一种铜离子-单宁酸共组装抗菌纳米片作为抗肿瘤药物载体的应用

1.本发明涉及一种铜离子-单宁酸共组装抗菌纳米片作为抗肿瘤药物载体用于肿瘤靶向的抗肿瘤和抗菌缓控释药物，属于复合材料技术领域和生物医药技术领域。


背景技术：

2.癌症是一种多因素疾病，在与癌症的发生、发展和治疗相关的众多因素中，细菌一直受到广泛关注。越来越多的证据表明，细菌与癌症的发生发展密切相关，并通过介导癌症的发生和相关感染来影响癌症的治疗效果。统计结果显示，42%的实体瘤癌症患者伴有革兰氏阳性细菌感染，27%伴有革兰氏阴性细菌感染，而在血液系统恶性肿瘤患者中，这一比例分别为47%和30%（clin. infect. dis., 2003, 37, 1144-1145）。手术切除是大多数实体瘤的常用治疗方法，但手术会使癌症患者的伤口处于高感染风险，一旦感染就会导致炎症，延迟伤口愈合，并可能导致其他相关并发症。此外，放疗和化疗等其他方法也会严重损害癌症患者的免疫系统，通常会导致继发性细菌感染，并增加感染败血症等致命疾病的风险。肿瘤中细菌的存在会减少药物的内化，这可能会削弱药物的治疗效果（sci. rep., 2015, 5, 14554），而且目前抗生素的过度使用和长期滥用已导致多药耐药病原体的迅速出现。因此，发展兼具抗菌和抗肿瘤性能的药物递送体系对于感染相关的癌症治疗具有重要意义。
3.为了解决癌症治疗过程中的细菌感染问题，用于抗癌药物递送的抗菌纳米载体在癌症治疗中受到越来越多的关注，抗菌纳米载体与抗癌药物相结合是细菌感染相关的癌症治疗的未来趋势（biomater. sci., 2020, 8, 6814-6824）。一些抗菌纳米载体，如抗菌肽修饰纳米颗粒、阳离子聚合物修饰纳米颗粒和金属纳米颗粒等已被用于抗癌药物的递送研究，其中金属纳米颗粒由于具有制备简单和抗菌性能强等特点而备受关注。金属纳米粒子释放出的cu
2
、ag

和zn
2
等金属离子作为一种特殊元素，可以通过抑制细菌壁合成、破坏细胞膜、破坏核酸功能等途径发挥其强大的杀菌活性。然而，大多数金属纳米颗粒通常不能直接用作药物载体，需要修饰并嵌入其他聚合物系统中，而且传统金属颗粒面临有毒金属离子泄漏的风险，这可能会导致严重的副作用。开发具有金属离子控释功能的金属纳米材料用于抗癌药物递送仍然具有挑战性。
4.植物为我们提供了多种次生代谢产物，包括具有多种生物活性和功能的天然化合物和聚合物。金属-多酚共组装的纳米材料是近年来发展的新兴材料，这些纳米结构具有多种特性，例如刺激响应的形态和结构变化、选择渗透性和增强的机械/热稳定性等，更重要的是，金属-多酚共组装的纳米材料可有效地限制材料骨架中的金属离子，以防止有毒金属离子的无序释放和不可避免的泄漏，并以刺激响应的方式进一步精确控制金属离子的释放。单宁酸是一种天然的树枝状多酚，广泛分布于多种植物中，其分子结构中含有丰富的邻苯二酚或邻苯三酚基团，是构建各种金属-多酚共组装纳米材料理想的酚类化合物来源。此外，单宁酸还具有抗菌、抗氧化和抗炎等活性，常被用于增强生物材料的抗菌能力。因此，发展可负载抗肿瘤药物的单宁酸和金属离子有机结合的金属-多酚共组装纳米材料，制备兼
具抗菌、抗肿瘤性能的纳米药物，可有效解决肿瘤治疗过程中患者易受细菌感染的问题，并提高化疗药物的治疗效果，为细菌感染和肿瘤的同时治疗提供新思路。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种铜离子-单宁酸共组装抗菌纳米片作为抗肿瘤药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.一、抗菌纳米片的制备及性能1、抗菌纳米片的制备将铜盐（cu
2
）和单宁酸（ta）溶于去离子水中形成混合溶液，用氢氧化钠调节混合溶液的ph值至7.2~8.0，并将混合溶液经加热搅拌，得到由铜离子-单宁酸（cu-ta）自组装形成的纳米片分散液；纳米片分散液通过离心收集沉淀物，用去离子水和无水乙醇洗涤，真空下冷冻干燥，即得抗菌纳米片。
7.所述铜盐为硫酸铜、氯化铜、硝酸铜中的任意一种，铜盐和单宁酸的摩尔比为70:1~300:1。
8.为了使铜离子-单宁酸充分自组装形成纳米片，所述混合溶液的加热搅拌是在50~100℃下搅拌3~48 h。
9.所述离心是在3000 rpm下离心10~15分钟。
10.对cu-ta进行形貌表征，使用的透射电子显微镜（transmission electron microscope，tem）为fei-tecnai g2。图1为cu-ta纳米片的透射电镜图，可见，cu-ta为典型的纳米片结构，其长度和宽度大约为130和72 nm。该类二维纳米片具有较高的比表面积（68.1 m2/g），非常有利于药物的负载。
11.2、cu-ta纳米片的抗菌性能采用最小抑菌浓度实验考察了cu-ta对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄糖球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）的抑菌效果。
12.实验方法：金黄色葡萄糖球菌和大肠杆菌在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养24小时（37℃），于600 nm波长下检测吸光度（optical density, od
600
），将菌液稀释至1
×
10
7 cfu/ml。在96孔板的中添加100μl细菌分散液（10
7 cfu/ml），然后添加一系列两倍稀释的cu-ta样品（100μl）。将96孔板在37℃下培养24小时，通过酶标仪（spectramax
®
，molecular devices, usa）测量od
600
评价细菌的存活率。
13.图2是不同浓度cu-ta纳米片对金黄色葡萄糖球菌和大肠杆菌的抑菌结果图。结果显示，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的存活率在cu-ta纳米片存在下均表现出浓度依赖性的下降行为。当cu-ta浓度低于0.2 mg/ml时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的存活率均高于50%，而当浓度为0.4 mg/ml时，存活率急剧下降至30%以下。图4结果表明，cu-ta对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度约为0.4 mg/ml。
14.3、cu-ta纳米片的生物相容性cu-ta纳米片的生物相容性考察采用live-dead比色法，分别考察5和50μg/ml浓度的cu-ta纳米片对正常vero细胞（非洲绿猴肾细胞）的细胞毒性。将vero细胞接种在24孔板（每孔1
×
106个细胞）中，并培养24小时。使用含有5和50μg/mlcu-ta的培养基更换旧培养基，并在37℃下培养24小时。移除培养基，向每个孔中添加活/死细胞的荧光染料，并在37℃
下培养30分钟。通过激光共聚焦显微镜（olympus fluoview 1000，japan）拍摄染色细胞的图像。
15.图3是vero细胞与不同浓度cu-ta纳米片培养的live/dead结果图。激光共聚焦显微镜图像显示，当用5或50μg/ml的cu-ta和磷酸盐缓冲盐（pbs，对照）处理时，vero细胞的形态几乎没有变化，cu-ta组和对照组也几乎没有红色荧光出现（死细胞）。上述结果表明，cu-ta纳米片对正常细胞具有较低的细胞毒性，是一种生物相容性较好的药物载体。
16.二、抗菌抗肿瘤性能纳米药物的制备和性能1、抗菌抗肿瘤性能纳米药物的制备将cu-ta抗菌纳米片超声分散于去离子水中，并加入抗肿瘤药物，在黑暗条件下充分搅拌（搅拌时间为12~72h）使抗肿瘤药物负载到抗菌纳米片中，经离心、干燥，得到兼具抗菌抗肿瘤性能的纳米药物。
17.所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、盐酸表阿霉素、吡喃阿霉素、盐酸伊立替康的任意一种。抗菌纳米片与抗肿瘤药物的质量比为10:1~1:1。
18.以盐酸表阿霉素为例，利用zeta电位仪表征了cu-ta在负载表阿霉素前后其表面电位变化，如图4所示，cu-ta纳米片表面的平均电位为
ꢀ‑
16.2 mv，当负载表阿霉素后cu-ta纳米片的表面电位为
ꢀ‑
0.97mv，这一表面电位的明显差异表明表阿霉素已通过静电相互作用成功负载到cu-ta纳米片表面。表阿霉素与cu
2
间具有较强的络合作用，络合物的形成会改变表阿霉素的共轭体系，降低其荧光效率。表阿霉素负载前后的荧光发射光谱表征结果显示（图5），表阿霉素的特征发射峰（596 nm）处的荧光强度远弱于未负载的游离表阿霉素，表明表阿霉素分子也可通过与铜离子间的络合作用负载到cu-ta纳米片表面。
19.2、抗菌抗肿瘤性能纳米药物ph和谷胱甘肽敏感（gsh）的药物释放行为以负载盐酸表阿霉素（epi）的cu-ta纳米药物（cu-ta/epi）为例，考察了纳米药物中epi和铜离子在三种不同的pbs缓冲液中的体外释放行为，分别为ph7.4的pbs缓冲液（模拟正常生理环境）、ph 5.0的pbs缓冲液（模拟肿瘤微酸环境）和含有10mm gsh的pbs缓冲液（ph 7.4，模拟肿瘤细胞高含量gsh环境）。将5.0 ml不同缓冲液分散的cu-ta/epi放置在透析袋中（截留分子量为6000-8000 da），然后将透析袋浸入不同的缓冲液中（30ml），并分别在37℃摇床中振荡24小时，每个释放条件包含三个平行样品。在预定的时间间隔内，取出5.0 ml缓冲液，然后加入5.0 ml的新鲜缓冲液。采用荧光分光光度计（perkin-elmer ls-55）和耦合等离子体光发射光谱仪（icp-oes，agilent technologies 5100）对每个样品中epi和铜离子的含量进行分析。
20.图6为cu-ta/epi纳米药物在三种不同缓冲液中epi（a）和铜离子（b）的释放行为图。在ph 7.4的缓冲液中，epi在24小时内释放了不到2%。在ph 5.0缓冲液或含有gsh的缓冲液中，epi在24小时内释放了大约28%和86%。其ph敏感的释放行为主要归因于epi-cu
2
络合物和cu-ta纳米片可在酸性条件下解离，从而触发epi的释放。此外，gsh是一种强金属络合剂，可通过gsh和ta与cu
2
的竞争络合破坏cu-ta结构，也会导致纳米片瓦解并触发epi的释放。铜离子的释放动力学行为与epi相似，在24小时内，只有不到3%的cu
2
在ph值为7.4的缓冲液中被释放，而在ph值为5.0或含gsh的缓冲液中，铜离子持续释放超过21%和60%。上述结果表明，cu-ta/epi纳米药物在正常生理环境中具有良好的稳定性，能够有效防止铜离子的泄漏风险，而肿瘤微酸性和高含量的gsh环境可以通过破坏cu-ta纳米片的结构有效地触发
epi与铜离子的释放。
21.3、cu-ta/epi纳米药物的体外细胞毒活性通过建立金黄色葡萄球菌与肝癌细胞hep g2共存的细胞模型，考察了epi和cu-ta/epi纳米药物在细菌存在下的细胞毒活性。将金黄色葡萄球菌菌落接种至5ml lb培养基中，于37℃摇床中培养24h（100rpm），离心5min（5000 rpm），弃去培养基后用pbs重悬细菌，通过测定od
600
值调整细菌浓度至约2
×
105cfu/ml。将hepg2细胞接种至96孔板（200μl，细胞密度为大约5
×
103个/孔），培养12h后加入2μl菌液和0, 5, 50和100
ꢀµ
g/ml的纳米药物，共培养24h后用mtt法测定细胞和细菌的存活率。
22.图7为hep g2细胞在有菌和无菌条件下与epi、cu-ta/epi共培养的细胞存活率图。如图7a所示，金黄色葡萄球菌的存在可明显抑制epi对hep g2细胞的杀伤效果，使epi对细胞的毒性下降50%以上，这可能是因为细菌的存在会减少epi的内化，进而削弱其治疗效果。而对于纳米药物组（图7b），金黄色葡萄球菌的存在将不再影响药物的治疗效果，在含菌和无菌条件下，cu-ta/epi纳米药物均显示出优异的细胞毒活性。上述结果表明，cu-ta/epi纳米药物能够实现抗肿瘤和抗菌的联合作用，有效避免微生物感染对抗癌药物疗效的影响。
23.综上所述，本发明将铜离子-单宁酸共组装的纳米片作为抗肿瘤药物的载体，即可有效避免传统金属粒子抗菌材料中金属离子无序泄漏导致的副作用风险，拓宽含金属纳米材料在生物医用材料领域的应用，又可通过高效负载抗肿瘤药物制备兼具抗菌和抗肿瘤性能的纳米药物，有望解决肿瘤治疗过程中患者易受细菌感染的问题，并能提高药物的治疗效果，为细菌感染和肿瘤的同步治疗提供了新思路。同时，本发明中兼具抗菌和抗肿瘤性能的纳米药物制备方法简单、快速、高效。
附图说明
24.图1为cu-ta纳米片的透射电镜图；图2为不同浓度cu-ta纳米片对金黄色葡萄糖球菌和大肠杆菌的抑菌效果图；图3为vero细胞与不同浓度cu-ta纳米片培养的live/dead结果图；图4为cu-ta纳米片负载盐酸表阿霉素前后表面电位图；图5为表阿霉素负载前后的荧光发射光谱图；图6为cu-ta/epi纳米药物在三种不同缓冲液中表阿霉素（a）和铜离子（b）的释放行为；图7为hep g2细胞在金黄色葡萄糖球菌和无菌条件下与表阿霉素、cu-ta/epi共培养的细胞存活率。
具体实施方式
25.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施案例对本发明铜离子-单宁酸（cu-ta）自组装纳米片的制备以及抗菌抗肿瘤纳米药物的制备做进一步说明。
26.实施例1（1）铜离子-单宁酸（cu-ta）自组装纳米片的制备：将54 mg（0.032 mmol）单宁酸和1.75g（7.01 mmol）五水硫酸铜溶解在100 ml去离子水中，搅拌30分钟得到均匀的水溶液。
在搅拌条件下，用2m氢氧化钠水溶液精确地调节溶液ph至7.4。随后将溶液加热至50℃并搅拌4小时；通过离心（3000 rpm，10分钟）收集沉淀物，用去离子水和无水乙醇连续洗涤三次，真空下冷冻干燥即得目标物；（2）cu-ta负载盐酸表阿霉素的纳米药物的制备：将10mg cu-ta纳米片超声分散在50 ml去离子水中，并向溶液中加入3 ml盐酸表阿霉素水溶液（1.0 mg/ml），并在黑暗条件下搅拌24小时。通过离心收集（3000rpm，10分钟）产物，用去离子水洗涤三次，真空下冷冻干燥即得目标物——cu-ta负载盐酸表阿霉素的纳米药物，该药物在三种不同缓冲液中表阿霉素和铜离子的释放行为见图6，其体外细胞毒活性见图7。
27.实施例2（1）铜离子-单宁酸（cu-ta）自组装纳米片的制备：将54 mg（0.032 mmol）单宁酸和1.75 g（7.01 mmol）五水硫酸铜溶解在100 ml去离子水中，搅拌30分钟得到均匀的水溶液。在搅拌条件下，用2m氢氧化钠水溶液精确地调节溶液ph至7.3；随后，将溶液加热至100℃并搅拌8小时；通过离心（3000 rpm，10分钟）收集沉淀物，用去离子水和无水乙醇连续洗涤三次，真空下冷冻干燥，即得目标物；（2）cu-ta负载盐酸阿霉素的纳米药物的制备：将10 mg cu-ta纳米片超声分散在50 ml去离子水中，向溶液中加入5 ml盐酸阿霉素水溶液（1.0 mg/ml），并在黑暗条件下搅拌24小时。通过离心收集（3000 rpm，10分钟）产物，用去离子水洗涤三次，真空下冷冻干燥即得目标物。
28.实施例3（1）铜离子-单宁酸（cu-ta）自组装纳米片的制备：将27 mg（0.016mmol）单宁酸和875mg（3.5mmol）五水硫酸铜溶解在50 ml去离子水中，搅拌30分钟得到均匀的水溶液。在搅拌条件下，用2m氢氧化钠水溶液精确地调节溶液ph至7.4。随后，将溶液加热至80℃并搅拌12小时。通过离心（3000 rpm，10分钟）收集沉淀物，用去离子水和无水乙醇连续洗涤三次，真空下冷冻干燥即得目标物；（2）cu-ta负载盐酸伊立替康的纳米药物的制备：将10 mg cu-ta纳米片在超声条件下重新分散在50 ml去离子水中，向溶液中加入2 ml盐酸伊立替康水溶液（1.0 mg/ml），并在黑暗条件下搅拌24小时。通过离心收集（3000 rpm，10分钟）产物，用去离子水洗涤三次，真空下冷冻干燥即得目标物。