一种生物催化合成4AA中间体的方法与流程

一种生物催化合成4aa中间体的方法
技术领域
1.本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种利用酮还原酶高 效制备4aa中间体的方法。


背景技术：

2.培南类药物如亚胺培南、比阿培南、美罗培南和法罗培南等，这些药物对 革兰阴性和阳性菌、需氧菌、厌氧菌等均具有广谱强效抗菌作用，研究此类药 物的合成有很重要的意义。化学名为(3r，4r)4-乙酸基-3-[(r)-((叔丁基二甲 基硅)氧基)乙基]-2-氮杂环丁酮的化合物，本领域通常被成为4aa，其是合成类 培南类抗生素的关键起始原料。因此以4aa的合成受到了广大科学工作者的关 注。
[0003]
4aa化学结构式如下所示：
[0004][0005]
其特征骨架为一个四元环内酰胺，具有三个手性中心共8个异构体，合成 难度比较大。关于4aa的合成已有文献综述(4aa的合成研究进展，河北化 工，2010，33卷,5期，34-35页)，但是大部分工艺都存在合成路线长、总收 率低、操作繁琐、成本高等缺点，因而限制了其产业化。因此开发经济适用的 4aa的工业化方法，对合成培南类药物有着很重要的意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明针对现有技术的不足，开发出了一种利用酮还原酶高效制备4aa中 间体的方法，所述4aa中间体具有式c所示的结构：
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该方法操作简单，条件温和，对环境友好，大幅度降低了生产的成本，适 合大规模的工业化生产。
[0009]
本发明提供一种合成4aa中间体的方法，所述4aa中间体具有式c所示 的结构：
[0010][0011]
其特征在于，以式b化合物为底物，在酮还原酶的作用下，制备得到所述 4aa中间
体，所述式b化合物的结构为：
[0012][0013]
上述反应中，式b化合物存在3r和3s两种光学异构体，酮还原酶可以选 择性将3s构型的3位乙酰基的羰基特异性还原为r构型羟基从而得到式c化 合物，由此3r构型的异构体不断转化为3s构型并被还原成式c化合物，同时 完成选择性还原和动态动力学拆分。
[0014]
进一步的，式b化合物由式a化合物乙酰化制备得到，所述式a化合物的 结构为：
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进一步的，所述酮还原酶的商品名为yh2080；
[0017]
进一步的，添加nad

或nadp

作为辅酶；
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进一步的，添加葡萄糖和葡萄糖脱氢酶或者异丙醇和醇脱氢酶或者甲酸和 甲酸脱氢酶实现辅酶的再生；
[0019]
进一步的，所述反应的溶剂为磷酸缓冲液；
[0020]
进一步的，所述方法的ph值为6-8，反应过程中通过添加碱维持ph值稳 定。
[0021]
本发明的另一方面，提供一种制备4aa的方法，其特征在于，通过如上所 述的方法制备得到式c化合物后，由式c化合物制备得到4aa，所述4aa的结 构为：
[0022][0023]
上述反应中，式a化合物是已知的，可以参照文献(science of synthesis, 31a,665-704,2007；journal of chemical research,(11),705-707,2005； bioorganic&medicinal chemistry letters,18(14),4163-4167,2008； journal of the american chemical society,111(3),1073-81,1989)制 备得到。
[0024]
由式c化合物制备得到4aa的方法是已知的，可以参照文献 (j.am.chem.soc.1989,111,9134；j.am.chem.soc.1990,112,7820；us4981992,1991；j.org.chem.1992,57,4243)制备得到。
具体实施方式
[0025]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实 施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]
本发明旨在提供一种合成4aa中间体的方法，本发明的具体实施方式中所 涉及到各个物质的结构列表如下：
[0027][0028]
所使用的酶制剂列表如下：
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酶来源商品编号酮还原酶苏州引航生物科技有限公司yh2080葡萄糖脱氢酶苏州引航生物科技有限公司yh1901醇脱氢酶苏州引航生物科技有限公司yh2023甲酸脱氢酶苏州引航生物科技有限公司yh1805
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实施例1：制备底物b
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将5ml二异丙胺溶解在70ml的四氢呋喃中，将上述溶液降温至-78度。 将正丁基锂(2.5m/hexanes,14ml)缓慢滴加至上述溶液中，滴加完毕保温1小 时。往上述溶液中缓慢滴加底物5g a的四氢呋喃溶液20ml，滴加完毕，在-78 度保温20分钟。乙酸乙酯(5g)缓慢滴加至反应液，滴加完毕，体系自然升温 至室温，搅拌过夜。反应完毕，往反应体系中滴加10％的醋酸水溶液，淬灭反应。 分液，取有机相，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相，干燥浓缩得粗品。粗品 通过柱层析得到纯品b 3.8克。
[0032]
实施例2：制备4aa关键中间体c
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称取底物b1g、葡萄糖2g置于50ml的三口烧瓶，加入10ml ph＝6.5， 0.2m的pbs缓冲液。将三口烧瓶放入反应锅中，设置转速850rpm温度30℃。 然后分别加入10mg nadp

,100mg葡萄糖脱氢酶的酶粉(购自苏州引航生物 科技有限公司，商品编号为yh1901)、以及100mg酮还原酶酶粉(购自苏州 引航生物科技有限公司，商品编号为yh2080)。开始反应，反应过程中用2m的 naoh溶液将ph维持在6.5左右，hplc监测。10小时反应转化率》98％。反应结 束，反应体系加热至80摄氏度搅拌2小时使酶失活，降至室温，往体系中加入 20ml乙酸
乙酯搅拌0.5小时，过滤(硅藻土助滤)。滤液分层，取有机相，水 相再用15ml乙酸乙酯萃取2次，分层，取有机相，合并有机相，无水硫酸钠干 燥，过滤，脱溶，得到粗品0.9克。粗品柱层析纯化得到纯品0.7克，ee 97％， dr 97:3。
[0034]
实施例3：制备4aa关键中间体c
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称取底物b1g、异丙醇1.5g置于50ml的三口烧瓶，加入20ml ph＝6.5， 0.2m的pbs缓冲液。将三口烧瓶放入反应锅中，设置转速850rpm温度30℃。 然后分别加入10mg nadp

,100mg醇脱氢酶的酶粉(购自苏州引航生物科技 有限公司，商品编号为yh2023)、以及100mg酮还原酶酶粉(购自苏州引航 生物科技有限公司，商品编号为yh2080)。开始反应，hplc监测。12小时反 应转化率》98％。反应结束，反应体系加热至80摄氏度搅拌2小时使酶失活，降 至室温，往体系中加入20ml乙酸乙酯搅拌0.5小时，过滤(硅藻土助滤)。 滤液分层，取有机相，水相再用15ml乙酸乙酯萃取2次，分层，取有机相，合 并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，脱溶，得到粗品0.87克。粗品柱层析纯化 得到纯品0.76克，ee 98％，dr 95：5。
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实施例4：制备4aa关键中间体c
[0037]
称取底物b1g、甲酸1g置于50ml的三口烧瓶，加入10ml ph＝6.75， 0.2m的pbs缓冲液。将三口烧瓶放入反应锅中，设置转速850rpm温度30℃。 然后分别加入10mg nadp

,100mg甲酸脱氢酶的酶粉(购自苏州引航生物科技 有限公司，商品编号为yh1805)、以及100mg酮还原酶酶粉(购自苏州引航 生物科技有限公司，商品编号为yh2080)。开始反应，hplc监测。10小时反 应转化率》98％。反应结束，反应体系加热至80摄氏度搅拌2小时使酶失活，降 至室温，往体系中加入20ml乙酸乙酯搅拌0.5小时，过滤(硅藻土助滤)。 滤液分层，取有机相，水相再用15ml乙酸乙酯萃取2次，分层，取有机相，合 并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，脱溶，得到粗品0.95克。粗品柱层析纯化 得到纯品0.82克，ee 97％，dr 98:2。
[0038]
以上所述仅为本发明的示例性实施例，并非因此限制本发明专利保护范 围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间 接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。