用于促进植物生长和治疗植物疾病的微生物组合物和使用方法与流程

用于促进植物生长和治疗植物疾病的微生物组合物和使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2014年12月29日提交的美国临时专利申请第62/097,287号的权益，其公开通过引用全文纳入本文。
技术领域
3.本发明公开的主题涉及用于施用于植物、植物种子、植物周围土壤以促进植物生长和治疗植物疾病的包含分离细菌菌株的组合物。在某些情况下，微生物菌株与具有抗微生物性质的化学活性试剂组合递送至植物、植物种子和植物周围的土壤。
技术背景
4.已知在土壤中存在许多对植物生长和健康有有益效果的微生物，其与植物一起生活，尤其在根部区域(植物生长促进根瘤菌(plant growth promoting rhizobacteria)“pgpr”)，或作为内生菌寄居在植物内。它们的有益的植物生长促进性质包括氮固定、铁螯合、磷酸盐的溶解、非有益微生物的抑制、抗虫、诱导系统抗性(isr)、系统获得性抗性(sar)、土壤中的植物材料的分解以提高有用的土壤有机物，以及刺激植物生长、发育并响应干旱等环境应激的植物激素(如吲哚乙酸(iaa)、乙偶姻和2,3-丁二醇等)的合成。此外，这些微生物可通过分解前体分子1-氨基环丙烷-1-羧酸酯(acc)来干扰植物的乙烯应激反应，从而刺激植物生长并减缓果实成熟。这些有益的微生物可改善土壤的品质、植物的生长、产率、和作物的品质。多种微生物表现出这样的对控制植物疾病有用的生物学活性。与合成的肥料和杀虫剂相比，这样的生物杀虫剂(活生物体和这些活生物体天然产生的化合物)更安全和更生物可降解。
5.真菌植物病原体，包括但不限于葡萄孢属(botrytis spp.)(例如灰葡萄孢(botrytis cinerea))、镰孢属(fusarium spp.)(例如尖镰孢(f.oxysporum)和禾谷镰孢菌(f.graminearum))、丝核菌属(rhizoctonia spp.)(例如立枯丝核菌(r.solani))、稻瘟菌属(magnaporthe spp.)、球腔菌属(mycosphaerella spp.)、柄锈菌属(puccinia spp.)(例如隐匿柄锈菌(p.recondita))、疫霉属(phytopthora spp.)和层锈菌属(phakopsora spp.)(例如豆薯层锈菌(p.pachyrhizi))是一类植物有害生物，可在农业和园艺行业中导致严重的经济损失。化学试剂可被用于控制真菌植物病原体，但化学试剂的使用具有一些缺点，包括高成本、缺乏功效、出现真菌的抗性菌株、以及不希望的环境影响。另外,这些化学处理有不加区别的倾向，并可能在该处理所针对的植物病原体以外，对有益的细菌、真菌、和节肢动物产生不良影响。第二种植物有害生物是细菌病原体，包括但不限于欧文氏菌属(erwinia spp.)(如菊欧文氏菌(erwinia chrysanthemi))、泛菌属(pantoea spp.)(如柠檬泛菌(p.citrea))、黄单胞菌属(xanthomonas)(例如野油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris))、假单胞菌属(pseudomonas spp.)(如丁香假单胞菌(p.syringae))和青枯菌属(ralstonia spp.)(如茄科青枯菌(r.soleacearum))，可在农业和园艺行业中导致严重
的经济损失。与病原真菌类似，使用化学试剂处理这些细菌病原体具有一些缺点。病毒和类病毒生物体包括第三种植物致病剂，其难以控制，但细菌微生物可通过诱导系统抗性(isr)向植物提供抗性。因此，需要可被用作生物肥料和/或生物杀虫剂以控制病原真菌、病毒、和细菌的微生物，且在改善农业的可持续性中需求旺盛。最后一类植物病原体包括植物病原线虫和昆虫，其导致植物的严重损害和损失。
6.已报道了一些作为生物防治株的芽孢杆菌属(species bacillus)的成员，并且部分被用于商业产品(joseph w.kloepper等，2004，phytopathology vol.94，no.11，1259-1266)。例如，目前在商业生物防治产品中使用的菌株包括：短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)菌株qst2808，作为活性成分用于sonata和ballad-plus，拜耳作物科学公司(bayer crop science)生产；短小芽孢杆菌株gb34，作为活性成分用于yieldshield，拜耳作物科学公司生产；枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)株qst713，作为serenade的活性成分使用，拜耳作物科学公司生产；枯草芽孢杆菌株gbo3，作为活性成分用于kodiak和system3，海伦娜化学公司(helena chemical company)生产。各种苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)和坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)的菌株被用作抗线虫和媒介昆虫的生物防治剂，这些菌株作为许多市售生物防治产品的基础，包括拜耳作物科学公司生产的nortica和poncho-votivo。另外，目前在商业的生物刺激剂产品中使用的芽孢杆菌菌株包括：解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)菌株fzb42作为活性成分用于abitep gmbh生产的rhizovital 42，以及作为全细胞(包括其发酵提取物)被包括在生物刺激剂产品(如jhbiotech inc生产的fulzyme)中的各种其他枯草芽孢杆菌。
7.本发明公开的主题提供微生物组合物及其利于植物生长和治疗植物疾病的使用方法。


技术实现要素：

8.在一个实施方式中，提供一种有益于植物生长和/或植物健康的组合物，所述组合物包括：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；其中，将所述组合物施用至植物的种子、植物的根或植物周围的土壤促进植物生长和/或植物健康。
9.在一个实施方式中提供一种促进植物生长和/或植物健康的方法，该方法包括将组合物递送至植物的种子、植物的根或植物周围的土壤，所述组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；其中，所述组合物的递送促进植物生长和/或植物健康。
10.在一个实施方式中，提供一种有益于植物生长和/或植物健康的组合物的方法，所述方法包括：向植物种子、植物的根或植物周围的土壤递送以下的组合：第一组合物，该第一组合物包含以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物、或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及第二组合物，该第二组合物包
含以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物、或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；其中，所述组合的递送促进植物生长和/或植物健康。
11.在一个实施方式中，提供一种植物种子，其中，该植物种子被有益于植物生长和/或植物健康的组合物包覆，所述组合物包括：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子。
12.在一个实施方式中，提供一种植物种子，其中，该植物种子被有益于植物生长和/或植物健康的组合物包覆，所述组合物包括：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；以及联苯菊酯杀昆虫剂。
13.在一个实施方式中提供一种促进植物生长和/或植物健康的方法，该方法包括将植物种子种植于合适的生长培养基，其中，所述种子被组合物包覆，所述组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；所述成分以适于促进植物生长和/或植物健康的量存在。
14.在一个实施方式中提供一种用于促进植物生长的组合物，该组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及联苯菊酯杀昆虫剂。
15.在一个实施方式中提供一种用于促进植物生长的组合物，该组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及联苯菊酯杀昆虫剂，其中，所述组合物在与液体肥料兼容的制剂中。
16.在一个实施方式中，提供一种用于促进植物生长的组合物，该组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及杀真菌剂，所述杀真菌剂包含源自白花羽扇豆(lupinus albus doce)的提取物、blad多肽或blad多肽片段中的一种或它们的组合。
17.在一个实施方式中提供一种产品，该产品包含：第一组合物，该第一组合物包含以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物、或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物，以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌
rti477的生物纯培养物、或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；和第二组合物，该第二组合物包含微生物、生物或化学杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、除草剂、植物提取物、植物生长调节剂或肥料中的一种或它们的组合，其中，所述第一和第二组合物分开包装；以及任选的递送说明，用于将所述第一组合物与第二组合物的组合以适于促进植物生长的量递送至：植物的叶、植物的皮、植物的果实、植物的花、植物的种子、植物的根、植物的插条、植物的嫁接苗、植物的愈伤组织；植物周围的土壤或生长培养基；在将植物种子播种在土壤或生长培养基中之前的土壤或生长培养基；或在将植物、植物的插枝、植物嫁接苗、或植物愈伤组织种植在土壤或生长培养基中之前的土壤或生长培养基。
附图说明
18.图1是根据本发明的一个或多个实施方式的解淀粉芽孢杆菌rti301中发现的独特的羊毛硫氨酸抗生素(lantibiotic)生物合成操纵子周围的基因组组织或包括该操纵子的基因组组织与两种解淀粉芽孢杆菌参照菌株-解淀粉芽孢杆菌fzb42和解淀粉芽孢杆菌trigocor1448的相应区域的对比示意图。
19.图2a是对照植株的图像，示出了生长13天后提取的小麦植株。图2b是rti477菌株接种的植株的图像，示出了生长13天后提取的小麦植株。这些图像示出了根据本发明的一种或多种实施方式的枯草芽孢杆菌菌株rti477对小麦早期植株生长的积极效果。
20.图3a是示出了点样(spotted)在解淀粉芽孢杆菌rti472菌株的菌苔上的解淀粉芽孢杆菌rti301菌株。图3b是示出了点样在枯草芽孢杆菌菌株rti477的菌苔上的解淀粉芽孢杆菌rti301菌株。这些图像示出了根据本发明的一种或多种实施方式的解淀粉芽孢杆菌菌株rti301与枯草芽孢杆菌菌株rti477之间的相容性。
21.图4a是示出了根据本发明的一个或多个实施方式的解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的形态学图像。图4b是示出了根据本发明的一个或多个实施方式的枯草芽孢杆菌rti477菌株的形态的图像。
22.图5示出了对照植株。图5b示出了用106cfu/ml的rti301 rti477(比率3:1)接种的植株。图5a-5b是示出了根据本发明的一个或多个实施方式的用解淀粉芽孢杆菌菌株rti301 枯草芽孢杆菌菌株rti477的组合接种的大豆种子以及8天生长后提取的种子获得的在早期植株生长方面的积极效果。
23.图6是表示早先报道的包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和新鉴定的微生物所产生的两种芬枯草菌素型和脱羟基芬枯草菌素型环状脂肽，以及根据本发明的一种或多种实施方式的解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477分离株所产生的新鉴定的(用粗体显示)芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素型分子的示意图。
24.详述
25.本技术以及权利要求书中使用的术语“一个”、“一种”、“所述”是指“一个或多个”。因此，例如，提及“植株”包括多个植株，除非上下文中明确指出了相反含义。
26.在本说明书和权利要求书中的术语“包括”、“包含”和“含有”以非排他性方式使用，除非上下文中有相反要求。类似地，术语“包括”及其语法上的变体不是为了起限制作用，因此，对列表中的项目的引述并不排除可以替换到或者添加到所列项目中的其他类似
项目。
27.出于本说明书和权利要求的目的，术语“约”与一个或多个数字或数值范围共同使用时，应理解为指所有这些数字，包括该范围内的所有数字以及延伸所示数值的上下边界的修改。通过端点引用数字范围包括该范围内包含的所有数字，例如，所有的整数，以及该范围内的所有分数(例如1-5包括1、2、3、4、5及其分数，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)以及该范围内的任意范围。
28.出于本说明书和权利要求的目的，当与rti301菌株或其它解淀粉芽孢杆菌菌株所产生的具有抗微生物活性的化合物关联使用时，术语“代谢物”和“化合物”可互换使用。
29.在本发明的一个或多个实施方式中，提供用于促进植物生长和/或植物健康的组合物及方法。在一个实施方式中，提供一种用于促进植物生长和/或植物健康的组合物，所述组合物包括两种或多种相容的微生物，其中，具有抗微生物性质的第一微生物用于通过抑制土壤中或与植物共同生存的内生性微生物的生长和发育而产生小生境(niche)。第二微生物具有有益于植物生长和/或植物健康的性质，并且与第一微生物的生长相容。该第二微生物的量足以建立(established)并促进植物生长和/或植物健康。所述组合物向植物种子、植物的根或植物周围的土壤的施用有益于植物生长和/或植物健康。所述第二微生物的益于植物生长和/或植物健康的性质包括增加的产量、改善的幼苗活力、改善的根发育、改善的植物生长、改善的植物健康、改善的外观、改善的对植物病原体的抗性、减少的病原体感染中的一种或它们的组合。所述植物病原体可包括昆虫、线虫、植物病原体真菌或植物病原体细菌中的一种或它们的组合。
30.在另一实施方式中提供一种促进植物生长和/或植物健康的方法，该方法包括将组合物递送至植物的种子、植物的根或植物周围的土壤，所述组合物包含两种或多种相容的微生物。所述组合物包括至少一种具有抗微生物性质的第一微生物的生物纯培养物，其存在的量适于抑制周围土壤中或与植物共同生存的内生性微生物的生长。这是为了建立(establish)一个小生境，从而使得第二微生物能够建立。所述组合物还包括至少一种具有有益于植物生长和/或植物健康的第二微生物的生物纯培养物，其中，所述第二微生物的生长与所述第一微生物的生长相容，且其中，所述第二微生物存在的量适于建立并适于促进植物生长和/或植物健康。所述组合物向植物种子、植物的根或植物周围的土壤的递送有益于植物生长和/或植物健康。
31.为了促进第二微生物的建立过程，第二微生物的生长可快于第一微生物的生长，且所述第二微生物可以成群(swarming)和高移动性的表型为特征。
32.所述组合物和方法包括与任意类型的植物使用，包括例如：单子叶植物、双子叶植物、谷类、玉米、甜玉米、爆米花玉米、种子玉米、青贮玉米、田地玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、芦笋、浆果、蓝莓、黑莓、树莓、罗甘莓、黑果木、蔓越莓、醋栗、接骨木、红醋栗、蔓越橘、灌木浆果、芸苔属蔬菜、花椰菜、卷心菜、菜花、球芽甘蓝、羽衣甘蓝、无头甘蓝、芥菜、球茎甘蓝、葫芦科蔬菜、黄瓜、哈密瓜、甜瓜、香瓜、西葫芦(squash)、西瓜、南瓜、茄子、鳞茎类蔬菜、洋葱、大蒜、葱、柑橘、橙、葡萄柚、柠檬、桔子、橘柚、柚子、果蔬、胡椒、番茄、草原樱桃、树番茄、秋葵、葡萄、草药/香料、叶用蔬菜、莴苣、芹菜、菠菜、欧芹、菊苣、豆类/蔬菜(多汁的和干燥的豆和豌豆)、豆、青豆、豆荚、荚豆、大豆、干豆、鹰嘴豆、利马豆、豌豆、三角豆、裂荚豌豆、扁豆、油籽作物、坎诺拉油菜、蓖麻、椰子、棉花、亚麻、油棕、橄榄、花生、油菜籽、红花、芝麻、
向日葵、大豆、仁果类水果、苹果、山楂、梨、榅桲、夏花山楂、根/块茎和球茎蔬菜、胡萝卜、马铃薯、甜马铃薯、木薯、甜菜、姜、辣根、萝卜、人参、芜箐、核果类水果、杏、樱桃、油桃、桃、李子、梅子、草莓、木本坚果、杏仁、开心果、山核桃、胡桃、榛子、栗子、腰果、山毛榉坚果、灰胡桃、夏威夷果、奇异果、香蕉、(蓝色)龙舌兰、草、草皮草、观赏植物、一品红、硬插枝、栗子、橡树、枫树、甘蔗、或甜菜。
33.用于本发明的组合物和方法的所述具有抗微生物性质的第一微生物和所述具有有益于植物生长和/或健康的性质的第二微生物可以是芽孢杆菌属微生物。出于说明书和权利要求的目的，术语“拮抗”和“抗微生物”在本文中可互换使用。所述第一微生物可以是芽孢杆菌属菌株，所述芽孢杆菌属菌株可以是解淀粉芽孢杆菌。具有有益于植物生长和/或植物健康的性质的第二微生物可以是枯草芽孢杆菌。有益于植物生长和/或植物健康的性质可以是生长促进性质和保护植物不受植物病原体感染和/或治疗或控制植物病原体感染的拮抗性质中的一种或两种。
34.用于本发明的组合物和方法的所述具有抗微生物性质的第一微生物和所述具有有益于植物生长和/或健康的性质的第二微生物的示例如下所述。例如，鉴定为属于枯草芽孢杆菌属的植物相关细菌从加北利福尼亚生长的辣木(moringa oleifera)的根中被分离，然后测试其植物生长促进性质和植物病原体拮抗性质。更具体地，通过高度保守的16s rrna和rpob基因的序列分析，分离的细菌菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌的新菌株(见实施例1)。新细菌分离株(称为“枯草芽孢杆菌rti477”)的16s rna序列被确定为与三种已知的其他枯草芽孢杆菌菌株、解淀粉芽孢杆菌菌株ns6(kf177175)和枯草芽孢杆菌枯草亚种(bacillus subtilis subsp.subtilis)菌株dsm 10(nr_027552)在16s rrna基因序列方面相同。另外，确定rti477的rpob序列与已知的枯草芽孢杆菌py79(cp006881)或枯草芽孢杆菌枯草亚种6051-hgw(cp003329)菌株(即99％序列相同度；9bp差异)或枯草芽孢杆菌枯草亚种bab-1a(cp004405)(即99％序列相同度；10bp差异)有最高水平的序列相似性。rpob基因序列在dna水平上的差异表明rti477是枯草芽孢杆菌的新菌株。枯草芽孢杆菌rti477的菌株按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定，于2014年4月17日保藏于美国弗吉尼亚州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(atcc)，专利保藏号为pta-121167。
35.所述具有抗微生物性质的第一微生物的示例有鉴定为属于解淀粉芽孢杆菌的植物相关细菌，其从纽约州(ny)内的葡萄园中生长的葡萄藤的根际土壤中分离，并测试其植物病原体拮抗性质。更具体地，通过高度保守的16s rrna和rpob基因的序列分析，分离的细菌菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌的新菌株(见实施例2)。新细菌分离株(称为“解淀粉芽孢杆菌rti301”)的16s rna序列被确定为与三种已知的其他解淀粉芽孢杆菌株、解淀粉芽孢杆菌菌株ns6(kf177175)、解淀粉芽孢杆菌菌株fzb42(nr_075005)和枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株dsm 10(nr_027552)在16s rrna基因序列方面相同。另外，确定rti301菌株的rpob基因序列与已知的解淀粉芽孢杆菌植物亚种(bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)trigocor1448(cp007244)(99％序列相似度；3碱基对差异)、解淀粉芽孢杆菌植物亚种as43.3(cp003838)(99％序列相似度；7碱基对差异)、解淀粉芽孢杆菌cc178(cp006845)(99％序列相似度；8碱基对差异)和解淀粉芽孢杆菌fzb42(cp000560)(99％序列相似度；8碱基对差异)中的相同基因具有序列相似性。rti301菌株鉴定为解淀粉芽孢杆
菌。rpob基因序列在dna水平上的差异表明rti301是解淀粉芽孢杆菌的新菌株。解淀粉芽孢杆菌rti301的菌株按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定，于2014年4月17日保藏于美国弗吉尼亚州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(atcc)，专利保藏编号为pta-121165。
36.解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的基因组序列的进一步分析揭示该菌株具有与羊毛硫氨酸抗生素生物合成相关的基因，而其他与解淀粉芽孢杆菌rti301菌株紧密相关的菌株中缺少该基因的同系物(见实施例3)。这在图1中进行说明，其示出了解淀粉芽孢杆菌rti301中发现的独特的羊毛硫氨酸抗生素生物合成簇的基因组织以及rti301下方示出的两种已知的解淀粉芽孢杆菌参照菌株fzb42(中间)和trigocor1448(底部)的相应区域的示意图。由图1可以看出，fzb42和trigocor1448菌株缺少该簇中存在的许多基因，并且多种基因呈现低水平的序列相同度。该簇相对于ncbi中的非冗余(nr)核苷酸数据的blastn分析示出了与解淀粉芽孢杆菌菌株的5’和3’侧接区的高度同源性(类似于图1中的高％相似性)。但是，羊毛硫肽(lantipeptide)生物合成簇对于rti301是独特的，并且与ncbi nr数据库中任意已测序的dna均不具有显著的同源性。该数据表明新鉴定的rti301具有独特的羊毛硫氨酸抗生素生物合成通路。
37.另外，解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的基因组的进一步的序列分析揭示该菌株具有与大量用于产生具有抗微生物性质的分子的生物合成通路相关的基因。这些包括用于subtilosin、表面活性肽、伊枯草菌素(iturin)、芬枯草菌素(fengycins)、解淀粉环菌素(amylocyclicin)、艰难菌素(difficidin)、芽孢菌溶素(bacilysin)、杆菌抗霉素(bacillomycin)和bacillaene的生物合成通路。与rti301菌株的抗微生物生物合成通路的宽范围相反，rti477菌株的进一步的序列分析揭示该菌株具有与用于更有限组具有抗微生物性质的分子的生物合成通路相关的基因。rti477菌株具有用于subtilosin、芬枯草菌素、表面活性肽、艰难菌素、bacillaene、芽孢菌溶素和杆菌抗霉素的生物合成通路，但是未观察到用于伊枯草菌素、羊毛硫氨酸抗生素和解淀粉环菌素的完整生物合成通路。
38.实施试验来测定rti301和rti477菌株的生长促进活性和拮抗活性。本文实施例4-6描述了测定枯草芽孢杆菌rti477菌株在多种植物中和各种条件下的生长促进活性和拮抗活性的实验。实施例4描述了在平板试验中测定的枯草芽孢杆菌rti477分离株相对于主要植物病原体的拮抗活性。实施例5描述了枯草芽孢杆菌rti477分离株的多种表型性状，显示该分离株具有快速生长和强的成群(swarming)表型。实施例6描述了rti477分离株在小麦中的生长促进活性。发芽的小麦种子悬浮于～2
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107cfu/ml的rti477菌株中接种2天，随后种植在盆中。生长13天后的提取的植物的图片示于图2中。图2a示出了对照植株，图2b示出了用rti477接种的植株。测定了小麦幼苗的干重，结果为用枯草芽孢杆菌rti477菌株接种的植株的总平均干重为35.41mg，未接种的对照为33.38mg，经rti477处理的植株的干重相对于未接种的对照干重有6％的增加。
39.类似地对rti477菌株实施试验来测定解淀粉芽孢杆菌rti301在多种植物和各种条件下的生长促进活性和拮抗活性。这些试验在实施例4-5中描述。实施例4描述了在平板试验中测定的解淀粉芽孢杆菌rti301分离株相对于主要植物病原体的拮抗活性。与rti477菌株相比，rti301菌株显示了对广泛的植物病原性微生物的优越拮抗性质。实施例5描述了解淀粉芽孢杆菌rti301分离株的各种表型性状。值得注意的是，相比于rti301，rti477生长
得更快并具有更强的成群表型。
40.解淀粉芽孢杆菌rti301菌株与其他芽孢杆菌分离株的相容性通过将rti301菌株点样在多种其他菌株的菌苔上来测定。这些数据在实施例7中描述。该试验的结果示于图3a-3b。图3a-3b示出解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477菌株之间的生长相容性，且rti301菌株与另一种解淀粉芽孢杆菌菌株(以pta-121166保藏于美国典型培养物保藏中心(atcc)的解淀粉芽孢杆菌rti472)缺乏相容性。当菌株rti301点样于菌株rti472的菌苔(图3a)上时，观察到了针对菌株rti472生长的清晰抑制区域。相反，当菌株rti301点样于菌株rti477的菌苔(图3b)上时，针对菌株rti477菌株仅观察到了最少的抑制且细胞片区中没有清除。因此，可以推断rti301和rti477的生长是相容的。
41.无意受限于任何特定的作用机理，提出了一种下述的作用模式以解释所观察到的菌株相容性差异。根据三种测试的菌株(即rti301、rti472和rti477)的基因组序列，预测这些菌株用于产生拮抗化合物芽孢菌溶素、bacillaene、艰难菌素和杆菌抗霉素。但是，解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477拥有用于合成subtilosin的基因，但是在解淀粉芽孢杆菌rti472的基因组中缺少该基因。subtilosin是一种细菌素，是一类由细菌产生的用于抑制相似或紧密相关的细菌菌株的生长的蛋白质毒素。因此，假想由解淀粉芽孢杆菌rti301合成的subtilosin可能是解淀粉芽孢杆菌rti472的生长抑制剂。相反，枯草芽孢杆菌rti477菌株未被rti301抑制，因为rti477菌株产生其自己的subtilosin，从而对所述化合物具有抗性。
42.也对解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477菌株之间的菌株形态差异进行了分析。显示这些菌株各自形态的图片在图4中示出：解淀粉芽孢杆菌rti301(图4a)和枯草芽孢杆菌rti477(图4b)。图4a-4b中示出的解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477菌株的集落形态表明了菌株特性在活动性方面的潜在差异。活动性是植物相关细菌根际定殖的重要性状。解淀粉芽孢杆菌rti301生长成良好划界的圆形集落。相反，枯草芽孢杆菌rti477生长成松散的集落，其形态指示了成群以及活动性(swarming and motility)。成群以及活动性是植物根的根际和表面的快速定殖相关的表型。再次，无意受限任何特定的作用机理，假设与枯草芽孢杆菌rti477菌株的形态相关的强成群表型导致该菌株相比于解淀粉芽孢杆菌rti301是更有效的根际定殖菌(colonizer)。
43.鉴于生长相容性和所观察到的表型差异，对rti301和rti477菌株的组合测试其促进植物生长和健康的能力。进行试验以测定向大豆种子单独以及组合施用枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301对大豆种子发芽、根发育和早期植株生长的效果。试验按实施例8的描述实施，使用了rti301和rti477的孢子。将rti301和rti477孢子的组合添加至种子，比率为1:3、1:1和3:1。数据示于表v。1x106、1x107和1x108浓度的解淀粉芽孢杆菌rti301对大豆种子的接种对于植株生长、根发育和构建没有效果。相同浓度的枯草芽孢杆菌rti477对大豆种子的接种时，在最低浓度下对根发育和构建仅具有轻微的改善。但是，使用rti301和rti477两者的组合(比例1:3)对大豆种子接种在所有测试浓度下均对根发育和早期植株生长带来了改善。rti301和rti477以3:1的比例和1x106cfu/ml的浓度施用时观察到了对根发育的最佳结果。使用3:1比例的rti301 rti477的孢子接种种子的积极效果的图片示于图5a和5b(a
–
对照植株；b
–
使用rti301 rti477(比例3:1)以106cfu/ml的浓度接种的植株)。如图5a-5b所示，对于根形成和构建的效果是特别积极的。细根毛对于水和养分的摄
取以及植物与其他微生物在根际的相互作用是重要的。这些结果显示单独施用菌株与对照植株相比没有效果或效果很小，施用枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的组合的种子对大豆早期生长和构建提供了比预期好得多的益处。观察了枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的组合的协同作用，其对植株生长提供了出乎意料的益处。
44.对大豆实施额外的试验以检测用rti301和rti477菌株的组合处理种子对产量的效果。如下所述进行实验：1)种子未处理；2)用cruisermaxx(噻虫嗪、咯菌腈 甲霜灵-m；先正达作物保护公司(syngenta crop protection,inc))与甲基硫菌灵的组合处理种子，这是典型的大豆种子处理(cruisermaxx与甲基硫菌灵的组合称作“化学对照”)；3)使用化学对照处理种子 用5.0x10
5
cfu/种子的菌株rti301接种；4)使用化学对照处理种子 用5.0x10
5
cfu/种子的菌株rti477接种；5)使用化学对照处理种子 用5.0x10
5
cfu/种子的两种菌株的组合接种。进行10个试验作为10个独立的点，在表vi中示出大豆产量结果(蒲式耳/英亩)。表vi中的结果表明，与单独使用化学对照处理的种子相比，单独使用解淀粉芽孢杆菌rti301或枯草芽孢杆菌rti477对大豆整体产量没有效果。如上述试验中所观察到的，使用解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477的组合接种提供了协同效果同时大豆产量增加了5％(从58.2蒲式耳/英亩增加至61.1蒲式耳/英亩)。枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的组合对大豆产量提供了出乎意料的益处。
45.实施例9描述了使用枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的组合处理种子对玉米的益处。对于玉米试验，数据总结于表vii中，实施方案如下所述：1)种子未处理(“utc”)；2)使用三种常用的化学活性剂的组合处理种子，称作“化学对照”或“cc”)；以及3)使用化学对照 分别为5.0x10
5
cfu/种子的菌株rti301和rti477的组合处理种子(“cc rti 301/477
46.1:1”)。在天然疾病压力或用丝核菌接种土壤的条件下进行两次试验。值得注意的是，观察到1:1组合的rti301和rti477 化学对照相对于仅用化学对照处理的组分别在天然病原体压力和丝核菌接种田间试验中获得了10.7蒲式耳/英亩和59.8蒲式耳/英亩的产量增加。这些数据表明使用这些菌株的组合处理种子能够在玉米产量方面带来非常大的增加。
47.实施例10描述了用rti301和rti477菌株的组合以及用于控制病原体的化学活性试剂处理种子对大豆出苗和产量的影响的试验。具体而言，对大豆进行如下所述的实验：1)种子未处理(“utc”)；2)使用三种常用的化学活性剂的组合处理种子，称作“化学对照”；3)使用vibrance(活性成分为环丙吡菌胺(sedaxane)；先正达作物保护公司(syngenta crop protection,inc))处理种子；以及4)使用化学对照 分别为5.0x10
5
cfu/种子的菌株rti301和rti477处理种子。进行两组试验，其中植物种子在种植时用立枯丝核菌(rhizoctonia solani)接种。表viii中的结果显示，相对于仅用化学对照的处理，使用解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477的组合以及化学对照的处理使得产量平均增加13.3蒲式耳/英亩(从59.4到72.7蒲式耳/英亩)。于是，使用rti301和rti477的组合的种子处理显著提高大豆产量，即便在严重的病原体压力条件下也是如此。
48.实施例11描述了使用枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的组合的滴灌对西葫芦、番茄和胡椒的益处。由土壤传播的真菌导致的疾病压力未在任何试验中
记录。在西葫芦试验中，种植时通过根部浸透以3.75x10
12
cfu/公顷的比率施用解淀粉芽孢杆菌rti301的孢子，以0.625x10
12
cfu/公顷的比率施用枯草芽孢杆菌rti477的孢子，未进一步通过滴灌来施用。使用accomplish lm(洛弗兰德产品公司(loveland products))作为市售对照，并以2340ml/ha的比率用与rti301 rti477组合相同的方式施用。该产品含有下组的共混物：敏捷噬酸菌(acidovorax facilis)(1x103cfu/ml)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)(1x103cfu/ml)、枯草芽孢杆菌(1x103cfu/ml)、蔬菜芽孢杆菌(bacillus oleronius)(1x103cfu/ml)、海洋芽孢杆菌(bacillus marinus)(1x103cfu/ml)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)(1x103cfu/ml)、和红球菌属红球菌(rhodococcus rhodochrous)(1x103cfu/ml)。与浸透液中未包括细菌孢子的未处理对照植株以及市售对照植株相比，rti301 rti477孢子的添加使得西葫芦的总产量及可出售产量均有增加。具体而言，rti301 rti477处理的植株生产了总共873.4kg/ha的西葫芦，相比之下，未处理的对照植株以及使用accomplish处理的植株分别为838.3kg/ha和836.1kg/ha，表示西葫芦总重分别有4.2％和4.5％的增加。相对于未处理的对照植株以及用市售标准处理的植株，用解淀粉芽孢杆菌rti301 枯草芽孢杆菌rti477孢子处理的植株的增加的西葫芦总重说明了用该处理所提供的积极生长效果。
49.在番茄试验中，种植时通过根部浸透以0.625x10
12
cfu/公顷的比率施用解淀粉芽孢杆菌rti301的孢子，以3.75x10
12
cfu/公顷的比率施用枯草芽孢杆菌rti477的孢子，然后在移植17天和35天之后以相同比率进行两次滴灌施用。使用accomplish lm作为市售对照，并以2340ml/ha的比率用与rti301 rti477组合相同的方式施用。与浸透和滴灌中未包括细菌孢子的未处理对照植株以及市售对照植株相比，rti301 rti477孢子的添加使得番茄的总产量及可出售产量均有增加。具体而言，rti301 rti477处理的植株带来了总共21,824kg/ha的可出售番茄，相比之下，未处理的对照植株以及使用accomplish处理的植株分别为16,765kg/ha和21,420kg/ha，表示可出售番茄重量分别有30.2％和1.9％的增加。特别是相对于未处理的对照植株，用解淀粉芽孢杆菌rti301 枯草芽孢杆菌rti477孢子处理的植株的大幅增加的可出售番茄重量说明了用该处理所提供的积极生长效果。
50.在胡椒(墨西哥胡椒(jalapeno pepper))试验中，种植时通过根部浸透以1.25x10
12
cfu/公顷的比率施用解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477的孢子，然后在移植17天和35天之后以相同比率进行两次滴灌施用。使用accomplish lm作为市售对照，并以2340ml/ha的比率用与rti301 rti477组合相同的方式施用。与未施用细菌孢子的未处理对照植株以及市售对照植株相比，rti301 rti477孢子的添加增加了墨西哥胡椒的产量。具体而言，rti301 rti477处理的植株带来了总共4154kg/ha的可出售胡椒，相比之下，未处理的对照植株以及使用accomplish处理的植株分别为3455kg/ha和3930kg/ha，表示可出售胡椒重量分别有20％和5.7％的增加。相对于未处理的对照植株以及用市售标准处理的植株，用解淀粉芽孢杆菌rti301 枯草芽孢杆菌rti477孢子处理的植株的大幅增加的可出售胡椒重量说明了用该处理所提供的积极生长效果。
51.由rti301和fti477菌株产生的抗微生物代谢物在实施例12中鉴定并在图6中说明。实施例12描述了对rti301和fti477菌株产生的环状脂肽-芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素的考察，并且令人惊讶地鉴定出了这些分子的几种之前未报道的种类。经测定，解淀粉芽孢杆菌rti301产生之前报道的芬枯草菌素a、b和c化合物以及脱羟基芬枯草菌素a、b和c
化合物。出乎意料的是，除了这些已知的化合物，确定rti301菌株还生产了之前没有被鉴定过的这些化合物的衍生物，其中环状肽链8位上的l-异亮氨酸(在图6中称为x3)被l-甲硫氨酸替代。新的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素种类在此被称为ma、mb和mc，是指a、b和c类的图6中的x3的l-异亮氨酸被l-甲硫氨酸替代的衍生物。新鉴定的分子用粗体示于图6和表ix。也对rti477菌株进行了新鉴定的芬枯草菌素ma、mb和mc化合物的观察，但是rti477菌株中并未观察到相应的脱羟基芬枯草菌素ma、mb和mc化合物(见表ix)。
52.进一步确定rti301菌株产生另外一类之前尚未鉴定的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素。在该类中，芬枯草菌素b和脱羟基芬枯草菌素b的l-异亮氨酸(图6中的位置x3)被l-同型半胱氨酸(hcy)替代。这些之前未鉴定的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素代谢物在此称为芬枯草菌素h和脱羟基芬枯草菌素h并用粗体示于图6和表ix。也对rti477菌株进行了新鉴定的芬枯草菌素h化合物的观察，但是rti477菌株中并未观察到相应的脱羟基芬枯草菌素h化合物(表ix)。
53.进一步确定rti301菌株产生另外一类未鉴定的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素代谢物。在该类中，环形肽骨架结构的位点4处的氨基酸(图6中的位点x1)被l-异亮氨酸替代。这些之前未鉴定的代谢物在此称为芬枯草菌素i和脱羟基芬枯草菌素i并示于图6和表ix。也对rti477菌株观察了新鉴定的芬枯草菌素i和脱羟基芬枯草菌素i化合物(表ix)。
54.于是，在本发明的组合物和方法中，具有抗微生物性质的解淀粉芽孢杆菌可以是以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301，或该菌的具有所有其识别特征的突变体。类似地，具有有益于植物生长和/或健康性质的枯草芽孢杆菌可以是以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477，或该菌的具有所有其识别特征的突变体。在本发明的组合物和方法中，所述植物可包括大豆或玉米，且所述植物生长益处的呈现方式可以是增加的产量。
55.在一个实施方式中，提供一种有益于植物生长和/或植物健康的含有两种或多种可相容的微生物的组合物，所述组合物包括：至少一种具有抗微生物性质的第一微生物的生物纯培养物，其存在的量适于抑制周围土壤中或与植物共同生存的内生性微生物的生长；至少一种具有有益于植物生长和/或植物健康的第二微生物的生物纯培养物，其中，所述第二微生物的生长与所述第一微生物的生长相容，且其中，所述第二微生物存在的量足以建立并适于促进植物生长和/或植物健康，其中，所述组合物向植物种子、植物的根或植物周围土壤的施用有益于植物生长和/或植物健康。所述第二微生物的益于植物生长和/或植物健康的性质包括增加的产量、改善的幼苗活力、改善的根发育、改善的植物生长、改善的植物健康、改善的外观、改善的对植物病原体的抗性、减少的病原体感染中的一种或它们的组合。所述植物病原体可包括昆虫、线虫、植物病原体真菌或植物病原体细菌中的一种或它们的组合。
56.在一个实施方式中，提供一种有益于植物生长和/或植物健康的组合物，所述组合物包括：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；所述成分以适于促进植物生长和/或植物健康的量存在。所述组合物向植物种子、植物的根或植物周围的土壤的施用有益于植物生长和/或植物健康。
57.本文所用的短语“细菌菌株的生物纯培养物”是指以下的一种或其组合：细菌菌株的生物纯发酵培养物的孢子、细菌菌株的生物纯发酵培养物的营养细胞、细菌菌株的生物纯发酵培养物的一种或多种产品、细菌菌株的生物纯发酵培养物的培养物固体、细菌菌株的生物纯发酵培养物的培养物上清液、细菌菌株的生物纯发酵培养物的提取物、以及细菌菌株的生物纯发酵培养物的一种或多种代谢物。
58.在一个实施方式中，组合物的形式为种植基质。所述种植基质可以是盆栽土的形式。
59.在一个实施方式中，所述组合物还包含载体、分散剂或酵母提取物中的一种或它们的组合。
60.在一个实施方式中，所述组合物还包含微生物、生物或化学杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、除草剂、植物提取物、植物生长调节剂或肥料中的一种或它们的组合，这些成分以适于促进植物生长和/或保护植物不受病原性感染的量存在。
61.在一个实施方式中，用于促进植物生长的组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及联苯菊酯杀昆虫剂。
62.在一个实施方式中，用于促进植物生长的组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及联苯菊酯杀昆虫剂，其中，所述组合物在可用作液体肥料的制剂中。可用作液体肥料的制剂可包含水合硅酸铝镁以及至少一种分散剂。所述联苯菊酯杀昆虫剂可以以0.1g/ml至0.2g/ml的浓度存在。所述联苯菊酯杀昆虫剂可以以约0.1715g/ml的浓度存在。在说明书和权利要求中使用的术语“在可用作液体肥料的制剂中”意在表示所述制剂能够在水性溶液中溶解、分散或乳化，使得与肥料混合而在液体制剂中被递送至植物。
63.在一个实施方式中提供一种促进植物生长和/或植物健康的方法，该方法包括将组合物递送至植物的种子、植物的根或植物周围的土壤，所述组合物包含：至少一种具有抗微生物性质的第一微生物的生物纯培养物，其存在的量适于抑制周围土壤中或与植物共同生存的内生性微生物的生长；至少一种具有有益于植物生长和/或植物健康的第二微生物的生物纯培养物，其中，所述第二微生物的生长与所述第一微生物的生长相容，且其中，所述第二微生物存在的量适于建立并适于促进植物生长和/或植物健康，其中，所述组合物的施用有益于植物生长和/或植物健康。
64.在一个实施方式中提供一种促进植物生长和/或植物健康的方法，该方法包括将组合物递送至植物的种子、植物的根或植物周围的土壤，所述组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；其中，所述组合物的递送促进植物生长和/或植物健康。
65.在一个实施方式中，提供一种有益于植物生长和/或植物健康的组合物的方法，所
述方法包括：向植物种子、植物的根或植物周围的土壤递送以下的组合：第一组合物，该第一组合物包含以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物、或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及第二组合物，该第二组合物包含以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物、或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；其中，所述组合的递送促进植物生长和/或植物健康。
66.所述含有微生物的组合物的形式可以是液体、油分散体、粉尘、干燥的可润湿粉末、可传播颗粒、或干燥的可润湿颗粒。所述微生物可以是孢子或营养细胞的形式。所述组合物的形式可为液体，并且枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301各自的浓度可为约1.0
×
108cfu/ml至约1.0
×
10
12
cfu/ml。所述组合物可以是粉尘、干燥的可润湿粉末、可传播颗粒、或干燥的可润湿颗粒的形式，并且枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301的量可以是约1.0
×
108cfu/g至约1.0
×
10
12
cfu/g。所述组合物可以是油分散体的形式，并且枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301的浓度可以是约1.0
×
67.108cfu/ml至约1.0
×
10
12
cfu/ml。
68.所述含有微生物的组合物还可包含载体、分散剂或酵母提取物中的一种或它们的组合。
69.在一个实施方式中，提供一种被有益于植物生长和/或植物健康的组合物包覆的植物种子，所述组合物含有两种或多种可相容的微生物。所述包覆组合物包括至少一种具有抗微生物性质的第一微生物的生物纯培养物的孢子，其存在的量适于抑制周围土壤中或与植物共同生存的内生性微生物的生长。所述组合物还包括至少一种具有有益于植物生长和/或植物健康的第二微生物的生物纯培养物的孢子，其中，所述第二微生物的生长与所述第一微生物的生长相容，且其中，所述第二微生物存在的量足以建立并适于促进植物生长和/或植物健康。
70.在一个实施方式中，提供一种用有益于植物生长和/或植物健康的组合物包覆的植物种子，所述组合物包括：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；所述成分以适于促进植物生长和/或植物健康的量存在。
71.在一个实施方式中，枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301各自的量为约1.0
×
102cfu/种子至约1.0
×
109cfu/种子。
72.在一个实施方式中，所述植物种子还包含微生物、生物或化学杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、除草剂、植物提取物、植物生长调节剂或肥料中的一种或它们的组合，这些成分以适于促进植物生长和/或保护植物不受病原性感染的量存在。在一个实施方式中，所述杀昆虫剂包含联苯菊酯。
73.在一个实施方式中，提供一种植物种子，其中，该植物种子被有益于植物生长和/或植物健康的组合物包覆，所述组合物包括：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物的孢
子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；以及联苯菊酯杀昆虫剂。
74.在一个实施方式中，提供一种用于促进植物生长和/或植物健康的方法，所述方法包括在合适的生长培养基中种植植物种子，其中，所述种子被组合物包覆，所述组合物包含：至少一种具有抗微生物性质的第一微生物的生物纯培养物的孢子，其存在的量适于抑制周围土壤中或与植物共同生存的内生性微生物的生长；至少一种具有有益于植物生长和/或植物健康的第二微生物的生物纯培养物的孢子，其中，所述第二微生物的生长与所述第一微生物的生长相容，且其中，所述第二微生物存在的量适于建立并适于促进植物生长和/或植物健康。
75.在一个实施方式中，提供一种促进植物生长和/或植物健康的方法，该方法包括将植物种子种植于合适的生长培养基，其中，所述种子被组合物包覆，所述组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；其中，含有rti301和rti477的孢子的包覆层有益于植物生长和/或植物健康。
76.本发明的包覆的种子可以是广范围的植物的种子，包括例如以下植物的种子：单子叶植物、双子叶植物、谷类、玉米、甜玉米、爆米花玉米、种子玉米、青贮玉米、田地玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、芸苔属蔬菜、花椰菜、卷心菜、菜花、球芽甘蓝、羽衣甘蓝、无头甘蓝、芥菜、球茎甘蓝、鳞茎类蔬菜、洋葱、大蒜、葱、果蔬、胡椒、番茄、草原樱桃、树番茄、秋葵、葡萄、草药/香料、葫芦科蔬菜、黄瓜、哈密瓜、甜瓜、香瓜、西葫芦(squash)、西瓜、南瓜、茄子、叶用蔬菜、莴苣、芹菜、菠菜、欧芹、菊苣、豆类/蔬菜(多汁的和干燥的豆和豌豆)、豆、青豆、豆荚、荚豆、大豆、干豆、鹰嘴豆、利马豆、豌豆、三角豆、裂荚豌豆、扁豆、油籽作物、坎诺拉油菜、蓖麻、棉花、亚麻、花生、油菜籽、红花、芝麻、向日葵、大豆、根/块茎和球茎蔬菜、胡萝卜、马铃薯、甜马铃薯、甜菜、姜、辣根、萝卜、人参、芜箐、甘蔗、甜菜、草和草皮草。
77.所述包覆的植物种子可以是玉米或大豆，所述植物生长益处可以呈现为增加的产量。
78.对于包覆的植物种子，所述第二微生物的益于植物生长和/或植物健康的性质包括增加的产量、改善的幼苗活力、改善的根发育、改善的植物生长、改善的植物健康、改善的外观、改善的对植物病原体的抗性、减少的病原体感染中的一种或它们的组合。所述植物病原体可包括昆虫、线虫、植物病原体真菌或植物病原体细菌中的一种或它们的组合。
79.包覆植物种子的所述组合物的第一和第二微生物可以是芽孢杆菌属微生物。所述第二微生物的生长可快于第一微生物的生长，且所述第二微生物可以成群(swarming)和高活动性的表型为特征。所述第二微生物可以是枯草芽孢杆菌。所述第一微生物可以是解淀粉芽孢杆菌，所述第二微生物可以是枯草芽孢杆菌。所述解淀粉芽孢杆菌可以是以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体。所述枯草芽孢杆菌可以是以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体。包覆在植物种子上的组合物可在约1.0
×
102cfu/种子至约1.0
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109cfu/种子的量的范围内包括所述第一微生物和所述第二微生物的孢子。
80.在一个实施方式中提供一种促进植物生长和/或植物健康的方法，该方法包括将植物种子种植于合适的生长培养基，其中，所述种子被组合物包覆，所述组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物的孢子，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物的孢子；所述成分以适于促进植物生长和/或植物健康的量存在。
81.在一个实施方式中，提供一种有益于植物生长和/或植物健康的组合物，所述组合物包括：一种或多种具有抗细菌性质或抗真菌性质中的一种或两种的化学活性试剂，其存在的量适于抑制周围土壤中或与植物共同生存的内生性微生物的生长；以及至少一种具有有益于植物生长和/或植物健康性质的微生物的生物纯培养物。所述微生物的生长与所述化学活性试剂相容，该微生物的量适于建立(established)并促进植物生长和/或植物健康。所述组合物向植物种子、植物的根或植物周围的土壤的施用有益于植物生长和/或植物健康。
82.在一个实施方式中提供一种促进植物生长和/或植物健康的方法，该方法包括向植物的种子、植物的根或植物周围的土壤递送以下的组合：一种或多种具有抗细菌性质或抗真菌性质中的一种或两种的化学活性试剂，其存在的量适于抑制周围土壤中或与植物共同生存的内生性微生物的生长；以及一种组合物，其包含至少一种具有有益于植物生长和/或植物健康性质的微生物的生物纯培养物。所述微生物的生长与所述化学活性试剂相容，或者在不相容的情况下，在所述化学活性试剂的递送之后再进行所述微生物的递送。所述微生物的量适于建立(established)并促进植物生长和/或植物健康，从而化学活性试剂与微生物的组合的递送有益于植物生长和/或植物健康。在一种或多种化学活性试剂与微生物相容的情况下，一种或多种化学活性试剂可与包括微生物的组合物共同配制。所述化学活性试剂与所述微生物的组合向植物种子、植物的根或植物周围的土壤的递送有益于植物生长和/或植物健康。
83.对于包括一种或多种化学活性试剂的组合物和方法，微生物的益于植物生长和/或植物健康的性质可包括增加的产量、改善的幼苗活力、改善的根发育、改善的植物生长、改善的植物健康、改善的外观、改善的对植物病原体的抗性、减少的病原体感染或它们的组合。所述植物病原体可包括昆虫、线虫、植物病原体真菌或植物病原体细菌中的一种或它们的组合。
84.用于产生小生境的一种或多种化学活性试剂例如可包括但不限于甲氧基丙烯酸酯、三唑、粉唑醇、戊唑醇、丙硫菌唑(prothiaconazole)、氟环唑、氟吡菌酰胺、百菌清、甲基硫菌灵、铜基杀真菌剂、氢氧化铜杀真菌剂、edbc基杀真菌剂、代森锰锌、琥珀酸脱氢酶(sdhi)杀真菌剂、联苯吡菌胺、异菌脲、烯酰吗啉或霜霉灭(valifenalate)。在另一实施方式中，一种或多种化学活性试剂可包括熏蒸剂，例如氯化苦(chloropicrin)、棉隆、1,3-二氯丙烯(telone)、二甲基二硫醚、威百亩/威百亩钾、溴甲烷。
85.所述组合物的形式可以是液体、油分散体、粉尘、干燥的可润湿粉末、可传播颗粒、或干燥的可润湿颗粒。所述有益的微生物可以是孢子或营养细胞的形式。所述有益的微生物可以是枯草芽孢杆菌属。所述有益的微生物可以是枯草芽孢杆菌。所述微生物可以是以成群和高活动性表型为特征的枯草芽孢杆菌。所述微生物可以是以atcc序号pta-121167保
藏的枯草芽孢杆菌rti477，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体。所述组合物的形式可为液体，并且所述有益的微生物可以是浓度为约1.0
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108cfu/ml至约1.0
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10
12
cfu/ml的枯草芽孢杆菌rti477。所述组合物可以是粉尘、干燥的可润湿粉末、可传播颗粒、或干燥的可润湿颗粒的形式，并且枯草芽孢杆菌rti477的量可以是约1.0
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108cfu/g至约1.0
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10
12
cfu/g。所述组合物可以是油分散体的形式，并且枯草芽孢杆菌rti477的浓度可以是约1.0
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108cfu/ml至约1.0
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10
12
cfu/ml。
86.在本发明的用于促进植物生长和/或植物健康的具有两种或多种相容微生物的组合物和方法中，所述组合物可还包含微生物、生物或化学杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、除草剂、植物提取物、植物生长调节剂或肥料中的一种或它们的组合，这些成分以适于促进植物生长和/或保护植物不受病原性感染的量存在。
87.在一个实施方式中，所述杀真菌剂可包括白花羽扇豆的提取物。在一个实施方式中，所述杀真菌剂可包括blad多肽。所述blad多肽可以是来自甜羽扇豆(白花羽扇豆)的天然产生的种子储藏蛋白，其通过引起真菌细胞壁损伤和扰乱内细胞膜来对易受影响的真菌病原体起作用。所述组合物可包括约20％的blad多肽。
88.在一个实施方式中，所述杀昆虫剂可包含联苯菊酯。所述杀线虫剂可包括硫线磷。所述组合物可配制为液体、粉末、可润湿的可溶颗粒或可传播颗粒。所述杀昆虫剂可包括联苯菊酯和噻虫胺。所述杀昆虫剂可包括联苯菊酯和噻虫胺，所述组合物可进行配置以与液体肥料共同使用。所述杀昆虫剂可包括联苯菊酯或ζ-氯氰菊酯。
89.所述杀线虫剂可包括硫线磷。所述杀昆虫剂可包括联苯菊酯和噻虫胺。所述组合物配制为液体，且所述杀昆虫剂可包括联苯菊酯或ζ-氯氰菊酯。
90.在一个实施方式中，所述方法还可包括将液体肥料施用至：植物周围的土壤或生长培养基；在将植物种子播种在土壤或生长培养基中之前的土壤或生长培养基；或在将植物种植在土壤或生长培养基中之前的土壤或生长培养基。
91.在一个实施方式中，联苯菊酯组合物可包括：联苯菊酯；水合硅酸铝镁；和选自蔗糖酯、木质素磺酸酯、烷基聚糖苷、萘磺酸甲醛缩合物和磷酸酯中的至少一种分散剂。
92.以所述组合物中所有组分的总重量为基准计，所述联苯菊酯存在的浓度优选为1.0-35重量％，更优选为15-25重量％。所述联苯菊酯杀昆虫剂可以以0.1g/ml至0.2g/ml的浓度存在于液体制剂中。所述联苯菊酯杀昆虫剂可以以约0.1715g/ml的浓度存在于液体制剂中。
93.以所述组合物中所有组分的总重量为基准计，分散剂或分散体存在的总浓度可为约0.02-20重量％。
94.在一些实施方式中，所述水合硅酸铝镁可选自蒙脱石和绿坡缕石。
95.在一些实施方式中，所述磷酸酯可选自壬基苯酚磷酸酯和十三烷基醇乙氧基化的磷酸钾盐。
96.其它实施方式还可包含防冻剂、消泡剂和杀微生物剂中的至少一种。
97.在一个实施方式中提供一种用于促进植物生长的组合物，该组合物包含：以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物，或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；以及杀昆虫
剂，其中，所述组合物在可用作液体肥料的制剂中。所述杀昆虫剂可以是以下中的一种或它们的组合：拟除虫菊酯(pyrethroids)、联苯菊酯、七氟菊酯、ζ-氯氰菊酯、有机磷酸酯、四氯乙磷、毒死蜱(chlorpyrifos)、丁基嘧啶磷(tebupirimphos)、氟氯氰菊酯、苯基吡唑类(fiproles)、氟虫腈(fipronil)、烟碱(nicotinoids)或噻虫胺(clothianidin)。所述杀昆虫剂可包括联苯菊酯。所述组合物可包含联苯菊酯杀昆虫剂、水合硅酸铝镁以及至少一种分散剂。所述联苯菊酯杀昆虫剂可以以0.1g/ml至0.2g/ml的浓度存在。所述联苯菊酯杀昆虫剂可以以约0.1715g/ml的浓度存在。
98.另外，本发明的组合物和方法的合适的杀昆虫剂、除草剂、杀真菌剂和杀线虫剂可包括以下：
99.杀昆虫剂：a0)各种杀昆虫剂，包括：agrigata、磷化铝(al-phosphide)、钝绥螨属(amblyseius)、蚜小蜂属(aphelinus)、烟蚜茧蜂属(aphidius)、食蚜瘿蚊(aphidoletes)、青蒿素(artimisinin)、苜蓿银纹夜蛾核多面体病病毒(autographa californica npv)、三唑锡(azocyclotin)、枯草芽孢杆菌(bacillus-subtilis)、苏云金芽孢杆菌艾扎瓦亚种(bacillus thuringiensis-spp-aizawai)、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(bacillus thuringiensis spp.kurstaki)、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)、百僵菌(beauveria)、球孢白僵菌(beauveria-bassiana)、高效氟氯氰菊酯(betacyfluthrin)、生物制品(biological)、杀虫双(bisultap)、溴氟菊酯(brofluthrinate)、乙基溴硫磷(bromophos-e)、溴螨酯(bromopropylate)、bt-玉米-gm(bt-corn-gm)、bt-大豆-gm(bt-soya-gm)、辣椒素(capsaicin)、杀螟丹(cartap)、南蛇藤提取物(celastrus-extract)、氯虫酰胺(chlorantraniliprole)、灭幼脲(chlorbenzuron)、氯氧磷(chlorethoxyfos)、氯弗虫脲(chlorfluazuron)、毒死蜱-乙基(chlorpyrifos-e)、蛇床素(cnidiadin)、冰晶石(cryolite)、杀螟腈(cyanophos)、氰虫酰胺(cyantraniliprole)、氯氟氰菊酯(cyhalothrin)、三环锡(cyhexatin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、离额茧蜂(dacnusa)、dcip、二氯丙烯(dichloropropene)、三氯杀螨醇(dicofol)、潜蝇姬小蜂属
100.(diglyphus)、潜蝇姬小蜂属 离额茧蜂属(diglyphus dacnusa)、混灭威(dimethacarb)、二甲基二硫醚(dithioether)、乙酸十二烷酯、甲氨基阿维菌素(emamectin)、恩蚜小蜂属(encarsia)、epn、浆角蚜小蜂属(eretmocerus)、二溴乙烯、桉叶脑(eucalyptol)、脂肪酸、脂肪酸/盐、喹螨醚(fenazaquin)、仲丁威(bpmc)、唑螨酯(fenpyroximate)、氟氰戊菊酯(flubrocythrinate)、氟螨嗪(flufenzine)、伐虫脒(formetanate)、安果磷(formothion)、呋线威(furathiocarb)、γ-氯氟氰菊酯(gamma-cyhalothrin)、大蒜汁
101.(garlic-juice)、颗粒体病毒、瓢虫(harmonia)、棉铃实夜蛾核多面体病毒(heliothis armigera npv)、非活性细菌(inactive bacterium)、吲哚-3-基丁酸(indol-3-ylbutyric acid)、碘代甲烷、铁、水胺硫磷(isocarbofos)、异柳磷(isofenphos)、异柳磷-甲基(isofenphos-m)、异丙威(isoprocarb)、叶蚜磷(isothioate)、高岭土、林丹(lindane)、浏阳霉素(liuyangmycin)、苦参碱(matrine)、地胺磷(mephosfolan)、聚乙醛、金龟子绿僵菌(metarhizium anisopliae)、甲胺磷(methamidophos)、速灭威(metolcarb)(mtmc)、矿物油、灭蚁灵(mirex)、m-异硫氰酸酯(m-isothiocyanate)、杀虫单(monosultap)、疣孢漆斑菌(myrothecium verrucaria)、二溴磷(naled)、华釉小蜂属
(neochrysocharis formosa)、尼古丁、烟碱、油、油酸、氧乐果(omethoate)、小花蝽属(orius)、氧化苦参碱(oxymatrine)、拟青霉菌(paecilomyces)、石蜡油、对硫磷-乙基(parathion-e)、巴斯德氏菌属(pasteuria)、石油类油(petroleum-oil)、信息素(pheromones)、磷酸、无色杆菌属(photorhabdus)、辛硫磷(phoxim)、植绥螨属(phytoseiulus)、嘧啶磷-乙基(pirimiphos-e)、植物油、抗溴氰菊酯小菜蛾(plutella xylostella)gv、多面体病毒、多酚提取物、油酸钾、丙溴磷(profenofos)、补骨内酯(prosuler)、丙硫磷
102.(prothiofos)、吡唑硫磷(pyraclofos)、除虫菊酯(pyrethrins)、哒嗪硫磷(pyridaphenthion)、嘧螨醚(pyrimidifen)、吡丙醚(pyriproxifen)、基亚伊提取物(quillay-extract)、灭螨猛(quinomethionate)、菜油(rape-oil)、鱼藤酮(rotenone)、皂苷(saponin)、saponozit、钠化合物、硅氟酸钠、淀粉、斯氏线虫属(steinernema)、葡萄球菌链霉菌属(streptomyces)、氟虫胺(sulfluramid)、硫、丁基嘧啶磷(tebupirimfos)、七氟菊酯(tefluthrin)、双硫磷(temephos)、得脱蟎(tetradifon)、久效威(thiofanox)、甲基乙拌磷(thiometon)、转基因(transgenics)(例如cry3bb1)、唑蚜威(triazamate)、木霉属(trichoderma)、赤眼蜂属(trichogramma)、杀铃脲(triflumuron)、轮枝孢病(verticillium)、藜芦碱(vertrine)、异构杀昆虫剂(例如κ-联苯菊酯、κ-七氟菊酯)、dichoromezotiaz、溴虫氟苯双酰胺(broflanilide)、pyraziflumid；
103.a1)氨基甲酸酯类，包括：涕灭威、棉铃威、丙硫克百威、甲萘威、克百威、丁硫克百威、甲硫威、灭多威、杀线威、抗蚜威、残杀威和硫双威；
104.a2)有机磷酸酯类，包括：乙酰甲胺磷、益棉磷、保棉磷、毒虫畏、毒死蜱、毒死蜱-甲基、甲基内吸磷、二嗪农、敌敌畏/ddvp、百治磷、乐果、乙拌磷、乙硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、恶唑磷、马拉硫磷、甲胺磷、杀扑磷、速灭磷、久效磷、氧乐果(oxymethoate)、亚砜磷、对硫磷、对硫磷-甲基、稻丰散、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、嘧啶磷-甲基、喹硫磷、特丁硫磷、杀虫畏、三唑磷和敌百虫；
105.a3)环戊二烯有机氯化合物类，例如硫丹；
106.a4)苯基吡唑(fiproles)类，包括：乙虫清(ethiprole)、氟虫腈、匹弗普罗(pyrafluprole)和哌普罗(pyriprole)；
107.a5)新烟碱类，包括啶虫脒、噻虫胺(clothianidin)、呋虫胺、吡虫啉、烯啶虫胺、噻虫啉以及噻虫嗪；
108.a6)多杀菌素类(spinosyns)，例如斯哌特姆(spinetoram)和多杀菌素(spinosad)；
109.a7)菌素(mectins)类的氯通道活化剂，包括阿巴菌素、甲氨基阿维菌素-苯甲酸盐、双氢除虫菌素、勒皮菌素和弥拜菌素；
110.a8)保幼激素模拟物(juvenile hormone mimics)，例如氢化保幼素(hydroprene)、丙诺保幼素(kinoprene)、美赐平(methoprene)、苯氧威和吡丙醚；
111.a9)选择性同翅类取食阻滞剂，例如吡蚜酮、氟啶虫酰胺和氟虫吡喹；
112.a10)螨生长抑制剂，例如四螨嗪、噻螨酮(hexythiazox)和乙螨唑；
113.a11)线粒体atp合成酶的抑制剂，例如丁醚脲、苯丁锡(fenbutatin oxide)和克螨特；氧化磷酸化的解偶联剂，例如虫螨腈；
114.a12)烟碱乙酰胆碱受体通道阻断剂，例如杀虫磺、杀螟丹盐酸盐、杀虫环和杀虫双；
115.a13)来自苯甲酰脲类的0型几丁质生物合成抑制剂，包括双三氟虫脲(bistrifluron)、二氟脲、氟虫脲、氟铃脲、虱螨脲、氟酰脲和氟苯脲；
116.a14)1型几丁质生物合成抑制剂，例如噻嗪酮(buprofezin)；
117.a15)蜕皮干扰剂，例如灭蝇胺(cyromazine)；
118.a16)蜕皮激素受体激动剂，例如甲氧虫酰肼、虫酰肼、氯虫酰肼和环虫酰肼(chromafenozide)；
119.a17)章鱼胺受体激动剂，例如双甲脒；
120.a18)线粒体复合物电子转移抑制剂，哒螨灵、吡螨胺、唑虫酰胺、嘧虫胺、腈吡螨酯(cyenopyrafen)、丁氟螨酯(cyflumetofen)、伏蚁腙(hydramethylnon)；灭螨醌或嘧螨酯(fluacrypyrim)；
121.a19)电压依赖性钠通道阻断剂，例如茚虫威和氰氟虫腙(metaflumizone)；
122.a20)脂合成抑制剂，例如季酮螨酯(spirodiclofen)、螺甲螨酯(spiromesifen)和螺四胺酸酯(spirotetramat)；
123.a21)来自二酰胺类的雷诺定受体调节剂，包括：氟虫双酰胺、邻苯二甲酰胺化合物(r)-3-氯-n1-{2-甲基-4-[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基]苯基}-n2-(1-甲基-2-甲基磺酰基乙基)邻苯二甲酰胺和(s)-3-氯-n1-{2-甲基-4-[1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基]苯基}-n2-(1-甲基-2-甲基磺酰基乙基)邻苯二甲酰胺、氯虫酰胺(chlorantraniliprole)和氰虫酰胺(cyantraniliprole)；
[0124]
a22)作用模式未知或不确定的化合物，例如印苦楝子素、酰胺弗门特(amidoflumet)、联苯肼酯(bifenazate)、联氟砜(fluensulfone)、胡椒基丁醚、啶虫丙醚、杀弗乐(sulfoxaflor)；
[0125]
或a23)来自拟除虫菊酯类的钠通道调节剂，包括氟酯菊酯、丙烯菊酯、联苯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氯氰菊酯、ζ-氯氰菊酯、溴氰菊酯、顺式氰戊菊酯、醚菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、τ-氟胺氰菊酯、氯菊酯、氟硅菊酯和四溴菊酯。
[0126]
杀真菌剂：b0)苯威吡氟(benzovindiflupyr)、抗霜霉剂(anitiperonosporic)、辛唑嘧菌胺(ametoctradin)、吲唑磺菌胺(amisulbrom)、铜盐(例如氢氧化铜、氯氧化铜、硫酸铜、过硫酸铜)、啶酰菌胺(boscalid)、噻呋酰胺(thiflumazide)、氟酰胺(flutianil)、呋霜灵(furalaxyl)、噻菌灵(thiabendazole)、麦锈灵(benodanil)、灭锈胺(mepronil)、异丙噻菌胺(isofetamid)、甲呋酰胺(fenfuram)、必杀芬(bixafen)、氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)、戊苯吡菌胺(penflufen)、环丙吡菌胺(sedaxane)、丁香菌酯(coumoxystrobin)、烯肟菌酯(enoxastrobin)、氟菌螨酯(flufenoxystrobin)、唑菌酯(pyraoxystrobin)、唑胺菌酯(pyrametostrobin)、三环吡菌威(triclopyricarb)、烯肟菌胺(fenaminstrobin)、苯氧菌胺(metominostrobin)、嘧啶肟草醚(pyribencarb)、消螨多(meptyldinocap)、三苯基乙酸锡(fentin acetate)、三苯基氯化锡(fentin chloride)、三苯基氢氧化锡(fentin hydroxide)、土霉素(oxytetracycline)、乙菌利(chlozolinate)、地茂散(chloroneb)、四氧硝基苯(tecnazene)、土菌灵(etridiazole)、依杜卡(iodocarb)、硫菌威(prothiocarb)、
基)-3-三氟甲基-1-甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(顺式-2-二环丙基-2-基-苯基)-3-二氟甲基-1-甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(反式-2-二环丙基-2-基-苯基)-3-二氟-甲基-1-甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、氟吡菌酰胺、n-(3-乙基-3,5-5-三甲基-环己基)-3-甲酰基氨基-2-羟基-苯甲酰胺、噻菌灵、硅噻菌胺、n-(6-甲氧基-吡啶-3-基)环丙烷羧酰胺、2-碘-n-苯基-苯甲酰胺、n-(2-二环-丙基-2-基-苯基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-1,3-二甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-1,3-二甲基-5-氟吡唑-4-基-羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-5-氯-1,3-二甲基-吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-氟甲基-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-(氯氟甲基)-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-二氟甲基-5-氟-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-5-氯-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-(氯二氟甲基)-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-5-氟-1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-5-氯-1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-1,3-二甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-1,3-二甲基-5-氟吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-5-氯-1,3-二甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-氟甲基-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-(氯氟甲基)-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-二氟甲基-5-氟-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-5-氯-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-(氯二氟甲基)-1-甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-5-氟-1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(2',4',5'-三氟联苯基-2-基)-5-氯-1-甲基-3-三氟甲基吡唑-4-基羧酰胺、n-(3',4'-二氯-3-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氯-3-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-二氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氟-3-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氟-3-氟联苯基-2-基)-1-甲基-s-二氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3'-氯-4'-氟-3-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-二氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氯-4-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氟-4-氟联苯基-2-基)-1-甲基-s-三氟甲基-ih-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氯-4-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-二氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氟-4-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-二氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3'-氯-4'-氟-4-氟联苯基-2-基)-1-甲基-s-二氟甲基-ih-吡唑-羧酰胺、n-(3',4'-二氯-5-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氟-5-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氯-5-氟联苯基-2-基)-1-甲基-s-二氟甲基-ih-吡唑-羧酰胺、n-(3',4'-二氟-5-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-二氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3',4'-二氯-5-氟联苯基-2-基)-1,3-二甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(3'-氯-4'-氟-5-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-二氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(4'-氟-4-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三
氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(4'-氟-5-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(4'-氯-5-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(4'-甲基-5-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(4'-氟-5-氟联苯基-2-基)-1,3-二甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(4'-氯-5-氟联苯基-2-基)-1,3-di甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(4'-甲基-5-氟联苯基-2-基)-1,3-二甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(4'-氟-6-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-(4'-氯-6-氟联苯基-2-基)-1-甲基-3-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-[2-(1,1,2,3,3,3-六氟丙氧基)-苯基]-3-二氟甲基-1-甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、n-[4'-(三氟甲基硫)-联苯基-2-基]-3-二氟甲基-1-甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺、和n-[4'-(三氟甲基硫-联苯基-2-基]-1-甲基-3-三氟甲基-1-甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺；
[0130]
b4)杂环化合物，包括：氟啶胺、啶斑肟、乙嘧酚磺酸酯、嘧菌环胺、氯苯嘧啶醇、嘧菌腙、嘧菌胺、氟苯嘧啶醇、嘧霉胺、嗪胺灵、拌种咯、咯菌腈、阿尔迪莫、十二环吗啉、丁苯吗啉、十三吗啉、苯锈啶、异菌脲、腐霉利、乙烯菌核利、噁唑酮菌、咪唑菌酮、辛噻酮、烯丙苯噻唑、5-氯-7-(4-甲基-哌啶-1
–
基)-6-(2,4,6-三氟苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶、敌菌灵、哒菌酮、咯喹酮、丙氧喹啉、三环唑、2-丁氧基-6-碘-3-丙基色原-4-酮、阿拉酸式苯-s-甲基、敌菌丹、克菌丹、棉隆、灭菌丹、氰菌胺、苯氧喹啉、n,n-二甲基-3-(3-溴-6-氟-2-甲基吲哚-1-磺酰基)-[1,2,4]三唑-1-磺酰胺、5-乙基-6-辛基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2,7-二胺、2,3,5,6-四氯-4-甲磺酰基-吡啶、3,4,5-三氯-吡啶-2,6-二-腈、n-(1-(5-溴-3-氯-吡啶-2-基)-乙基)-2,4-二氯-烟酰按、n-((5-溴-3-氯吡啶-2-基)-甲基)-2,4-二氯-烟酰按、二氟林、氯定、乙酸十二环吗啉、氟菌胺、灰瘟素、喹菌酮、咪菌威、野燕枯、苯敌快-甲基硫酸盐、恶喹酸和病花灵；
[0131]
b5)氨基甲酸酯类，选自：代森锰锌、代森锰、威百亩、甲硫威(methasulphocarb)、代森联、福美铁、丙森锌、福美双、代森锌、福美锌、乙霉威、异丙菌威、苯噻菌胺、霜霉威、霜霉威盐酸盐、4-氟苯基n-(1-(1-(4-氰基苯基)-乙磺酰基)丁-2-基)氨基甲酸酯、3-(4-氯-苯基)-3-(2-异丙氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰基氨基)丙酸甲酯；
[0132]
或b6)其它杀真菌剂，包括：胍、多果定、多果定游离碱、双胍辛胺、双胍盐、抗生素：春雷霉素、土霉素及其盐、链霉素、多抗霉素、井冈霉素a、硝基苯基衍生物：乐杀螨、消螨普、消螨通、含硫杂环基化合物：二噻农、稻瘟灵、有机金属化合物：三苯锡盐、有机磷化合物：敌瘟磷、异稻瘟净、三乙膦酸、三乙膦酸铝、磷酸和其盐、吡菌磷、甲基立枯磷、有机氯化合物：苯氟磺胺、磺菌胺、六氯苯、四氯苯酞、戊菌隆、五氯硝基苯、硫菌灵、甲基硫菌灵、对甲抑菌灵，其它：环氟菌胺、霜脲氰、甲菌定、乙嘧酚、呋霜灵、苯菌酮和螺环菌胺、双胍辛胺乙酸盐、双胍辛胺三乙酸盐(iminoctadine-triacetate)、双胍辛胺三烷苯磺酸盐、春雷霉素盐酸盐水合物、双氯酚、五氯苯酚及其盐、n-(4-氯-2-硝基-苯基)-n-乙基-4-甲基-苯磺酰胺、氯硝胺、酞菌酯、四氧硝基苯(tecnazen)、联苯、溴硝丙二醇、二苯胺、米多霉素、喹啉铜、调环酸钙、n-(环丙基甲氧基亚氨基-(6-二氟甲氧基-2,3-二氟-苯基)-甲基)-2-苯基乙酰胺、n'-(4-(4-氯-3-三氟甲基-苯氧基)-2,5-二甲基-苯基)-n-乙基-n-甲基甲脒、n'-(4-(4-氟-3-三氟甲基-苯氧基)-2,5-二甲基-苯基)-n-乙基-n-甲基甲脒、n'-(2-甲基-5-三氟甲基-4-(3-三甲基硅烷基-丙氧基)-苯基)-n-乙基-n-甲基甲脒和n'-(5-二氟甲基-2-甲基4-(3-三甲基硅烷基-丙氧基)-苯基)-n-乙基-n-甲基甲脒。
[0133]
除草剂:c1)乙酰-coa羧基酶抑制剂(acc)，例如环己酮肟醚，如禾草灭(alloxydim)、烯草酮(clethodim)、克劳普草酮(cloproxydim)、噻草酮(cycloxydim)、烯禾定(sethoxydim)、肟草酮(tralkoxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、环苯草酮(clefoxydim)或吡喃草酮(tepraloxydim)；苯氧基苯氧基丙酸酯，如炔草酯(clodinafop-propargyl)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、禾草灵(diclofop-methyl)、恶唑禾草灵(fenoxaprop-ethyl)、精恶唑禾草灵(fenoxaprop-p-ethyl)、噻唑禾草灵(fenthiapropethyl)、吡氟禾草灵(fluazifop-butyl)、精吡氟禾草灵(fluazifop-p-butyl)、吡氟氯禾灵-乙氧基乙基(haloxyfop-ethoxyethyl)、氟吡甲禾灵(haloxyfop-methyl)、高效氟吡甲禾灵(haloxyfop-p-methyl)、异恶草醚(isoxapyrifop)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾灵(quizalofop-ethyl)、精喹禾灵(quizalofop-p-ethyl)或喹禾灵(quizalofop-tefuryl)；或芳基氨基丙酸，如草氟安(flamprop-methyl)或麦草氟异丙酯(flamprop-isopropyl)；
[0134]
c2)乙酰乳酸合酶抑制剂(als)，例如咪唑啉酮(imidazolinones)，如咪唑烟酸(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)、咪草酸-甲基(imazamethabenz-methyl)(imazame)、甲氧咪草烟(imazamox)、甲基咪草烟(imazapic)或咪唑乙烟酸(imazethapyr)；嘧啶醚，如嘧硫酸(pyrithiobac-acid)、嘧硫草醚钠(pyrithiobac-sodium)、双草醚钠(bispyribac-sodium).kih-6127或嘧苯恶(pyribenzoxym)；磺酰胺(sulfonamides)、例如双氟磺草胺(florasulam)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)或磺草唑胺(metosulam)；或磺酰脲(sulfonylureas)、例如酰嘧磺隆(amidosulfuron)、四唑嘧磺隆(azimsulfuron)、苄嘧磺隆-甲基(bensulfuron-methyl)、氯嘧磺隆-乙基(chlorimuron-ethyl)、氯磺隆(chlorsulfuron)、醚磺隆(cinosulfuron)、环丙嘧磺隆(cyclosulfamuron)、胺苯磺隆(ethametsulfuron-methyl)、乙氧嘧磺隆(ethoxysulfuron)、啶嘧磺隆(flazasulfuron)、氯吡嘧磺隆-甲基(halosulfuron-methyl)、唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)、甲磺隆-甲基(metsulfuron-methyl)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、氟嘧磺隆-甲基(primisulfuron-methyl)、氟磺隆(prosulfuron)、吡嘧磺隆-乙基(pyrazosulfuron-ethyl)、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、甲嘧磺隆-甲基(sulfometuron-methyl)、噻吩磺隆(thifensulfuron-methyl)、醚苯磺隆(triasulfuron)、苯甲磺隆(tribenuron-methyl)、氟胺磺隆-甲基(triflusulfuron-methyl)、三氟甲磺隆(tritosulfuron)、将磺酰磺隆(sulfosulfuron)、比甲酰胺磺隆(foramsulfuron)or碘磺隆(iodosulfuron)；
[0135]
c3)酰胺，例如草毒死(allidochlor)(cdaa)、新燕灵(benzoylprop-ethyl)、溴丁酰草胺(bromobutide)、氯硫酰草胺(chlorthiamid)、草乃敌(diphenamid)、乙氧苯草胺(etobenzanid)(benzchlomet)、噻唑草酰胺(fluthiamide)、杀木磷(fosamin)或杀草利(monalide)；
[0136]
c4)植物生长素除草剂，例如吡啶甲酸，例如二氯吡啶酸(clopyralid)或毒莠定(picloram)；或者2,4-d或草除灵(benazolin)；
[0137]
c5)植物生长素转移抑制剂，例如抑草生(naptalam)或氟吡草腙(diflufenzopyr)；
[0138]
c6)类胡萝卜素生物合成抑制剂，例如吡草酮(benzofenap)、异恶草酮(clomazone)(dimethazone)、吡氟草胺(diflufenican)、氟咯草酮(fluorochloridone)、氟啶酮、吡唑特(pyrazolynate)、苄草唑(pyrazoxyfen)、异恶唑草酮(isoxaflutole)、氯草酮
(isoxachlortole)、甲基磺草酮(mesotrione)、磺草酮(sulcotrione)(chlormesulone)、环己二酮(ketospiradox)、呋草酮、达草灭(norflurazon)或杀草强(amitrole)；
[0139]
c7)epsps(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)，例如草甘膦或硫复松(sulfosate)；
[0140]
c8)谷氨酰胺合成酶抑制剂，例如双丙氨膦(bilanafos(bialaphos))或草丁膦铵；
[0141]
c9)脂质生物合成抑制剂，例如有酰替苯胺，例如莎稗磷或苯噻草胺；乙酰氯苯胺类，例如二甲噻草胺、s-二甲噻草胺、乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、去草胺、丁烯草胺、乙酰甲草胺(diethatyl-ethyl)、二甲草胺、吡草胺、甲氧毒草安、s-甲氧毒草安、丙草胺(pretilachlor)、扑草胺、广草胺、特丁草胺、甲氧噻草胺或二甲苯草胺(xylachlor)；硫脲，例如苏达灭除草剂、草灭特、燕麦敌、哌草丹、eptc、禾草畏、草达灭、克草猛、苄草丹、禾草丹(benthiocarb)、野麦威或灭草猛；或者呋草黄(benfuresate)或氟草磺胺(perfluidone)；
[0142]
c10)有丝分裂抑制剂，例如有氨基甲酸酯，例如黄草灵、雷克拉(carbetamid)、氯苯胺灵、坪草丹、炔敌稗(pronamid)(propyzamid)、苯胺灵或仲草丹；二硝基苯胺，例如贝尼芬(benefin)、仲丁灵、敌乐胺(dinitramin)、乙丁烯氟灵(ethalfluralin)、氟消草(fluchloralin)、黄草消(oryzalin)、二甲戊灵(pendimethalin)、氨氟乐灵(prodiamine)或氟乐灵(trifluralin)；吡啶，例如氟硫草定(dithiopyr)或噻唑烟酸(thiazopyr)；或者丁胺磷、敌草索-二甲酯(dcpa)或马来酰肼；
[0143]
c11)原卟啉ix原氧化酶抑制剂，例如有二苯基醚(diphenyl ethers)，例如氟锁草醚(acifluorfen)、氟锁草醚-na(acifluorfen-sodium)、苯草醚、甲羧除草醚(bifenox)、全灭草(chlomitrofen)(cnp)、氯氟草醚(ethoxyfen)、消草醚(fluorodifen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、氟磺胺草醚(fomesafen)、氟呋草醚(furyloxyfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、除草醚(nitrofen)、三氟甲草醚(nitrofluorfen)或乙氧氟草醚(oxyfluorfen)；噁二唑，例如恶草酮(oxadiargyl)或丙炔恶草酮(oxadiazon)；环酰亚胺，例如唑啶草酮(azafenidin)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、唑酮草酯(carfentrazone)、乙基唑酮草酯、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟烯草酸(flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺(flumioxazine)、炔草胺(flumipropyn)、丙嘧草酯(flupropacil)、氟噻乙草酯-甲基(fluthiacet-methyl)、甲磺草胺或噻二唑草胺(thidiazimin)；或者吡唑，例如et-751、jv 485吡氯草胺(nipyraclofen)；
[0144]
c12)光合作用抑制剂，例如有敌稗(propanil)、哒草特(pyridate)或哒草醇(pyridafol)；苯并硫杂二嗪农，例如噻草平；二硝基酚，例如杀草全(bromofenoxim)、地乐酚(dinoseb)、地乐酚-乙酸酯、乐消(dinoterb)或dnoc；双亚吡啶基(dipyridylenes)，例如牧草快(cyperquat)-氯化物、苯敌快-甲基硫酸盐、敌草快(diquat)或百草枯-二氯化物；脲，例如氯溴隆、绿麦隆、枯莠隆、恶唑隆、敌草隆、磺噻隆(ethidimuron)、非草隆、伏草隆、异丙隆、异恶隆(isouron)、利谷隆、噻唑隆(methabenzthiazuron)、灭草定(methazole)、吡喃隆、甲氧隆、绿谷隆、草不隆、环草隆或丁噻隆(tebuthiuron)；苯酚，例如溴苯腈或碘苯腈(ioxynil)；氯草敏(chloridazon)；三嗪，例如莠灭净(ametryn)、莠去津、草净津、desmein、dimethamethryn、环嗪酮(hexazinone)、扑灭通(prometon)、扑草净(prometryn)、扑灭津、西玛津、西草净(simetryn)、甲氧去草净(terbumeton)、去草净(terbutryn)、特丁津或草达津；三嗪酮、例如苯嗪草酮(metamitron)或赛克津(metribuzin)；尿嘧啶，例如除草定
(bromacil)、环草定(lenacil)或特草定(terbacil)；或双氨基甲酸酯，例如双苯胺灵或苯敌草；
[0145]
c13)增效剂，例如有环氧乙烷，例如灭草环；
[0146]
c14)cis细胞壁合成抑制剂，例如异恶草胺(isoxaben)或敌草腈(dichlobenil)；
[0147]
c15)多种其他除草剂，例如有二氯丙酸(dichloropropionic acids)，例如茅草枯(dalapon)；二氢苯并呋喃，例如乙氧呋草黄(ethofumesate)；苯乙酸，例如伐草克(fenac)；或者叠氮净(aziprotryne)、燕麦灵(barban)、地散磷、噻草隆(benzthiazuron)、氟草黄、丁环草磷、丁硫咪唑酮、播土隆、苯酮唑(cafenstrole)、氯草灵、燕麦酯-甲基(chlorfenprop-methyl)、枯草隆、环庚草醚、苄草隆(cumyluron)、环莠隆(cycluron)、环草津(cyprazine)、三环塞草胺、苄草隆(dibenzyluron)、杀草净(dipropetryn)、杀草隆(dymron)、艾格林津(eglinazine)-乙基、草藻灭(endothall)、乙嗪草酮(ethiozin)、氟酮磺隆(flucabazone)、氟苯草灭(fluorbentranil)、氟胺草唑(flupoxam)、草特灵、异乐灵(isopropalin)、卡灵草(karbutilate)、抑长灵、灭草隆、敌草胺、萘丙胺(naproanilide)、磺乐灵(nitralin)、恶嗪草酮(oxaciclomefone)、棉胺宁、哌草磷、普赛津(procyazine)、环丙氟灵(profluralin)、稗草畏、密草通(secbumeton)、草克死(cdec)、芽根灵(terbucarb)、吡嘧磺隆(triaziflam)、triazofenamid或三甲隆；或它们的环境可兼容盐。
[0148]
杀线虫剂或生物杀线虫剂(bionematicides)：苯菌灵、二氧威、涕灭砜威、环线威(tirpate)、二胺磷(diamidafos)、苯线磷、硫线磷、除线磷(diclofenthion)、灭线磷、丰索磷、噻唑膦(fostiazate)、速杀硫磷(heterophos)、氯氨磷(isamidofos)、氯唑磷(isazofos)、磷虫威、硫磷嗪、新烟磷(imicyafos)、甲基灭蚜磷、乙酰虫腈(acetoprole)、苯鲁噻唑(benclothiaz)、氯化苦、棉隆、联氟砜(fluensulfone)、1,3-二氯丙烯(telone)、二甲基二硫醚、威百亩(metam sodium)、威百亩钾(metam potassium)、安百亩(metam)盐(所有的mitc产生物)、溴甲烷(methyl bromide)、生物土壤修复剂(例如芥末籽、芥末籽提取物)、土壤蒸汽熏蒸、异硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate)(aitc)、硫酸二甲酯(dimethyl sulfate)、糠醛(furfual)(醛)。
[0149]
本发明的合适的植物生长调节剂包括以下：植物生长调节剂：d1)抗生长素(antiauxins)，例如氯贝酸、2,3,5-三-碘苯甲酸；
[0150]
d2)生长素，例如4-cpa、2,4-d、2,4-db、2,4-dep、滴丙酸、2,4,5-涕丙酸、iaa、iba、萘乙酰胺、[α]-萘乙酸、1-萘酚、萘氧乙酸、环烷酸钾、环烷酸钠、2,4,5-t；
[0151]
d3)细胞激动素，例如2ip、苄基腺嘌呤、4-羟基苯乙基醇、激动素、玉米素；
[0152]
d4)落叶剂，例如氰氨化钙、噻节因、草藻灭、乙烯利、脱叶亚磷(merphos)、甲氧隆、五氯苯酚、噻苯隆、脱叶磷(tribufos)；
[0153]
d5)乙烯抑制剂，例如四烯雌酮、1-甲基环丙烯；
[0154]
d6)乙烯释放剂，例如acc、乙烯硅、乙烯利、乙二肟；
[0155]
d7)杀配子剂(gametocides)，例如杀雄嗪、马来酰肼(maleic hydrazide)；
[0156]
d8)赤霉素，例如赤霉素、赤霉酸；
[0157]
d9)生长抑制剂，例如脱落酸、嘧啶醇、仲丁灵、西维因、三丁氯苄膦、氯苯胺灵、调呋酸、氟节胺、增糖胺、杀木磷、增甘膦、异嘧醇(isopyrimol)、茉莉酸、马来酰肼、助壮素(mepiquat)、哌壮素、茉莉酮、苯胺灵、调节胺(tiaojiean)、2,3,5-三-碘苯甲酸；
[0158]
d10)形态素，例如整形素、整形醇、二氯芴丁酯、芴丁酯；
[0159]
d11)生长阻滞剂，例如矮壮素、亚拉生长素、调嘧醇、抑长灵、多效唑、四环唑、烯效唑；
[0160]
d12)生长刺激剂，例如芸苔素内酯、乙基芸苔素内酯(brassinolide-ethyl)、dcpta、氯吡脲、恶霉灵、补骨内酯(prosuler)、三十烷醇(triacontanol)；
[0161]
d13)未分类的植物生长调节剂，例如菊乙胺酯(bachmedesh)、氟草黄、丁环草磷、香芹酮、氯化胆碱、苯氰丁酰胺(ciobutide)、苯哒嗪钾、氨腈、环丙酰胺酸、环己酰亚胺、环丙磺酰胺、爱增美(epocholeone)、吲唑酯、乙烯、呋苯硫脲(fuphenthiourea)、乙二醇缩糖醛(furalane)、增产肟、氯乙亚磺酸(holosulf)、抗倒胺、karetazan、砷酸铅、磺菌威、调环酸、比达农、杀雄啉、抑芽唑、抗倒酯(trinexapac)。
[0162]
所述肥料可以是液体肥料。术语“液体肥料”是指流体或液体形式的肥料，其含有各种比例的氮、磷和钾(例如但不限于10％的氮、34％的磷和0％的钾)以及微量养料，所述微量养料通常称作起始肥料，其具有高含磷量并且促进快速且茁壮的根生长。
[0163]
本发明的化学制剂可以是任意合适的常规形式，例如，乳液浓缩剂(ec)、悬浮液浓缩剂(sc)、混悬-乳液(suspo-emulsion)(se)、胶囊悬浮液(cs)、水分散颗粒(wg)、可乳化颗粒(eg)、油包水乳液(eo)、水包油乳液(ew)、微乳(me)、油分散体(od)、油溶性可流动制剂(of)、油溶性液体(ol)、可溶性浓缩剂(sl)、超低容量悬浮剂(su)、超低容量液体(ul)、可分散的浓缩剂(dc)、可润湿粉末(wp)或任何技术上可行的制剂，与农业上可接受的辅料组合。
[0164]
在一个实施方式中提供一种产品，该产品包含：第一组合物，该第一组合物包含以atcc序号pta-121165保藏的解淀粉芽孢杆菌rti301的生物纯培养物、或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物，以及以atcc序号pta-121167保藏的枯草芽孢杆菌rti477的生物纯培养物、或该菌株的具有所有其识别特征的突变体的生物纯培养物；和第二组合物，该第二组合物包含微生物、生物或化学杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、除草剂、植物提取物、植物生长调节剂或肥料中的一种或它们的组合，其中，所述第一和第二组合物分开包装；以及任选的使用说明，用于将所述第一组合物与第二组合物的组合以适于促进植物生长的量递送至：植物的叶、植物的皮、植物的果实、植物的花、植物的种子、植物的根、植物的插条、植物的嫁接苗、植物的愈伤组织；植物周围的土壤或生长培养基；在将植物种子播种在土壤或生长培养基中之前的土壤或生长培养基；或在将植物、植物的插枝、植物嫁接苗、或植物愈伤组织种植在土壤或生长培养基中之前的土壤或生长培养基。
[0165]
在一个实施方式中，所述第一组合物还包含载体、分散剂或酵母提取物中的一种或它们的组合。
[0166]
在一个实施方式中，所述第一组合物的形式可以是液体、粉尘、可传播颗粒、干燥的可润湿粉末或干燥的可润湿颗粒。在一个实施方式中，所述第一组合物的形式为液体，并且解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477各自的浓度为约1.0
×
108cfu/ml至约1.0
×
10
12
cfu/ml。在一个实施方式中，所述第一组合物可以是粉尘、干燥的可润湿粉末、可传播颗粒、或干燥的可润湿颗粒的形式，并且枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301的量可以是约1.0
×
108cfu/g至约1.0
×
10
12
cfu/g。在一个实施方式中，所述第一组合物可以是油分散体的形式，并且枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301的浓度可以是约
1.0
×
108cfu/ml至约1.0
×
10
12
cfu/ml。
[0167]
在所述产品中，所述杀昆虫剂可以是以下中的一种或它们的组合：拟除虫菊酯、联苯菊酯、七氟菊酯、ζ-氯氰菊酯、有机磷酸酯、四氯乙磷、毒死蜱、丁基嘧啶磷、氟氯氰菊酯、苯基吡唑类、氟虫腈、烟碱或噻虫胺。在一个实施方式中，所述产品中的第二组合物中的杀昆虫剂包含联苯菊酯。在一个实施方式中，所述产品中的第二组合物中的杀昆虫剂包含联苯菊酯，并且在可用作液体肥料的制剂中。
实施例
[0168]
包括以下实施例以向本领域技术人员提供指导，用于实践本公开的代表性实施方式。根据本发明以及本领域的一般技能水平，本领域技术人员能够理解以下实施例仅用于示例，并且可采用多种改变、修改以及变化，而不偏离本公开的范围。
[0169]
实施例1
[0170]
通过序列分析对作为枯草芽孢杆菌的细菌分离株的鉴定
[0171]
与植物相关的指定为rti477的细菌菌株分离自生长于北加利福尼亚的辣木(moringa oleifera)的根。对rti477菌株的16s rrna以及rpob基因进行测序，然后使用blast与ncbi和rdp数据库中的其他已知的细菌菌株进行比较。测定到rti477的16s rna部分序列(seq id no:1)与短小芽孢杆菌菌株bsn5(cp002468)、解淀粉芽孢杆菌菌株ns6(kf177175)和枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株dsm 10(nr_027552)的部分16s rrna基因序列相同。另外，确定rti477的rpob序列与已知的枯草芽孢杆菌py79(cp006881)、枯草芽孢杆菌枯草亚种6051-hgw(cp003329)菌株(即99％序列相同度；9bp差异)、枯草芽孢杆菌枯草亚种bab-1a(cp004405)(即99％序列相同度；10bp差异)有99％的序列相同性。rti477菌株鉴定为枯草芽孢杆菌的菌株。rpob基因序列在dna水平上的差异表明rti477是枯草芽孢杆菌的新菌株。枯草芽孢杆菌rti477的菌株按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定，于2014年4月17日保藏于美国弗吉尼亚州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(atcc)，专利保藏编号为pta-121167。
[0172]
实施例2
[0173]
通过序列分析对作为解淀粉芽孢杆菌的细菌分离株的鉴定
[0174]
植物相关的指定为rti301的细菌菌株分离自生长在纽约州(ny)的葡萄藤的根际土壤。对rti301菌株的16s rrna以及rpob基因进行测序，然后使用blast与ncbi和rdp数据库中的其他已知的细菌菌株进行比较。测定到rti301的16s rna部分序列(seq id no:3)与解淀粉芽孢杆菌菌株ns6(kf177175)、解淀粉芽孢杆菌菌株fzb42(nr_075005)和枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株dsm 10(nr_027552)的16s rrna基因序列相同。另外，确定rti301的rpob基因序列(seq id no:4)与已知的解淀粉芽孢杆菌植物亚种trigocor1448(cp007244)(99％序列相似度；3碱基对差异)、解淀粉芽孢杆菌植物亚种as43.3(cp003838)(99％序列相似度；7碱基对差异)、解淀粉芽孢杆菌cc178(cp006845)(99％序列相似度；8碱基对差异)和解淀粉芽孢杆菌fzb42(cp000560)(99％序列相似度；8碱基对差异)中的相同基因具有序列相似性。rti301菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌。rpob基因序列在dna水平上的差异表明rti301是解淀粉芽孢杆菌的新菌株。解淀粉芽孢杆菌rti301的菌株按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定，于2014年4月17日保藏于美国弗吉尼亚州玛纳萨
斯的美国典型培养物保藏中心(atcc)，专利保藏编号为pta-121165。
[0175]
实施例3
[0176]
解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477中与抗微生物化合物的生物合成有关的基因
[0177]
解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的基因组的进一步的序列分析揭示该菌株具有与大量用于产生具有抗微生物性质的分子的生物合成通路相关的基因。这些包括用于subtilosin、表面活性肽、伊枯草菌素(iturin)、芬枯草菌素(fengycins)、解淀粉环菌素(amylocyclicin)、艰难菌素、芽孢菌溶素(bacilysin)、杆菌抗霉素(bacillomycin)和bacillaene的生物合成通路。另外，在rti301菌株中发现了与羊毛硫氨酸抗生素生物合成有关的基因，而其他紧密相关的解淀粉芽孢杆菌菌株中并没有该基因的同系物。这在图1中进行说明，其示出解淀粉芽孢杆菌rti301中的羊毛硫氨酸抗生素生物合成操纵子周围的以及包括该操纵子的基因组织的示意图。在图1中，顶部的箭头表示rti301菌株的蛋白质编码区域并指出了相对的转录方向。作为对比，两种解淀粉芽孢杆菌参照菌株fzb42和trigocor1448的相应区域在rti301菌株下方示出。rti301菌株中的羊毛硫氨酸抗生素生物合成操纵子中的基因首先使用rast鉴定，并使用blastp将它们的相同度精细化。rti301菌株的基因编码的蛋白质的氨基酸相同度与两个参照菌株进行比较，均通过代表性箭头的阴影度以及箭头中的相同度百分比表示。由图1可观察到，3个不同菌株的羊毛硫氨酸抗生素生物合成操纵子周围的基因具有高度的序列相同性，但是羊毛硫氨酸抗生素生物合成操纵子内的序列相同度低(即，羊毛硫氨酸抗生素生物合成操纵子内低于40％，但周围区域高于99％)。该簇相对于ncbi中的非冗余(nr)核苷酸数据的blastn分析示出了与解淀粉芽孢杆菌菌株的5’和3’侧接区的高度同源性(类似于图1中的高％相似性)。但是，羊毛硫肽生物合成簇对于rti301是独特的，并且未观察到与ncbi nr数据库中任意已测序的dna的显著同源性。因此，该羊毛硫氨酸抗生素合成操纵子对于解淀粉芽孢杆菌rti301而言是一种新型的特征。
[0178]
与rti301菌株的抗微生物生物合成通路的宽范围相反，rti477菌株的进一步的序列分析揭示该菌株具有与用于更有限的一组具有抗微生物性质的分子的生物合成通路相关的基因。rti477菌株具有用于subtilosin、芬枯草菌素、表面活性肽、艰难菌素、bacillaene、芽孢菌溶素和杆菌抗霉素的生物合成通路，但是未观察到用于伊枯草菌素、羊毛硫氨酸抗生素和解淀粉环菌素的完整生物合成通路。
[0179]
实施例4
[0180]
枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301分离株的抗微生物性质
[0181]
枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301分离株相对于主要植物病原体的拮抗能力在平板试验中进行测定。以4cm的距离在869琼脂板上并排生长所述细菌分离株和病原真菌，实施了用于评价相对于植物真菌病原体的拮抗作用的平板试验。在室温下对平板进行培养，并在两周内定期检查生长性质，例如生长抑制、小生境占有(niche occupation)或没有影响。在筛选针对细菌病原体的拮抗性质的情况下，病原体首先作为菌苔铺展在869琼脂平板上。随后，在平板上点样20μl等份的各分离株的培养物。将平板在室温下培育并在两周内定期检查施用了rti477和rti301的位置周围的菌苔中的抑制区域。分别在以下表i和表ii中示出rti477和rti301菌株各自拮抗活性的汇总。与rti477菌株相比，
rti301菌株显示了对宽范围的植物病原性微生物的优越拮抗性质。
[0182]
表i.枯草芽孢杆菌rti477分离株针对主要植物病原体的拮抗性质
[0183][0184][0185]
非常强的活性, 强的活性, 活性, -弱活性,-未观察到活性
[0186]
表ii.解淀粉芽孢杆菌rti301分离株对主要植物病原体的拮抗性质
[0187][0188][0189]
非常强的活性, 强的活性, 活性, -弱活性,-未观察到活性
[0190]
实施例5
[0191]
枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301分离株的表型性状
[0192]
除拮抗性质外，还测定了枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的各种表型性状，各菌株的数据分别示于下表iii和iv。根据表格下方文字中描述的步骤实施了评价。值得注意的是，相比于rti301，rti477生长得更快并具有更强的成群表型。
[0193]
表iii.表型试验：植物激素的产生、乙偶姻和吲哚乙酸(iaa)、以及枯草芽孢杆菌rti477分离株的营养循环
[0194][0195]
非常强, 强, 一些, -弱,-未观察到
[0196]
表iv.表型试验：植物激素的产生、乙偶姻和吲哚乙酸(iaa)、以及解淀粉芽孢杆菌rti301分离株的营养循环
[0197][0198]
非常强, 强, 一些, -弱,-未观察到
[0199]
乙偶姻测试.将富集869培养基中20μl的起始培养物转移至1ml甲基红-伏普(voges proskauer)培养基(西格玛奥德里奇(sigma aldrich)39484)。在30℃和200rpm的条件下将培养物培养2天。转移0.5ml的培养物并添加50μl的0.2g/l的甲基红。红色表示酸产生。剩余的0.5ml培养物与0.3ml的5％α-萘酚(西格玛奥德里奇n1000)混合，然后混合0.1ml的40％koh。30分钟的培养后，对试样进行解读。红色的显色表明乙偶姻的产生。对于酸和乙偶姻试验，用未接种培养基作为阴性对照(sokol等，1979，journal of clinical microbiology.9：538-540)。
[0200]
吲哚-3-乙酸。将富集869培养基中20μl的起始培养物转移至1ml的1/10869培养基，该培养基中补充有0.5g/l的色氨酸(西格玛奥德里奇t0254)。在30℃和200rpm的条件下在暗处将培养物培养4-5天。对试样进行离心并将0.1ml的上清液与0.2ml的索尔科斯基试剂(salkowski’s reagent)(35％高氯酸，10mm fecl3)混合。在暗处培养30分钟后，将产生
粉红色的试样记为阳性(positive)，用于iaa合成。将iaa的稀释液(西格玛奥德里奇i5148)用作阳性对照；未接种的培养基用作阴性对照(taghavi等，2009，应用环境微生物学75:748-757(applied and environmental microbiology 75:748-757))。
[0201]
磷酸盐溶解测试。将细菌置于pikovskaya(pvk)琼脂培养基上，该培养基每升包含10g葡萄糖、5g三磷酸钙、0.2g氯化钾、0.5g硫酸铵、0.2g氯化钠、0.1g七水合硫酸镁、0.5g酵母提取物、2mg硫酸锰、2mg硫酸铁和15g琼脂，ph为7，经过高压灭菌。洁净区域表示磷酸盐溶解细菌(sharma等，2011，微生物学和生物技术研究期刊1:90-95(journal of microbiology and biotechnology research 1:90-95))。
[0202]
几丁质酶活性。将10％湿重的胶体几丁质添加至改良pvk琼脂培养基(每升包含10g葡萄糖、0.2g氯化钾、0.5g硫酸铵、0.2g氯化钠、0.1g七水合硫酸镁、0.5g酵母提取物、2mg硫酸锰、2mg硫酸铁和15g琼脂，ph为7，经过高压灭菌)。将细菌接种在这些几丁质板上；洁净区域表明几丁质酶活性(n.k.s.murthy和bleakley.，2012.“用于筛选几丁质酶生产微生物的胶体壳多糖的简化方法(simplified method of preparing colloidal chitin used for screening of chitinase producing microorganisms)”.微生物学网络杂志(the internet journal of microbiology).10(2))。
[0203]
蛋白酶活性。将细菌接种在补充有10％牛奶的869琼脂培养基上。洁净区域表示分解蛋白质的能力，表明了蛋白酶活性(sokol等，1979，临床微生物学期刊(journal of clinical microbiology)9:538-540)。
[0204]
实施例6
[0205]
枯草芽孢杆菌分离株rti477对小麦的生长效果
[0206]
测定了施用所述细菌分离株rti477对小麦的早期植株生长以及活力的效果。通过在暗处和通气的条件下在室温下于～2x10
7
cfu/ml的细菌悬液中对表面消毒并发芽的小麦种子进行接种2天，实施了该试验(也进行了未使用细菌的对照试验)。然后，在6"的填充有砂的盆中种植所述接种和对照种子。每个处理组一个盆，每盆10颗种子，并按需交替用水和改良的霍格兰氏溶液(hoagland’s solution)进行浇水。实验室窗台(lab windowsill)中以约21℃的温度培育盆，提供13天的自然光/黑暗循环，在第13天回收植株并测量了参数。干重测定为9个植物的总重，结果为用枯草芽孢杆菌rti477菌株接种的植株的平均总干重为35.41mg，未接种的对照为33.38mg，经接种的干重相对于未接种的对照干重有6％的增加。生长13天后提取的植物的图片示于图2中。图2a示出了对照植株，图2b示出了用rti477接种的植株。
[0207]
实施例7
[0208]
枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301的生长相容性
[0209]
解淀粉芽孢杆菌rti301菌株与其他芽孢杆菌分离株的相容性通过将rti301菌株点样在多种其他菌株的菌苔上来测定。该试验的结果示于图3a-3b。图3a-3b显示解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477菌株之间的生长相容性，且rti301菌株与另一种解淀粉芽孢杆菌菌株(以pta-121166保藏于美国典型培养物保藏中心(atcc)的解淀粉芽孢杆菌rti472)缺乏相容性。当菌株rti301点样于菌株rti472的菌苔(图3a)上时，观察到了针对菌株rti472生长的清晰抑制区域。相反，当菌株rti301点样于菌株rti477的菌苔(图3b)上时，针对菌株rti477菌株仅观察到了最少的抑制且细胞片区中没有清除。因此，可以推断
rti301和rti477的生长是相容的。
[0210]
无意受限于任何特定的作用机理，提出了一种下述的作用模式以解释所观察到的菌株相容性差异。根据三种测试的菌株(即rti301、rti472和rti477)的基因组序列，预测这些菌株用于产生拮抗化合物芽孢菌溶素、bacillaene、艰难菌素和杆菌抗霉素。但是，解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477拥有用于合成subtilosin的基因，但是在解淀粉芽孢杆菌rti472的基因组中缺少该基因。subtilosin是一种细菌素，是一类由细菌产生的用于抑制相似或紧密相关的细菌菌株的生长的蛋白质毒素。因此，假想由解淀粉芽孢杆菌rti301合成的subtilosin可能是解淀粉芽孢杆菌rti472的生长抑制剂。相反，枯草芽孢杆菌rti477菌株未被rti301抑制，因为rti477菌株产生其自己的subtilosin，从而对所述化合物具有抗性。
[0211]
也对解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477菌株之间的菌株形态差异进行了分析。显示这些菌株各自形态的图片在图4中示出：解淀粉芽孢杆菌rti301(图4a)和枯草芽孢杆菌rti477(图4b)。图4a-4b中示出的解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477菌株的集落形态表明了菌株特性在活动性方面的潜在差异。活动性是植物相关细菌根际定殖的重要性状。解淀粉芽孢杆菌rti301生长成良好划界的圆形集落。相反，枯草芽孢杆菌rti477生长成松散的集落，其形态指示了成群以及活动性。成群以及活动性是植物根的根际和表面的快速定殖的潜在重要表型。再次，无意受限任何特定的作用机理，假设枯草芽孢杆菌rti477菌株的形态表明的强成群表型可能导致该菌株相比于解淀粉芽孢杆菌rti301是更有效的根际定殖菌(colonizer)。
[0212]
鉴于生长相容性和所观察到的表型差异，对rti301和rti477菌株的组合进一步测试其促进植物生长和健康的活力。
[0213]
实施例8
[0214]
协同植物生长促进性质中的枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301的组合结果
[0215]
使用枯草芽孢杆菌rti477菌株的孢子包覆或其营养细胞接种的多种植物种子中观察到了对种子发芽和根发育及构建的积极效果。这在例如上述实施例6中的小麦中有描述。另外，还进行了试验以测定向大豆种子施用枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301对大豆种子发芽、根发育和构建以及早期植物生长和/或植物健康的效果。试验按上述的描述实施，使用了rti301和rti477的孢子。对于该试验，菌株在14l的发酵槽中的2xsg中形成。收集孢子但之后未清洗，浓度为1.0x108cfu/ml。在试验中将孢子浓度稀释10倍或更高。将无菌滤纸置于各无菌塑料生长腔室的底部，各容器中分别放置6粒种子。将3ml的各种稀释度的rti301或rti477孢子添加至生长腔室，将其密闭并在19℃下培养8天，之后对幼苗进行拍摄。另外，还测试了rti301和rti477孢子的1:3、1:1和3:1的比率的组合。数据示于下表v。两种菌株在单独施用时与未接种的对照相比均未抑制种子发芽。
[0216]
1x106、1x107和1x108浓度的解淀粉芽孢杆菌rti301对大豆种子的接种对于根发育和构建没有效果。相同浓度的枯草芽孢杆菌rti477对大豆种子接种时，仅在最低浓度下对根发育和构建具有轻微的改善。出乎意料的是，使用rti301和rti477两者的组合(比例1:3)对大豆种子接种在所有测试浓度下均对根发育带来了改善。以1x106cfu/ml和1x107cfu/ml的浓度使用rti301和rti477(比例1:1)的组合接种的大豆种子在根发育方面有改善，
1x106cfu/ml的浓度中观察到了最一致的结果。rti301和rti477以3:1的比例和1x106cfu/ml的浓度施用时观察到了对根发育的最佳结果。
[0217]
另外，使用3:1比例的rti301 rti477的孢子接种种子的积极效果的图片示于图5a和5b(a
–
对照植株；b
–
使用rti301 rti477(比例3:1)以106cfu/ml的浓度接种的植株)。如图5a-5b所示，对于根形成和构建的效果是特别积极的。细根毛对于水和养分的摄取以及植物与其他微生物在根际的相互作用是重要的。这些结果显示单独施用菌株与对照植株相比没有效果或效果很小，施用枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301菌株的组合的种子对大豆早期生长和构建提供了显著的益处。
[0218]
表v.用rti301和rti477的孢子处理的大豆种子发芽试验
[0219][0220]
非常显著的生长益处， 强生长益处， 生长益处， -弱生长益处，＝没有观察到效果，-弱抑制，
‑‑
强抑制，n.d.未测定
[0221]
还实施了额外的试验以研究用rti301和rti477菌株的组合接种植物种子后对植物生长和发育的效果。具体而言，对大豆进行如下所述的实验：1)种子未处理；2)用cruisermaxx(杀昆虫剂 杀真菌剂，含有噻虫嗪、咯菌腈 甲霜灵-m；先正达作物保护公司)与甲基硫菌灵杀真菌剂的组合处理种子，这是典型的大豆种子处理(cruisermaxx与甲基硫菌灵的组合称作“化学对照”)；3)使用化学对照处理种子 用5.0x10
5
cfu/种子的菌株rti301接种；4)使用化学对照处理种子 用5.0x10
5
cfu/种子的菌株rti477接种；5)使用化学对照处理种子 用5.0x10
5
cfu/种子的两种菌株的组合接种。进行10个试验，每个试验的每个处理重复4或5次。10个田间试验的平均大豆产量结果(蒲式耳/英亩)示于下表vi，田间试验位置位于威斯康辛州(2)、印第安纳州(2)、伊利诺伊州(3)和爱荷华州(3)。四个试验用立枯丝核菌(rhizoctonia solani)接种，三个试验用禾谷镰孢菌(fusarium graminearum)或杆状镰孢菌(f.virguliforme)接种，一个试验用大豆疫霉(phytophthora sojae)接种，两个试验未接种。各病原体分别在润湿灭菌的谷物种子上生长，然后空气干燥。将所选的试验中使用的干燥的接种物与上述比率的种子混合种植，以在种子开始生长时提供感染。
[0222]
表vi中的结果表明，与单独使用化学对照处理的种子相比，单独使用解淀粉芽孢
杆菌rti301或枯草芽孢杆菌rti477对大豆整体平均产量没有效果。如上述试验中所观察到的，使用解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477的组合接种提供了协同效果并使10个田间试验中的大豆产量平均增加了5％(从58.2蒲式耳/英亩增加至61.1蒲式耳/英亩，见表vi)。值得注意的是，在未接种的田间试验中(n＝2个试验)，观察到rti 301和rti 477的组合 化学对照中相对于化学对照的在产量方面有3.7蒲式耳/英亩的产量增加，在用立枯丝核菌接种的试验中(n＝4个试验)，观察到两菌株 化学对照相对于化学对照有4.3蒲式耳/英亩的增加，在用镰孢菌(fusarium)接种的试验中(n＝3个试验)，观察到两菌株 化学对照相对于化学对照有1.5蒲式耳/英亩的增加，在用大豆疫霉接种的试验中(n＝1个试验)，观察到两菌株 化学对照相对于化学对照有1.0蒲式耳/英亩的增加，因此产量响应与疾病接种和化学杀真菌剂的种子处理无关。
[0223]
表vi.解淀粉芽孢杆菌rti301、枯草芽孢杆菌rti477和两种菌株的组合对大豆种子接种的平均结果。
[0224][0225]
无意受限于任何特定作用机理，所观察到的两种菌株的组合对大豆产量的协同作用的一种解释如下所述。解淀粉芽孢杆菌rti301产生宽范围的拮抗代谢物，例如subtilosin，其能抑制竞争真菌和细菌菌株的生长和发育，包括紧密关联的芽孢杆菌属。藉此，在单独施用至植物时，rti301菌株能够开启一个用于在根际建立的小生境/空间。但是，数据并不支持解淀粉芽孢杆菌rti301的强植物生长促进性质。于是，在rti301菌株被导入并在根际开启了小生境之后，其能够建立但是无法显著促进植物生长和/或植物健康。单独使用解淀粉芽孢杆菌rti301处理种子后未观察到大豆产量增加可证实这一点。
[0226]
相比之下，枯草芽孢杆菌rti477相比于解淀粉芽孢杆菌rti301具有更窄范围的拮抗作用，因此，在单独施用至植物种子时，预计对于开启其构建的小生境的效果更弱。其结果是，该菌株更不容易在大豆根际建立，可能导致对植物生长不具有有益效果。单独使用枯草芽孢杆菌rti477处理种子后未观察到大豆产量增加可证实这一点。
[0227]
试验表明枯草芽孢杆菌rti477菌株的生长与解淀粉芽孢杆菌rti301相容。另外，rti477的表型表明该菌株能够是强成群表型，并且从而假设是比解淀粉芽孢杆菌rti301更有效的根际定殖菌。因此，两种菌株的组合可预期对大豆具有有益效果。具体而言，一旦解淀粉芽孢杆菌rti301在大豆根际开启了用于建立的小生境，该菌株因枯草芽孢杆菌rti477的成群表型而无法竞争过枯草芽孢杆菌rti477。然后rti477菌株自身能够在大豆根际建立，在此处可向植物宿主提供有益效果。使用两种菌株的组合接种植物种子后所观察到的大豆产量的增加可证实这一点。
[0228]
实施例9
[0229]
枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301孢子处理种子增加了玉米产量
[0230]
还实施了额外的试验以研究用rti301和rti477菌株的组合接种植物种子后对植物生长、发育和产量的效果。
[0231]
具体而言，对玉米实施下述试验，数据汇总于以下表ix：1)种子未处理(“utc”)；2)用maxim(光谱种子处理杀真菌剂咯菌腈作为其活性成分，施用量为0.0625mg/种子；先正达作物保护公司)、apron xl(活性成分甲霜灵-m，施用量为0.0625mg/种子)；先正达作物保护公司)和poncho(噻虫胺杀昆虫剂，施用量为0.25mg/种子；拜耳作物科学公司)处理种子，这是典型的玉米种子处理(maxim,apron xl和poncho的组合称作“化学对照”或“cc”)；3)使用化学对照处理种子 用5.0x10
5
cfu/种子的菌株rti301和rti477的组合处理种子(“cc rti 301/477 1:1”)。在天然疾病压力或用丝核菌接种土壤的条件下分别进行两个试验，每个试验中的每个处理重复5次。对于接种试验，丝核菌分别在润湿灭菌的谷物种子上生长，然后空气干燥。在种植时将干燥的接种物与上述种子按预定比例混合，以在种子开始生长时提供感染。田间试验的平均玉米产量结果(蒲式耳/英亩)示于下表ix，田间试验位置位于伊利诺伊州的肖尼敦。
[0232]
表vii中的结果表明，与单独使用化学对照处理的种子相比，施用化学对照 使用1比1的解淀粉芽孢杆菌rti301与枯草芽孢杆菌rti477的组合显著增加了平均玉米产量。值得注意的是，观察到1:1组合的rti301和rti477 化学对照相对于仅用化学对照处理的组分别在天然病原体压力和丝核菌接种田间试验中获得了10.7蒲式耳/英亩和59.8蒲式耳/英亩的产量增加。这些数据表明使用这些菌株的组合处理种子显著提高了玉米产量。
[0233]
表vii.在天然疾病压力和人工丝核菌接种条件下的未处理的玉米种子(utc)、施用化学对照处理的玉米种子(cc)、使用cc 解淀粉芽孢杆菌rti301与枯草芽孢杆菌rti477处理的玉米种子的产量增加。统计相关度(字母)基于p＝0.1。
[0234][0235]
实施例10
[0236]
枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301组合的种子处理增加了立枯丝核菌人工接种的大豆的产量
[0237]
实施试验以研究用rti301和rti477菌株的组合以及用于控制病原体的化学活性试剂处理种子对大豆出苗和产量的影响。具体而言，对大豆进行如下所述的实验：1)种子未处理(utc)；2)用cruisermaxx(杀昆虫剂 杀真菌剂，含有噻虫嗪、咯菌腈 甲霜灵-m；先正达作物保护公司)与甲基硫菌灵杀真菌剂的组合处理种子，这是典型的大豆种子处理(cruisermaxx与甲基硫菌灵的组合称作“化学对照”)；3)使用vibrance(活性成分环丙吡菌
胺；先正达作物保护公司)处理种子；4)使用化学对照 用5.0x10
5
cfu/种子的菌株rti301和rti477处理种子。在威斯康辛州的白水市进行2个试验，每个试验的每个处理重复4次。通过首先使病原体分别在润湿灭菌的作物种子的生长来在试验中接种立枯丝核菌，然后在种植时将干燥的接种物与种子以预定比例混合以在种子开始生长时提供感染。试验的平均大豆出芽和产量结果示于下表viii。表viii中的结果显示，相对于仅用化学活性试剂的处理，使用解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477的组合以及化学对照的处理使得产量平均增加13.3蒲式耳/英亩(从59.4到72.7蒲式耳/英亩)。于是，使用rti301和rti477的组合的种子处理可显著提高大豆产量，即便在严重的病原体压力条件下也是如此。
[0238]
表viii田间试验中的用立枯丝核菌人工接种的植株以及用解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477的组合处理种子以及大豆种子的化学活性试剂处理对大豆出芽和产量的平均结果。
[0239][0240]
实施例11
[0241]
使用解淀粉芽孢杆菌分离株rti301和枯草芽孢杆菌分离株rti477的滴灌对水果和蔬菜的效果
[0242]
实施田间试验以测定使用解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477的孢子的滴灌对西葫芦、番茄和胡椒的效果。由土壤传播的真菌导致的疾病压力未在任何试验中记录。根据下述试验测定了对植株产量的效果。
[0243]
实施了对胡椒(墨西哥胡椒(jalapeno pepper))植株的试验，其中在种植时通过根部浸透以1.25x10
12
cfu/公顷的比率施用解淀粉芽孢杆菌rti301和枯草芽孢杆菌rti477的孢子，然后在移植17天和35天之后以相同比率进行两次滴灌施用。使用accomplish lm(洛弗兰德产品公司)作为市售对照，并以2340ml/ha的比率用与rti301 rti477组合相同的方式施用。该产品含有下组的共混物：敏捷噬酸菌(acidovorax facilis)(1x103cfu/ml)、地衣芽孢杆菌(1x103cfu/ml)、枯草芽孢杆菌(1x103cfu/ml)、蔬菜芽孢杆菌(bacillus oleronius)(1x103cfu/ml)、海洋芽孢杆菌(bacillus marinus)(1x103cfu/ml)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)(1x103cfu/ml)、和红球菌属红球菌(rhodococcus rhodochrous)(1x103cfu/ml)。
[0244]
与未施用细菌孢子的未处理对照植株以及市售对照植株相比，rti301 rti477孢子的添加增加了墨西哥胡椒的产量。具体而言，rti301 rti477处理的植株带来了总共4154kg/ha的可出售胡椒，相比之下，未处理的对照植株以及使用accomplish处理的植株分别为3455kg/ha和3930kg/ha，表示可出售胡椒重量分别有20％和5.7％的增加。相对于未处理的对照植株以及用市售标准处理的植株，用解淀粉芽孢杆菌rti301 枯草芽孢杆菌rti477孢子处理的植株的大幅增加的可出售胡椒重量说明了用该处理所提供的积极生长
效果。
[0245]
对番茄植株实施了类似的田间试验，其中，种植时通过根部浸透以0.625x10
12
cfu/公顷的比率施用解淀粉芽孢杆菌rti301的孢子，以3.75x10
12
cfu/公顷的比率施用枯草芽孢杆菌rti477的孢子，然后在移植17天和35天之后以相同比率进行两次滴灌施用。使用accomplish lm作为市售对照，并以2340ml/ha的比率用与rti301 rti477组合相同的方式施用。
[0246]
与浸透和滴灌中未包括细菌孢子的未处理对照植株以及市售对照植株相比，rti301 rti477孢子的添加使得番茄的总产量及可出售产量均有增加。具体而言，rti301 rti477处理的植株带来了总共21,824kg/ha的可出售番茄，相比之下，未处理的对照植株以及使用accomplish处理的植株分别为16,765kg/ha和21,420kg/ha，表示可出售番茄重量分别有30.2％和1.9％的增加。特别是相对于未处理的对照植株，用解淀粉芽孢杆菌rti301 枯草芽孢杆菌rti477孢子处理的植株的大幅增加的可出售番茄重量说明了用该处理所提供的积极生长效果。
[0247]
对西葫芦植株实施了类似的田间试验，其中，种植时通过根部浸透以3.75x10
12
cfu/公顷的比率施用解淀粉芽孢杆菌rti301的孢子，以0.625x10
12
cfu/公顷的比率施用枯草芽孢杆菌rti477的孢子，未进一步通过滴灌来施用。使用accomplish lm作为市售对照，并以2340ml/ha的比率用与rti301 rti477组合相同的方式施用。
[0248]
与浸透中未包括细菌孢子的未处理对照植株以及市售对照植株相比，rti301 rti477孢子的添加使得西葫芦的总产量及可出售产量均有增加。具体而言，rti301 rti477处理的植株带来了总共873.4kg/ha的西葫芦，相比之下，未处理的对照植株以及使用accomplish处理的植株分别为838.3kg/ha和836.1kg/ha，表示西葫芦总重分别有4.2％和4.5％的增加。相对于未处理的对照植株以及用市售标准处理的植株，用解淀粉芽孢杆菌rti301 枯草芽孢杆菌rti477孢子处理的植株的增加的西葫芦总重说明了用该处理所提供的积极生长效果。
[0249]
实施例12
[0250]
枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301分离株产生的新代谢物的鉴定
[0251]
之前报道了五类芬枯草菌素型代谢物和脱羟基芬枯草菌素型代谢物是由包括枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的微生物种类生产的(参照例如li、xing-yu等，2013，j.microbiol.biotechnol.23(3)，313
–
321；pecci y等2010，《质谱(mass spectrom.)》，45(7):772-77.)。这些代谢物是还含有脂肪酸基团的环状肽分子。芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素型代谢物的五个类型记作a、b、c、d和s。这些代谢物的骨架结构和五类中的每一类的特异性氨基酸序列示于图6。在枯草芽孢杆菌中，芬枯草菌素型化合物称作大侧柏素(plipastatin)。大侧柏素a和b的分子重量与芬枯草菌素a和b相似，差别仅在于肽环的3号位的酪氨酸残基在芬枯草菌素中是d-型的，在大侧柏素中是l-型的，以及肽环的9号位的酪氨酸残基在芬枯草菌素中是l-型的，在大侧柏素中是d-型的。(marc ongena和philippe jacques,2007,微生物学趋势(trends in microbiology)卷16,no.3:115-125)。出于本说明书和权利要求的目的，术语“芬枯草菌素”将指代大侧柏素代谢物和芬枯草菌素代谢物。类似地，出于本说明书和权利要求的目的，术语“脱羟基芬枯草菌素”将用于指代脱羟基大侧柏素代谢物和脱羟基芬枯草菌素代谢物。
[0252]
用uhplc-tof ms分析枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301生产的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素型代谢物。将30℃下在869培养基或2x sg培养基中生长6天的菌株生产的这些代谢物的分子量与芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素型代谢物预期的理论分子量进行比较。另外，为了确定菌株生产的多种芬枯草菌素型代谢物的氨基酸组成，对先前通过uhplc-tof ms鉴定的每种芬枯草菌素型代谢物进行使用lc-ms-ms的肽测序。藉此，测得所述菌株产生了芬枯草菌素a、b、c、d和s以及脱羟基芬枯草菌素a、b、c、d和s。令人惊讶的是，除了这些已知的化合物，测得这些菌株还产生了之前未鉴定的这些化合物的衍生物。
[0253]
例如，确定解淀粉芽孢杆菌rti301菌株生产了芬枯草菌素类化合物和脱羟基芬枯草菌素类化合物，其中环状肽链8位上的l-异亮氨酸(在图6中称为x3)被l-甲硫氨酸替代。新的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素种类在此被称为ma、mb和mc，是指a、b和c类的图6中的x3的l-异亮氨酸被l-甲硫氨酸替代的衍生物。新鉴定的分子示于图6和以下表ix。也对rti477菌株进行了新鉴定的芬枯草菌素ma、mb和mc化合物的观察，但是rti477菌株中并未观察到相应的脱羟基芬枯草菌素ma、mb和mc化合物(表ix)。
[0254]
进一步确定rti301菌株产生另外一类之前尚未鉴定的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素。在该类中，芬枯草菌素b和脱羟基芬枯草菌素b的l-异亮氨酸(图6中的位置x3)被l-同型半胱氨酸(hcy)替代。这些之前未鉴定的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素代谢物在此称为芬枯草菌素h和脱羟基芬枯草菌素h并用粗体示于图6和表ix。也对rti477菌株进行了新鉴定的芬枯草菌素h化合物的观察，但是rti477菌株中并未观察到相应的脱羟基芬枯草菌素h化合物(表ix)。
[0255]
进一步确定rti301菌株产生另外一类未鉴定的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素代谢物。在该类中，环形肽骨架结构的位点4处的氨基酸(图6中的位点x1)被l-异亮氨酸替代。这些之前未鉴定的代谢物在此称为芬枯草菌素i和脱羟基芬枯草菌素i并示于图6和表ix。也对rti477菌株观察了新鉴定的芬枯草菌素i和脱羟基芬枯草菌素i化合物(表ix)。
[0256]
之前报道的芬枯草菌素和脱羟基芬枯草菌素型代谢物和新鉴定的代谢物的氨基酸序列的汇总在以下的表ix中提供。
[0257]
表ix枯草芽孢杆菌rti477和解淀粉芽孢杆菌rti301分离株中的芬枯草菌素型代谢物的ms/ms鉴定的总结。
[0258][0259]
参考文献
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本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。
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虽然通过阐述和举例的方式详细描述了上述主题以清晰理解，但本发明技术人员应理解可在权利要求书范围内实施某些改变和修改。