一种油炸薯片中羧甲基赖氨酸含量的检测方法

1.本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种油炸薯片中羧甲基赖氨酸(n
ε-carboxymethyllysine，cml)含量的检测方法。


背景技术：

2.多数食品在热加工的过程中都会产生cml，cml通过食品介质进入人体后会积聚于多个不同的组织器官中，达到一定数量后，会直接影响组织器官的功能，导致机体的病理变化。cml与人体许多疾病的发生密切相关，能促使糖尿病、肾病、动脉粥样硬化等疾病的发展和人体器官的快速衰老。马铃薯中含有丰富的淀粉、蛋白质等生成cml的前体物质，在以马铃薯为原料进行食品加工的过程中，尤其是油炸、焙烤等深加工方式会生成大量的cml。
3.传统的用于检测cml含量的方法主要有酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)、气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，gc-ms)、反相-高效液相色谱法(reversed phase-high performance liquid chromatography, rp-hplc)、液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry, lc-ms)和荧光传感检测法等，目前这些方法都有一定的局限性。由于样品基质比较复杂，elisa法容易受到杂质的干扰，特异性抗体选择比较困难，定量分析结果不可靠。gc-ms法和rp-hplc法中为了提高检测的灵敏度并降低检测限都需要对样品进行复杂的柱前衍生化处理。lc-ms法中由于存在“柱外效应”现象，如果流动相的流型发生变化，样品的滞留和扩散会使色谱峰显著变宽，导致柱效率降低。荧光传感检测法虽然前处理简单、快速高效和灵敏度高，但是该方法的检出限(limit of detection，lod)较高，对于食品中痕量cml的检测能力还有待进一步提升。另外，由于cml在c
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色谱柱中保留性很差，需要通过在流动相中添加三氟乙酸或九氟戊酸等离子对试剂以增加保留性，但这些试剂在增加保留时间的同时会因抑制离子化效率而导致检测灵敏度降低，并且很难从色谱柱上清洗干净而对色谱柱造成损害。目前国内外尚无推荐使用的食品中cml含量检测的标准方法。
4.中国专利cn103293243公开了一种食品中cml含量的检测方法，并具体公开了脱脂、硼氢化钠还原、三氯乙酸沉淀蛋白质、110
°
c蛋白质盐酸(6.0mol/l)水解、9-芴甲基氯甲酸酯衍生化、固相萃取和复溶等预处理步骤。但是此方法耗时较长、操作步骤繁琐、并且由于蛋白质水解使用的盐酸浓度和温度较高，会对实验室造成环境污染和仪器设备造成腐蚀。研究开发一种操作简便、环境友好、准确和快速的cml含量的检测新方法迫在眉睫。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术中耗时较长、操作步骤繁琐、浓酸对环境污染并对仪器腐蚀严重等问题，本发明目的是提供一种与目前存在的方法相比具有明显优势的，一种油炸薯片中cml含量的检测方法。
6.本发明是以下述方式实现的：一种油炸薯片中羧甲基赖氨酸(n
ε-carboxymethyllysine，cml)含量的检测方法，
具体包括以下步骤：（1）称取样品并对其进行脱脂处理；（2）用磷酸盐缓冲溶液配制酸性蛋白酶溶液；（3）向装有脱脂后样品的离心管中加入酸性蛋白酶溶液，然后加入同位素内标，最后将离心管密封后涡旋混匀，使样品水解；（4）样品水解完成后进行离心收集上清液，然后用甲酸溶液浸提样品中的残留物并离心收集上清液；将样品水解后的上清液和甲酸溶液浸提后的上清液混合过滤得预处理样品液；（5）采用mcx固相萃取柱对预处理样品液进行固相萃取净化得到洗脱液，然后将洗脱液吹干、复溶和过滤得到待测溶液；（6）采用超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，uplc-ms/ms)对待测溶液进行检测，通过内标法曲线计算cml的含量。
7.所述步骤（1）脱脂步骤为：将油炸薯片样品研磨至粒径为0.4-0.5 mm，向样品中加入正己烷涡旋混匀并离心，离心速度为3500-4500 r/min，时间为2-4 min，弃去正己烷，上述正己烷脱脂过程共执行3次，最后将样品于35℃-40℃下用氮气吹干以挥发除去正己烷。
8.所述步骤（2）磷酸盐缓冲溶液由0.15-0.25 mol/l的h3po4溶液和浓度为0.15-0.25 mol/l的nah2po4溶液配制而成，该磷酸盐缓冲溶液的ph值为2-4。
9.所述步骤（2）中酸性蛋白酶的酶活力为45000-55000 u/g，其在溶液中浓度为0.035-0.045 g/ml。
10.所述步骤（3）中向装有脱脂后样品的离心管中加入酸性蛋白酶溶液后，样品中酸性蛋白酶的含量为4500-5500 u/g；cml的同位素内标物为氘代羧甲基赖氨酸（n
ε-carboxymethyllysine-d4，cml-d4），其浓度为4.0-6.0 μg/ml。
11.所述步骤（3）中离心管密封后涡旋混和均匀，于35℃-40℃水浴中水解10-14 h，每25-35 min涡旋混匀1次，使之水解均匀。
12.所述步骤（4）中离心转速为3500-4500 r/min，离心时间为3-5 min。
13.所述步骤（4）中甲酸溶液的体积浓度为4%-6.0%，甲酸溶液浸提样品中的残留物后在3500-4500 r/min离心3-5 min，重复至少3次。
14.所述步骤（5）净化方法为：对mcx固相萃取柱进行预处理后，将步骤（4）得到的预处理样品进行上样，然后用体积浓度为4%-6.0%甲酸水溶液淋洗，真空抽干；再用甲醇淋洗，真空抽干；弃去全部流出液；最后用体积浓度为12%-18%氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干；收集洗脱液，洗脱液于35℃-40℃下用氮气吹干，超纯水复溶，得到净化后的待测液。
15.所述步骤（6）中的液相色谱条件为，仪器：acquity超高效液相色谱仪；色谱柱：acquity beh amide hilic柱(2.1
×
100 mm，1.7
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m)；保护柱：acquity beh amide vanguard柱(1.7
ꢀµ
m)；柱温：35℃；进样量：5 μl；运行时间：7.0 min；流动相：a相为0.1%甲酸水溶液，b相为乙腈；以0.30 ml/min进行梯度洗脱，洗脱参数如下：0-2.0 min 10% a, 2.0-6.0 min 20% a, 6.0-6.1 min 90% a, and 6.1-7.0 min 10% a；质谱条件为，仪器：xevo tq三重四级杆串联质谱仪；离子源模式：esi

；监测模式：mrm；毛细管电压：2.0 kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：650 l/
h；锥孔气流速：50 l/h；脱溶剂气和锥孔气体为氮气；碰撞气体为氩气，cml和cml-d4的质谱参数如下：cml m/z 205.22-m/z 84.00定性，m/z 205.22-m/z 130.00定量；cml-d
4 m/z 209.00-m/z 87.70定性。
16.相对于现有技术，本发明避免了使用高浓度盐酸和高温水解蛋白质的方法，而采用40℃的酸性蛋白酶水解，此方法对实验室环境友好，也不会对仪器设备造成腐蚀。由于酶水解温度较盐酸水解温度大大降低，此温度下由中间产物重新生成的cml含量极低，所以也省去了硼氢化钠还原中间产物的操作步骤。本发明采用hilic柱代替c
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色谱柱，保留时间达到4.68 min，样品预处理步骤因此避免了使用影响检测灵敏度和损害色谱柱的离子对试剂，及繁琐的9-芴甲基氯甲酸酯衍生化操作。本发明尤其适用于油炸薯片等含结合态cml较高，而游离态cml较低的食品中cml含量的检测。本发明不但操作方法简便，而且具有准确度高、灵敏度好和精确度高的特点。
附图说明
17.图1cml的内标法标准曲线。
18.图2cml和cml-d4的一级质谱图。
19.图3cml和cml-d4的二级质谱图。
20.图4cml标准品的总离子流色谱图。
21.图5cml标准品的定量子离子流色谱图。
22.图6cml-d4内标物子离子流色谱图。
23.图7 实施例1中样品1的cml定量子离子流色谱图。
24.图8 实施例1中样品1的 cml-d4内标物子离子流色谱图。
25.图9 实施例1中样品2的cml定量子离子流色谱图。
26.图10 实施例1中样品2的 cml-d4内标物子离子流色谱图。
27.图11 实施例1中样品3的cml定量子离子流色谱图。
28.图12 实施例1中样品3的cml-d4内标物子离子流色谱图。
29.图13 实施例1中样品4的cml定量子离子流色谱图。
30.图14 实施例1中样品4的 cml-d4内标物子离子流色谱图。
31.图15 实施例1中样品5的cml定量子离子流色谱图。
32.图16 实施例1中样品5的 cml-d4内标物子离子流色谱图。
33.图17 对比例1中样品1的cml定量子离子流色谱图。
34.图18 对比例1中样品1的 cml-d4内标物子离子流色谱图。
35.图19 对比例1中样品2的cml定量子离子流色谱图。
36.图20 对比例1中样品2的 cml-d4内标物子离子流色谱图。
37.图21 对比例1中样品3的cml定量子离子流色谱图。
38.图22 对比例1中样品3的cml-d4内标物子离子流色谱图。
39.图23 对比例1中样品4的cml定量子离子流色谱图。
40.图24 对比例1中样品4的 cml-d4内标物子离子流色谱图。
41.图25 对比例1中样品5的cml定量子离子流色谱图。
42.图26 对比例1中样品5的 cml-d4内标物子离子流色谱图。
具体实施方式
43.实施例1取5种不同品牌的油炸薯片采用以下处理方法分别对其进行预处理：（1）称取样品并对样品脱脂处理：称取0.10 g(精确至1.0 mg)研磨至粒径约为0.5 mm的油炸薯片样品，置于容积为10 ml聚丙烯离心管中。向样品中加入5.0 ml正己烷，充分涡旋混匀后，以4000 r/min离心3.0 min，弃去正己烷层；上述正己烷脱脂过程共执行3次，以彻底除去脂肪，最后样品于40℃下用氮气吹干以挥发除去正己烷，得到脱脂后的样品；（2）用磷酸盐缓冲溶液配制酸性蛋白酶溶液：用22.0 ml浓度为0.20 mol/l的h3po4溶液和900.0 ml浓度为0.20 mol/l的nah2po4溶液配制ph值为3.0的磷酸盐缓冲溶液；取1.00 g(精确至1.0 mg)的酸性蛋白酶(酶活力为50000 u/g)用该磷酸盐缓冲溶液溶解，定容至25 ml的容量瓶中，配制成浓度为0.04 g/ml的酸性蛋白酶溶液；（3）向装有脱脂后样品的离心管中加入酸性蛋白酶溶液，然后加入同位素内标物cml-d4并将离心管密封后涡旋混匀，使样品水解：向装有脱脂后样品的离心管中加入250
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l上述浓度为0.04 g/ml酸性蛋白酶溶液，同时加入50
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l浓度为5.0 μg/ml的cml-d4同位素内标溶液，使最后待测溶液中cml-d4的理论浓度为10.0 ng/ml。最后加入h3po
4-nah2po4磷酸盐缓冲溶液，使离心管中液体总体积补足至4.0 ml。离心管密封后涡旋混和均匀，于40℃水浴中水解12 h，每30.0 min涡旋混匀1次，使样品水解均匀；（4）样品水解完成后进行离心收集上清液，然后用5.0%的甲酸溶液浸提样品中的残留物并离心收集上清液；将样品水解后的上清液和甲酸溶液浸提后的上清液混合过滤得预处理样品液：水解结束后，离心管首先于4000 r/min离心3 min，收集上清液；然后加5.0 ml体积浓度为5.0%甲酸水溶液浸提残留物，涡旋混匀后于4000 r/min离心3 min，收集上清液；共用5.0 ml浓度为5.0%甲酸水溶液浸提3次；4次离心所得的所有上清液，全部收集至25 ml容量瓶中，并用5.0%甲酸水溶液定容至25 ml；定容后的溶液用滤纸过滤1次，以除去颗粒较大的杂质，得到滤液为预处理样品液；（5）采用mcx固相萃取柱对预处理样品液进行固相萃取净化得到洗脱液：mcx固相萃取柱用3.0 ml甲醇活化和3.0 ml水平衡后，将1.0 ml预处理样品液以1-2滴/秒的速度过该柱，待样液完全流出后，用3.0 ml浓度为5.0%甲酸水溶液淋洗，真空抽干；再用3.0 ml甲醇淋洗，真空抽干；弃去全部流出液。最后用5.0 ml浓度为15.0%氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并用试管收集洗脱流出液。将洗脱液于40℃下用氮气吹扫浓缩干燥，最后用1.0 ml水溶解试管中的残留物，涡旋混匀，过0.22 μm聚醚砜针式过滤器于2.0 ml的进样小瓶中，得到待测溶液；采用超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，uplc-ms/ms)对待测溶液进行检测，通过cml-d4同位素内标法曲线计算cml的含量。
44.液相色谱条件为，仪器：acquity超高效液相色谱仪；色谱柱：acquity beh amide hilic柱(2.1
×
100 mm，1.7
ꢀµ
m)；保护柱：acquity beh amide vanguard柱(1.7
ꢀµ
m)；柱温：35℃；进样量：5 μl；运行时间：7.0 min；流动相：a相为0.1%甲酸水溶液，b相为乙腈；以0.30 ml/min进行梯度洗脱，洗脱参数如下：0-2.0 min 10% a, 2.0-6.0 min 20% a, 6.0-6.1 min 90% a, and 6.1-7.0 min 10% a。
45.质谱条件为，仪器：xevo tq三重四级杆串联质谱仪；离子源模式：esi

；监测模式：mrm；毛细管电压：2.0 kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：650 l/h；锥孔气流速：50 l/h；脱溶剂气和锥孔气体为氮气；碰撞气体为氩气，cml和cml-d4的质谱参数如下：cml m/z 205.22-m/z 84.00定性，m/z 205.22-m/z 130.00定量；cml-d
4 m/z 209.00-m/z 87.70定性。
46.使用上述uplc-ms/ms检测系统，对样品1-5进行检测，得到的图7、图9、图11、图13和图15的cml定量子离子流色谱图，对应得到图8、图10、图12、图14和图16的cml-d4内标物子离子流色谱图。cml定量子离子流色谱图中有效峰面积值是电脑上检测系统软件积分计算出的有效峰面积值：样品1是6287.56 mv
·
s，样品2是9072.55 mv
·
s，样品3是13713.73 mv
·
s，样品4是8533.08 mv
·
s，样品5是8039.60 mv
·
s；每个样品中cml-d4内标物子离子色谱图的有效峰面积值是：样品1中是3509.42 mv
·
s，样品2中是1531.73 mv
·
s，样品3中是2893.97 mv
·
s，样品4中是3122.41 mv
·
s，样品5中是3340.80 mv
·
s。
47.以样品1为例计算样品中的cml含量：首先进行检测方法的方法学验证得出内标法标准曲线，具体过程为：准确移取系列体积浓度为100.0 ng/ml的cml标准溶液，分别加入50.0 μl的200.0 ng/ml的cml-d4内标物溶液，配制成浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 ng/ml的系列cml标准溶液各1.0 ml，该系列cml标准溶液的每个浓度梯度中cml-d4内标物的含量均为10.0 ng/ml，涡旋均匀，采用uplc-ms/ms方法测定cml的含量。以响应值y(见公式1)对cml浓度x分别为纵坐标和横坐标，绘制cml的内标法标准曲线如图1所示。以标准曲线中最低浓度(1.0 ng/ml)的cml定量子离子色谱图的信噪比(signal intensity s, noise n; s/n)值为基准来计算检出限(limit of detection，lod)和定量限(limit of quantification，loq)。采用s/n=3时对应的cml浓度为方法的lod，s/n=10时对应的cml浓度为方法的loq。
48.ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
公式1。
49.所述cml含量检测方法的线性范围为1.0-50.0 ng/ml。
50.所述cml含量检测方法的lod为0.038 ng/ml，loq为0.127 ng/ml。
51.所述cml含量检测方法的内标法标准曲线如图1所示，本曲线的回归方程和相关系数如下：y=2.4359*x-1.1831，r2=0.9989。
52.在对检测方法进行方法学验证的同时，得到了cml和cml-d4的一级(母离子)质谱图如图2所示，cml和cml-d4的二级(子离子)质谱图如图3所示，cml标准品的总离子流色谱图如图4所示，cml标准品的定量子离子流色谱图如图5所示，cml-d4内标物子离子流色谱图如图6所示。
53.样品1的cml定量子离子色谱峰面积为6287.56 mv*s，cml-d4内标物子离子色谱峰峰面积为3509.42 mv*s。然后根据计算得出样品1中的响应值，，将响应值带入到内标法标准曲线回归方程y=2.4359
·
x-1.1831中，x=7.84 ng/ml，样品中的cml含量为x
·
25*10/1000，即1.96
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g/g。
54.使用上述相同方法计算出样品2-5中cm l的浓度，具体结果如表1所示。
55.表1 实施例1的油炸薯片中cml含量的检测结果检测方法准确度的评价：准确度是指该检测方法多次测定结果的平均值与真实值接近的程度，一般用回收率表示。在样品3的酶水解步骤按照表2所示的添加量分别加入3个不同浓度水平的cml标准品溶液和50
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l浓度为5.0 μg/ml的cml-d4同位素内标溶液，重复测定3次，计算各加标水平的平均回收率和相对标准偏差(relative standard deviation，rsd)见表2。由表2可知，该检测方法的回收率为84.26%-104.40%，rsd为3.26%-5.74%。对于方法学验证中的准确度而言，通常可以接受的回收率范围在80.00%-120.00%之间，可以接受的rsd范围是10.00%以下，可见本方法回收率符合要求，准确度较高，可以满足油炸薯片中cml含量的定量检测要求。
56.表2 油炸薯片中cml含量检测的加标回收率检测方法精密度的评价：采用重复性试验和平行性试验来验证检测方法的精密度，一般用rsd表示。重复性试验是在短时间内对一个样品的同一试样进行6次重复测定，计算各检测结果之间的rsd。平行性试验是对同一样品的6个平行试样进行测定，计算各检测结果之间的rsd，对样品2进行重复性试验和平行性试验的验证。从表3可以看出样品2的重复性试验的rsd为4.19%，从表4可以看出样品2的平行性试验的rsd值为8.57%。rsd值均在10.00%以下，证明该方法精密度良好，可以满足油炸薯片中cml含量的定量检测要求。
57.表3 油炸薯片中cml含量检测的重复性试验结果
ml甲醇活化和3.0 ml水平衡后，将1.0 ml预处理样品液以1-2滴/秒的速度过该柱，待样液完全流出后，用3.0 ml浓度为5.0%甲酸水溶液淋洗，真空抽干；再用3.0 ml甲醇淋洗，真空抽干；弃去全部流出液。最后用5.0 ml浓度为15.0%氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并用试管收集洗脱流出液。将洗脱液于40℃下用氮气吹扫浓缩干燥，最后用1.0 ml水溶解试管中的残留物，涡旋混匀，过0.22 μm聚醚砜针式过滤器于2.0 ml的进样小瓶中，得到待测溶液；采用uplc-ms/ms对待测溶液进行检测，通过cml-d4同位素内标法曲线计算cml的含量。
59.液相色谱条件为，仪器：acquity超高效液相色谱仪；色谱柱：acquity beh amide hilic柱(2.1
×
100 mm，1.7
ꢀµ
m)；保护柱：acquity beh amide vanguard柱(1.7
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m)；柱温：35℃；进样量：5 μl；运行时间：7.0 min；流动相：a相为0.1%甲酸水溶液，b相为乙腈；以0.30 ml/min进行梯度洗脱，洗脱参数如下：0-2.0 min 10% a, 2.0-6.0 min 20% a, 6.0-6.1 min 90% a, and 6.1-7.0 min 10% a。
60.质谱条件为，仪器：xevo tq三重四级杆串联质谱仪；离子源模式：esi

；监测模式：mrm；毛细管电压：2.0 kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：650 l/h；锥孔气流速：50 l/h；脱溶剂气和锥孔气体为氮气；碰撞气体为氩气，cml和cml-d4的质谱参数如下：cml m/z 205.22-m/z 84.00定性，m/z 205.22-m/z 130.00定量；cml-d
4 m/z 209.00-m/z 87.70定性。
61.检测结果：对与实施例1相同的5种不同品牌的油炸薯片样品，以对比例1中样品的预处理方法 (1)-(4) 步骤对样品进行预处理，并采用与实施例1完全相同的uplc-ms/ms检测条件对cml的含量进行检测，检测结果见表5。图17、图19、图21、图23和图25为对比例1的cml定量子离子流色谱图，图18、图20、图22、图24和图26为对比例1的cml-d4内标物子离子流色谱图。采用实施例1中的计算方法得出对比例1样品中cml的含量见表5。对比表1和表5可以看出，实施例1中1-5样品的cml定量子离子和cml-d4内标物子离子的峰面积均大于对比例1中对应样品的峰面积，从图7-图26的色谱图中可以看出，实施例1中cml定量子离子和cml-d4内标物子离子色谱峰也较对比例1中的峰形好，并且基线噪声小。除了实施例1中样品1的检测结果比对比例1的检测结果稍低外，实施例1中其他样品的检测结果均高于对比例1。并且本发明中cml含量检测的方法节约时间和环境友好，准确度和精密度好。
62.表5 对比例1的油炸薯片中cml含量的检测结果因为uplc-ms/ms检测系统对进样的要求较高，本发明样品预处理方法同样适用于
lc-ms、lc-ms/ms和hplc-ms/ms检测系统，自然也适用于其它检测方法样品的预处理。
63.上文所述的一系列内容仅是针对本发明可行的实施例的具体描述，并非用以限制本发明的保护范围。任何不经过创造性劳动所做的变化或替换，都涵盖在本发明的保护范围之内。