一种煤岩液相流生物核酸探针示踪方法

1.本发明涉及一种煤岩层水力示踪测试评价方法，特别是一种煤岩液相流生物核酸探针示踪方法。


背景技术：

2.水力化措施(水力压裂、煤层注水等)是增加煤岩体透气性、促进瓦斯解吸、提高煤层瓦斯抽采效果的有效技术途径，其具有影响范围大、增透效果显著等优势，广泛应用于低透气性煤层的增透。但是，由于水具有无色无味特征、并且煤岩体不透光，水力化措施技术实施过程中无法明确判定注入水的流动方向、影响范围、及其制约因素，从而导致水力化措施的执行效果具有极大的不确定性和不可控性。
3.水力化措施效果评价以及目前主要采用的测试方法：
4.(1)有效浸润范围的含水率测定分析：水力化措施实施后的有效湿润范围、湿润程度及湿润的分布状态是衡量水力化措施的一种关键指标，常规的探测方法是采用煤样含水率增值分析法，即由取样点绘制出沿钻孔周围水分增值分布曲线或区域分布状态图，以此确定整个注水区域煤层的湿润分布状态。但由于煤层水分变化的复杂性，该方法可靠性相对较差。
5.(2)离子示踪法：将示踪离子与水混合注入煤岩体，在不同点位取样分析样品中示踪离子的含量，并绘制离子浓度分布曲线或区域分布状态图，确定水力化措施的有效范围。但是该种方法伴随注入液在煤层水的稀释与吸附作用下离子浓度逐步降低，同时受煤体元素构成复杂、示踪离子与煤层化学组分的化学反应等因素干扰，离子示踪法存在抗干扰能力弱、受分析设备敏感度影响大等问题；甚至当示踪粒度过度稀释后导致水力化措施远端无法准确测得的难题受当前测试技术限制无法解决。
6.(3)气体示踪法：该方法与离子示踪法类似，用示踪气体替代示踪离子。通过示踪气体煤岩体中的流动/渗流实现分布。通过分析不同点位样品中示踪气体含量，绘制离子浓度分布曲线或区域分布状态图，确定水力化措施的有效范围。气体示踪解决了煤层水与煤层组分的干扰问题，但是该种方法仍然存在两项技术难题：
①
煤层气对示踪气体具有稀释和干扰作用，当示踪气体被煤层气过度稀释时，示踪气体的测试分析难度变大，从而降低示踪技术敏感度；
②
受煤体介孔裂隙空间水封堵效应的影响，示踪气体难以在介孔裂隙空间有效分布，由此气体示踪只能用于大裂隙贯通情况的分析，不适用于水力化措施评价。
7.综合以上测试技术，现有的水力化测试评价技术普遍存在可靠性低、辨识度低、操作复杂、成本高的技术难题


技术实现要素：

8.技术问题：本发明的目的是要克服现有技术中的不足之处，提供一种可靠性高、辨识度高、操作简单、成本低廉的煤岩液相流生物核酸探针示踪方法。
9.技术方案：本发明的一种煤岩液相流生物核酸探针示踪技术，以人工编辑荧光蛋
白表达质粒转化示踪菌作为示踪介质，利用示踪菌随液体自由扩散和在煤体表面单层吸附特性完成菌种在介孔的分布，示踪菌携带有特异性绿色荧光蛋白核酸探针，该核酸探针与pet22b表达质粒进行重组融合并且可以随着示踪菌的生长而自主复制表达，以生物核酸探针扩增方法实现示踪菌分布的定性定量分析，准确判断煤层裂系的走向。
10.具体步骤如下：
11.步骤1、人工合成egfp和mchery生物核酸探针并与商用表达质粒pet22b进行重组融合，构建含有特异性生物核酸探针的pet22b-egfp,pet22b-mchery重组融合表达质粒；以大肠杆菌为载体，转化人工编辑的含有生物核酸探针的重组融合表达质粒并进行诱导表达，将大肠杆菌改造为含有特异性生物核酸探针示踪菌，所述的大肠杆菌菌种编号：e.coilbl21；
12.步骤2、初步将示踪菌的菌群密度培育至1
×
108～1
×
109个/ml，完成示踪菌种子液的制备；
13.步骤3、综合水力化措施预估处理煤岩体体量、孔隙率、孔隙比表面积估算出水力化措施示踪菌液需求量(l
he
)和水力化措施示踪菌液的菌密度(ρe)；具体为：
14.l
he
＝vc×n[0015][0016][0017]
其中l
he
：水力化措施示踪菌液需求量，单位：m3；
[0018]
l
te
：含有特异性生物核酸探针示踪菌总需求量，单位：个；
[0019]
se：含有特异性生物核酸探针示踪菌单菌投影面积，单位：um2/个；
[0020]vc
：煤岩体处理体积，单位：m3；
[0021]
vm：孔隙比表面积，单位：m2/m3；
[0022]
n：孔隙率；
[0023]
ρe：水力化措施示踪菌液的菌密度，单位：个/ml；
[0024]
步骤4、以示踪菌种子液为菌源，根据步骤3计算结构培育并诱导表达水力化措施示踪菌液，并用相应激发波长照射示踪菌液检验示踪菌是否培育成功；菌剂注入完成后静置48-72小时，使示踪菌自由扩散特性完成菌种在煤体介孔以上裂隙空间的布置，吸附在煤裂隙表面并逐渐稳定；
[0025]
步骤5、根据设计好的空间取样点布置，钻孔取样，取样时采用无菌硅胶取样器孔底取样，每个孔煤样取样量3g，无菌硅胶取样器型号：jd-kkc-10；
[0026]
步骤6、利用荧光显微镜观察示踪菌随液体自由扩散和在煤体样品表面单层吸附特性完成菌种在介孔的分布分析；图2所示，为示踪菌在煤炭样品表面的吸附剂介孔分布图。
[0027]
步骤7、根据煤孔隙大肠杆菌粘滞系数和煤样有效比表面积，评估菌种最大扩散半径，并划分五个范围区域，并设计空间取点布置；五个范围区域具体为示踪菌高丰度半径(rh)、示踪菌中丰度半径(rm)、示踪菌低丰度半径(rl)、示踪菌微量分布半径(rt)和示踪菌痕量分布半径(rta)；
[0028]
其中，示踪菌高丰度半径(rh)为煤样中菌种密度》1*106、示踪菌中丰度半径(rm)为煤样中菌种密度:1*10
5-1*106、示踪菌低丰度半径(rl)为煤样中菌种密度:1*10
4-1*105、示踪菌微量分布半径(rt)为煤样中菌种密度:1*10
3-1*104、示踪菌痕量分布半径(rta)为煤样中菌种密度:《1*103；
[0029]
步骤8、根据步骤7划定的示踪菌丰度分布，对不同丰度区域煤样的示踪菌进行提取；
[0030]
所述的示踪菌提取方法如下：
[0031]
(1)示踪菌高丰度半径(rh)、示踪菌中丰度半径(rm)、示踪菌低丰度半径(rl)范围内的菌株提取方法：1g煤样与2.5ml超纯水混合，充分震荡后3000
×
g离心5min，取上清液1ml为提取菌液；
[0032]
(2)示踪菌微量分布半径(rt)、示踪菌痕量分布半径(rta)范围内的大肠杆菌提取方法：3g煤样与7.5ml超纯水混合，充分震荡后3000
×
g离心5min，取上清液5ml，然后将5ml上清液15000
×
g离心10min，弃上清液，留浓缩菌液0.5ml为浓缩提取菌液。；
[0033]
步骤9、生物探针法探测煤层中示踪菌的分布：利用环境微生物样品总群落基因组dna提取试剂盒对不同空间位点的煤炭样品进行处理，提取煤样中微生物总基因组；
[0034]
由于示踪菌中携带有生物核酸探针，以煤样中微生物总基因组为模板，利用分子生物学技术手段进行核酸探针的特异性识别和扩增，来检测煤层中示踪菌的分布；
[0035]
步骤10、根据各取样点的空间坐标和各样品的计数结果绘制三维示踪菌分布等高图，分析示踪菌在煤矿裂系中的分布；
[0036]
步骤11、将示踪菌分布等高图与水力化措施设计控制区域向比对，利用生物核酸探针的特异性，检测荧光菌在每层中的注入分布情况，从而准确判断煤层裂系的走向，完成水力化措施效果评价。
[0037]
所述的示踪菌具备非团聚性特征，是菌种自身具备的一种菌间不粘附的特征；实施中的具体体现为：当一菌株在煤体吸附表面形成占位后，其他菌株不会吸附在已吸附的示踪菌表面，由此特性使示踪菌在煤体表面形成的菌膜具备单一菌层特征，即单层吸附。
[0038]
所述的示踪菌具备下述技术特征：
[0039]
(1)示踪菌经过荧光蛋白表达载体转化，经诱导表达特异性蛋白后，携带有荧光特征；
[0040]
(2)示踪菌本身具备双波长激发荧光特征，两种激发光的波长差≥100nm；被激发的荧光光谱范围限制在400nm-800nm，并且两种被激发的荧光波长差≥100nm；
[0041]
(3)示踪菌来源于非煤地质环境的自然界，确保示踪菌与煤层菌种具备显著dna差异；
[0042]
(4)示踪菌自身具有运动特征、有显著的敏感因子趋避特性，能够自主向低敏感因子环境移动的能力；
[0043]
(5)示踪菌的菌株直径小于2μm，长度小于6μm。
[0044]
有益效果，由于采用了上述方案，以人工编辑荧光蛋白表达质粒转化示踪菌作为示踪介质，利用示踪菌随液体自由扩散和在煤体表面单层吸附特性完成菌种在介孔的分布，以生物核酸探针扩增方法实现示踪菌分布的定性定量分析；不仅适用于煤矿的开采，对于其它类似地下岩系裂缝的分布同样可以进行检测。
[0045]
具有以下有益效果：
[0046]
(1)介质大小为μm级的微小的的独立体：示踪介质大小1-10μm的独立体，具备μm尺度上的不可分割特征。
[0047]
(2)介质可通过物理手段浓缩与观测：即使介质被无限稀释，仍然像水仓中的发光球；介质可通过常温物理操作实现浓缩(如离心或过滤)；特定波长光照射下能够激发荧光；可通过光学显微镜被观测；煤样中的介质计数量纲为：个/g煤。
[0048]
(3)示踪菌具备dna的独特性：示踪菌携带一种或多种具备独特性的dna片段，该片段显著区别于煤层任何微生物的dna结构，识别率强。
[0049]
(4)示踪介质自身具备运动特征：能主动规避具有抑制特征的敏感因子，以此可通敏感因子浓度差向低浓度区域主动移动。
[0050]
(5)示踪技术受煤层因素干扰小，基于示踪菌携带的重组荧光蛋白作为示踪介质，能极大程度降低煤层复杂环境干扰对示踪的影响。
[0051]
(6)利用示踪介质的自由扩散与煤体表面单层吸附的特征使示踪菌能够不完全依托外力作用下主动完成在煤层介孔中的分布。
[0052]
(7)菌株非团聚性特征解决了菌源使用量的可预估难题。
[0053]
这些关键技术可靠性高、辨识度高、操作简单、成本低廉，突破、提高了水力化措施效果评价精度、控制评价成本，达到了本发明的目的。与传统技术相比，本发明的水力化措施效果评价的敏感度和特异性更高。
[0054]
优点：利用大肠杆菌为示踪介质，借助大肠杆菌个体小(个体尺寸《5μm)并且不可继续分割、携带特种易辨识dna片段，具备荧光特征、菌体可通过离心实现浓缩、具备敏感因子自主躲避特性。
附图说明
[0055]
图1是本发明的取样点布置图。
[0056]
图2是本发明示踪菌在煤炭样品表面的吸附剂介孔分布图。
[0057]
图3是本发明煤炭样品示踪菌生物核酸探针pcr鉴定图。
具体实施方式
[0058]
本发明的一种煤岩液相流生物核酸探针示踪技术，以人工编辑荧光蛋白表达质粒转化示踪菌作为示踪介质，利用示踪菌随液体自由扩散和在煤体表面单层吸附特性完成菌种在介孔的分布，示踪菌携带有特异性绿色荧光蛋白核酸探针，该核酸探针与pet22b表达质粒进行重组融合并且可以随着示踪菌的生长而自主复制表达，以生物核酸探针扩增方法实现示踪菌分布的定性定量分析，准确判断煤层裂系的走向。
[0059]
具体步骤如下：
[0060]
步骤1、人工合成egfp和mchery生物核酸探针并与商用表达质粒pet22b进行重组融合，构建含有特异性生物核酸探针的pet22b-egfp,pet22b-mchery重组融合表达质粒；以大肠杆菌为载体，转化人工编辑的含有生物核酸探针的重组融合表达质粒并进行诱导表达，将大肠杆菌改造为含有特异性生物核酸探针示踪菌，所述的大肠杆菌菌种编号：e.coilbl21；
[0061]
步骤2、初步将示踪菌的菌群密度培育至1
×
108～1
×
109/ml，完成示踪菌种子液的制备；
[0062]
步骤3、综合水力化措施预估处理煤岩体体量、孔隙率、孔隙比表面积估算出水力化措施示踪菌液需求量(l
he
)和水力化措施示踪菌液的菌密度(ρe)；具体为：
[0063]
l
he
＝vc×n[0064][0065][0066]
其中l
he
：水力化措施示踪菌液需求量，单位：m3；
[0067]
l
te
：含有特异性生物核酸探针示踪菌总需求量，单位：个；
[0068]
se：含有特异性生物核酸探针示踪菌单菌投影面积，单位：um2/个；
[0069]vc
：煤岩体处理体积，单位：m3；
[0070]
vm：孔隙比表面积，单位：m2/m3；
[0071]
n：孔隙率；
[0072]
ρe：水力化措施示踪菌液的菌密度，单位：个/ml；
[0073]
步骤4、以示踪菌种子液为菌源，根据步骤3计算结构培育并诱导表达水力化措施示踪菌液，并用相应激发波长照射示踪菌液检验示踪菌是否培育成功；菌剂注入完成后静置48-72小时，使示踪菌自由扩散特性完成菌种在煤体介孔以上裂隙空间的布置，吸附在煤裂隙表面并逐渐稳定；
[0074]
步骤5、根据设计好的空间取样点布置，钻孔取样，取样时采用无菌硅胶取样器孔底取样，每个孔煤样取样量3g，无菌硅胶取样器型号：jd-kkc-10；
[0075]
步骤6、利用荧光显微镜观察示踪菌随液体自由扩散和在煤体样品表面单层吸附特性完成菌种在介孔的分布；图2所示，为示踪菌在煤炭样品表面的吸附剂介孔分布图。
[0076]
步骤7、根据煤孔隙大肠杆菌粘滞系数和煤样有效比表面积，评估菌种最大扩散半径，并划分五个范围区域，并设计空间取点布置；五个范围区域具体为示踪菌高丰度半径rh、示踪菌中丰度半径rm、示踪菌低丰度半径rl、示踪菌微量分布半径rt和示踪菌痕量分布半径rta；
[0077]
其中，示踪菌高丰度半径rh为煤样中菌种密度》1*106、示踪菌中丰度半径rm为煤样中菌种密度:1*10
5-1*106、示踪菌低丰度半径rl为煤样中菌种密度:1*10
4-1*105、示踪菌微量分布半径rt为煤样中菌种密度:1*10
3-1*104、示踪菌痕量分布半径rta为煤样中菌种密度:《1*103；
[0078]
步骤9、根据步骤7划定的示踪菌丰度分布，对不同丰度区域煤样的示踪菌进行提取；
[0079]
所述的示踪菌提取方法如：
[0080]
(1)示踪菌高丰度半径rh、示踪菌中丰度半径rm、示踪菌低丰度半径rl范围内的菌株提取方法：1g煤样与2.5ml超纯水混合，充分震荡后3000
×
g离心5min，取上清液1ml为提取菌液；
[0081]
(2)示踪菌微量分布半径rt、示踪菌痕量分布半径rta范围内的大肠杆菌提取方
法：3g煤样与7.5ml超纯水混合，充分震荡后3000
×
g离心5min，取上清液5ml，然后将5ml上清液15000
×
g离心10min，弃上清液，留浓缩菌液0.5ml为浓缩提取菌液。
[0082]
步骤9、生物探针法探测煤层中示踪菌的分布：利用环境微生物样品总群落基因组dna提取试剂盒对不同空间位点的煤炭样品进行处理，提取煤样中微生物总基因组；
[0083]
由于示踪菌中携带有生物核酸探针，以煤样中微生物总基因组为模板，利用分子生物学技术手段进行核酸探针的特异性识别和扩增，来检测煤层中示踪菌的分布；
[0084]
步骤10、根据各取样点的空间坐标和各样品的计数结果绘制三维示踪菌分布等高图，分析示踪菌在煤矿裂系中的分布；
[0085]
步骤11、将示踪菌分布等高图与水力化措施设计控制区域向比对，利用生物核酸探针的特异性，检测荧光菌在每层中的注入分布情况，从而准确判断煤层裂系的走向，完成水力化措施效果评价。
[0086]
所述的示踪菌具备非团聚性特征，是菌种自身具备的一种菌间不粘附的特征；实施中的具体体现为：当一菌株在煤体吸附表面形成占位后，其他菌株不会吸附在已吸附的示踪菌表面，由此特性使示踪菌在煤体表面形成的菌膜具备单一菌层特征，即单层吸附。
[0087]
所述的示踪菌具备下述技术特征：
[0088]
(1)示踪菌经过荧光蛋白表达载体转化，经诱导表达特异性蛋白后，携带有荧光特征；
[0089]
(2)示踪菌本身具备双波长激发荧光特征，两种激发光的波长差≥100nm；被激发的荧光光谱范围限制在400nm-800nm，并且两种被激发的荧光波长差≥100nm；
[0090]
(3)示踪菌来源于非煤地质环境的自然界，确保示踪菌与煤层菌种具备显著dna差异；
[0091]
(4)示踪菌自身具有运动特征、有显著的敏感因子趋避特性，能够自主向低敏感因子环境移动的能力；
[0092]
(5)示踪菌的菌株直径小于2μm，长度小于6μm。
[0093]
下面根据附图结合实施例对本发明作详细的说明。
[0094]
实施例1：
[0095]
步骤1、人工合成egfp和mchery生物核酸探针并与商用表达质粒pet22b进行重组融合，构建含有特异性生物核酸探针的pet22b-egfp,pet22b-mchery重组融合表达质粒。以大肠杆菌为载体，转化人工编辑的含有生物核酸探针的重组融合表达质粒并进行诱导表达，将大肠杆菌改造为含有特异性生物核酸探针示踪菌，所述的大肠杆菌菌种编号：e.coilbl21。
[0096]
所述的改造和的大肠杆菌同时具备以下特征即为示踪菌：
[0097]
(1)示踪菌经过荧光蛋白表达载体转化，经诱导表达特异性蛋白后，携带有荧光特征；
[0098]
(2)示踪菌本身具备双波长激发荧光特征，两种激发光的波长差≥100nm；被激发的荧光光谱范围限制在400nm-800nm，并且两种被激发的荧光波长差≥100nm；
[0099]
(3)示踪菌来源于非煤地质环境的自然界，确保示踪菌与煤层菌种具备显著dna差异；
[0100]
(4)示踪菌自身具有运动特征、有显著的敏感因子趋避特性，能够自主向低敏感因
子环境移动的能力；
[0101]
(5)示踪菌的菌株直径小于2μm，长度小于6μm。
[0102]
步骤2、初步将示踪菌的菌群密度培育至1*109/ml左右，完成示踪菌种子液的配置准备；
[0103]
步骤3、综合水力化措施预估处理煤岩体体量、孔隙率、孔隙比表面积估算出水力化措施示踪菌液需求量(l
he
)和水力化措施示踪菌液的菌密度(ρe)，具体为：
[0104]
l
he
＝vc×n[0105][0106][0107]
其中l
he
：水力化措施示踪菌液需求量，单位：m3；
[0108]
l
te
：含有特异性生物核酸探针示踪菌总需求量，单位：个；
[0109]
se：含有特异性生物核酸探针示踪菌单菌投影面积，单位：um2/个；
[0110]vc
：煤岩体处理体积，单位：m3；
[0111]
vm：孔隙比表面积，单位：m2/m3；
[0112]
n：孔隙率；
[0113]
ρe：水力化措施示踪菌液的菌密度，单位：个/ml；
[0114]
步骤4、诱导表达示踪菌液，并用相应激发波长照射示踪菌液检验示踪菌是否培育成功；菌剂注入完成后静置48-72小时，使示踪菌自由扩散特性完成菌种在煤体介孔以上裂隙空间的布置，吸附在煤裂隙表面并逐渐稳定；
[0115]
步骤5、根据设计好的空间取样点布置，钻孔取样，取样时采用无菌硅胶取样器孔底取样；每点位取样3g；
[0116]
步骤6、利用荧光显微镜观察示踪菌随液体自由扩散和在煤体样品表面单层吸附特性完成菌种在介孔的分布：图2所示，为示踪菌在煤炭样品表面的吸附剂介孔分布图。
[0117]
步骤7、根据煤孔隙大肠杆菌粘滞系数和煤样有效比表面积，评估菌种最大扩散半径，并划分五个范围区域，并设计空间取点布置(图1、图2)；五个范围区域具体为示踪菌高丰度半径rh、示踪菌中丰度半径rm、示踪菌低丰度半径rl、示踪菌微量分布半径rt和示踪菌痕量分布半径rta；
[0118]
其中，示踪菌高丰度半径rh为煤样中菌种密度》1*106、示踪菌中丰度半径rm为煤样中菌种密度:1*10
5-1*106、示踪菌低丰度半径rl为煤样中菌种密度:1*10
4-1*105、示踪菌微量分布半径rt为煤样中菌种密度:1*10
3-1*104、示踪菌痕量分布半径rta为煤样中菌种密度:《1*103；
[0119]
步骤8、根据步骤7划定的示踪菌丰度分布，对不同丰度区域煤样的示踪菌进行提取；
[0120]
所述的示踪菌提取方法如下：
[0121]
(1)示踪菌高丰度半径rh、示踪菌中丰度半径rm、示踪菌低丰度半径rl范围内的菌株提取方法：1g煤样与2.5ml超纯水混合，充分震荡后3000
×
g离心5min，取上清液1ml为提取菌液；
[0122]
(2)示踪菌微量分布半径rt、示踪菌痕量分布半径rta范围内的大肠杆菌提取方法：3g煤样与7.5ml超纯水混合，充分震荡后3000
×
g离心5min，取上清液5ml，然后将5ml上清液15000
×
g离心10min，弃上清液，留浓缩菌液0.5ml为浓缩提取菌液。
[0123]
步骤9、生物探针法探测煤层中示踪菌的分布：利用环境微生物样品总群落基因组dna提取试剂盒对不同空间位点的煤炭样品提取液进行处理，提取煤样中微生物总基因组；
[0124]
由于示踪菌中携带有特异性荧光探针，以煤样中微生物总基因组为模板，利用分子生物学技术手段进行荧光探针的特异性识别和扩增，来检测煤层中示踪菌的分布：
[0125]
生物核酸探针pcr引物由擎科生物合成；
[0126]
引物a：atggtctcgaagggcgag
[0127]
引物b：ttacttcatgagctcgtcca
[0128]
特异性生物核酸探针pcr反应体系如下：
[0129][0130][0131]
特异性生物核酸探针pcr扩增条件：95℃ 3min，95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min；图3为煤炭样品示踪菌提取提特异性生物核酸探针pcr鉴定图；
[0132]
步骤7划定的示踪菌丰度分布步骤10、根据各取样点的空间坐标和各样品的计数结果绘制三维示踪菌分布等高图，分析重组蛋白荧光细菌在煤矿裂系中的分布；
[0133]
步骤11、将示踪菌分布等高图和水力化措施设计控制区域向比对，利用生物核酸探针的特异性，检测荧光菌在每层中的注入分布情况，从而准确判断煤层裂系的走向，完成水力化措施效果评价。
[0134]
该方法不仅适用于煤矿的开采，对于其它类似地下岩系裂缝的分布同样可以进行检测。