2倍富集是显著的，10倍富集是更加显著的，100倍富集是更加显著的，1000倍富集是甚至更加显著的。
[0068]
如本文中所用，术语“可操作连接”或“可操作地连接”是指如此描述的组件(component)的物理或功能性并置以允许它们以其预期方式起作用。更具体地，例如两个dna序列可操作地连接意指该两个dna以使得至少一个dna序列能够对另一个序列发挥生理作用这样的关系布置(顺式或反式)。例如，增强子和/或启动子可与转基因(例如治疗性转基因，例如cftrδr小基因)可操作地连接。
[0069]
如本文中所用，“包装”是指导致病毒载体(特别是aav载体)的组装和衣壳化的一系列亚细胞事件。因此，当在适当的条件下将合适的载体引入包装细胞系时，其可以组装成病毒颗粒。与病毒载体(特别是aav载体)的包装相关的功能在本文中和本领域中有所描述。
[0070]
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其类似物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化或加帽的核苷酸和核苷酸类似物，并且可被非核苷酸组分中断。可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰(如果存在的话)。如本文中所用，术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有指明或要求，否则本文中描述的公开内容的为多核苷酸的任何实施方案涵盖双链形式以及已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
[0071]
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。该术语还涵盖经过修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、脂化或与标记组分的缀合。当在基因治疗及用于其的组合物的背景下讨论时，多肽例如“cftr”等是指相应的完整多肽，或者保留所期望的完整蛋白质生化功能的其任何片段或经遗传改造衍生物。类似地，对cftr和用于基因治疗的其他这样的基因(通常称为将被递送至接受者细胞的“转基因”)的提及，包括编码完整多肽或者具有所期望生化功能的任何片段或经遗传改造衍生物的多核苷酸。
[0072]“药物组合物”意指适合向对象施用、包含并入病毒载体(例如raav载体)中或独立于病毒载体(例如，并入脂质体、微粒或纳米颗粒中))的治疗或生物活性剂(例如，包含转基因(例如cftrδr小基因；参见例如ostedgaard et al.proc.natl.acad.sci.usa 108(7)：2921-6，2011)的多核苷酸)的任何组合物。这些制剂中的任何一种都可通过本领域公知和接受的方法制备。参见例如remington：the science and practice of pharmacy(21st ed.)，ed.a.r.gennaro，lippincott williams&wilkins，2005，和encyclopedia of pharmaceutical technology，ed.j.swarbrick，informa healthcare，2006，其各自在此通过引用并入。
[0073]“可药用稀释剂、赋形剂、载体或辅料”意指对象在生理上可接受同时保留与其一起施用的药物组合物的治疗特性的稀释剂、赋形剂、载体或辅料。
[0074]
应用于多核苷酸的“重组”意指多核苷酸是克隆、限制和/或连接步骤以及产生不同于自然界中发现的多核苷酸的构建体的其他过程的多种组合的产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒颗粒。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制物和原始病毒构建体的后代。
[0075]“重组腺相关病毒(aav)”或“raav载体”意指重组产生的aav或aav颗粒，其包含待
体内、离体或体外递送至细胞中的非aav来源的多核苷酸序列(例如，包含可与一个或更多个增强子和/或启动子可操作地连接的转基因的多核苷酸)。raav可使用来自任何aav血清型的天然存在的衣壳蛋白。在一些实施方案中，非天然存在的(例如，嵌合的)衣壳可用于本文中所述的raav，例如av.tl65。
[0076]“参考”意指用于比较目的的任何样品、标准或水平。“正常参考样品”或“野生型参考样品”可以是例如来自未患有病症(例如，囊性纤维化)的对象的样品。“阳性参考”样品、标准或值是来源于已知患有病症(例如囊性纤维化)的对象的样品、标准、值或数目，其可通过至少一种以下标准与对象的样品匹配：年龄、体重、疾病阶段和整体健康状况。
[0077]
术语“对象”和“患者”在本文中可互换使用以指任何哺乳动物(例如人、灵长类、猫、狗、雪貂、牛、马、猪、山羊、大鼠，或小鼠)。例如，对象是人。
[0078]“终止子”是指倾向于减少或阻止通读转录的多核苷酸序列(即其减少或阻止源自终止子一侧的转录继续到终止子的另一侧)。转录被破坏的程度通常是碱基序列和/或终止子序列长度的函数。特别地，如在多种分子生物学系统中公知的，通常称为“转录终止序列”的特定dna序列是倾向于破坏通过rna聚合酶的通读转录的特定序列，大概是通过导致rna聚合酶分子停止和/或脱离正在转录的dna。这样的序列特异性终止子的典型实例包括多腺苷酸化(“polya”)序列，例如sv40 polya。除了或代替这样的序列特异性终止子，在启动子和编码区之间插入相对长的dna序列也倾向于破坏编码区的转录，通常与间插序列的长度成比例。这种效应的产生大概是因为rna聚合酶分子总是有与被转录的dna脱离的一些倾向，并且增加在到达编码区之前要穿过的序列的长度通常会提高在编码区转录完成或可能甚至开始之前发生脱离的可能性。终止子可因此阻止从仅一个方向(“单向”终止子)或从两个方向(“双向”终止子)的转录，并且可由序列特异性终止序列或序列非特异性终止子或二者构成。多种这样的终止子序列是本领域已知的；并且下面提供了在本公开内容的上下文中这样的序列的举例说明性用途。
[0079]“治疗性基因”、“预防性基因”、“靶多核苷酸”、“转基因”、“目的基因”等一般是指待使用载体转移的一种或更多种基因。通常，在本公开内容的上下文中，这样的基因位于raav载体内(该载体侧翼是末端反向重复序列(itr)区域，并且因此可复制并衣壳化(encapsidate)进raav颗粒中)。在本公开内容中可使用靶多核苷酸来产生用于多种不同应用的raav载体。这样的多核苷酸包括但不限于：(i)编码可用于其他形式的基因治疗以减轻由结构蛋白或酶的缺失、缺陷或次优水平引起的缺陷的蛋白质的多核苷酸；(ii)转录成反义分子的多核苷酸；(iii)转录成结合转录或翻译因子的诱饵的多核苷酸；(iv)编码细胞调节物例如细胞因子的多核苷酸；(v)可使接受体细胞对特定药物易感的多核苷酸，例如疱疹病毒胸苷激酶基因；(vi)用于癌症治疗的多核苷酸，例如用于治疗多种癌症的e1a肿瘤抑制基因或p53肿瘤抑制基因；和(vii)用于基因编辑(例如crispr)的多核苷酸。为了实现转基因在接受体宿主细胞中的表达，在一个实施方案中，其与启动子可操作地连接，启动子是其自己的启动子或是异源启动子。大量合适的启动子是本领域已知的，其选择取决于靶多核苷酸的期望表达水平；是否期望组成型表达、诱导型表达、细胞特异性或组织特异性表达等。raav载体还可包含选择标志物。示例性转基因包括但不限于囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cftr)或其衍生物(例如，cftrδr小基因；参见例如，ostedgaard et al.proc.natl.acad.sci.usa 108(7)：2921-6，2011，其通过引用整体并入本文)、α-抗胰蛋
白酶、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、因子viii、肌养蛋白、促红细胞生成素、α1-抗胰蛋白酶、表面活性蛋白sp-d、sp-a或sp-c、促红细胞生成素或细胞因子例如ifn-α、ifnγ、tnf、il-1、il-17或il-6，或为抗原(例如病毒、细菌、肿瘤或真菌抗原)的预防性蛋白质，或者中和抗体或其靶向抗原(例如来自人呼吸病毒例如流感病毒或rsv的抗原)表位的片段，包括但不限于hbov蛋白质、流感病毒蛋白质、rsv蛋白质或sars蛋白质。
[0080]“治疗有效量”意指为了以临床相关方式改善、抑制或缓解对象的病情或者病症或疾病(例如，囊性纤维化)的症状而施用的组合物的量。对象中的任何改善都被认为足以实现治疗。在一个实施方案中，足以治疗的量是降低、抑制或阻止囊性纤维化发生或一种或更多种症状的量，或者是降低对象患有囊性纤维化的一种或更多种症状的严重程度或持续时间长度的量(例如，相对于未用本文中所述的组合物治疗的对照对象，降低至少约10％、约20％或约30％，或者降低至少约50％、约60％或约70％，或者降低至少约80％、约90％、约95％、约99％或更多)。用于实施本文中所述方法(例如治疗囊性纤维化)的药物组合物的有效量取决于施用方式和所治疗对象的年龄、体重和一般健康而变化。医生或研究人员可决定适当的量和剂量方案。
[0081]
如本文中所用，“转导”及其变化形式是指将raav中的外源多核苷酸(例如转基因)引入宿主细胞中导致多核苷酸(例如转基因)在细胞中表达的过程的术语。该过程通常包括1)aav在其与细胞表面受体结合之后的内吞作用，2)从内体或其他胞内区室向细胞胞质溶胶中逃逸，3)将病毒颗粒或病毒基因组运输到细胞核，4)病毒颗粒的脱壳，以及产生可表达的双链aav基因组形式，包括环状中间体。raav可表达的双链形式可作为核附加体持续存在或任选地可整合到宿主基因组中。aav在其与细胞表面受体结合之后的内吞作用、从内体或其他胞内区室向细胞胞质溶胶逃逸、将病毒颗粒或病毒基因组运输到细胞核，或者病毒颗粒的脱壳，以及产生表达性双链aav基因组形式(包括环状中间体)中的任何一项或组合的改变可导致表达水平或表达持续性的改变，或者向细胞核的运输改变，或者表达引入的多核苷酸的宿主细胞或细胞群的类型或相对数目改变。通过raav引入的多核苷酸的表达或持久性改变可通过本领域公知的方法来确定，所述方法包括但不限于蛋白质表达(例如通过elisa、流式细胞术和western印迹)、通过杂交测定测量dna和rna产生(例如northern印迹、southern印迹和凝胶迁移运动测定)，或者定量或非定量逆转录、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)或数字液滴pcr测定。
[0082]
个体或细胞的“治疗”是试图在治疗开始时改变个体或细胞的天然过程的任何类型的干预，例如在个体中引发预防性、治愈性或其他有益效果。例如，可对个体进行治疗以降低或限制由任何病理病症引起的病理状况，包括(但不限于)遗传或诱导的遗传缺陷(例如囊性纤维化)，病毒、细菌或寄生生物体感染，赘生或再生障碍性病症，或者免疫系统功能障碍例如自身免疫或免疫抑制。治疗包括(但不限于)施用组合物，例如药物组合物，和施用已经用组合物处理过的相容细胞。可以预防性或治疗性地进行治疗；即在病理事件开始之前或之后或者与病原体(etiologic agent)接触之前或之后。治疗可以减轻病理病症的一种或更多种症状。例如，囊性纤维化的症状是本领域已知的并且包括例如持续咳嗽、喘息、呼吸困难(breathlessness)、运动不耐受、反复肺感染、鼻道发炎或鼻塞、粪便恶臭或油腻、体重增加差和生长不良、肠阻塞、便秘、汗中盐浓度升高、胰腺炎和肺炎。检测到病症(例如，
囊性纤维化)的一种或更多种症状的改善或不存在，表明治疗成功。
[0083]“变体”是指与天然或参考多核苷酸或多肽基本上同源的多核苷酸或多肽。例如，变体多核苷酸可与天然或参考多核苷酸基本上同源，但其由于一个或更多个缺失、插入和/或替换而具有不同于天然或参考多核苷酸的多核苷酸序列。在另一实例中，变体多肽可与天然或参考多肽基本上同源，但其由于一个或更多个缺失、插入和/或替换而具有不同于天然或参考多肽的氨基酸序列。编码变体多肽的多核苷酸序列涵盖当与天然或参考多核苷酸序列相比时包含一个或更多个核苷酸添加、缺失或替换但编码变体蛋白质或其保留活性的片段的序列。本领域已知多种诱变方法，并且本领域普通技术人员可应用这些方法。
[0084]
变体多核苷酸或多肽序列可以与天然或参考序列具有至少80％、至少85％、至少至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多同一性。天然序列和变体序列之间的同源程度(同一性百分比)可例如通过使用万维网上通常用于此目的的可免费获得的计算机程序(例如，具有缺省设置的blastp或blastn)比较两个序列来确定。
[0085]
如本文中所用，“载体”是指包含多核苷酸或与多核苷酸缔合且可用于介导多核苷酸在体外或体内递送至细胞的大分子或大分子的缔合。举例说明性载体包括例如质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载剂。待递送的多核苷酸(有时称为转基因)可包含基因治疗中的目的编码序列(例如编码治疗性或目的蛋白质的基因)、疫苗开发中的目的编码序列(例如表达适合在哺乳动物中引发免疫应答的蛋白质、多肽或肽的多核苷酸)和/或选择标志物或可检测标志物。
[0086]
多核苷酸
[0087]
本公开内容提供了可并入raav载体中或用于制备raav载体的多核苷酸。多核苷酸可包括任何合适的元件或组分，包括选自以下的一个或更多个元件：5’aav itr(例如，aav25’itr)、f5增强子、tg83启动子、5’非翻译区(utr)、cftrδr小基因、3’utr、多腺苷酸化位点和/或3’aav itr(例如，aav23’itr)。虽然多核苷酸通常被并入raav载体中，但应理解在本领域已知的其他类型载体的情况下它们可被递送或施用。
[0088]
在一个方面，本公开内容提供了分离的多核苷酸，其包含seq id no：7序列或与seq id no：7的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：1序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。在另外一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：14序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。
[0089]
在一些实施方案中，多核苷酸还在3’方向上包含3’非翻译区(3
’‑
utr)，其包含seq id no：5的序列，或与seq id no：5的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0090]
在一些实施方案中，多核苷酸还在3’方向(例如，相对于3
’‑
utr的3’)上包含合成多腺苷酸化位点，其包含seq id no：6的序列。
[0091]
在一些实施方案中，多核苷酸还在多核苷酸的5
′
末端处包含5
′
腺相关病毒(aav)末端反向重复序列(itr)和/或在多核苷酸的3
′
末端处包含3
′
aav itr。在一些实施方案中，多核苷酸包含seq id no∶11的序列，或其变体，例如与seq id no：11的多核苷酸序列具有
至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：1序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。在另外一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：14序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。
[0092]
在另一些实施方案中，多核苷酸包含seq id no：17的序列，或其变体，例如与seq id no：17的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：1序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。在另外一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：14序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。
[0093]
任何多核苷酸可包含5’aav itr。可使用任何合适的5’aav itr，包括来自任何aav血清型(例如aav2)的5’aav itr。在一些实施方案中，5’aav itr包含seq id no：9的序列，或其变体，例如与seq id no：9的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在另一实例中，在一些实施方案中，多核苷酸包含5’aav itr，该5’aav itr包含seq id no：15的序列，或其变体，例如与seq id no：15的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。任何多核苷酸可包含3’aav itr。可使用任何合适的3’aav itr，包括来自任何aav血清型(例如aav2)的3’aav itr。在一些实施方案中，3’aav itr包含seq id no：10的序列，或其变体，例如与seq id no：10的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在另一实例中，在一些实施方案中，多核苷酸包含3’aav itr，该3’aav itr包含seq id no：16的序列，或其变体，例如与seq id no：16的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。itr序列可以是回文的，例如在seq id no：15和seq id no：16中，其中5
′
端的itr序列位于反向链上，而3
′
端的itr序列位于正向链上。
[0094]
任何多核苷酸可包含f5增强子。参见例如美国专利申请no.16/082,767，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，f5增强子包含seq id no：1或seq id no：14的序列，或其变体，例如与seq id no：1或seq id no：14的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，f5包含seq id no：1的多核苷酸序列。在另一些实施方案中，f5增强子包含seq id no：14的多核苷酸序列。
[0095]
任何多核苷酸可包含tg83启动子。参见例如美国专利申请no.16/082,767。在一些实施方案中，tg83启动子包含seq id no：2的序列，或其变体，例如与seq id no：2的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0096]
任何多核苷酸可包含5’utr。可使用任何合适的5’utr。在一些实施方案中，5
’‑
utr包含seq id no：3的序列，或其变体，例如与seq id no：3的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0097]
任何多核苷酸可包含编码cftrδr小基因的序列。可使用任何合适的cftrδr小基因，包括人cftrδr(hcftrδr)或雪貂cftrδr。在一些实施方案中，编码hcftrδr小基因的序列包含seq id no：4的序列，或其变体，例如与seq id no：4的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0098]
任何多核苷酸可包含3
’‑
utr。可使用任何合适的3
’‑
utr。在一些实施方案中，3
’‑
utr包含seq id no：3的序列，或其变体，例如与seq id no：5的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0099]
任何多核苷酸可包含多腺苷酸化位点。可使用任何合适的多腺苷酸化位点。在一些实施方案中，多腺苷酸化位点包含seq id no：6的序列，或其变体，例如与seq id no：6的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0100]
在一个方面，本公开内容提供了分离的多核苷酸，其包含seq id no：8的序列，或其变体，例如与seq id no：8的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：1序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。在另外一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：14序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。
[0101]
在一个方面中，本公开内容提供了分离的多核苷酸，其包含seq id no：11的序列，或其变体，例如与seq id no：11的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：1序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。在另外一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：14序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。
[0102]
在一个方面，本公开内容提供了分离的多核苷酸，其包含seq id no：12的序列，或其变体，例如与seq id no：12的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：1序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。在另外一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：14序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。
[0103]
在另一个方面，本公开内容提供了分离的多核苷酸，其包含seq id no：18的序列，或其变体，例如与seq id no：18的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：1序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。在另外一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：14序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序
列的hcftrδr小基因。
[0104]
多核苷酸还可包含一个或更多个可检测标志物。多种这样的标志物是已知的，举例来说，包括细菌β-半乳糖苷酶(lacz)基因；人胎盘碱性磷酸酶(ap)基因和编码多种细胞表面标志物的基因，这些标志物已在体外和体内二者中用作报道分子。多核苷酸还可包含一个或更多个选择标志物。
[0105]
重组aav载体
[0106]
重组aav载体是人基因治疗的潜在强大工具，特别是对于例如囊性纤维化的疾病。raav载体与其他基因治疗方法相比的主要优势是它们通常不需要靶细胞的持续复制以游离地(episomally)存在或稳定整合到宿主细胞中。一般而言，本公开内容提供了raav，其包含av.tl65衣壳蛋白，以及包含与转基因可操作地连接的f5增强子和tg83启动子的多核苷酸。
[0107]
例如，在一个方面，本公开内容提供了raav，其包含(i)av.tl65衣壳蛋白；以及(ii)多核苷酸，所述多核苷酸包含与cftrδr小基因可操作地连接的f5增强子和tg83启动子。
[0108]
在另一方面，本公开内容提供了用于在有此需要的对象中治疗囊性纤维化的raav，所述raav包含(i)av.tl65衣壳蛋白；以及(ii)多核苷酸，所述多核苷酸包含与cftrδr小基因可操作地连接的f5增强子和tg83启动子。
[0109]
在一些实施方案中，av.tl65衣壳蛋白包含seq id no：13的氨基酸序列，或其变体，例如与seq id no：13的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
[0110]
在一些实施方案中，f5增强子包含seq id no：1或seq id no：14的多核苷酸序列，或其变体，例如与seq id no：1或seq id no：14的多核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，f5包含seq id no：1的多核苷酸序列。在另一些实施方案中，f5增强子包含seq id no：14的多核苷酸序列。
[0111]
在一些实施方案中，tg83启动子包含seq id no：2的多核苷酸序列，或其变体，例如与seq id no：2的多核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0112]
可使用任何合适的cftrδr小基因或其衍生物。在一些实施方案中，cftrδr小基因是人cftrδr小基因。在另一些实施方案中，cftrδr小基因是雪貂cftrδr小基因。在一些实施方案中，人cftrδr小基因由包含以下的多核苷酸编码：seq id no：4的序列，或其变体，例如与seq id no：4的多核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0113]
在一些实施方案中，多核苷酸在5’至3’方向上包含f5增强子、tg83启动子和cftrδr小基因。在一些具体实施方案中，多核苷酸在5’至3’方向上包含5’aav itr(例如，aav25’itr)、f5增强子、tg83启动子、5’非翻译区(utr)、cftrδr小基因、’3-utr、多腺苷酸化位点和3’aav itr(例如，aav23’itr)。
[0114]
在另一方面，本公开内容提供了raav，其包含本文中所述的任何多核苷酸，例如包含以下的多核苷酸：seq id no：7、seq id no：11或seq id no：17的序列，或其变体，例如与
seq id no：7、seq id no：11或seq id no：17的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。例如，本公开内容提供了raav，其包含含有以下的多核苷酸：seq id no：17的序列，或其变体，例如与seq id no：17的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，raav对气道上皮细胞(例如，肺上皮细胞)具有向性。在一些实施方案中，raav包含av.tl65衣壳蛋白、aav1衣壳蛋白、aav2衣壳蛋白、aav5衣壳蛋白、aav6衣壳蛋白或aav9衣壳蛋白。在一些实施方案中，raav包含av.tl65衣壳蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：1序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。在另外一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：14序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。
[0115]
异源多核苷酸通过重组技术整合到aav基因组编码区中或代替aav基因组编码区(即代替aav rep和cap基因)，但通常任一侧翼是aav末端反向重复序列(itr)区。这意味着itr出现在编码序列的上游和下游二者，或者直接并置，例如(尽管不一定)没有任何aav来源的间插序列，以降低可能再生能够复制的aav基因组的重组的可能性。然而，单个itr可能足以执行通常与包含两个itr的构造相关的功能(参见例如wo 94/13788)，并且因此具有仅一个itr的载体构建体可与本公开内容的包装和生产方法结合应用。
[0116]
rep的天然启动子是自我调节的，并且可限制产生的aav颗粒的量。rep基因还可与异源启动子可操作地连接，无论rep是作为载体构建体的部分提供还是单独提供。任何不被rep基因表达强烈下调的异源启动子都是合适的；但诱导型启动子是显著的，因为rep基因的组成型表达可对宿主细胞具有负面影响。多种诱导型启动子是本领域已知的；举例来说，包括重金属离子诱导型启动子(例如金属硫蛋白启动子)；类固醇激素诱导型启动子(例如mmtv启动子或生长激素启动子)；以及例如在存在t7 rna聚合酶的情况下有活性的来自t7噬菌体的那些的启动子。诱导型启动子的一个亚类是由用于补充raav载体的复制和包装的辅助病毒诱导的那些。还描述了许多辅助病毒诱导型启动子，包括可由腺病毒e1a蛋白质诱导的腺病毒早期基因启动子；腺病毒主要晚期启动子；可由疱疹病毒蛋白质(例如vp16或1cp4)诱导的疱疹病毒启动子；以及牛痘或痘病毒诱导型启动子。
[0117]
鉴于多种aav基因组的相对衣壳化尺寸限制，将大的异源多核苷酸插入基因组需要去除aav序列的一部分。去除一种或更多种aav基因以降低产生能够复制的aav(“rca”)的可能性在任何情况下都是期望的。因此，在一个实施方案中，rep、cap或二者的编码或启动子序列被去除，因为这些基因提供的功能可以以反式提供。
[0118]
所得载体被称为在这些功能上“有缺陷”。为了复制和包装载体，用一种或更多种一起编码多种缺失的rep和/或cap基因产物的必要功能的包装基因补充缺失功能。包装基因或基因盒在一个实施方案中侧翼不是aav itr，并且在一个实施方案中不与raav基因组共有任何显著同源性。因此，为了使在载体序列与单独提供的包装基因之间复制期间的同源重组最小化，可期望避免两个多核苷酸序列的重叠。同源性水平和相应的重组频率随着增加的同源序列长度及其共有的同一性水平而提高。如本领域已知的，在给定系统中会引起关注的同源性水平可从理论上确定并通过实验确认。然而，通常来说，如果重叠序列小于约25个核苷酸序列(如果其在其整个长度上至少80％相同)，或重叠序列小于约50个核苷酸
序列(如果其在其整个长度上至少70％相同)，则重组可以显著降低或消除。当然，甚至更低水平的同源性进一步降低重组的可能性。显示出，即使在没有任何重叠的同源性的情况下也有一些产生rca的残余频率。通过将aav的复制和衣壳化功能“拆分”，甚至可获得产生rca(例如通过非同源重组)的频率的进一步降低，如allen et al.，wo 98/27204所述。
[0119]
raav载体构建体和互补包装基因构建体在本公开内容中可以以多种不同形式实施。病毒颗粒、质粒和稳定转化的宿主细胞均可用于将这样的构建体瞬时或稳定地引入包装细胞中。
[0120]
在本公开内容的某些实施方案中，aav载体和互补包装基因(如果有的话)以细菌质粒、aav颗粒或其任意组合的形式提供。在另一些实施方案中，aav载体序列、包装基因或二者以经遗传改变的(例如可遗传改变的)真核细胞的形式提供。可遗传地改变以表达aav载体序列、aav包装基因或二者的宿主细胞的发展提供了以可靠水平表达的材料的确定来源(established source)。
[0121]
因此，在本公开内容的上下文中可使用多种不同的经遗传改变的细胞。举例来说，哺乳动物宿主细胞可与稳定整合的raav载体的至少一个完整拷贝一起使用。包含至少一个与启动子可操作地连接的aav rep基因的aav包装质粒可用于提供复制功能(如美国专利no.5,658,776中所述)。或者，具有与启动子可操作地连接的aav rep基因的稳定哺乳动物细胞系可用于提供复制功能(参见例如trempe et al.，(wo 95/13392)；burstein et al.(wo 98/23018)；和johnson et al.(美国专利no.5,656,785))。提供如上所述的衣壳化蛋白的aav cap基因可与aav rep基因一起提供或单独提供(参见例如上述申请和专利以及allen et al.(wo 98/27204)。其他组合是可能的并且包括在本公开内容的范围内。
[0122]
产生raav，例如包含av.tl65衣壳蛋白的raav的方法是本领域已知的。参见例如，excoffon et al.proc.natll.acad.sci.usa 106(10)：3865-3870，2009和美国专利no.10,046,016，其各自通过引用整体并入本文。
[0123]
增强因子
[0124]
本文中所述的raav可与aav转导的增强因子组合使用，以实现转基因转导和/或表达的显著提高。可使用任何合适的增强因子。例如，美国专利no.7,749,491描述了合适的增强因子，该专利通过引用整体并入本文。增强因子可以是蛋白酶体调节剂。蛋白酶体调节剂可以是蒽环类(例如多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星或米托蒽醌)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米)、三肽基醛(例如n-乙酰基-l-亮氨酰-l-亮氨酰-l-正亮氨酸(llnl))，或其组合。在一些实施方案中，增强因子是多柔比星。在另一些实施方案中，增强因子是伊达比星。
[0125]
raav和增强因子可以在同一组合物或不同组合物(例如药物组合物)中与细胞接触，或施用于对象。raav和增强因子的接触或施用可以依次(例如raav之后是增强因子，反之亦然)或同时进行。
[0126]
药物组合物
[0127]
本公开内容提供了药物组合物，其包括包含本文中所述的任何raav的药物组合物。药物载体可包括一种或更多种可药用载体、赋形剂、稀释剂、缓冲剂等。
[0128]
例如，在一个方面，本公开内容提供了包含raav的药物组合物，所述raav包含(i)av.tl65衣壳蛋白；以及(ii)多核苷酸，所述多核苷酸包含与cftrδr小基因可操作地连接
的f5增强子和tg83启动子。
[0129]
在另一个方面，本公开内容提供了包含用于在有此需要的对象中治疗囊性纤维化的raav的药物组合物，所述raav包含(i)av.tl65衣壳蛋白；以及(ii)多核苷酸，所述多核苷酸包含与cftrδr小基因可操作地连接的f5增强子和tg83启动子。
[0130]
在一些实施方案中，av.tl65衣壳蛋白包含seq id no：13的氨基酸序列，或其变体，例如与seq id no：13的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
[0131]
在一些实施方案中，f5增强子包含seq id no：1或seq id no：14的多核苷酸序列，或其变体，例如与seq id no：1或seq id no：14的多核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，f5包含seq id no：1的多核苷酸序列。在另一些实施方案中，f5增强子包含seq id no：14的多核苷酸序列。
[0132]
在一些实施方案中，tg83启动子包含seq id no：2的多核苷酸序列，或其变体，例如与seq id no：2的多核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0133]
可使用任何合适的cftrδr小基因或其衍生物。在一些实施方案中，cftrδr小基因是人cftrδr小基因。在另一些实施方案中，cftrδr小基因是雪貂cftrδr小基因。在一些实施方案中，人cftrδr小基因由包含以下的多核苷酸编码：seq id no：4序列，或其变体，例如与seq id no：4的多核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
[0134]
在一些实施方案中，多核苷酸在5’至3’方向上包含f5增强子、tg83启动子和cftrδr小基因。在一些具体实施方案中，多核苷酸在5’至3’方向上包含5’aav itr(例如，aav25’itr)、f5增强子、tg83启动子、5’非翻译区(utr)、cftrδr小基因、3
’‑
utr、多腺苷酸化位点和3’aav itr(例如，aav23’itr)。
[0135]
在另一方面，本公开内容提供了包含raav的药物组合物，所述raav包含本文中所述的任何多核苷酸，例如包含以下的多核苷酸：seq id no：7、11或17的序列，或其变体，例如与seq id no：7、11或17具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。例如，本文中提供了包含raav的药物组合物，所述raav包含含有以下的多核苷酸：seq id no：17的序列，或其变体，例如与seq id no：17的多核苷酸序列具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，raav对气道上皮细胞(例如，肺上皮细胞)具有向性。在一些实施方案中，raav包含av.tl65衣壳蛋白、aav1衣壳蛋白、aav2衣壳蛋白、aav5衣壳蛋白、aav6衣壳蛋白或aav9衣壳蛋白。在一些实施方案中，raav包含av.tl65衣壳蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：1序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。在另一个实施方案中，多核苷酸包含：包含seq id no：14序列的f5增强子、包含seq id no：2序列的tg83启动子和/或包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因。
[0136]
本文中所述的药物组合物可包含单独的raav，或与一种或更多种另外的治疗剂组合的raav。示例性的另外的治疗剂包括但不限于增强因子(例如，本文中所述的任何增强因
子，例如多柔比星或伊达比星)、抗生素(例如，阿奇霉素(azithromycin)阿莫西林(amoxicillin)和克拉维酸(clavulanic acid)氯唑西林(cloxacillin)和双氯西林(diclocacillin)、替卡西林(ticarcillin)和克拉维酸头孢氨苄(cephalexin)、头孢地尼(cefdinir)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢克洛(cefaclor)；磺胺甲唑(sulfamethoxazole)和甲氧苄啶(trimethoprim)红霉素(erythromycin)/磺胺异唑(sulfisoxazole)、红霉素、克拉霉素(clarithromycin)、四环素(tetracycline)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、替加环素(tigecycline)、万古霉素(vancomycin)、亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meripenem)、多黏菌素e甲磺酸(colismtimethate)利奈唑胺(linezolid)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)或其组合)，黏液稀释剂(例如，高张盐水或阿法链道酶(dornase alfa))、cftr调节物(例如，依伐卡托(ivacaftor)鲁玛卡托(lumacaftor)、鲁玛卡托/依伐卡托替扎卡托(tezacaftor)/依伐卡托或(拉卡托(elexacaftor)/依伐卡托/替扎卡托))、黏液溶解剂(例如，乙酰半胱氨酸、氨溴索、溴己新、羧甲司坦、厄多司坦(erdosteine)、美司坦和阿法链道酶)、免疫抑制剂、生理盐水、高张盐水或其组合。
[0137]
例如，本文中所述的药物组合物可包含一种或更多种免疫抑制剂。可使用任何合适的免疫抑制剂。例如，免疫抑制剂的非限制性实例包括皮质类固醇(例如，吸入皮质类固醇(例如，倍氯米松(beclomethasone)布地奈德(budesonide)布地奈德/福莫特罗(formotero1)环索奈德(ciclesonide)氟替卡松(fluticasone)(flovent)、丙酸氟替卡松(fluticasonepropionate)(flovent)、糠酸氟替卡松(fluticasone furoate)(arnuity)、丙酸氟替卡松/沙美特罗(salmeterol)糠酸氟替卡松/芜地溴铵(umeclidinium)/维兰特罗(vilanterol)(trelegy)、糠酸莫米松(mometasone furoate)或莫米松(mometasone)/福莫特罗泼尼松(predisone)或甲基泼尼松龙(methylprednisone))、多克隆抗淋巴细胞抗体(例如，抗淋巴细胞球蛋白(anti-lymphocyte globulin，alg)和抗胸腺细胞球蛋白(anti-thymocyte globulin，atg)抗体，其可以是例如马或兔来源的)、单克隆抗淋巴细胞抗体(例如，抗cd3抗体(例如，莫罗单抗(murmomab)和阿仑单抗)或抗cd20抗体(例如，利妥昔单抗))、白介素2(interleukin-2，il-2)受体拮抗剂(例如，达利珠单抗和巴利昔单抗)、钙调磷酸酶抑制剂(例如，环孢素a和他克莫司(tacrolimus))、细胞周期抑制剂(例如，硫唑嘌呤、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，mmf)和霉酚酸(mycophenolic acid，mpa))、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mtor)抑制剂(例如，
西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素)和依维莫司(everolimus))、氨甲蝶呤、环磷酰胺、蒽环类(例如，多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星、米托蒽醌或其组合)、紫杉烷(例如，(紫杉醇))及其组合(例如，钙调磷酸酶抑制剂、细胞周期抑制剂和皮质类固醇的组合)。
[0138]
在一些具体实施方案中，本文中所述的药物组合物可包含一种或更多种皮质类固醇(例如，吸入皮质类固醇(例如，倍氯米松布地奈德布地奈德/福莫特罗环索奈德氟替卡松丙酸氟替卡松(flovent)、糠酸氟替卡松丙酸氟替卡松/沙美特罗糠酸氟替卡松/芜地溴铵/维兰特罗(trelegy)、糠酸莫米松或莫米松/福莫特罗泼尼松或甲基泼尼松龙)。在一些实施方案中，皮质类固醇是吸入皮质类固醇。
[0139]
免疫抑制剂(例如，本文中所述的任何免疫抑制剂)可通过吸入施用或全身(例如，静脉内或皮下)施用。
[0140]
通常来说，病毒载体在药学上合适的无热原缓冲液例如林格平衡盐溶液(ph 7.4)中。虽然不是必需的，但药物组合物可任选地以适合于施用精确量的单位剂型提供。药物组合物通常是无菌的。
[0141]
治疗cf的方法
[0142]
本公开内容提供了治疗和/或预防cf的方法。
[0143]
例如，在一个方面，本公开内容提供了治疗cf的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的raav，所述raav包含(i)av.tl65衣壳蛋白；以及(ii)多核苷酸，所述多核苷酸包含与cftrδr小基因可操作地连接的f5增强子和tg83启动子。raav可包含本文中所述的任何多核苷酸。
[0144]
在另一方面，本公开内容的特征在于用于在有此需要的对象中治疗囊性纤维化的raav，所述raav包含(i)av.tl65衣壳蛋白；以及(ii)多核苷酸，所述多核苷酸包含与cftrδr小基因可操作地连接的f5增强子和tg83启动子。在一些实施方案中，raav用于与一种或更多种另外的治疗剂(例如，本文中所述的任何增强因子)组合使用。raav可包含本文中所述的任何多核苷酸。
[0145]
本文中所述的组合物(例如，raav或药物组合物)可在体内使用以及离体使用。体内基因治疗包括将本公开内容的载体直接施用于对象。药物组合物可作为液体溶液剂或混悬剂、作为乳剂或作为适合在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式提供。对于向呼吸道中施用，一种示例性的施用方式是通过气溶胶，使用当与适当的气溶胶化器(aerosolubilizer)装置使用时提供固体或液体气溶胶的组合物。另一些进入呼吸道的施用方式是使用柔性纤维支气管镜来滴注(instill)载体。
[0146]
本文中所述的组合物(例如raav或药物组合物)可通过任何合适的途径施用，例如通过吸入、雾化、气溶胶化、鼻内、气管内、支气管内、经口、肠胃外(例如，静脉内、皮下或肌内)、经口、经鼻、经直肠、表面或经颊。它们也可以局部或全身施用。在一些实施方案中，本文中所述的组合物使用雾化器喷雾器(例如，具有喉-气管黏膜雾化装置)以气
溶胶化颗粒气管内和/或支气管内施用。在一些实施方案中，组合物肠胃外施用。在其他一些实施方案中，组合物全身施用。载体还可通过生物假体的方式引入，举例来说，生物假体包括血管移植物(ptfe和涤纶)、心脏瓣膜、血管内支架、血管内铺面(intravascular paving)以及其他非血管假体。关于载体溶液的递送、频率、组成和剂量范围的一般技术在本领域技术范围内。
[0147]
对于通过吸入施用至上(鼻)或下呼吸道，本文中所述的组合物(例如，raav或药物组合物)可方便地从吹入器、雾化器(nebulizer)或加压包或其他方便的递送气溶胶喷剂的方式递送。加压包可包含合适的抛射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。
[0148]
或者，对于通过吸入或吹入施用，组合物可以采用干粉的形式，例如药剂和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型形式存在于例如胶囊或筒中或例如明胶或泡罩包装中，粉末可在吸入器、吹入器或计量的剂量吸入器的帮助下从中施用。
[0149]
对于鼻内施用，药剂可通过滴鼻剂、液体喷剂施用，例如通过塑料瓶雾化器(atomizer)或计量的剂量吸入器施用。典型的雾化器是mistometer(wintrop)和medihaler(riker)。
[0150]
本文中描述的组合物(例如，raav或药物组合物)的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性还是预防性以及技术人员已知的其他因素。本文中所述的组合物可在相同或不同部位处施用一次或多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或更多次)。本公开内容的药剂的施用可在预选的时间段内基本上连续或可以以一系列间隔剂量进行。
[0151]
本文中所述的组合物(例如，raav或药物组合物)可作为单一治疗施用。本文中所述的组合物(例如，raav或药物组合物)也可与一种或更多种另外的治疗剂组合施用。可使用任何合适的另外的治疗剂，包括cf的标准护理治疗。在一些实施方案中，所述一种或更多种另外的治疗剂包括抗生素(例如，阿奇霉素阿莫西林和克拉维酸氯唑西林和双氯西林、替卡西林和克拉维酸头孢氨苄、头孢地尼、头孢丙烯、头孢克洛；磺胺甲唑和甲氧苄啶红霉素/磺胺异唑、红霉素、克拉霉素、四环素、多西环素、米诺环素、替加环素、万古霉素、亚胺培南、美罗培南、多黏菌素e甲磺酸/利奈唑胺、环丙沙星、左氧氟沙星或其组合)，黏液稀释剂(例如，高张盐水或阿法链道酶)、cftr调节物(例如，依伐卡托鲁玛卡托、鲁玛卡托/依伐卡托替扎卡托/依伐卡托或(拉卡托/依伐卡托/替扎卡托))、黏液溶解剂(例如，乙酰半胱氨酸、氨溴索、溴己新、羧甲司坦、厄多司坦、美司坦和阿法链道酶)、免疫抑制剂、生理盐水、高张盐水或其组合。
[0152]
例如，本文中所述的任何一种组合物(例如，raav或药物组合物)可与一种或更多
种免疫抑制剂组合施用。可使用任何合适的免疫抑制剂。例如，免疫抑制剂的非限制性实例包括皮质类固醇(例如，吸入皮质类固醇(例如，倍氯米松布地奈德布地奈德/福莫特罗环索奈德氟替卡松(flovent)、丙酸氟替卡松(flovent)、糠酸氟替卡松(arnuity)、丙酸氟替卡松/沙美特罗糠酸氟替卡松/芜地溴铵/维兰特罗(trelegy)、糠酸莫米松或莫米松/福莫特罗泼尼松或甲基泼尼松龙)、多克隆抗淋巴细胞抗体(例如，抗淋巴细胞球蛋白(alg)和抗胸腺细胞球蛋白(atg)抗体，其可以是例如马或兔来源的)、单克隆抗淋巴细胞抗体(例如，抗cd3抗体(例如，莫罗单抗和阿仑单抗)或抗cd20抗体(例如，利妥昔单抗))、白介素2(il-2)受体拮抗剂(例如，达利珠单抗和巴利昔单抗)、钙调磷酸酶抑制剂(例如，环孢素a和他克莫司)、细胞周期抑制剂(例如，硫唑嘌呤、霉酚酸酯(mmf)和霉酚酸(mpa))、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mtor)抑制剂(例如，西罗莫司(雷帕霉素)和依维莫司)、氨甲蝶呤、环磷酰胺、蒽环类(例如，多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星、米托蒽醌或其组合)、紫杉烷(例如，(紫杉醇))及其组合(例如，钙调磷酸酶抑制剂、细胞周期抑制剂和皮质类固醇的组合)。
[0153]
在一些具体实施方案中，本文中所述的任何一种组合物(例如，raav、药物组合物和/或增强因子)可以与一种或更多种皮质类固醇(例如，吸入皮质类固醇(例如，倍氯米松布地奈德布地奈德/福莫特罗环索奈德氟替卡松(flovent)、丙酸氟替卡松(flovent)、糠酸氟替卡松(arnuity)、丙酸氟替卡松/沙美特罗糠酸氟替卡松/芜地溴铵/维兰特罗(trelegy)、糠酸莫米松或莫米松/福莫特罗泼尼松或甲基泼尼松龙)组合施用。在一些实施方案中，皮质类固醇是吸入皮质类固醇。
[0154]
免疫抑制剂(例如，本文中所述的任何免疫抑制剂)可通过吸入施用或全身(例如静脉内或皮下)施用。
[0155]
本文中所述的组合物(例如，raav或药物组合物)可单独或与可药用载体组合施用于哺乳动物。如上所述，活性成分和载体的相对比例由化合物的溶解度和化学性质、所选择的施用途径和标准药物实践确定。
[0156]
本发明组合物的剂量将随着施用形式、所选择的特定化合物和接受治疗的特定患者的生理特征而变化。可期望利用最低有效病毒浓度以降低不期望的作用(例如毒性)的风险。
实施例
[0157]
通过参考以下实施例将更充分地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文中描述的实施例和实施方案仅用于举例说明性目的，并且本领域
技术人员根据其将想到多种修改或变化，并且这些修改或变化将包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求书的范围之内。
[0158]
实施例1：av.tl65-sp183-cftrδr的开发和极化的人cf气道上皮中cftr介导的氯离子转运的功能性互补
[0159]
raav载体的包装能力有限，这阻碍了该病毒用于囊性纤维化(cf)基因治疗的开发。例如，总尺寸＞4.9kb的病毒基因组在基因组末端发生小缺失。在cftr载体的情况下，转基因盒与itr直接连接，这可导致cftr功能受损。
[0160]
本研究描述了称为av.tl65-sp183-hcftrδr的raav载体的开发。该载体利用了预期克服阻碍cf肺基因治疗努力的许多障碍的元件的组合：对人气道具有高度向性的进化的嵌合aav衣壳蛋白av.tl65；短但高活性的183碱基对合成增强子和启动子(sp183，其包括f5增强子和tg83启动子)和高功能性cftr小基因(人cftrδr(称为hcftrδr))。本文中所述实例利用了包含含有以下的多核苷酸的raav载体：包含seq id no：15序列的5
′
aav itr、包含seq id no：14序列的f5增强子(其可包含5
′
ecori位点和3
′
xhoi位点，如在seq id no：1中)、包含seq id no：2序列的tg83启动子、包含seq id no：3序列的5
′
utr、包含seq id no：4序列的hcftrδr小基因、包含seq id no：5序列的3
′
utr、包含seq id no：6序列的s-pa和包含seq id no：16序列的3
′
aav itr。例如，经包装的多核苷酸可包含seq id no：17的序列。av.tl65-sp183-hcftrδr可单独使用或与一种或更多种raav转导增强因子(例如，小分子增强因子)组合使用。令人感兴趣的是，如本文中所述，我们已经确定，av.tl65也可感染雪貂的气道，使得能够使用雪貂cf模型。在这样的模型中也可使用雪貂形式的cftrδr小基因(fcftrδr)。
[0161]
出乎意料的是，在评价cftr介导的氯离子转运的cf气液界面(air-liquid interface，ali)培养物的头对头比较中，av.tl65-sp183-hcftrδr优于av.1-sp183-hcftrδr(图1a至1c)。在这些实验中，raav2病毒基因组av.tl65-sp183-hcftrδr被包装成三种衣壳血清型(av.tl65、av.1和av.2)并用于从顶端(av.tl65和av.1)或基底外侧表面(av.2)顶端感染极化的人cf ali培养物。使用aav2的基底外侧感染作为阳性对照，因为它从基底外侧表面高效地感染。向病毒接种物添加2.5μm多柔比星和20μm llnl，并感染ali培养物16小时。然后去除病毒，并在没有蛋白酶体抑制剂的情况下再饲喂培养物。在开发av.tl65之前，raav血清型1(av.1)是在人ali培养物和黑猩猩肺中测试过的表现最好的载体。av.tl65-sp183-hcftrδr表现优于av.1-sp183-hcftrδr约2倍(图1b和1c)。因此，这些数据表明在极化的人cf气道上皮中cftr介导的氯离子转运的功能性互补。
[0162]
实施例2：av.tl65-sp183-hcftrδr的体内表达
[0163]
本研究描述了临床候选载体av.tl65-sp183-hcftrδr在新生和成熟雪貂气道中hcftr表达的测试。这些分析的终点是转基因来源的人cftr(hcftr)与内源性雪貂cftr(fcftr)mrna的比值。将三日龄新生雪貂用100μl体积的6
×
1011个drp的av.tl65-sp183-hcftrδr在500μm多柔比星中感染。未感染的动物被给予等体积的含有多柔比星的载剂。在感染之后10天，收获整个肺和气管，并在液氮中快速冷冻。将组织粉碎，并产生mrna和cdna用于人和雪貂cftr的q-pcr。如图2a至2d中所示，在基因递送至肺之后，与内源性(雪貂)cftr相比，av.tl65-sp183-cftrδr导致人cftr的表达为240％高。出乎意料的是，与对照相比，经处理雪貂还显示出在肺(但不是气管)中的内源性cftr提高约90倍，意味着受体结合
和/或av.tl65-sp183-cftrδr的感染过程可能诱导内源性cftr表达。在不希望受到理论束缚的情况下，这可以为部分功能cftr突变体或在服用cftr调节剂的患者中提供另外的治疗效果。
[0164]
新生雪貂出生时气道不成熟，缺乏黏膜下腺体，并含有少量纤毛细胞。在生命的前3周结束时，整个雪貂软骨气道的纤毛形成和黏膜下腺体形成已完成。考虑到雪貂气道上皮的表型和气道中的分泌物在这个成熟阶段会变化，我们评价了av.tl65是否转导成熟的雪貂气道。为此，我们评价了av.tl65转导1月龄雪貂肺的能力。用含有sp183-hcftrδr cdna的av.tl65的7.5
×
10
12
个drp在500μl体积的pbs(在存在250μm多柔比星的情况下)中转导1月龄雪貂(n＝3)的肺。模拟感染的对照动物(n＝1)接受500μl不含载体的pbs(在存在250μm多柔比星的情况下)。用penncentury微喷雾器通过气管插管将载体递送至肺。还使用100ul含有1.5
×
10
12
个drp以及250μm多柔比星通过滴注液体对同一动物进行鼻递送。模拟感染的鼻递送接受含有250μm多柔比星的pbs。在感染之后12天时，分开收获肺叶，以及气管、隆嵴(carina)和具有周围外膜的鼻甲。快速冷冻组织，并分开加工粉碎的样品以得到mrna和dna。在1月龄成熟雪貂中(图3a至3d)，在基因递送至肺之后，与内源性(雪貂)cftr相比，av.tl65-sp183-hcftrδr导致人cftr的表达为3倍高。虽然开发了av.tl65以有效转导分化的人气道上皮的顶端表面，但这些发现表明，决定av.tl65效力的受体和共受体在雪貂中是保守的。值得注意的是，在这些实验中，在av.tl65感染之后在3日龄雪貂中观察到的内源性雪貂cftr转录物的诱导(图2b)在成熟雪貂肺中未观察到(图3b)，这表明这种生物学可能对新生动物气道具有特异性。这些来自新生和成熟雪貂的发现表明目前用于cf的基因治疗方法在体内稳健转化。
[0165]
实施例3：大的安全范围(safety margin)表明吸入多柔比星增强基因治疗的临床可行性
[0166]
吸入蛋白酶体抑制剂的临床可行性已用多柔比星得到证实，在针对肺癌或转移患者的两项临床试验中对作为吸入气溶胶化制剂施用的多柔比星进行了测试。这些研究中的最大耐受剂量为6.0mg/m2和7.5mg/m2，每3周一次，多至8个周期。在成熟雪貂肺中(图3a至3d)实现效力的多柔比星剂量是100μl的250μm多柔比星，相当于0.34mg/m2，假定雪貂体表面积为0.043m2。因此，预期，使用通过fda的mg/m2异速生长尺度律(allometric scaling)，有效雪貂剂量与最大耐受人剂量之间存在18至22倍的安全范围。多柔比星的这种大安全范围支持利用吸入增强因子改善raav转导效率的概念。
[0167]
实施例4：在av.tl65-sp183-fcftrδr感染的幼年和成年cf雪貂中通过鼻电位差(pd)测量的cftr功能性互补和细菌清除
[0168]
本实施例描述了cf雪貂中的模型临床试验，以显示av.tl65-sp183-fcftrδr感染之后鼻pd测量的功能性互补和增强的细菌清除。这些研究利用了经肠道校正的cftr-ko雪貂模型，这将防止对雪貂cftr的免疫应答。预期av.tl65-sp183-fcftrδr向cf动物的鼻上皮的递送将导致cftr依赖性的vt变化。
[0169]
实险设计与方法
[0170]
在cf雪貂中对鼻上皮的基因治炕将av.tl65-sp183-fcftrδr以1
×
10
12
个drp/kg的剂量单独或与增强因子一起递送至5月龄成年cf雪貂的鼻上皮。还在没有载体和/或增强因子的情况下对年龄匹配的非cf对照进行评价以确定基线值。在基线处以及感染之后10、
20和30天，使用先前描述的方案获得鼻跨上皮电压(vt)测量。基线测量之后，使用依次添加向上皮灌注液依次添加的以下试剂/溶液来评估跨上皮电压测量：阿米洛利(100μm)、无cl溶液、异丙肾上腺素(10μm)、atp(100μm)和glyh-101(100μm)。在存在异丙肾上腺素的情况下的跨上皮电压的变化反映了cftr介导的cl通透性，并且如果由于cftr，添加glyh-101应阻断这种电压变化。在一个实例中，评价了8只cf动物(4只雄性和4只雌性)和8只非cf对照(4只雄性和4只雌性)。
[0171]
cf雪貂肺的基因治疗。使用penn-century微喷雾器将av.tl65-sp183-fcftrδr以1
×
10
13
个drp/kg的剂量单独或与增强因子一起递送至1月龄cf雪貂的肺上皮(类似于图3a至3d中所述的实验)。对照cf和非cf雪貂将接受对照物(例如，单独的载剂或增强因子)。在基因转移时，将cf和非cf动物二者从饲养期间使用的以防止肺细菌定殖的抗生素中取出。在感染或对照递送单独的增强因子之后12天时，使用penn-century微喷雾器，使用与先前在新生cf和非cf雪貂中描述的程序类似的程序，用氨苄西林抗性铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)(pa01)(1
×
106cfu/100克体重)和红霉素抗性假中间葡萄球菌(staphylococcus pseudintermedius)(1
×
106cfu/100克体重)的等量混合物对动物进行攻击，表明cf细菌清除有缺陷。在一个实例中，对进行和未进行载体施用的16只cf动物(每种条件4只雄性和4只雌性)以及8只非cf对照(4只雄性和4只雌性)进行了评价。在细菌攻击之后24小时时，产生全肺匀浆以用于量化以下终点：1)血琼脂上的总细菌cfu，2)血琼脂上的氨苄西林抗性细菌cfu，3)血琼脂上的红霉素抗性细菌cfu，4)转基因和内源性cftr mrna，以及5)载体来源的基因组。
[0172]
实施例5：极化的人cf气道上皮中的cftr功能性互补
[0173]
在本实施例中，使用av.tl65-sp183-fcftrδr测量短路电流以评估对功能性cftr的挽救。该测定评价了ussing室中人支气管上皮(hbe)的顶端膜中camp调节的氯离子通道活性。阿米洛利用于阻断上皮na

通道活性，确保在随后的操作期间短路电流的变化(δisc)是继发于对cl-转运的作用。与具有约120mm cl-浓度的生理林格溶液相比，当应用于包含低cl-浓度(约5mm)的缓冲液时，阴离子转运抑制剂4，4
’‑
二异硫氰基-2，2
’‑
二苯乙烯二磺酸(dids)更有效地阻断cl-/hco
3-交换器推定的阴离子转运蛋白-1。camp激动剂毛喉素和ibmx通过环磷酸腺苷(camp)依赖性机制激活cftr。glyh101是cftr的特异性抑制剂，其允许在ussing室系统中确定cftr的相对贡献(相对于其他阴离子转运途径)。在本研究中，将cf hbe(df508/df508)(n＝6)细胞与非cf hbe细胞(n＝6)进行比较，将细胞在usg培养基中培养；并且在aav和pi处理(aav，10k moi)之后7天进行测定。在本实验中，使用了雪貂cftrδr小基因，但在另一些实例中，可使用人cftrδr。
[0174]
图4示出了代表性的cf轨迹。在用av.tl65 多柔比星或av.tl65 依达比星处理的cf hbe中经毛喉素刺激的cftr介导的氯离子转运(isc)超过在非cf hbe中经毛喉素刺激的cftr介导的氯离子转运的50％(图5)。在添加aav、pi或二者之前和之后的跨上皮抗性(teer)测量均未显示出变化，并且也未受到影响(并且如果有的话，teer会轻微提高)，因此表明，av.tl65 多柔比星或av.tl65 依达比星处理对hbe没有显著的毒性或显著的细胞死亡。
[0175]
实施例6：av.tl65-sp183-hcftrδr相对于标准护理治疗可显著提高cftr活性
[0176]
将av.tl65-sp183-hcftrδr对cftr活性的补充与当前的标准护理治疗vx-809
(lumacaftor)与vx-770(ivacaftor)-的组合进行比较。在两个单独的cf hbe p3细胞系：df508/df508和df508/r553x中，将av.tl65-sp183-hcftrδr dox或ida的作用与vx-770/vx-809(“vx”)进行比较。将细胞用蛋白酶体抑制剂(pi)或载剂以及用av.tl65(moi＝10k、25k、80k)处理。将细胞在bronchialife/vertex气-液界面(ali)培养基中进行培养，并在aav和pi处理之后7天进行测定。进行了用于24孔板测定的跨上皮细胞电流钳放大器(tecc-24)。通过毛喉素/vx的cftr激活引起cl电导提高，导致膜去极化。添加dmso只引起轻微偏差。
[0177]
图6示出了来自24孔transwell滤板的单个孔的代表性i
eq
轨迹(37℃)。在存在pi的情况下观察到在经av.tl65-sp183-hcftrδr处理的细胞中cftr活性的moi依赖性提高。在不含pi的情况下用av.tl65-sp183-hcftrδr处理的细胞中，未观察到cftr活性的变化。vx-809/vx-770显著提高了cftr活性。
[0178]
图7示出了曲线下面积(auc)图，其显示对于每种条件在毛喉素刺激之后的平均cftr介导的氯离子分泌，n＝4。添加aav或pi或二者之前和之后的跨上皮电阻测量均未显示出变化且未受到影响。
[0179]
这些数据表明，相对于当前的标准护理，例如vx-770/vx-809组合治疗，av.tl65-sp183-hcftrδr显著提高了cftr活性。
[0180]
序列表
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
[0195]
[0196]
[0197][0198]
实施例7：向雪貂肺重复给药av.tl65引发以年龄依赖性方式减弱转导的抗体应答
[0199]
使用基因治疗治疗囊性纤维化(cf)肺疾病可必需重复给药重组腺相关病毒(raav)。然而，对raav介导的肺免疫应答知之甚少。在这里，我们表明雪貂是用于临床前测试av.tl65将cftr递送至肺并表征中和抗体(nab)应答的合适物种。av.tl65-hcftrδr有效转导人和雪貂二者的气道上皮培养物，并补充cf气道培养物中的cftr cl-电流。将av.tl65-hcftrδr递送至新生和幼年雪貂肺产生的hcftr mrna水平是内源性fcftr水平的200至300％高。在新生和幼年雪貂中进行av.tl65的单剂量(av.tl65-gluc)或重复给药(av.tl65-fcftrδr随后是av.tl65-gluc)。尽管两个年龄组的血浆nab应答接近等同，但重
复给药在幼年雪貂中显著降低了转基因表达(11倍)并提高了支气管肺泡灌洗液(balf)nab，而在新生雪貂中则没有。值得注意的是，在重复给药之后，两个年龄组都表现出balf抗衣壳结合igg、igm和iga抗体的减少。幼年雪貂的独特之处在于在第二次载体施用之后血浆抗衣壳结合igm的抑制。因此，年龄依赖性免疫系统成熟和同种型转换可影响av.tl65重复给药之后高亲和力肺nab的发展，并可为肺中钝性aav中和反应提供途径。
[0200]
如下更详细地进行以上结果。
[0201]
结果
[0202]
雪貂是用于评价对肺的av.tl65基因治疗的合适的临床前物种
[0203]
为了评价av.tl65衣壳变体是否能够补充气道中的cftr功能，我们测试了在顶端感染之后av.tl65-sp183-hcftrδr病毒校正人cf ali培养物中cftr介导的cl-电流的能力。由于raav1先前已被证明是人ali培养物顶端转导的最佳血清型之一，因此我们还将相同的av2-f5tg83-hcftrδr病毒基因组假包装到aav1衣壳中，并与av.tl65进行了比较分析。该比较表明，与用携带相同基因组(av1.sp183-hcftrδr)的raav1病毒感染之后相比，av.tl65-spl83-hcftrδr病毒的顶端感染产生更高水平的cftr介导的cl-电流(图8a)和cftr mrna(图8b)。
[0204]
为了评价av.tl65是否也能够转导雪貂气道上皮，我们首先使用分泌的高斯萤光素酶(gluc)报道载体av.tl65-sp183gluc在来源于人和雪貂的分化良好的气管支气管ali培养物中进行体外转导测定(图8c)。用av.tl65-sp183gluc对这些培养物的顶端感染表明两个物种之间的gluc转基因表达水平没有显著差异。为了确认在体内av.tl65对雪貂肺的向性，我们评价了在气管内递送之后av.tl65-sp183-hcftrδr在新生和幼年雪貂中的转导效率。在这些研究中，将转基因来源的hcftrδr mrna的表达以内源性fcftr mrna为参照作为转导效率的指标(即hcftrδr/fcftr mrna拷贝的比值)。使用该度量，在新生和幼年雪貂二者中，肺中的hcftrδr mrna表达是内源性fcftr mrna的2至3倍高(图8d)。相比之下，hcftrδr mrna的气管表达在新生动物中低于内源性fcftr mrna，并且在幼年动物中接近等同。用av.tl65气管的转导新生动物低且幼年动物高度可变可能是由于递送方法造成，该方法使用手术将病毒滴注到气管中部。总体而言，这些体外和体内研究表明，雪貂是研究肺对av.tl65感染中的免疫学应答的合适物种。
[0205]
先前将av.tl65暴露于幼年雪貂但不是新生雪貂的肺损害第二次施用的转导
[0206]
我们利用两种raav载体(av.tl65-sp183-fcftrδr和av.tl65-sp183-gluc)来评价对雪貂肺重复给药av.tl65的可行性。选择av.tl65-sp183-fcftrδr用于第一次病毒感染，因为该载体不应对转基因(即雪貂cftr或fcftr)产生(mount)免疫应答。对于第二次病毒感染，我们想要允许对转基因表达进行时序和定量分析的稳健的报道子，并因此选择了分泌型gluc报道基因载体av.tl65-sp183-gluc。将单剂量组中的雪貂仅用av.tl65-sp183-gluc载体感染，并将重复剂量组的雪貂首先用av.tl65-sp183-fcftrδr感染，然后用av.tl65-sp183-gluc感染。我们首先评价了较年轻动物的重复给药(图9)。我们在新生雪貂中开始了这些研究，这些新生雪貂在1周龄时用av.tl65-sp183-fcftrδr感染重复剂量组，并随后在三周之后用av.tl65-sp183-gluc病毒感染重复剂量和单剂量(原初)组二者(图9a)。在感染av.tl65-sp183-gluc之后14天期间监测血液样品中萤光素酶活性，并在实验结束时监测balf中的萤光素酶活性。来自该研究的发现表明，在两个给药组中血浆中的gluc
活性在感染之后5天达到峰值，并保持稳定至14天(图9b)。两个给药组之间的血浆gluc活性水平也没有显著差异。类似地，两个给药组之间感染之后14天balf中的gluc活性也没有显著差异(图9c)。在血浆和balf二者中，gluc活性远高于原初(未感染的)对照中的背景水平(图9b和9c)。
[0207]
这项对新生雪貂的研究表明，重复施用av.tl65是可行的，没有显著降低对肺的转导；然而，仍然存在新生雪貂中发育不足的免疫系统可产生针对aav衣壳的耐受免疫状态的可能性。由于这些原因，我们通过以下在幼年雪貂中重复实验：在1月龄时(大约代表1至2岁的学步儿)用av.tl65-sp183-fcftrδr对重复剂量组开始第一次感染，随后在4周之后将gluc报道载体(av.tl65-sp183-gluc)递送至单剂量组和重复剂量组二者(图10a)。来自该第二项研究的发现表明，两组在感染之后5天的血浆gluc活性最大，然而，重复剂量组在所有测试时间点的血浆gluc活性都较低(15至34倍)。与单剂量和重复剂量新生组中稳定的血浆gluc表达(图9b)相反，我们观察到两个幼年组的血浆gluc活性逐渐下降，重复剂量动物的趋势更急剧。(图10b)。同样地，在重复剂量幼年组中balfgluc活性也显著降低(11倍)(图10c)。累积起来，这些研究表明了在幼年而不是新生雪貂中nab针对aav衣壳应答的潜力。
[0208]
av.tl65的重复给药在balf和血浆中引起更高的nab应答
[0209]
鉴于在先前暴露于该病毒的幼年雪貂肺中av.tl65转导的效率降低，我们试图评价测试动物的balf和血浆中的nab。将抗av.tl65 nab的滴度确定为抑制a594细胞(人气道细胞系)中av.tl65-sp183-fluc转导的ic
50
。与单次给药和重复给药的新生雪貂中转基因表达水平相似一致，在两种给药条件之间balf中的nab滴度没有显著差异(图11a)。相比之下，在重复剂量组中幼年雪貂balf中的nab滴度与单剂量组相比显著更高(图11b)。此外，在单剂量组和重复剂量组二者的较年长动物的实验中，nab的绝对滴度比新生测试组高(3至5倍)，表明较年长雪貂中的免疫应答发展得更充分。
[0210]
对血浆样品的类似分析表明，在对照原初组(图11c和11d)和av.tl65感染之前的测试组中没有预先存在的nab。在两个年龄组中，单剂量和重复剂量动物在感染之后表现出血浆nab滴度逐渐的时间依赖性增加，并且重复剂量的幼年雪貂产生的血浆nab滴度略微高于(2至2.8倍)新生雪貂。幼年雪貂在单剂量感染之后在血浆中也更快地产生nab，在感染之后5天出现nab，而与之相比新生雪貂在感染之后10天出现nab。除了幼年雪貂感染之后14天的时间点外，两个年龄重复剂量组中的血浆nab水平也显著高于单剂量组的血浆nab水平。
[0211]
用于量化抗av.tl65衣壳抗体同种型的基于elisa的测定的开发
[0212]
从aav2/aav5衣壳改组文库进化而来，vp2和av.tl65的最丰富的vp3衣壳蛋白来源于aav5，在vp1中具有单个a581t突变。av.tl65的vp1是aav2和aav5衣壳的杂交体，其n端独特序列(vp1u)来自aav2vp1的1至131aa，随后是带有a581t突变的aav5衣壳的128至724aa。aav的vp1u包含磷脂酶a2(pla2)催化结构域，该结构域被认为对病毒体从内体逃逸至关重要。为了评价经av.tl65感染雪貂的血浆和balf中的av.tl65衣壳特异性免疫球蛋白(igg、igm和iga)，开发了使用aav病毒颗粒作为包被抗原的elisa测定。为了验证该方法，我们使用了从1月龄雪貂收集的血浆，对于该雪貂，av.tl65病毒以1至2个月的间隔被递送至肺四次。使用aav5颗粒作为包被抗原，见到原初血浆和av.tl65免疫血浆之间的差异igg结合从1∶50稀释开始，，并且至1∶1250稀释时，原初血浆结合不存在，而av.tl65免疫血浆抗体结合仍然很高(图12a)。相比之下，当将aav2用作包被抗原时，在所有稀释度下免疫血浆和原初
血浆之间的血浆igg结合没有差异，并且检测igg的灵敏度比aav5要低得多(图12b)。这些发现表明，av.tl65的表面抗原表位显示出与aav5衣壳相似的免疫原性，并且出于这些原因我们选择使用aav5作为包被抗原以用于对测试动物的balf和血浆中的抗衣壳抗体同种型进行分类。
[0213]
我们接下来使用这种elisa方法对测试动物的balf和血浆中的抗衣壳抗体同种型(igg、igm和iga)进行分类(图12和13)。一般而言，新生和幼年雪貂在单次和重复给药组二者的血浆中引发相似的aav5反应性igg应答，但重复感染之后滴度更高(图13a和13d)。相比之下，考虑到动物年龄和给药方案，血浆aav5反应性igm(图13b和13e)和iga(图13c和13f)应答表明与igg应答存在差异。例如，衣壳结合血浆igm水平仅在重复剂量组的幼年动物中受到抑制(图13b和13e)，而衣壳结合血浆iga水平在重复给药之后两个年龄组中均受到抑制。此外，新生动物最初在第二次病毒暴露之后最初产生大的抗衣壳iga应答，其随时间减弱，而幼年动物则缺少这种应答(图13c和13f)。这些发现表明，抗体同种型转换的年龄依赖性差异可能受到先前暴露于av.tl65的影响。与预期相反，对于新生和幼年动物二者，与重复剂量组相比，在单剂量组中balf中的aav5反应性igg、igm和iga显著较高(图14)。此外，尽管两次暴露于病毒的幼年动物的balf中nab水平较高，但衣壳结合igg、igm和iga的绝对水平在两个年龄组和给药条件之间一般相似(图11a和11b)。
[0214]
材料和方法
[0215]
重组av.tl65病毒载体的产生
[0216]
pav.tl65repcap(excoffon et al.，2009，同上)是aav辅助质粒，其用于产生用于产生av1-sp183-hcftrδr和av.tl65-sp183-hcftrδr、av.tl65-sp183-fcftrδr、av.tl65-sp183-fluc、av.tl65-sp183-gluc的av.tl65衣壳。用于包装的raav前病毒质粒是pav2.f5tg83-hcftrδr和pav2.f5tg83-fcftrδr，以及pav2-f5tg83fluc(萤火虫萤光素酶报道子)和pav2-f5tg83gluc(高斯萤光素酶报道子)。av.tl65载体是在费城儿童医院(children
′
s hospital of philadelphia，chop)的vector core中使用三质粒转染方法产生的。简而言之，将aav辅助pav.tl65repcap和腺病毒辅助pad与aav前病毒载体中的一种一起转染到hek293细胞中。将从经转染的hek293细胞产生的raav载体在cscl密度梯度上进行纯化。使用对转基因具有特异性的引物和探针通过定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qpcr)确定滴度，并通过银染之后进行sds-page来评价载体储备的纯度。
[0217]
av.tl65载体在人和雪貂气道上皮中的体外评价
[0218]
为了评价雪貂是否是用于分析av.tl65的合适物种，我们最初在来源于人和雪貂的分化良好的气管支气管ali培养物中进行了体外转导实验。将报道载体av.tl65-sp183gluc以10,000个drp(dna酶抗性颗粒)/细胞的moi(感染复数)顶端接种到人(n＝6个来自两个供体的transwell)和雪貂(n＝6个来自两个供体的transwell)的气道上皮ali培养物上。在感染期期间，在培养基中补充多柔比星，最终浓度为4μm，并在感染5天之后根据renilla萤光素酶活性测定试剂盒(promega)的制造商说明测量高斯萤光素酶活性的相对发光单位(rlu)，该试剂盒设计成用于测量高斯萤光素酶和renilla萤光素酶。两个未感染的transwell被设定为对照。
[0219]
用av1-sp183-hcftrδr和av.tl65-sp183-hcftrδr病毒感染人cf气道上皮之后
cftr介导的电流的体外比较
[0220]
在来源于cf患者(f508del/f508del)近气道的极化的人ali培养物中评价了av.tl65-sp183-hcftrδr和av1-sp183-hcftrδr表达hcftrδr和cftr功能互补的有效性。在存在多柔比星(2.5μm)和llnl(20μm)的情况下，将每种载体以100,000个drp/细胞的moi顶端施加至ali培养物(n＝4个来自两个供体的transwell)。这两种蛋白酶体调节剂已显示增强数种aav血清型的转导。在感染之后12天，如前所述在ussing室中测量cftr介导的cl-电流以确定在camp刺激(ibmx/毛喉素)和cftr抑制(glyh101)之后短路电流的变化(δisc)。将未感染的ali培养物(n＝4个来自两个供体的transwell)用作基线对照。在测量δisc之后，将来自每个病毒感染组的两个插入片段合并并使用plus mini试剂盒(qiagene)裂解总rna。将mrna转化为cdna之后，将载体来源的hcftrδr mrna通过pcr进行定量，并相对于人gapdh mrna进行归一化。
[0221]
新生和幼年雪貂肺中av.tl65转导分析
[0222]
使三日龄新生雪貂(n＝3)或一月龄幼年雪貂(n＝3)气管内接受4
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10
10
个drp/克体重的与多柔比星(终浓度250μm)混合的av.tl65-sp183-hcftrδr病毒。将模拟感染组中的雪貂(n＝3)仅用pbs中的dox(250μm)接种。在感染之后11天时对动物实施安乐死，分开收获气管和肺组织，快速冷冻并粉碎用于提取总rna。将转基因hcftrδr和内源性fcftr的载体来源的mrna通过进行量化，并将hcftrδr和fcftrδr的拷贝数相对于gapdh进行归一化，并随后表示为hcftrδr/fcftr的比值。
[0223]
向雪貂施用av.tl65-sp183-fcftrδr和/或av.tl65-sp183-gluc用于体液应答研究
[0224]
我们使用以下实验设计评价了向新生和幼年雪貂重复给药av.tl65载体。新生雪貂：将av.tl65-sp183-gluc报道载体气管内施用至对av.tl65衣壳未免疫(naive)或先前在1周龄时用av.tl65-sp183-fcftδr感染的4周龄雪貂。幼年雪貂：将av.tl65-sp183-gluc报道载体气管内施用至对av.tl65衣壳未免疫或先前在4周龄时用av.tl65-sp183-fcftrδr感染的8周龄雪貂。对于每个剂量，动物接受包含av.tl65-sp183gluc或av.tl65-sp183-fcftrδr载体(1x10
13
个drp/kg)和多柔比星(200μm终浓度)的接种物。在用异氟烷和氧气的混合物进行麻醉下，在1周龄新生雪貂中进行外科气管内注射，向试剂盒施用150μl接种物。对于其他年龄，在通过皮下注射氯胺酮与甲苯噻嗪的混合物的麻醉下使用气溶胶化器气管内施用病毒。将用于气溶胶化的载体/多柔比星接种物的体积相对于雪貂体重进行归一化(5ml/kg)。
[0225]
用于测量高斯萤光素酶活性的出血和支气管肺泡灌洗液收集
[0226]
在av.tl65-sp183-gluc报道载体递送之后0、5、10和14天时，将来自麻醉的雪貂血浆收集到肝素化管中。将动物用(virbac ah inc)实施安乐死，并通过滴注5ml pbs/300克体重从气管/肺盒收集支气管肺泡灌洗液(balf)。在样品收集之后立即测量血浆和balf中的gluc活性。
[0227]
使用血浆和balf进行抗体中和测定
[0228]
使用对先前报道的方法(wu et al.front immunol.8：1649,2017)的修改进行微
中和测定。将血浆和balf中nab的滴度量化为感染之前与连续稀释的血浆或balf一起孵育的av.tl65-sp183-fluc病毒感染a549细胞之后报道基因表达的降低。简而言之，将来自雪貂的所有血浆样品都进行热灭活(56℃，30分钟)。将血浆的五倍连续稀释液(以1∶50开始并且以1∶156,250结束)与av.tl65-sp183-fluc一起孵育，总体积为100ul。对于balf，施加相同的条件，但连续稀释液以1∶5开始并且以1∶3125结束。将这些混合物在37℃下孵育1小时以促进抗体结合和中和，并随后将其施加至48孔板中的a549细胞单层(1
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105/孔，moi＝5000个drp/细胞)，对于每种稀释度一式两份。在将细胞与病毒混合物在37℃/5％co2下孵育1小时之后，向孔中补充包含2％胎牛血清的dmem，并孵育另外24小时。然后用萤火虫萤光素酶测定试剂盒(promega)根据制造商的说明测量细胞裂解物中的萤火虫萤光素酶活性。每次进行该测定时，将仅用av.tl65-sp183-fluc感染的a549细胞用作100％转导的参考对照。将每个血浆或balf样品的中和滴度计算为半数最大抑制浓度(ic50)。
[0229]
血浆和balf中衣壳结合igg、igm和iga的elisa测量
[0230]
使用elisa程序捕获和量化血浆和balf中的总衣壳结合igg、igm和iga。简而言之，将碳酸盐缓冲液中的raav5在4℃下与96孔elisa板结合过夜(1
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109个drp/孔)。将受试血浆样品(igg和igm稀释至1∶2000，并且iga稀释至1∶20)和未经稀释的balf样品施加至每个孔，并在室温下孵育1小时。在pbs-t(0.05％吐温20)中洗涤3次之后，添加经稀释的hrp缀合的二抗并在室温下孵育1小时。hrp缀合的二抗包括鸡抗雪貂igg(gallus immunotech或abcam)和山羊抗雪貂igm或iga(life-bio inc)。然后通过读板仪中的吸光度对hrp反应产物进行量化。
[0231]
统计学分析
[0232]
实验数据表示为平均值
±
sd，并且使用prism7(graphpad software，inc.，san diego，ca，usa)进行数据分析。用单因素方差分析(analysis of variance，anova)随后用tukey检验分析统计学显著性(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001，****p＜0.0001)。
[0233]
动物护理中的伦理声明
[0234]
所有动物实验均根据爱荷华大学机构动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committees of the university of iowa)批准的协议进行。
[0235]
所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文。虽然在前述的说明书中已经结合本发明的一些优选实施方案描述了本发明，并且出于举例说明的目的已经阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员来说明显的是，本发明易于有另外的实施方案并且在不脱离本发明基本原理的情况下，可对本文中的某些细节作出相当大的变化。