用于递送至肝脏的galnac-寡核苷酸偶联物及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及双触角n-乙酰基-d-半乳糖胺(galnac)配体-寡核苷酸偶联物，以及用于制备该偶联物的方法。
背景技术：
2.作为能够与去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)结合的配体，与n-乙酰基-d-半乳糖胺(galnac)等共价结合的核酸疗法(例如反义和sirna)的偶联物已被报道为将寡核苷酸递送至肝脏的肝实质细胞(非专利文献1、专利文献1至9)。在这些报告中，一至三个galnac与一个寡核苷酸结合。此外，非专利文献2描述了其中结合两个galnac的实例。
3.在寡核苷酸的固相合成后的纯化步骤中使用反相hplc的情况下，在固相合成步骤中产生的具有短链长度的寡聚体的保留时间通常接近目标寡聚体的保留时间，并且大规模获得高纯度精炼产物是非常困难的。在寡核苷酸的固相合成中，通常使用其中核苷的5'-羟基被4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmtr)基团保护的核酸单元，且因此位于待合成的寡核苷酸的5'端处的核苷的5'-羟基具有dmtr基团。非专利文献3和4描述了使用dmtr基团的高疏水性的反相柱纯化(在下文中，也称为dmtr-on反相柱纯化；“dmtr-on”表示使用具有在其5'端导入的dmtr基团的寡核苷酸)和使用dmtr-on的离子交换柱纯化(在下文中，也称为dmtr-on离子交换柱纯化)的实例。然而，由于通常通过使dmtr基团脱保护而将galnac单元导入寡核苷酸的5'端处的羟基，因此待合成的偶联物不具有dmtr基团。因此，为了从没有偶联galnac单元的寡核苷酸进行分离/纯化，需要通过hplc进行纯化，这既费力又费时(非专利文献5)。迄今为止，尚未报道使用用于galnac单元-寡核苷酸偶联物的诸如dmtr-on反相柱纯化或dmtr-on离子交换柱纯化的方法的实例。
4.因此，期望开发能够有效地将寡核苷酸递送至肝实质细胞并且在大量生产方面具有有利结构的galnac单元，以及该galnac单元与对疾病具有治疗效果的寡核苷酸的偶联物，以及期望其有效的生产方法。
5.引用列表专利文献专利文献1：国际公开号 wo2009/073809专利文献2：国际公开号 wo2014/076196专利文献3：国际公开号 wo2014/179620专利文献4：国际公开号 wo2015/006740专利文献5：国际公开号 wo2015/105083专利文献6：国际公开号 wo2016/055601专利文献7：国际公开号 wo2017/023817专利文献8：国际公开号 wo2017/084987专利文献9：国际公开号 wo2017/131236非专利文献
非专利文献1：methods in enzymology，1999，第313卷，第297至321页非专利文献2：bioorganic & medicinal chemistry letters 26 (2016) 3690-3693非专利文献3：akta design purification-user manual 18-1124-23 edition ad非专利文献4:organic process research & development 2005，9，212-215非专利文献5:molecules 2017，22，1356。
技术实现要素：
6.发明所要解决的问题在用于使用galnac单元将合成核酸递送至肝脏的研究中常规使用的接头强调使配体位点远离核酸，采用在非常长的骨架中具有长直链烷基和环结构的结构，并且还具有在许多情况下具有三个或更多个支链的复杂结构。然而，本发明人的研究新揭示了一个问题，即当浓缩使用这种常规长链烷基接头的偶联物时，在高浓度溶液中形成胶束，并且难以制备合适的剂量。另外，在常规方法中，还没有确立对结合有galnac单元的寡核苷酸进行柱分离的方法，并且难以大量生产。
7.用于解决的问题的手段作为用于解决上述问题的深入研究的结果，本发明人发现具有本发明的接头结构的双触角galnac单元与寡核苷酸的偶联物即使在高剂量溶液中也表现出良好的溶解性，同时保持有效递送至肝实质细胞的能力。此外已发现，与在galnac的6位羟基上具有高度疏水性保护基团(例如4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmtr)基团)的galnac单元结合的寡核苷酸可以通过疏水性树脂柱以更好的效率进行纯化，从而完成本发明。因此，可以预期大规模的偶联物的离子交换柱纯化或dmtr-on反相柱纯化是容易的。
8.本发明的主旨如下。
9.(a1) 具有预期在肝实质细胞中具有药理作用的核酸序列的寡核苷酸与双触角galnac单元的偶联物或其药学上可接受的盐，其中，在偶联物中，双触角galnac单元由下式表示并与寡核苷酸的5'端或3'端结合，并且其中偶联物在体内特异性地递送至肝实质细胞：[式1]其中w是由下式表示的基团：[式2]
g代表5-乙酰氨基-2-羟甲基-3,4-二羟基四氢吡喃-6-基(galnac)；z代表氧原子或硫原子；l1和l2中的一个表示亚甲基(ch2)，而另一个表示不插入原子；o、q、r和s各自独立地表示0或1；n表示1至15的整数；m表示0至5的整数；并且v表示1至7，条件是n为1时，则m为0至5的整数，并且n为2至15的整数时，则m为0。
[0010]
(a2) 根据(a1)的偶联物或其药学上可接受的盐，其中在双触角galnac单元的式中，o和q各自为0。
[0011]
(a3) 根据(a1)或(a2)的偶联物或其药学上可接受的盐，其中双触角galnac单元与寡核苷酸的5'端结合。
[0012]
(a4) 根据(a1)的偶联物或其药学上可接受的盐，其中双触角galnac单元是由下式中的任一个表示的基团：[式3][式4]
[式5][式6]
[式7](a5) 包含根据(a1)至(a4)中任一项的偶联物或其药学上可接受的盐的药物。
[0013]
另外，本发明提供以下的制备方法和作为该制备方法的中间体使用的包含含有疏水性保护基团的galnac单元的化合物或偶联物。
[0014]
(b1) 一种用于制备寡核苷酸与galnac单元的偶联物的方法，包括以下步骤：a：合成包含与寡核苷酸的5'端或3'端结合的由下式表示的含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构的偶联物：[式8]其中ra、rb和rc中的至少一个为疏水性保护基团，而其余为氢原子或在游离条件下
会被去除的保护基团；x1和x2各自独立地表示接头结构，其可以在x1和x2之间分支；t为接头结构中的支链的数量并且为1至10的整数；并且y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的键。
[0015]
b：使含有步骤a的产物的溶液通过填充有由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂的柱，并且使水性洗涤溶液通过该柱；和c：在步骤b之后从柱上洗脱寡核苷酸的步骤。
[0016]
(b2) 根据(b1)的制备方法，其中，疏水性保护基团是在碱性条件或酸性条件下被去除的保护基团，优选在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，更优选任选取代的三苯甲基或任选取代的甲硅烷基。
[0017]
(b3) 根据(b1)的制备方法，其中包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构与位于寡核苷酸的5'端的核苷的5位处的羟基结合。
[0018]
(b4) 根据(b1)的制备方法，其中在包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构中，ra为疏水性保护基团，rb和rc各自为氢原子，并且t为1至3的整数。
[0019]
(b5) 根据(b1)的制备方法，其中由于疏水性相互作用而具有吸附性的树脂为选自苯乙烯-二乙烯基苯吸附树脂、苯乙烯-二乙烯基苯改性吸附树脂、甲基丙烯酸类吸附树脂以及酚类吸附树脂中的任一种。
[0020]
(b6) 根据(b1)的制备方法，其中填充有由于疏水性相互作用而具有吸附性的树脂的柱是离子交换柱或反相柱。
[0021]
(b7) 根据(b1)的制备方法，其中步骤a包括以下步骤：a1：在支持物上合成所需的寡核苷酸，该支持物能够通过重复地对位于5'端的核苷的5'-羟基的保护基团进行脱保护和使用支持物缩合核苷以延长寡核苷酸的链，使寡核苷酸在从3'端至5'端的方向上延伸，其中所选择的保护基团是除所用的核苷的5'-羟基的保护基团之外的、在允许切割寡核苷酸的3'端与支持物之间的结合的条件(在下文中称为“游离条件”)下进行脱保护的保护基团，该保护基团被选作所用的核苷的5'-羟基的保护基团以外的保护基团，并且在游离条件下不会发生脱保护的保护基团被选作核苷的5'-羟基的保护基团；a2：将含有疏水性保护基团的galnac单元导入位于在支持物上合成的寡核苷酸的5'端的核苷的5'-羟基中，其中选择在游离条件下不会发生脱保护的疏水性保护基团；和a3：在游离条件下用溶液处理在步骤a2中得到的支持物以得到含有疏水性保护基团的galnac单元与寡核苷酸的偶联物溶液。
[0022]
(b8) 根据(b1)的制备方法，在步骤b之后且在步骤c之前，包括使吸附在柱上的偶联物的疏水性保护基团脱保护。
[0023]
(b9) 根据(b1)的制备方法，其中游离条件为碱性，并且疏水性保护基团是在酸性条件下被去除的保护基团。
[0024]
(b10) 根据(b1)的制备方法，其中包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构由下式中的任一项表示：[式9]
其中r1表示在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，x表示接头结构，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的原子键，并且下同：[式10][式11]
[式12][式13]
[式14]
[式15][式16]
[式17][式18][式19]
(b11) 由下式表示的化合物：[式20]其中ra、rb和rc中的至少一个为疏水性保护基团，而其余为在游离条件下会被去除的保护基团；x1和x2各自独立地表示接头结构，其可以在x1和x2之间分支；t为接头结构中的支链的数量并且为1至10的整数；并且y表示亚磷酰胺基团(优选由-p(och2ch2cn)n(ch(ch3)2)2或-p(och3)n(ch(ch3)2)2表示的基团)或h-膦酸酯基团(-ph(=o)(oh))；或其盐。
[0025]
(b12) 根据(b11)的化合物或其盐，其中ra是在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，rb和rc各自是乙酰基，y表示亚磷酰胺基或h-膦酸酯基团，并且t为1至3的整数。
[0026]
(b13) 根据(b11)或(b12)的化合物或其盐，其由下式中的任一个表示：[式21]其中r1为在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，并且y表示亚磷酰胺基或h-膦酸酯基团，并且下同：[式22]
[式23][式24][式25]
(b14) 根据(b11)或(b12)的化合物或其盐，其由下式中的任一个表示：[式26]其中r1表示在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，x表示接头结构，并且y表示亚磷酰胺基团或h-膦酸酯基团，并且下同：[式27][式28]
[式29][式30]
和[式31](b15) 根据(b11)至(b14)中任一项的化合物或其盐，其中疏水性保护基团为任选取代的三苯甲基，并且亚磷酰胺基团为-p(och2ch2cn)n(ch(ch3)2)2或-p(och3)n(ch(ch3)2)2。
[0027]
(b16) 包含与寡核苷酸的5'端或3'端结合的由下式表示的包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构的偶联物或其盐：[式32]
其中，ra、rb和rc中的至少一个为疏水性保护基团，并且其余为氢原子或在游离条件下会被去除的保护基团；x1和x2各自独立地表示接头结构，其可以在x1和x2之间分支；t为接头结构中的支链的数量并且为1至10的整数；并且y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的键。
[0028]
(b17) 根据(b16)所述的偶联物或其盐，其中包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构由下式中的任一项表示：[式33]其中r1表示在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的原子键，并且下同：[式34][式35]
[式36][式37](b18) 根据(b16)的偶联物或其盐，其中包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构由下式中的任一项表示：[式38]
其中r1表示在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，x表示接头结构，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的原子键，并且下同：[式39][式40]
[式41][式42]
和[式43]
(b19) 根据(b16)至(b18)中任一项的偶联物或其盐，其中疏水性保护基团是任选取代的三苯甲基，并且y表示通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键与位于寡核苷酸的5'端的核苷的5'-羟基结合的原子键。
[0029]
发明效果本发明的偶联物实现了各种寡核苷酸向肝脏的适当递送及其高水溶性。此外，它通过建立一种用于galnac单元与寡核苷酸的偶联物的dmtr-on柱纯化的方法来实现大规模生产。这些使得增加剂量以增强药理作用和制备用于应用长期连续制剂的高浓度化学溶液成为可能，从而使核酸治疗的产品设计能够满足各种需要。
附图说明
[0030]
[图1] 图1是显示当将实施例8至14的化合物施用于异源敲入小鼠时肝脏中g6pc mrna异常剪接的校正效果的图。通过qrt-pcr相对定量地评价校正后的异源敲入小鼠肝脏中具有异常剪接的g6pc mrna的量(通过肌动蛋白mrna的量校正)。y轴表示以生理盐水施用组为1时施用组中正常g6pc mrna表达量的相对值(rq：相对量；mpk：mg/kg)。
[0031]
[图2] 图2是显示当将实施例15至23的化合物施用于异源敲入小鼠时肝脏中g6pc mrna异常剪接的校正效果的图。通过qrt-pcr定量地评价校正后的异源敲入小鼠肝脏中具有异常剪接的g6pc mrna的量(通过肌动蛋白mrna的量校正)。y轴与图1中的相同。rq：相对量；mpk：mg/kg。
[0032]
[图3] 图3是显示当将apob-aso(白色柱)和apob-aso偶联物(填充柱)添加到细胞中时apob mrna在人原代培养肝细胞中的降解效果的图。细胞中apob mrna的量通过qrt-pcr相对定量地评价(通过肌动蛋白mrna的量校正)。y轴表示以未处理的人原代培养肝细胞
中apob mrna的量为100%时添加组中的相对值(%)。
[0033]
[图4] 图4是dmtr-on离子交换柱纯化步骤和色谱图的相关图。
[0034]
[图5] 图5是在dmtr-on离子交换柱纯化(检测波长：260nm)中在galnac的羟基上具有dmtr基团的偶联物的色谱图。
[0035]
[图6] 图6是在dmtr-on离子交换柱纯化(检测波长：260nm)中在寡核苷酸附近具有dmtr基团的偶联物的色谱图。
具体实施方式
[0036]
在下文中，将详细描述本发明的实施方案。在本说明书中，术语“偶联物”是指其中galnac单元与寡核苷酸的5'端和/或3'端结合的化合物。
[0037]
在本说明书中，术语“galnac单元”是指含有能够与肝脏的肝实质细胞上的去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)结合的n-乙酰基-d-半乳糖胺(galnac)的部分结构。galnac单元含有磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团，用于将直链或支链接头结构与寡核苷酸结合。这样的含有用于结合的一个磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团的结构单元可称为“galnac单元”。除非另有说明，一个galnac单元中包含的galnac的数量没有限制，并且可以采用本说明书中已知和公开的那些。只要保持与asgpr结合的能力，就可以修饰galnac的结构。此外，还包括在制备过程中导入的具有保护基团的galnac。
[0038]
在本说明书中，除非另有说明，双触角galnac单元是指由上式(a1)表示的galnac单元。
[0039]
在本说明书中，术语“寡核苷酸”是指链长为100个碱基或更短的可合成核酸，其可以是单链或双链的。如后所述，可以根据目的选择性地使用dna、rna、天然核酸、修饰核酸等作为所要采用的核酸，并且这些核酸可以混合在一个寡核苷酸中。
[0040]
在本说明书中，术语“游离条件”是指在寡核苷酸的合成过程中，当支持物与寡核苷酸之间的结合被切割以从支持物游离寡核苷酸时所采用的处理条件。在通用固相合成中，游离条件为碱性。
[0041]
在本发明中，“疏水性保护基团”是指可以作为羟基的保护基团使用的、具有高度疏水性的结构以及在游离条件下不会被去除的保护基团。例如，当游离条件为碱性时，优选在酸性条件下被去除的保护基团，而当游离条件为酸性时，优选在碱性条件下被去除的保护基团。
[0042]
在本说明书中，术语“亚磷酰胺基团”是在核酸合成中采用的用于亚酰胺试剂的由-p(or)n(ch(ch3)2)2(这里的r是c1-c3烷基或氰基-c1-c3亚烷基)表示的官能团。优选地，其实例包括-p(och2ch2cn)n(ch(ch3)2)2和-p(och3)n(ch(ch3)2)2，但不限于这些实例。
[0043]
在本说明书中，“h-膦酸酯基团”是在核酸合成中采用的由-ph(＝o)(oh)表示的官能团或其盐。具有h-膦酸酯基团的化合物可以与-ph(＝o)(o-)一起形成盐。这样的盐的实例可以包括金属盐；所述金属盐包括碱金属盐如钠盐、钾盐和锂盐，碱土金属盐如钙盐和镁盐，铝盐，铁盐，锌盐，铜盐，镍盐和钴盐；胺盐包括无机盐如铵盐和有机盐如叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n,n'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐；无机酸盐包括氢卤化
物如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；有机酸盐包括低级烷烃磺酸盐如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐，芳基磺酸盐如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐，乙酸盐，苹果酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，草酸盐和马来酸盐；以及氨基酸盐如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐，优选有机盐，更优选三乙胺盐。这些盐可以通过已知方法来制备。
[0044]
在本说明书中，核苷酸之间的结合或核苷酸和偶联物的结构中的术语“通过磷酸酯基团结合”和“含有磷酸酯基团的结构”是指两个结构单元以核酸合成中常用的结合方式结合，例如磷酸二酯键或其修饰形式(例如硫代磷酸酯键)，或含有这样的结合方式的结构。
[0045]
《1.寡核苷酸》在本说明书中，术语“核酸”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指含有至少两个单链、双链和三链中的任一种形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。
[0046]
除非另有说明，特定核酸序列隐含地包括保守修饰的突变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、snp和互补序列，并且还包括明确指出的序列。
[0047]
1-1.核酸的种类本发明的核酸可以包括本领域技术人员已知的任何形式。核酸形式的具体实例可以包括单链dna、单链rna和其中混合有dna和rna的单链寡核苷酸。其他形式的核酸的具体实例可以包括双链dna、双链rna、dna-rna杂合多核苷酸和由其中混合有dna和rna的两个寡核苷酸组成的双链多核苷酸。
[0048]
构成本发明的核酸的核苷或核苷酸的实例除了天然核苷或核苷酸以外还包括经化学修饰的修饰核苷或修饰核苷酸。修饰核苷/核苷酸的实例包括糖修饰的核苷/核苷酸、核碱基修饰的核苷/核苷酸、骨架修饰的核苷/核苷酸或其组合(例如，参见nucleic acid research，1997，第25卷，第22号，4429-4443)。
[0049]
在本说明书中，“天然核苷”是指2'-脱氧核苷如2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧胞苷、2'-脱氧-5-甲基胞苷和胸苷，和核糖核苷如腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基胞苷和尿苷。此外，“寡核苷酸”是指由其中核苷的糖部分与磷酸形成酯的化合物构成的寡核苷酸。在本说明书中，寡核苷酸和多核苷酸以相同的含义使用。
[0050]
在本说明书中，2'-脱氧腺苷可称为a
t
，2'-脱氧鸟苷可称为g
t
，2'-脱氧胞苷可称为c
t
，2'-脱氧-5-甲基胞苷可称为5mec
t
，胸苷可称为t
t
，2'-脱氧尿苷可称为u
t
，腺苷可称为a
rt
，鸟苷可称为g
rt
，胞苷可称为c
rt
，5-甲基胞苷可称为5mec
rt
，以及尿苷可称为u
rt
。在本说明书中，2'-脱氧腺苷核苷酸可称为a
p
，2'-脱氧鸟苷核苷酸可称为g
p
，2'-脱氧胞苷核苷酸可称为c
p
，2'-脱氧-5-甲基胞苷核苷酸可称为5mec
p
，胸苷核苷酸可称为t
p
，2'-脱氧尿苷核苷酸可称为u
p
，腺苷核苷酸可称为a
rp
，鸟苷核苷酸可称为g
rp
，胞苷核苷酸可称为c
rp
，5-甲基胞苷核苷酸可称为5mec
rp
，以及尿嘧啶核苷酸可称为u
rp
。
[0051]
在本说明书中，与a
p
对应的代替核苷酸中的磷酸酯而含有的硫代磷酯盐可称为as，与g
p
对应的那些可称为gs，与c
p
对应的那些可称为cs，与5mec
p
对应的那些可称为5mecs，与t
p
对应的那些可称为ts，与u
p
对应的那些可称为us，与a
rp
对应的那些可称为a
rs
，与g
rp
对应的那些可称为g
rs
，与c
rp
对应的那些可称为c
rs
，与5mec
rp
对应的那些可称为5mec
rs
，以及与u
rp
对应的那些可称为u
rs
。
[0052]
在本说明书中，“糖修饰的核苷”是指其中核苷的糖部分被修饰的核苷。糖修饰的
核苷的实例包括2'-o-甲基核苷、2'-o,4'-c-亚乙基核苷(ena)和2'-o,4'-c-亚甲基核苷酸(bna/lna)。
[0053]
其中，2'-o-甲基修饰的实例包括2'-o-甲基核苷和2'-o-甲基核苷酸。与a
rt
对应的那些可称为a
m1t
，与g
rt
对应的那些可称为g
m1t
，与c
rt
对应的那些可称为c
m1t
，与5mec
rt
对应的那些可称为5mec
m1t
，与u
rt
对应的那些可称为u
m1t
，与a
rp
对应的那些可称为a
m1p
，与g
rp
对应的那些可称为g
m1p
，与c
rp
对应的那些可称为c
m1p
，与5mec
rp
对应的那些可称为5mec
m1p
，与u
rp
对应的那些可称为u
m1p
，与a
rs
对应的那些可称为a
m1s
，与g
rs
对应的那些可称为g
m1s
，与c
rs
对应的那些可称为c
m1s
，与5mecs对应的那些可称为5mec
m1s
，以及与u
rs
对应的那些可称为u
m1s
。
[0054]
在本说明书所附的序列表中，“cm”表示2'-o-甲基胞苷，“um”表示2'-o-甲基尿苷，以及“gm”表示2'-o-甲基鸟苷，在每个序列的条目《223》中。
[0055]
在本说明书中，2'-o,4'-c-亚乙基核苷酸单元和“ena单元”是指具有ena的上述核苷和核苷酸中的每一个。可以表达具有ena单元的核苷和核苷酸，例如与a
t
对应的那些可称为a
2t
，与a
p
对应的那些可称为a
e2p
，与as对应的那些可称为a
e2s
，与g
t
对应的那些可称为g
2t
，与g
p
对应的那些可称为g
e2p
，与gs对应的那些可称为g
e2s
，与5mec
t
对应的那些可称为称为c
2t
，与5mec
p
对应的那些可称为c
e2p
，与5mecs对应的那些可称为c
e2s
，与t
t
对应的那些可称为t
2t
，与t
p
对应的那些可称为t
e2p
，以及与ts对应的那些可称为t
e2s
。
[0056]
在本说明书中，2'-o,4'-c-亚甲基核苷酸单元和“2',4'-bna/lna单元”是指具有2',4'-bna/lna的上述核苷和核苷酸中的每一个。可以表达具有2',4'-bna/lna单元的核苷和核苷酸，例如，与a
t
对应的那些可称为a
1t
，与a
p
对应的那些可称为a
e1p
，与as对应的那些可称为a
e1s
，与g
t
对应的那些可称为g
1t
，与g
p
对应的那些可称为g
e1p
，与gs对应的那些可称为g
e1s
，与5mec
t
对应的那些可称为c
1t
，与5mec
p
对应的那些可称为c
e1p
，与5mecs对应的那些可称为c
e1s
，与t
t
对应的那些可称为t
1t
，与t
p
对应的那些可称为t
e1p
，以及与ts对应的那些可称为t
e1s
。
[0057]
1-2.靶基因在本说明书中，只要是其中导入了该靶基因的细胞、组织或个体中的rna(在下文中，其可以称为“导入对象”)，“靶基因”就不特别限定，并且可以是要翻译成蛋白的mrna或不翻译成蛋白的非编码rna。非编码rna的实例包括功能性rna，例如mrna、trna、rrna、mrna型ncrna(mrna类非编码rna)、长链ncrna(长非编码rna)、snrna(小核rna)、snorna(小核仁rna)和mirna(微rna)的非翻译区。具体地，靶基因对于导入对象可以是内源性的，也可以是外源性的，以便通过技术如基因转移来导入。此外，它可以是存在于染色体上的基因或染色体外的基因。外源基因的实例包括源自能够感染导入对象的病毒、细菌、真菌或原生动物的那些，但不限于这些实例。该基因的功能可以是已知的或未知的。
[0058]
靶基因的实例可以包括在肝脏中具有特异性增加的表达的基因和/或在肝脏中具有特定疾病的患者中特异性突变的基因。这样的疾病的实例可以包括心血管疾病(例如，高血压、心脏肥大、心绞痛、动脉硬化和高胆固醇血症)、癌症(例如，肝癌)、呼吸系统疾病(例如，肺炎、支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺病和肺纤维化)、糖尿病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、贫血(例如，与慢性疾病相关的贫血和铁难治性缺铁性贫血)、年龄相关性黄斑变性、免疫系统疾病(例如，自身免疫性疾病、免疫缺陷和白血病)、肝/胆疾病(例如，非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝炎、肝功能衰竭、胆汁淤积和结石)、消化道疾病(例如，溃疡、肠炎和
吸收障碍)、感染、肥胖和纤维化(例如，肝纤维化)。
[0059]
这些疾病的致病基因的实例可以包括纺锤体驱动蛋白(ksp)、血管内皮生长因子(vegf)、转甲状腺素蛋白(ttr)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)、polo类激酶1(plk-1)、apob-100、核糖核苷酸还原酶m2亚基(rrm2)、凝聚素、热休克蛋白27(hsp27)、生存素、真核起始因子-4e(eif-4e)、白细胞介素4受体的α亚基(il-4r-α)、因子xi、因子vii、n-ras、h-ras、k-ras、bcl-2、bcl-xl、her-1、her-2、her-3、her-4、mdr-1、人β-连环蛋白基因、ddx3(dead (asp-glu-ala-asp)框肽3，x连锁)、髓细胞白血病序列1(mcl1)基因、pkr(eif2ak2)、hsp47(serpinh1)、铁调素、活化蛋白c(apc)、信号转导和转录激活因子(stat3)、胶原蛋白、i型、α1(col1a1)、apoc-iii、血管生成素类3蛋白(angptl3)、生长激素受体(ghr)、前激肽释放酶(pkk)、跨膜蛋白酶、丝氨酸6(tmprss6)、脂蛋白(a)、胰高血糖素受体或二酰基甘油酰基转移酶2(dgat2)、血管紧张素原、补体因子b(fb)、氨基乙酰丙酸合酶1(alas1)、抗凝血酶(at)、原发性高草酸尿型1(ph1)、补体的c5成分、α-1抗胰蛋白酶(aat)和肝炎b病毒(hbv)基因组，但不限于这些实例。
[0060]
1-3.双链寡核苷酸在本发明的核酸是对靶基因具有rna干扰作用的核酸的情况下，只要具有该核酸的rna干扰作用，其结构和化学修饰就没有限制。其实例可以包括sirna(例如，参见国际公开号wo 2002/044321，current opinionin chemical biology 570-579)、由其中rna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸组成的aturnai(例如，参见国际公开号wo 2004/015107)、其中具有不同类型的有义链和反义链的核酸与其中dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸中的watson-crick碱基对形成双链的双链寡核苷酸(其将在下文第3-4-1节中描述(例如，参见国际公开号wo 2010/001909))、具有被修饰的寡核苷酸末端的核酸（其将在下文第3-4-1节中描述(例如，参见国际公开号wo 2010/052715)）、以及通过在反义链多核苷酸的5'端和有义链的3'端之间通过接头结合而具有单链并通过在分子中形成watson-crick碱基对而具有双链结构的单链寡核苷酸(其将在3-4-3节中描述(例如，参见国际公开号wo 2012/074038))。
[0061]
在本说明书中，短语“由与靶基因相同的核苷酸序列组成”是指由与靶基因的核苷酸序列的至少一部分相同的序列组成，不仅包括完全相同的序列，还包括基本相同的核苷酸序列，只要对靶基因发挥rna干扰作用和/或基因表达抑制作用即可。短语“由与靶基因互补的核苷酸序列组成”是指由与靶基因的核苷酸序列的至少一部分互补的序列组成，不仅包括完全互补的序列，还包括基本相同的序列，只要对靶基因发挥rna干扰作用和/或基因表达抑制作用即可。此外，在其中靶基因中的snp等已知的情况下，具有这样的突变的序列也包括在同一核苷酸序列中。在本说明书中，将含有与靶基因互补的核苷酸序列且对靶基因具有rna干扰作用和/或基因表达抑制作用的多核苷酸称为用于靶基因的寡核苷酸。
[0062]
本发明的核酸的核苷酸序列没有特别限定，只要其对靶基因具有rna干扰作用和/或基因表达抑制作用即可，但可以通过以下来确定：例如使用计算机软件(例如，genetyx(r)：可从genetyx coorporation获得)基于预期对靶基因具有rna干扰作用的序列确定有义链和反义链的序列，或进一步确认基于选定序列产生的寡核苷酸的rna干扰作用和/或基因表达抑制作用。
[0063]
具有rna干扰作用的双链寡核苷酸的有义链和反义链的链长各自可以是10个核苷
酸至靶基因的开放阅读框(orf)全长的任意长度，只要发挥rna干扰作用和/或基因表达抑制作用，并且优选18个核苷酸至靶基因的开放阅读框(orf)全长的任意长度，进一步优选10至100个核苷酸，进一步优选15至30个核苷酸。
[0064]
在其中使用具有不同类型的有义链和反义链的核酸在其中dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸中形成watson-crick结合的双链寡核苷酸(国际公开号wo 2010/001909)作为具有rna干扰作用的双链寡核苷酸的情况下，有义链优选具有18至21的链长，进一步优选18至19。反义链优选具有19至21的链长，进一步优选21。此外，整个结构不一定具有双链结构，并且也包括在5'和/或3'端部分突出的那些。突出端包括1至5个核苷酸，优选1至3个核苷酸，进一步优选2个核苷酸。此外，最优选的实例是具有其中反义链的寡核苷酸的3'端突出2个核苷酸(突出端结构)并形成18个碱基对的结构的多核苷酸。
[0065]
1-3-1.具有dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸作为要包含在核酸脂质颗粒中的本发明的核酸的实例，可以提及双链寡核苷酸，其中具有不同类型的有义链和反义链的核酸在其中dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸中形成watson-crick结合。
[0066]
这样的双链寡核苷酸的具体实例包括在国际公开号wo 2010/001909、国际公开号wo 2010/001909等中公开的双链寡核苷酸。
[0067]
1-3-2.修饰的双链寡核苷酸在使用具有rna干扰作用的核酸作为要包含在核酸脂质颗粒中的核酸的情况下，可以提及其中寡核苷酸的末端被修饰的核酸作为其实例，只要它具有rna干扰作用即可。例如，一种双链寡核苷酸，可以提及其中在具有rna干扰作用的双链寡核苷酸中反义链的5'端处的磷酸酯基团被修饰为5'-芳基磷酸酯基团(例如，参见国际公开号wo 2010/052715)，例如其中具有不同类型的有义链和反义链的核酸在其中sirna、aturnai或dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸中形成watson-crick结合的双链寡核苷酸(例如，参见国际公开号wo 2010/001909)。
[0068]
这样修饰的双链寡核苷酸的具体实例包括国际公开号wo 2010/052715和国际公开号wo 2015/005253中公开的修饰的双链寡核苷酸。
[0069]
1-4.单链寡核苷酸1-4-1. rna干扰单链核苷酸用于本发明的核酸的实例还包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有用于靶基因的有义链寡核苷酸和具有与有义链互补的核苷酸序列的反义链寡核苷酸，并且具有通过接头在每个反义链寡核苷酸的5'端和有义链寡核苷酸的3'端处形成磷酸二酯结构而结合的单链结构(例如，参见国际公开号wo 2012/074038)，只要它具有rna干扰作用即可。
[0070]
这样的化合物的具体实例可以包括在国际公开号wo 2012/074038和国际公开号wo 2015/005253中描述的那些。
[0071]
1-4-2. 反义核苷酸在由基因突变引起的疾病的治疗中，应用反义核苷酸以治疗可以通过使突变基因的表达正常化或抑制突变基因的表达来治疗的疾病。在抑制基因表达的情况下，使用具有与靶基因的mrna的一部分互补的序列且其中该序列中间的核酸是dna的核苷酸。这样的用于抑制表达的反义核苷酸与靶基因的mrna形成双链。由于所形成的双链中的rna/dna双链
结构在体内被rnaseh特异性分解，所以特异性破坏了靶基因的mrna，从而抑制了靶基因的表达。
[0072]
旨在使基因表达正常化的反义核苷酸的实例包括抑制异常剪接的那些和将基因上的突变位点恢复为正常序列的那些。在将基因上的突变恢复为正常序列的情况下，在反义核苷酸的3'侧包括针对靶基因的有义链中突变位点的5'侧区域的反义序列，以及在其5'侧包括构成核酸酶与其缔合的发夹结构的序列(其中在2个位点彼此互补的序列通过中间接头/环序列连接的序列)。借助于这样的核苷酸，3'侧的反义区域起到引导rna的作用，所述引导rna将核酸酶引导至靶基因的突变位点(mrna或基因组dna的有义链)。这种现象类似于被称为crispr-cas系统的基因组编辑技术，并被广泛认为适用于各种基因编辑。
[0073]
由于基因突变而发生异常剪接的机制如下。在从pre-mrna到成熟mrna的剪接过程中，突变导致剪接因子意外识别并结合至在正常pre-mrna中不结合的位点，使得表达进行异常剪接的mrna，从而引起靶基因表达的蛋白的功能失败或表达失败。当反义核苷酸与突变pre-mrna上被剪接因子错误识别的区域结合时，剪接因子无法识别该区域，且因此抑制异常剪接。由基因突变引起的异常剪接引起的疾病的实例包括抑制由下文详述的1a型糖原贮积病的g6pc基因中的c.648g》t突变引起的异常剪接的反义寡核苷酸，以及可以提及的用于治疗各种已知疾病的其他反义寡核苷酸。
[0074]
本发明提供了一种能够在mrna水平修复ia型糖原贮积病患者的具有c.648g》t突变的g6pc基因并表达正常g6pc蛋白的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。本发明的寡核苷酸是具有15至30个由与具有c.648g》t突变的g6pc基因的cdna互补的核苷酸序列组成的碱基的寡核苷酸，并且由与包含具有c.648g》t突变的g6pc基因的外显子5的5'端的第82位点至第92位点中任何一个的区域互补的序列组成。
[0075]
在患有ia型糖原贮积病的患者中，具有c.648g》t突变的患者可以在本发明中被靶向。不仅可以靶向具有c.648g》t突变的纯合子患者，还可以靶向具有c.648g》t突变和其他突变的复合杂合子患者。
[0076]
g6pc基因的c.648g》t突变是智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸从g到t的突变。它位于外显子5的5'端的第86位。本发明的寡核苷酸可以由与具有c.648g》t突变的g6pc基因的外显子5的5'端的第82位点至第92位点中的任何一个的区域互补的序列组成，优选地由与包含第92位点的区域互补的序列组成。
[0077]
具有15至30个由与具有c.648g》t突变的g6pc基因的cdna互补的核苷酸序列组成的碱基并且由与具有c.648g》t突变的g6pc基因的外显子5的5'端的第82位点至第92位点中的任何一个的区域互补的序列组成的寡核苷酸的实例，可包括含有seq id nos：1至32、40至42和44至48的任何序列的全部或一部分的那些(假设在序列中t或t可以是u或u，或者u或u可以是t或t)。在本发明中，术语“序列的一部分”通常是整个序列中的80％或更多，优选85％，进一步优选90％，最优选94％或更多。本发明的寡核苷酸适当地具有15至30，优选15至21，更优选15至18个碱基。
[0078]
构成本发明的寡核苷酸的核苷酸可以是天然dna、天然rna、dna/rna嵌合体以及它们的修饰形式中的任何一种，但优选核苷酸中的至少一种是修饰核苷酸。
[0079]
本发明中的修饰核苷酸的实例可以包括其中糖被修饰(例如，其中d-呋喃核糖是
2'-o-烷基化的那些，其中d-呋喃核糖是2'-o,4'-c-亚烷基化的的那些，以及其中d-呋喃核糖是2'-,4'-交联的那些)的那些，其中磷酸二酯键被修饰(例如，硫代化)的那些，其中碱基被修饰的那些，以及它们的组合。其中构成反义寡核苷酸的至少一个d-呋喃核糖被2'-o-烷基化或2'-o,4'-c-亚烷基化的那些可以预期具有比天然核苷酸(即寡dna和寡rna)更高的治疗效果，因为它们与rna的高结合力和对核酸酶的高耐受性。此外，其中构成寡核苷酸的至少一个磷酸二酯键被硫代化的那些也可以预期具有比天然核苷酸(即，寡dna和寡rna)更高的治疗效果，因为它们对核酸酶的高耐受性。含有上述修饰的糖和修饰的磷酸二酯键二者的寡核苷酸对核酸酶具有更高的耐受性，且因此可以预期具有更高的治疗效果。
[0080]
本发明的寡核苷酸中的糖修饰的实例可以包括d-呋喃核糖的2'-o-烷基化(例如，2'-o-甲基化、2'-o-氨基乙基化、2'-o-丙基化、2'-o-烯丙基化、2'-o-甲氧基乙基化、2'-o-丁基化、2'-o-戊基化和2'-o-炔丙基化)、d-呋喃核糖的2'-o,4'-c-亚烷基化(例如，2'-o,4'-c-亚乙基化、2'-o,4'-c-亚甲基化、2'-o,4'-c-亚丙基化、2'-o,4'-c-四亚甲基化以及2'-o,4'-c-五亚甲基化)、d-呋喃核糖的2'-脱氧-2'-c,4'-c-亚甲氧基亚甲基化、s-cet(2',4'-约束乙基)、amna(酰胺桥核酸)、3'-脱氧-3'-氨基-2'-脱氧-d-呋喃核糖和3'-脱氧-3'-氨基-2'-脱氧-2'-氟-d-呋喃核糖。
[0081]
本发明的寡核苷酸中的糖2'-,4'-交联修饰的实例可以包括d-呋喃核糖的2'-o,4'-c-亚烷基化(例如，2'-o,4'-c-亚乙基化)、2'-o,4'-c-亚甲基化、2'-o,4'-c-亚丙基化、2'-o,4'-c-四亚甲基化和2'-o,4'-c-五亚甲基化)、d-呋喃核糖的2'-脱氧-2'-c,4'-c-亚甲氧基亚甲基化、s-cet(2',4'-约束乙基)和amna。
[0082]
本发明的寡核苷酸中的磷酸二酯键的修饰的实例可以包括硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、甲基硫代膦酸酯键、二硫代磷酸酯键和氨基磷酸酯键。
[0083]
在本发明中，碱基修饰的实例可以包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化和n4-甲基化，胸腺嘧啶的5-去甲基化(尿嘧啶)、5-氟化、5-溴化和5-碘化，腺嘌呤的n6-甲基化和8-溴化，以及鸟嘌呤的n2-甲基化和8-溴化。
[0084]
本发明的寡核苷酸可以根据文献(nucleic acids research，12，4539(1984))中描述的方法，使用市售合成仪(例如，型号392，可从perkinelmer，inc.获得，通过磷酰胺方法)来合成。作为其中使用的核苷亚磷酰胺试剂，对于天然核苷和2'-o-甲基核苷(即2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基胞苷和2'-o-甲基尿苷)可以使用市售试剂。具有含2至6个碳原子的烷基的2'-o-烷基鸟苷、腺苷、胞苷和尿苷可以如下合成。
[0085]
2'-o-氨基乙基鸟苷、2'-o-氨基乙基腺苷、2'-o-氨基乙基胞苷和2'-o-氨基乙基尿苷可以根据文献(blommers et al. biochemistry(1998)，37，17714-17725.)来合成。
[0086]
2'-o-丙基鸟苷、2'-o-丙基腺苷、2'-o-丙基胞苷和2'-o-丙基尿苷可以根据文献(lesnik, e.a. et al. biochemistry(1993)，32，7832-7838.)来合成。
[0087]
对于2'-o-烯丙基鸟苷、2'-o-烯丙基腺苷、2'-o-烯丙基胞苷、2'-o-烯丙基尿苷可使用市售试剂。
[0088]
2'-o-甲氧基乙基鸟苷、2'-o-甲氧基乙基腺苷、2'-o-甲氧基乙基胞苷和2'-o-甲氧基乙基尿苷可以根据专利(us6261840)或文献(martin, p. helv.chim. acta. (1995) 78，486-504.)来合成。
[0089]
2'-o-丁基鸟苷、2'-o-丁基腺苷、2'-o-丁基胞苷和2'-o-丁基尿苷可根据文献
(lesnik, e.a. et al. biochemistry (1993)，32，7832-7838.)来合成。
[0090]
2'-o-戊基鸟苷、2'-o-戊基腺苷、2'-o-戊基胞苷和2'-o-戊基尿苷可根据文献(lesnik, e.a. et al. biochemistry (1993)，32，7832-7838.)来合成。
[0091]
对于2'-o-炔丙基鸟苷、2'-o-炔丙基腺苷、2'-o-炔丙基胞苷和2'-o-炔丙基尿苷可以使用市售试剂。
[0092]
2'-o,4'-c-亚甲基鸟苷、2'-o,4'-c-亚甲基腺苷、2'-o,4'-c-亚甲基胞苷、2'-o,4'-c-亚甲基-5-甲基胞苷和2'-o,4'-c-亚甲基胸苷可以根据国际公开号wo 99/14226中描述的方法制备，以及具有含2至5个碳原子的亚烷基的2'-o,4'-c-亚烷基鸟苷、2'-o,4'-c-亚烷基腺苷、2'-o,4'-c-亚烷基胞苷、2'-o,4'-c-亚烷基-5-甲基胞苷和2'-o,4'-c-亚烷基胸苷可以根据国际公开号wo 00/47599中描述的方法制备。
[0093]
其中d-呋喃核糖被2'-脱氧-2'-c,4'-c-亚甲氧基亚甲基化的核苷可以根据文献(wang, g. et al. tetrahedron (1999), 55, 7707-7724.)来合成。
[0094]
s-cet(约束乙基)可以根据文献(seth, p. p. et al. j. org. chem (2010), 75, 1569-1581.)来合成。
[0095]
amna可以根据文献(yahara, a. et al. chembiochem (2012), 13, 2513-2516.)或国际公开号wo 2014/109384来合成。
[0096]
本发明中，在核酸核苷酸序列中腺嘌呤可分别记为(a)或(a)，鸟嘌呤可分别记为(g)或(g)，胞嘧啶可分别记为(c)或(c)，胸腺嘧啶可分别记为(t)或(t)，以及尿嘧啶可分别记为(u)或(u)。可以使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。在核碱基中，尿嘧啶(u)或(u)和胸腺嘧啶(t)或(t)彼此相容。尿嘧啶(u)或(u)和胸腺嘧啶(t)或(t)均可用于与互补链的腺嘌呤(a)或(a)形成碱基对。
[0097]
具有硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸可以通过偶联核苷亚磷酰胺试剂，然后与硫、二硫化四乙基秋兰姆(tetd, applied biosystems)、beaucage试剂(glen research)或试剂如氢化黄原烷(tetrahedron letters, 32, 3005 (1991), j. am. chem. soc. 112, 1253 (1990), pct/国际公开号wo 98/54198)反应来合成。
[0098]
作为合成仪中使用的可控孔度玻璃(cpg)，可以使用结合有2'-o-甲基核苷的市售产品。此外，对于2'-o,4'-c-亚甲基鸟苷、2'-o,4'-c-亚甲基腺苷、2'-o,4'-c-亚甲基-5-甲基胞苷和2'-o,4'-c-亚甲基胸苷，根据国际公开号wo 99/14226中描述的方法制备的核苷可以与cpg结合，并且对于具有含2至5个碳原子的亚烷基的2'-o,4'-c-亚烷基鸟苷、2'-o,4'-c-亚烷基腺苷、2'-o,4'-c-亚烷基-5-甲基胞苷和2'-o,4'-c-亚烷基胸苷，根据国际公开号wo 00/47599中描述的方法制备的核苷根据文献(oligonucleotide synthesis, edited by m. j. gait, oxford university press, 1984)可以结合至此。其中2-羟乙基磷酸酯基团与3'端结合的寡核苷酸可以通过使用修饰的cpg(公开于日本专利公开号7-87982的实施例12b中)来合成。此外，此外，其中羟基烷基磷酸酯基团或氨基烷基磷酸酯基团与3'端结合的寡核苷酸可通过使用3'-氨基-修饰剂c3 cpg、3'-氨基-修饰剂c7 cpg、glyceryl cpg（glen research）、3'-specer c3 synbase cpg 1000或3'-specer c9 synbase cpg 1000（链接技术）来合成。
[0099]
《2.galnac单元》在本发明的偶联物中，寡核苷酸可以具有通过接头和磷酸酯基团结合的galnac。
[0100]
本发明中的galnac单元是与其中结合有galnac的接头结合的磷酸酯基团，并且可以具有一个进一步的键。galnac单元的磷酸酯基团可以与寡核苷酸的5'端和/或3'端结合，优选地，与寡核苷酸的5'端结合。在其中galnac单元具有键的情况下，该键可以与羟基、galnac、其中结合有galnac的接头、另一galnac单元的磷酸酯基团或寡核苷酸的3'端处的磷酸酯基团结合。一个galnac单元包含两个galnac。
[0101]
在偶联物中，1个galnac单元可以与寡核苷酸结合，或者多个galnac单元可以与寡核苷酸串联结合。与一个寡核苷酸结合的galnac单元的数量优选为1至7，更优选1至5，特别优选1至3，最优选1。
[0102]
在其中将2个galnac单元导入本发明的寡核苷酸的5'端中的情况下，symmetric doubler phosphoramidite(1,3-双-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊氨基]丙基-2-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，glen research)等可以在合成寡核苷酸时使用，并且在其中三个galnac单元导入寡核苷酸的5'端中的情况下，trebler phosphoramidite(三-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧基甲基]乙基-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，glen research)、long trebler phosphoramidite(三-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧基甲基]亚甲氧基丙基-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，glen research)等可以在合成寡核苷酸时使用。在其中将4个galnac单元导入寡核苷酸的5'端中的情况下，偶联2次的symmetric doubler phosphoramidite等可以在合成寡核苷酸时使用。在其中将5个galnac单元导入寡核苷酸的5'端中的情况下，各自偶联一次的symmetric doubler phosphoramidite和trebler phosphoramidite或long trebler phosphoramidite可以在合成寡核苷酸时使用。在其中将5或更多个galnac单元导入寡核苷酸的5'端中的情况下，可以适当组合symmetric doubler phosphoramidite、trebler phosphoramidite或long trebler phosphoramidite用于合成。
[0103]
在其中将这样的galnac单元导入本发明中的寡核苷酸的3'端中的情况下，asymmetric doubler (lev) phosphoramidite(1-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊氨基]-3-[5-乙酰丙酰氧基戊氨基]-丙基-2-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，glen research)等可以在合成寡核苷酸时使用。具体地，在将市售的unylinker support(例如，glen unysuppor 1000，glen research)与asymmetric doubler (lev) phosphoramidite偶联以去除dmtr基团之后，感兴趣的寡核苷酸的链被延长。在达到预期的链长后，可以通过使用试剂如肼将乙酰丙酰基脱保护并根据asymmetric doubler (lev) phosphoramidite试剂所附的方案偶联galnac单元，来将其导入寡核苷酸的3'端中。
[0104]
在本发明中，附加寡核苷酸序列是与发挥药用作用的寡核苷酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列，其由磷酸二酯键构成并且可在体内切割，可以包含在与galnac单元结合的寡核苷酸的5'端和/或3'端。可切割的寡核苷酸的链长优选为1至6个核苷酸，进一步优选1至3个核苷酸。可以切割的寡核苷酸没有特别限制，只要它可以切割，但是其实例可以包括完全由dna组成的天然寡脱氧核苷酸和完全由rna组成的天然寡核苷酸。核苷酸序列没有特别限制，只要它是可以被切割的序列，但其实例可以包括5'-tcatca-3'、5'-catca-3'、5'-atca-3'5'-tca-3'、5'-ca-3'和5'-a-3'。
[0105]
在一方面，本发明的双触角galnac单元为由下式表示的基团：[式44]
其中w是由下式表示的基团：[式45]g表示5-乙酰氨基-2-羟甲基-3,4-二羟基四氢吡喃-6-基(galnac)；z表示氧原子或硫原子；l1和l2中的一个表示亚甲基(ch2)，而另一个表示不插入原子。o、q、r和s各自独立地表示0或1；n表示1至15的整数；m表示0至5的整数；并且v表示1至7，条件是n为1时，则m为0至5的整数，并且n为2至15的整数时，则m为0，优选o和q各自为0。
[0106]
在上述式中，优选的是l2表示亚甲基(ch2)，并且l1表示在l1和l2中不插入原子。优选地，n为1至10的整数，更优选2至7的整数，进一步优选2至4的整数。优选地，m为0至3的整数。优选地，v为1至5的整数。更优选地，s为1，n为2至7的整数，m为0、1或2，并且v为1至5的整数，进一步优选地，它是一个基团，其中在上式表示的基团中s为1、n为2或3、m为0以及v为1至3的整数。
[0107]
本发明的双触角galnac单元优选地具有双触角结构，每一个均具有距磷酸酯基团3个原子内的甘油结构，并且在支链的每个末端具有galnac，其中从支链点到galnac的每个接头结构几乎相同，连接galnac部分和磷酸酯基团部分的接头骨架具有15个原子或更短的长度，杂原子含量高，并且连续烷基链长度为c5或更短，因此在水中表现出良好的溶解性。
[0108]
本发明的双触角galnac单元的具体实例可包括由下式表示的基团：[式46]
[式47][式48]
[式49][式50]。
[0109]
《3.制备偶联物的方法》与本发明的galnac单元结合的寡核苷酸可以根据文献(nucleic acids research, 12, 4539 (1984))中描述的方法，使用市售合成仪(例如，型号392，可从perkinelmer, inc.获得，通过亚磷酰胺法)等，并且通过以与核苷亚磷酰胺试剂相同的方式使用包含在galnac单元中的亚磷酰胺来合成。
[0110]
合成含galnac单元的亚磷酰胺的方法含有本发明的galnac单元的亚磷酰胺或h-膦酸酯可以根据下面将描述的方法a或方法b来制备。在方法a或方法b中，在根据常规方法完成反应后，从反应混合物中收集每个反应的目标化合物。例如，通过以下来得到目标化合物：适当地中和反应混合物，滤出不溶物(如果存在)，然后向其中加入水和不混溶的有机溶剂如乙酸乙酯，分离含有目标物质的有机层，用水等对其进行洗涤，用无水硫酸钠对其进行干燥，以及蒸去溶剂。如果必要，可以通过常规方法，例如硅胶柱色谱法分离/纯化所获得的化合物。或者，可以通过再沉淀和重
结晶对其进行纯化。条件是如果r=0，则方法c代替方法a或方法b来使用。
[0111]
[方法a]方法a是使用化合物(3)制备支链化合物(7)和化合物(7')的方法。化合物(1)的构型不受限制。通过施用化合物(3)，可以适当地选择galnac部分的6位羟基的保护基团。如果r=0，则使用方法c。
[0112]
[式51]其中r
13
是羟基的常规保护基团，但理想的是苄基，r
14
是羟基的常规保护基团，但理想的是乙酰基或疏水性保护基团(更理想的是4,4'-二甲氧基三苯甲基)，r
15
是羰基的常
规保护基团，但理想的是苄基，在-p(r3)r4中，r3和r4可以相同或不同并且各自表示羟基、被保护的羟基、巯基、被保护的巯基、氨基、具有1至4个碳原子的烷氧基、具有1至4个碳原子的烷硫基、具有1至5个碳原子的氰基烷氧基或被具有1至4个碳原子的烷基取代的氨基，x为碳或氧，n为整数1至15的整数，m为0至5的整数，条件是n为1时，m为0至5的整数，并且n为2至15的整数时m为0，r独立地为0或1，并且v为1至7。
[0113]
步骤a-1为氨基甲酸酯化步骤，其中化合物(1)在惰性溶剂中在活化剂和碱的存在下转化为活性酯，然后与化合物(2)反应进行氨基甲酸酯化。
[0114]
反应中使用的惰性溶剂的实例包括烃、芳烃、卤化烃和醚，优选二氯甲烷。
[0115]
反应中使用的活化剂没有特别限定，只要其形成活化酯，而其实例包括碳酸双(五氟苯基)酯、碳酸双(4-硝基苯基)酯和氯甲酸4-硝基苯基酯。优选地，活化剂是氯甲酸4-硝基苯基酯。
[0116]
作为反应中使用的碱的实例包括三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、吡啶和4-二甲氨基吡啶，并且优选的是在制备活性酯时使用吡啶，并且在随后与胺反应时添加n,n-二异丙基乙胺。
[0117]
反应温度根据活化剂、碱、惰性溶剂等而不同，而一般为-20℃至回流温度。优选地，反应温度为10℃至30℃。
[0118]
反应时间根据活化剂、碱、惰性溶剂、反应温度等而不同，而通常为15分钟至24小时，优选1小时至4小时。
[0119]
步骤a-2是去除作为保护基团的r
13
和r
15
的步骤。保护基团的去除根据其类型而不同，而通常可以根据合成有机化学技术中众所周知的方法进行，例如在t. h. greene, p. g. wuts, protective groups in organic synthesis. third edition, 1999, john wiley & sons, inc.中公开的方法。
[0120]
步骤a-3是在惰性溶剂中在缩合剂和碱的存在下与化合物(3)进行酰胺缩合的步骤。
[0121]
反应中使用的惰性溶剂可以根据要使用的缩合剂的类型来适当地选择。其实例包括水、醇和极性非质子溶剂，优选二氯甲烷或n,n-二甲基甲酰胺。
[0122]
反应中使用的碱的实例包括三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、吡啶和4-二甲氨基吡啶，优选n,n-二异丙基乙胺。
[0123]
反应中使用的缩合剂的实例包括作为碳二亚胺缩合剂的wsc(1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺)和dic(n,n'-二异丙基碳二亚胺)、作为咪唑缩合剂的cdi(n,n'-羰基二咪唑)、作为三嗪缩合剂的dmt-mm(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉=氯化物n水合物)、作为脲缩合剂的hatu(o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐)和tstu(o-(n-琥珀酰亚胺基)-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐)、以及作为鏻缩合剂的pybop(1h-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻)，优选wsc或hatu。此外，可以根据需要添加作为添加剂的hoat(1-羟基-7-氮杂苯并三唑)、hobt(1-羟基苯并三唑)和oxyma((羟基亚氨基)氰基乙酸乙酯)。
[0124]
反应温度根据缩合剂、碱、溶剂等而不同，但通常为-20℃至回流温度。优选地，其为10℃至30℃。
[0125]
反应时间根据缩合剂、碱、溶剂、反应温度等而不同，但通常为15分钟至72小时，优
选1小时至24小时。
[0126]
步骤a-4是制备化合物(7)的步骤，其中在惰性溶剂中在2-氰乙基二异丙基氯亚磷酰胺和碱的存在下将-p(r3)r4导入到化合物(6)的仲羟基中。
[0127]
反应中使用的惰性溶剂的实例包括烃、芳烃、卤化烃、醚和乙腈，优选二氯甲烷。
[0128]
反应中使用的碱的实例包括三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、吡啶和4-二甲氨基吡啶，优选n,n-二异丙基乙胺。
[0129]
反应温度根据碱、惰性溶剂等而不同，但通常为-20℃至回流温度。优选地，其为10℃至30℃。
[0130]
反应时间根据碱、惰性溶剂、反应温度等而不同，但通常为15分钟至24小时，优选1小时至4小时。
[0131]
步骤a-5是由化合物(7)合成化合物(8)的步骤，其中仅去除作为保护基团的r
15
。保护基团的去除根据其类型而不同，但通常可以根据合成有机化学技术中众所周知的方法进行，例如在t.h.greene, p.g.wuts, protective groups in organic synthesis. third edition, 1999, john wiley & sons, inc.中公开的方法。
[0132]
步骤a-6是对化合物(8)进行酰胺化的步骤。可以以与上述步骤a-3中相同的方式进行。
[0133]
步骤a-7是去除作为保护基团的r
13
的步骤。保护基团的去除根据其类型而不同，但通常可以根据合成有机化学技术中众所周知的方法进行，例如在t.h.greene, p.g.wuts, protective groups in organic synthesis. third edition, 1999, john wiley & sons, inc.中公开的方法。
[0134]
步骤a-8是由化合物(6)合成作为h-膦酸酯的化合物(7')的步骤。h-膦酸酯可以例如通过以下来获得：使根据文献(b. c. freohler, p. g. ng and md. matteucci, nucleic acids res., 14 5399 (1986))由三氯化磷和1,2,4-三唑预先制备的3-(1,2,4-三唑基)亚磷酸酯(代替亚磷酰胺试剂)与化合物(6)在惰性溶剂中反应，然后向其中加入水以终止反应，并进行后处理。使用的溶剂没有特别限制，只要其不阻碍反应，但优选的是卤代烃如二氯甲烷。反应温度在-20℃至100℃范围内没有特别限制，但一般是室温。反应时间根据使用的溶剂和反应时间而不同，但反应时间在室温下在二氯甲烷中反应的情况下为30分钟。
[0135]
[方法b]方法b是使用化合物(3)制备支链化合物(14)和化合物(14')的方法。化合物(10)的构型不受限制。通过使用(3)，可以适当地选择galnac部分的6位羟基的保护基团。如果r=0，则使用方法c。
[0136]
[式52]r12
是羟基的常规保护基团，但理想的是苄基。在式中，r3、r4、x、n、m、r、v、r
14
和r
15
各自具有与上述相同的含义。
[0137]
步骤b-1是对化合物(10)进行氨基甲酸酯化的步骤，并且可以以与上述步骤a-1相同的方式进行。
[0138]
步骤b-2是去除作为保护基团的r
12
和r
15
的步骤。步骤b-2可以以与上述步骤a-2相同的方式进行。
[0139]
步骤b-3是对化合物(12)进行酰胺化步骤，并且可以以与上述步骤a-3相同的方式进行。
[0140]
步骤b-4是将-p(r3)r4导入化合物(13)的羟基的步骤，并且可以以与上述步骤a-3相同的方式进行。
[0141]
步骤b-5是由化合物(11)合成化合物(15)的步骤，其中仅去除作为保护基团的r
15
。
步骤b-5可以以与上述步骤a-5相同的方式进行。
[0142]
步骤b-6是对化合物(15)进行酰胺化的步骤。步骤b-6可以以与上述步骤a-6相同的方式进行。
[0143]
步骤b-7是去除作为保护基团的r
12
的步骤。步骤b-7可以以与上述步骤a-7相同的方式进行。
[0144]
步骤b-8是由化合物(13)合成化合物(14')的步骤。步骤b-8可以以与上述步骤a-8相同的方式进行。
[0145]
[方法c]方法c是使用化合物(3)制备支链化合物(19)或化合物(22)和化合物(19')或化合物(22')的方法。化合物(1)和化合物(10)的构型不受限制。通过使用化合物(3)可以适当地选择galnac部分的6位羟基的保护基团。
[0146]
[式53]
其中r3、r4、x、n、m、r、r
12
、r
13
和r
14
各自具有与上述相同的含义。
[0147]
步骤c-1是对化合物(1)或化合物(10)进行氨基甲酸酯化的步骤，并且可以使用化合物(3)代替化合物(2)以与上述步骤a-1相同的方式进行。
[0148]
步骤c-2是去除作为保护基团的r
12
或r
13
的步骤。保护基团的去除根据其类型而不
同，但通常可以根据合成有机化学技术中众所周知的方法进行，例如在t.h.greene, p.g.wuts, protective groups in organic synthesis. third edition, 1999, john wiley & sons, inc.中公开的方法。
[0149]
步骤c-3是将-p(r3)r4导入化合物(19)或化合物(22)的羟基中的步骤，并且可以以与上述步骤a-3相同的方式进行。
[0150]
步骤c-4是由化合物(18)合成化合物(19')或由化合物(21)合成化合物(22')的步骤。步骤c-4可以以与上述步骤a-8相同的方式进行。
[0151]
《4.使用疏水性保护基团的制备方法》本发明提供：一种制备galnac单元与合成寡核苷酸的偶联物的方法，通过将galnac单元与寡核苷酸的5'端或3'端结合，其中在galnac部分的3位、4位和6位中任一个处的一个或多个羟基上导入了高度疏水的保护基团，并通过由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂的吸附来将galnac单元与杂质分离；一种结合化合物(例如亚磷酰胺和h-膦酸酯)，其包含含有疏水性保护基团的galnac，用作制备方法、偶联物等中的中间体。
[0152]
本发明的制备方法包括以下步骤：a:合成包含与寡核苷酸的5'端或3'端结合的含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构的偶联物；b：使含有步骤a中获得的产物的溶液通过填充有由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂的柱，并且使水性洗涤溶液通过该柱；和c：在步骤b之后从柱上洗脱寡核苷酸。
[0153]
在该制备方法中，可以采用各种疏水性保护基团，只要它们符合上述定义即可。在正常的核酸合成中，寡核苷酸通过使用氨水等的碱处理从支持物中游离，且因此可以使用通过在酸性条件下的处理而去除的保护基团，例如任选取代的三苯甲基和任选取代的甲硅烷基。任选取代的三苯甲基的具体实例包括三苯甲基、单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。任选取代的甲硅烷基的实例包括三苯基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基，优选4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmtr基团)。
[0154]
作为在碱性条件下被去除的疏水性保护基团，可以采用各种酯基团，但其优选实例包括乙酰基和苯甲酰基。
[0155]
在本发明中，术语“包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构”是指由下式表示的结构。
[0156]
[式54]在式中，作为galnac上羟基的取代基的ra、rb和rc中的至少一个为疏水性保护基团，而其余为氢原子或在游离条件下会被去除的保护基团。它们中的全部可以为疏水性保护基团，它们中的任意两个可以为疏水性保护基团，或者它们中的仅任意一个为疏水性保护基团。优选地，ra是疏水性保护基团(更优选地，在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，
进一步优选任选取代的三苯甲基，最优选dmtr基团)，并且rb和rc是氢原子。在其中该取代基不是疏水性保护基团的情况下，其中可以与在游离条件下会被去除的保护基团结合，但是这些保护基团在从支持物中切割寡核苷酸的过程中被去除以便在步骤a中使用时的阶段成为氢原子(galnac上的羟基)。
[0157]
x1和x2各自独立地表示接头结构，其可以在x1和x2之间分支。作为本文采用的接头结构，可以采用各种骨架如烷基链、peg链和肽链。该接头结构可以通过在中间分支而包含多个galnac。接头结构中支链的数量(t)为约1至10，优选1至3。在具有两个或更多个支链的情况下，支链点和galnac之间的接头结构可以相同或不同。在含有多个galnac的情况下，至少一个疏水性保护基团与每个galnac结合。
[0158]
在上述式中，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的键。在与寡核苷酸的5'端结合的情况下，磷酸二酯键或硫代磷酸酯键与末端处的核苷的5'-羟基一起形成。这样的结合可以通过固相合成寡核苷酸，然后使用其中y(具有包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构)形成亚磷酰胺结构或h-膦酸酯结构的化合物(含有疏水性保护基团的glcnac单元亚酰胺类化合物)以与核苷亚磷酰胺试剂相同的方式来合成。与本发明的二等分galnac单元对应的含有疏水性保护基团的galnac单元亚酰胺类化合物的具体实例在上述(b13)中进行了描述。
[0159]
本发明的制备方法不限于适用于上述本发明的双触角galnac单元，并且也可以适用于公知的galnac单元(例如，在专利文献1至9和非专利文献1和2中描述的那些)与寡核苷酸的偶联物的制备。在这种情况下，具有与已知glcnac单元对应的结构的化合物被用作含有疏水性保护基团的glcnac单元亚磷酰胺或h-膦酸酯。与已知的galnac单元对应的亚酰胺类化合物的实例可以包括以下化合物。
[0160]
以下化合物可参考j. med. chem. 2016, 59, 2718-2733及其引用的参考文献等。
[0161]
对于基于tris的galnac单元[式55]对于基于triacid的galnac单元
[式56]对于基于pentaerythritol的galnac单元[式57]对于基于lys的galnac单元[式58]
下式表示的含有疏水性保护基团的galnac单元亚磷酰胺可以参照国际公开号wo 19027009来制备。
[0162]
对于基于aryl的galnac单元[式59]
以下化合物可参考j. med. chem. 2016, 59, 2718-2733及引用的参考文献等来制备。
[0163]
用于基于hydroxyprolinol的galnac单元/基于piperidine的galnac单元[式60]在与已知glcnac单元对应的亚酰胺类化合物的上述式中，r1表示疏水性保护基团。x表示接头结构，优选c3至c6直链烷基。y表示亚磷酰胺基团或h-膦酸酯基团。
[0164]
与已知的glcnac单元对应的含有疏水性保护基团的galnac单元-亚磷酰胺或含有疏水性保护基团的galnac单元-h-膦酸酯可以通过适当地使用属于在合成galnac单元的过程中的方法a至方法c中的上述化合物(3)的galnac衍生物来合成。例如通过参照实施例1的
方法，可以合成在3位、4位和6位的至少一个羟基被疏水性保护基团保护的各种galnac衍生物。
[0165]
通过将上述含有疏水性保护基团的galnac单元亚酰胺类化合物导入以与根据前述方法的核苷亚酰胺试剂相同的方式合成的寡核苷酸的5'端或3'端中，可以合成具有包括含有疏水性保护基团的galnac-磷酸酯基团(在前述式中，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的键)的结构的偶联物。由此合成的偶联物的实例可以包括(b17)和(b18)中描述的偶联物。
[0166]
将含有疏水性保护基团的galnac单元-h-膦酸酯化合物导入所合成的寡核苷酸的5'端或3'端中的反应所使用的溶剂没有特别限制，只要它不抑制反应即可。优选地，使用无水乙腈。用作缩合剂的试剂的实例包括羧酸和磷酸的酸氯化物，优选新戊酰氯。用于将h-膦酸酯键氧化成磷酸二酯键的氧化剂没有特别限制，只要它通常用于氧化反应即可。其实例可以包括无机金属氧化剂，所述无机金属氧化剂包括锰氧化物如高锰酸钾和二氧化锰；氧化钌如四氧化钌；硒化合物如二氧化硒；铁化合物如氯化铁；锇化合物如四氧化锇；银化合物如氧化银；汞化合物如乙酸汞；氧化铅化合物如氧化铅和四氧化铅；铬酸盐化合物如铬酸钾、铬酸-硫酸盐络合物和铬酸-吡啶络合物；以及铈化合物如硝酸铵铈(can)，无机氧化剂包括卤素分子例如氯分子、溴分子和碘分子；高碘酸如高碘酸钠；臭氧；过氧化氢溶液；亚硝酸化合物如亚硝酸；亚氯酸化合物如亚氯酸钾、亚氯酸钠；以及过硫酸盐化合物如过硫酸钾和过硫酸钠，以及有机氧化剂，包括用于dmso氧化的试剂(二甲亚砜和二环己基碳二亚胺、草酰氯、乙酸酐或五氧化二磷，或吡啶-乙酸酐络合物)；过氧化物如叔丁基过氧化氢；稳定的阳离子如三苯甲基阳离子；琥珀酰亚胺如n-溴琥珀酰亚胺；次氯酸盐化合物如次氯酸叔丁酯；偶氮二羧酸酯化合物如偶氮二羧酸甲酯；二硫化物如二甲基二硫化物、二苯基二硫化物、和二吡啶基二硫化物和三苯基膦；亚硝酸酯如亚硝酸甲酯；四卤代烃如四溴甲烷；和醌化合物如2,3-二氯-5,6-二氰基-对苯醌(ddq)，优选碘分子。所使用的脱氧剂的实例包括杂环胺如吡啶、二甲氨基吡啶，和脂族胺如三甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺，优选杂环胺(特别是吡啶)。在形成硫代磷酸酯键的情况下是没有限制的，只要是能够使h-膦酸酯键反应而形成硫代磷酸酯键的试剂即可。其实例包括硫、四乙基秋兰姆二硫化物、beaucage试剂和苯乙酰基二硫化物，优选硫。所合成的偶联物可以以与寡核苷酸的通用dmtr-on纯化相同的方式从支持物中游离，同时保留疏水性保护基团。
[0167]
这样的具有包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构的偶联物可以以与寡核苷酸的通用dmtr-on纯化相同的方式从支持物中游离，同时保留疏水性保护基团。一般而言，寡核苷酸的3'端与支持物之间的键被氨水切割，并且寡核苷酸在碱性条件下游离。因此，将不被碱性去除的保护基团，例如在酸性条件下被去除的基团选作疏水性保护基团。同时，在采用其中在酸性条件下将寡核苷酸的3'端与支持物之间的键切割的结合方式作为结合方式的情况下，寡核苷酸的游离条件是酸性的，且因此选择在酸性条件下不被去除的保护基团，例如在碱性条件下被去除的保护基团作为疏水性保护基团。
[0168]
将由此获得的含有疏水性保护基团的galnac单元-寡核苷酸偶联物吸附到填充有由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂的柱，然后用水性洗涤溶液洗涤该柱，使得可以分离没有疏水性保护基团的杂质。
[0169]“由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂”没有特别限制，只要它是其中高度疏水
性组分用于基材的树脂即可。为此使用各种树脂，并且其实例包括苯乙烯-二乙烯基苯吸附树脂、改性苯乙烯-二乙烯基苯吸附树脂、甲基丙烯酸类吸附树脂或酚醛吸附树脂。
[0170]
作为将含有疏水性保护基团的galnac单元-寡核苷酸偶联物吸附到柱上时使用的填充溶液，不含有大量有机溶剂的碱性水溶液是理想的。例如，可以使用用于在固相合成后从支持物中切除低聚物的浓缩氨水或通过用适量的溶剂(如水和缓冲剂)稀释氨水而获得的碱性水溶液。
[0171]
可以采用各种溶液作为用于从柱上去除杂质的洗涤溶液，只要它们是具有使得疏水保护基团不会发生脱保护并且保持与树脂的疏水相互作用的性质的溶液即可。通过使用含有浓度足够低以保持与树脂的疏水相互作用的有机溶剂的水溶液作为洗涤溶液来提高去除杂质的效率。具体地，在其中疏水性保护基团为dmtr基团的情况下，可以使用含有适量的盐的水溶液、含有乙腈的水溶液等作为洗涤溶液。
[0172]
与galnac结合的疏水性保护基团可以通过在与所采用的保护基团对应的脱保护条件下处理偶联物来进行脱保护。在一般的寡核苷酸合成之后应用该制备方法的情况下，采用在酸性条件下进行脱保护的疏水性保护基团如dmtr基，因此脱保护通过用酸性溶液处理来进行。
[0173]
对吸附偶联物的柱上适当地进行脱保护处理，从而能够获得脱保护的galnac-寡核苷酸偶联物，同时源自保护基团的杂质被吸附到柱上。
[0174]
此外，可以通过对尚未脱保护且未从柱洗脱的含有疏水性保护基团的galnac-寡核苷酸偶联物进行脱保护处理并将脱保护处理后的溶液再次通过由于疏水相互作用而具有吸附力的同一树脂柱，来将源自保护基团的杂质从脱保护的偶联物中分离。
[0175]
galnac-寡核苷酸偶联物可以通过使保留偶联物的柱经受与所采用的树脂相对应的适当梯度洗脱方法以高纯度进行分级分离。在从柱上洗脱而不脱保护疏水性保护基团的情况下，可以通过梯度洗脱将偶联物洗脱，这增加了有机溶剂的含量，以抑制疏水性保护基团与吸附树脂之间的疏水相互作用。
[0176]
在其中在柱上的吸附状态下进行脱保护处理的情况下，可以根据将脱保护的偶联物保留在柱上的模式来适当地选择适当的洗脱条件。
[0177]
在使用由于疏水相互作用而具有吸附性的离子交换柱的情况下，在将偶联物吸附到柱上的同时进行脱保护处理，并且可以根据所采用的使用洗脱液中的盐浓度从离子交换柱洗脱的常规方法，来将galnac-寡核苷酸偶联物从柱上洗脱/分级分离。具体地，在使用resource q(可获自ge healthcare japan corporation)作为柱的情况下，可以使用将氢氧化钠/氯化钠的混合水溶液中氯化钠的含量从0逐渐增加到2m(2 mol/l)的梯度洗脱液。
[0178]
在使用反相柱的情况下，可以根据所采用的使用合适的有机溶剂从反相柱洗脱的常规方法来将galnac-寡核苷酸偶联物从柱上洗脱/分级分离。具体地，在使用clarity qsp(可获自phenomenex inc.)作为柱的情况下，可以使用含有适量乙腈的三羟甲基氨基甲烷(tris)-盐酸缓冲剂。
[0179]
为了检测目标物质，使用作为核酸检测波长的260nm下的吸光度。目标物质可以通过随时间测量柱的通过流体在260nm下的吸光度并收集洗脱步骤中要检测的级分来获得。
[0180]
《5.药物》本发明的偶联物可以用作治疗由其中所含的寡核苷酸靶向的疾病的药物。治疗包
括预防性治疗和后治疗二者。
[0181]
本发明的偶联物可以以药学上可接受的盐的形式使用。“药学上可接受的盐”是指寡核苷酸的盐，并且这样的盐的实例可以包括金属盐，包括碱金属盐如钠盐、钾盐和锂盐，碱土金属盐如钙盐和镁盐，铝盐，铁盐，锌盐，铜盐，镍盐和钴盐；胺盐，包括无机盐如铵盐和有机盐如叔辛胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n,n'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基-苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐；无机酸盐，包括氢卤化物如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；有机酸盐，包括低级烷烃磺酸盐如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐，芳基磺酸盐如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐，乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐；以及氨基酸盐，例如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐，优选碱金属盐，更优选钠盐。这些盐可以通过已知方法来制备。
[0182]
此外，偶联物及其药学上可接受的盐也可以作为溶剂化物(例如，水合物)存在并且可以使用这样的溶剂化物。在本发明中，这样的溶剂化物被视为在寡核苷酸或偶联物的盐的范围内。
[0183]
在使用本发明的偶联物或其药学上可接受的盐作为药物产品的情况下，该药物产品本身，或与适当的药学上可接受的赋形剂或稀释剂混合，可以以片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或糖浆剂的形式口服施用，或以注射剂、栓剂、贴剂或外用药物的形式肠胃外施用。
[0184]
这些制剂(preparation)是通过公知方法使用添加剂如赋形剂(例如，有机赋形剂，包括糖衍生物如乳糖、白糖、右旋糖、甘露醇和山梨糖醇；淀粉衍生物如玉米淀粉、马铃薯淀粉、α淀粉和糊精；纤维素衍生物，例如结晶纤维素；阿拉伯树胶；右旋糖酐；和普鲁兰多糖，以及无机赋形剂，包括硅酸盐衍生物如轻质无水硅酸盐、合成硅酸铝、硅酸钙和偏硅酸铝酸镁；磷酸盐如磷酸盐氢钙；碳酸盐如碳酸钙；以及硫酸盐如硫酸钙)、润滑剂(例如，硬脂酸；金属硬脂酸盐如硬脂酸钙和硬脂酸镁；滑石；胶体二氧化硅；蜡如蜂蜡和gay蜡；硼酸；己二酸；硫酸盐如硫酸钠；乙二醇；富马酸；苯甲酸钠；dl亮氨酸；月桂基硫酸盐如月桂基硫酸钠和月桂基硫酸镁；硅酸如无水硅酸盐和硅酸盐水合物；以及上述淀粉衍生物)、粘合剂(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和与上述赋形剂相同的化合物)、崩解剂(例如，纤维素衍生物如低取代度的羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙和内部交联的羧甲基纤维素钠；以及化学改性淀粉/纤维素如羧甲基淀粉、羧甲基淀粉钠、交联的聚乙烯吡咯烷酮)、乳化剂(例如，胶体粘土如膨润土和硅酸铝镁(veegum)；金属氢氧化物如氢氧化镁和氢氧化铝；阴离子表面活性剂如月桂基硫酸钠和硬脂酸钙；阳离子表面活性剂如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)；以及非离子表面活性剂如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯)、稳定剂(对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；醇如氯丁醇、苄基醇和苯乙醇；苯扎氯铵；酚如苯酚和甲酚；硫柳汞；脱氢乙酸；和山梨酸)、调味剂(例如，常用的甜味剂、酸味剂和香料)和稀释剂来制备的。
[0185]
本发明的药物可含有0.1至250微摩尔/毫升的寡核苷酸(反义寡核苷酸)，优选1至50微摩尔/毫升的寡核苷酸或其药学上可接受的盐、0.02-10% w/v的碳水化合物或多元醇
aldrichco.llc)或解封溶液-1(3w/v%三氯乙酸/二氯甲烷溶液，产品号042-28921，可获自fujifilm wako pure chemical corporation)用作解封剂(deblock)。
[0197]
苯基乙酰二硫化物(产品号fp07495，可从carbosynth holdings limited获得)使用1:1(v/v)的乙腈(脱水的，产品号01837-05，kanto chemical co., inc.)和吡啶(脱水的，产品号11339-05，kanto chemical co., inc.)的溶液溶解至0.2m用作硫代试剂以形成硫代磷酸酯键。
[0198]
oxdizer 0.05m(产品号l560250-04，可获自sigma-aldrich co. llc)或碘(产品号20035-00，可获自kanto chemical co., inc.)使用78:20:2(v/v/v)的四氢呋喃(脱水的，产品号40993-05，可获自kanto chemical co., inc.)、吡啶(脱水的，产品号11339-05，可获自kanto chemical co., inc.)和蒸馏水的溶液溶解至0.02m用作氧化剂。
[0199]
可获自chemgenes corporation的2'-o-me核苷(腺苷，产品号anp-5751，胞苷，产品号anp-5752，鸟苷，产品号anp-5753，或尿苷，产品号anp-5754)的亚磷酰胺用作核苷亚磷酰胺试剂。
[0200]
作为非天然核苷的亚磷酰胺，使用根据日本专利公开号2000-297097的实施例14(5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-o,4'-c-亚乙基-6-n-苯甲酰腺苷-3'-o-(2-氰乙基n,n-二异丙基)亚磷酰胺)、实施例27(5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-o,4'-c-亚乙基-2-n-异丁酰鸟苷-3'-o-(2-氰乙基n,n)-二异丙基)亚磷酰胺)、实施例22(5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-o,4'-c-亚乙基-4-n-苯甲酰基-5-甲基胞苷-3'-o-(2-氰乙基n,n)-二异丙基)亚磷酰胺)或实施例9(5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-o,4'-c-亚乙基-5-甲基尿苷-3'-o-(2-氰乙基n,n-二异丙基)亚磷酰胺)的化合物。
[0201]
根据作为固相载体的合成规模来适当地选择nittophase unylinker 100、10
µ
mol(可获自nitto denko corporation)，primer support 5g unylinker 350、10
µ
mol(可获自ge healthcare)，primer support 5g unylinker 350、100
µ
mol(可获自ge healthcare)或glen unysupport cpg 500、1
µ
mol(可获自glen research)。
[0202]
(实施例1)含有疏水性保护基团的galnac的合成(1a)[(2r,3r,4r,5r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[3-(苄氧羰基氨基)丙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物1a)的合成[式61]向n-(3-羟丙基)氨基甲酸苄酯(6.4g，30.8mmol)和作为文献(国际公开号wo 2011053614)中已知的化合物的[(2r,3r,4r,5r)-5-乙酰氨基-3,4,6-三乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(10g，25.7mmol)在二氯甲烷(200ml)中的悬浮液加入三氟甲磺酸(450
µ
l，5.1mmol)，然后在45℃下搅拌4小时。在反应完成后，减压蒸馏去除约一半的溶剂进行浓缩。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和生理盐水洗涤，随后用无水硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。向其中加入异丙醚(100m)，随后搅拌3小时。过滤得到
的固体产物，以得到目标物质1a(11.9g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0203]1h-nmr (cdcl3) δ： 7.43-7.29 (5h, m), 6.26 (1h, d, j = 8.5 hz), 5.36-5.29 (1h, m), 5.12 (1h, d, j = 12.1 hz), 5.08 (1h, d, j = 12.1 hz), 5.03-4.95 (2h, m), 4.33 (1h, d, j = 9.1 hz), 4.21-4.06 (3h, m), 4.01-3.93 (1h, m), 3.80-3.73 (1h, m), 3.62-3.49 (1h, m), 3.44-3.35 (1h, m), 3.14-3.04 (1h, m), 2.15 (3h, s), 2.05 (3h, s), 2.01 (3h, s), 1.95 (3h, s), 1.88-1.75 (1h, m), 1.69-1.56 (1h, m)。
[0204]c25h34
n2o
11
的计算值：[m h] 539，实测值539。
[0205]
(1b)n-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢吡喃-2-基]氧丙基]氨基甲酸苄酯(化合物1b)的合成[式62]向步骤(1a)中合成的化合物(12.4g，23mmol)在乙醇(200ml)中的悬浮液中加入28％甲醇钠甲醇溶液(0.85ml)，随后在室温下搅拌。随着反应的进行，溶液变成澄清溶液。通过静置60分钟得到沉淀物。过滤沉淀物并用乙醇和二异丙醚洗涤，随后减压干燥。以固体形式得到含有目标物质1b的粗产物(10g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0206]1h-nmr (dmso-d6) δ： 7.60 (1h, d, j = 9.1 hz), 7.40-7.17 (5h, m), 5.01 (2h, s), 4.62-4.55 (2h, m), 4.49 (1h, d, j = 4.2 hz), 4.20 (1h, d, j = 8.5 hz), 3.76-3.27 (6h, m), 3.08-2.99 (2h, m), 1.81 (3h, s), 1.66-1.56 (2h, m)。
[0207]c19h28
n2o8的计算值：[m na] 435，实测值435。
[0208]
(1c)n-[(2r,3r,4r,5r,6r)-2-(3-氨基丙氧基)-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢吡喃-3-基]乙酰胺盐酸盐(化合物1c)的合成[式63]将步骤(1b)中合成的化合物(22.8g，55.3mmol)溶解在四氢呋喃(280ml)/1n盐酸(61ml)中。向其中加入10％钯/碳(湿)(5.56g)，然后在氢气氛下在室温下剧烈搅拌3.5小时。在反应完成后，过滤混合物，并且减压蒸馏去除得到的通过流体。过滤通过加入适量乙醇产生的固体产物，并用乙醇和乙醚洗涤，随后减压干燥。得到含有目标物质1c的粗产物(17g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0209]1h-nmr (d2o) δ：4.27 (1h, d, j = 8.5 hz), 3.90-3.50 (8h, m), 2.93 (2h, t, j = 7.0 hz), 1.89 (3h, s), 1.82-1.75 (2h, m)。
[0210]
(1d)9h-芴-9-基甲基n-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢吡喃-2-基]氧丙基]氨基甲酸酯(化合物1d)的合成[式64]将步骤(1c)中合成的化合物(16.4g，52.1mmol)溶解在四氢呋喃(200ml)/纯水(50ml)中，并且向其中加入n,n-二异丙基乙胺(12.7ml，72.9mmol)。在冰冷却下，向其中加入n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基氧基]琥珀酰亚胺(21.1g，62.5mmol)，随后在室温下搅拌1.5小时。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂。向其中加入乙醚(100ml)，随后搅拌1小时。将固体产物依次用乙醇、乙酸乙酯和乙醚洗涤，随后减压干燥，以得到含有目标物质1d的粗产物(22.9g)。
[0211]1h-nmr (dmso-d6) δ：7.89 (2h, d, j = 7.3 hz), 7.69 (2h, d, j = 7.3 hz), 7.61 (1h, d, j = 9.1 hz), 7.42 (2h, t, j = 7.3 hz), 7.33 (2h, t, j = 7.3 hz), 7.24 (1h, t, j = 5.7 hz), 4.60-4.57 (2h, m), 4.49 (1h, d, j = 4.2 hz), 4.31-4.18 (4h, m), 3.76-3.28 (8h, m), 3.05-2.97 (2h, m), 1.81 (3h, s), 1.62-1.57 (2h, m)。
[0212]
c26h32n2o8的计算值：[m na] 523，实测值523。
[0213]
(1e)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[3-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)丙氧基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物1e)的合成[式65]向步骤(1d)中合成的化合物(1.56g，3.1mmol)在吡啶(20ml)中的悬浮液中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(1.27g，3.7mmol)，随后在室温下搅拌30分钟。随后，向其中加入乙酸酐(1.18ml，12.5mmol)，随后在室温下搅拌20小时。在反应完成后，加入n,n-二异丙基乙胺(1.1ml，6.2mmol)和乙醇(2ml)，并减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色
谱法(己烷:乙酸乙酯＝75:25-0:100，v/v，含有1％三乙胺)纯化，以得到无定形目标物质1e(2.8g，定量)。
[0214]1h-nmr (cdcl3) δ: 7.77 (2h, d, j = 7.3 hz), 7.62 (2h, d, j = 7.3 hz), 7.43-7.18 (13h, m), 6.83-6.79 (4h, m), 6.03 (1h, d, j = 9.1 hz), 5.55 (1h, d, j = 3.0 hz), 5.14-5.03 (2h, m), 4.46-4.43 (3h, m), 4.24-4.04 (2h, m), 3.97-3.91 (1h, m), 3.85-3.82 (1h, m), 3.77 (6h, s), 3.72-3.71 (1h, m),3.54-3.33 (3h, m), 3.09-3.04 (2h, m), 2.03 (3h, s), 1.89 (6h, s), 1.65-1.56 (2h, m)。
[0215]c52h55
no
12
的计算值：[m na] 908，实测值909。
[0216]
(1f)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-4-乙酰氧基-6-(3-氨基丙氧基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物1f)的合成[式66]向步骤(1e)中合成的化合物(2.49g，2.8mmol)的二氯甲烷(8ml)溶液中加入哌啶(0.45ml，4.5mmol)，随后在室温下搅拌。如果反应不完全，则酌情加入哌啶。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过nh-硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇=100:0-85:15，v/v)纯化，以得到无定形目标物质1f(1.48g，收率79%)。
[0217]1h-nmr (cdcl3) δ：7.39-7.18 (9h, m), 6.83-6.80 (4h, m), 5.55 (1h, d, j = 3.0 hz), 5.51 (1h, d, j = 9.1 hz), 5.27 (1h, dd, j = 11.2, 3.3 hz), 4.64 (1h, d, j = 8.5 hz), 3.98-3.90 (2h, m), 3.84-3.82 (1h, m), 3.79 (6h, s), 3.75-3.74 (1h, m), 3.58-3.56 (1h, m), 3.35 (1h, dd, j = 9.1, 5.4 hz), 3.07 (1h, t, j = 8.5 hz), 2.82-2.74 (4h, m), 2.01 (3h, s), 1.96 (3h, s), 1.89 (3h, s), 1.74-1.69 (2h, m)。
[0218]c37h45
no
10
的计算值：[m na] 687，实测值687。
[0219]
(实施例2)与galnac单元x
18
对应的亚酰胺试剂(具有含有疏水性保护基团的galnac-磷酸酯基团的化合物)的合成(2a)2-[[2-苄氧基-3-[(2-苄氧基-2-氧代-乙基)氨基甲酰氧基]丙氧基]羰基氨基]苄基乙酸酯(化合物2a)的合成[式67]
将2-苄氧基-1,3-丙二醇(2.5g，14mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(5.8g，29mmol)溶解在四氢呋喃(100ml)中，并向其中加入吡啶(5.0ml，61.8mmol)，随后在室温下搅拌20分钟。过滤析出的固体，然后向其中加入四氢呋喃(70ml)。随后，向其中加入甘氨酸苄酯tfa盐(9.2g，33mmol)和n,n-二异丙基乙胺(9.6ml，55mmol)，随后在室温下搅拌过夜。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(己烷:乙酸乙酯=100:0-40:60，v/v)纯化，以得到胶状目标物质2a(6.5g，收率84%)。
[0220]1h-nmr (cdcl3) δ: 7.37-7.33 (15h, m), 5.48 (2h, t, j = 5.4 hz), 5.18 (4h, s), 4.64 (2h, s), 4.23 (4h, d, j = 5.4 hz), 3.99 (4h, d, j = 5.4 hz), 3.84 (1h, t, j = 5.4 hz)。
[0221]c30h32
n2o9的计算值：[m h] 565，实测值565，[m na] 587，实测值587(2b)2-[[3-(羧甲基氨基甲酰氧基)-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]乙酸的合成(化合物2b)[式68]将步骤(2a)中合成的化合物2a(7.3g，2.8mmol)溶解于四氢呋喃(200ml)/纯水(50ml)中。向其中加入20％氢氧化钯-活性炭(约50％水)(3g)，随后在氢气氛下在室温下剧烈搅拌5小时。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除通过流体，以得到含有目标物质2b的粗产物(3.2g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0222]1h-nmr (d2o) δ：4.21-4.14 (5h, m), 3.86 (4h, s)。
[0223]
(2c)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基 1-甲氧基]甲基]四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酰氧基]-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]乙酰基]氨基]丙氧基]-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物2c)的合成[式69]
向步骤(2b)中合成的化合物2b(0.31g，1.05mmol)、步骤(1e)中合成的化合物1f(1.47g，2.21mmol)和n,n-二异丙基乙胺(0.91ml，5.27mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(9ml)的溶液中加入1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(11.3g，29.6mmol)，随后在室温下搅拌3小时。在反应完成后，将反应溶液逐滴加入乙醚(总计185ml)中。将上清液中的溶剂去除后得到的胶状粗产物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇=100:0-15:85，v/v，含有1%三乙胺)纯化，以得到作为固体的目标物质2c(1.05g，收率63%)。
[0224]1h-nmr (cdcl3) δ：7.39-7.17 (18h, m), 6.83-6.80 (8h, m), 6.70-6.27 (2h, m), 5.56-5.54 (2h, m), 5.10 (2h, d, j = 10.9 hz), 4.49-3.02 (44h, m), 2.01 (6h, s), 1.96 (6h, s), 1.90 (6h, s), 1.80-1.63 (4h, m)。
[0225]c81h98
n6o
27
的计算值：[m na] 1611，实测值1611(2d)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酰氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基-丙氧基]羰基氨基]乙酰基]氨基]丙氧基]-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物2d)的合成[式70]
6.70-6.50 (1h, m), 6.16-6.02 (1h, m), 5.56-5.54 (2h, br), 5.11-5.00 (2h, m), 4.53-2.99 (44h, m), 2.01 (6h, s), 1.95 (6h, s), 1.88 (6h, s), 1.77-1.68 (4h, m)。
[0233]c81h98
n6o
27
的计算值：[m na] 1611，实测值1611(3d)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[[2-[[2-[[2-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酰氧基]-3-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基-丙氧基]羰基氨基]乙酰基]氨基]丙氧基]-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物3d)的合成[式74]以与步骤(2d)中相同的方式使用化合物3c(0.31g，1.05mmol)代替化合物2c来得到目标物质3d(0.60g，收率72％)。
[0234]1h-nmr (cdcl3) δ：7.38-7.18 (18h, m), 7.13-6.97 (1h, m), 6.83-6.81 (8h, m), 6.58-6.36 (1h, m), 5.56-5.52 (2h, m), 5.10-5.04 (2h, m), 4.46-2.97 (47h, m), 2.65-2.63 (2h, m), 2.02 (6h, s), 1.95 (3h, s), 1.94 (3h, s), 1.90 (3h, s), 1.89 (3h, s), 1.77-1.67 (4h, m), 1.20-1.16 (12h, m)。
[0235]
(实施例4) 与galnac单元x
20
对应的亚酰胺试剂(具有含有疏水性保护基团的galnac-磷酸酯基团的化合物)的合成(4a)3-[[2-苄氧基-3-[(3-苄氧基-3-氧代-丙基)氨基甲酰氧基]丙氧基]羰基氨基]丙酸苄酯(化合物4a)的合成[式75]
以与步骤(2a)中相同的方式使用3-氨基丙酸苄酯tfa盐(2.4g，8.17mmol)代替步骤(2a)中使用的甘氨酸苄酯tfa盐来得到目标物质4a(1.62g，收率80％)。
[0236]1h-nmr (cdcl3) δ：7.39-7.27 (15h, m), 5.21 (2h, br s), 5.14 (4h, s), 4.63 (2h, s), 4.24-4.10 (4h, m), 3.79-3.74 (1h, m), 3.48-3.44 (4h, m), 2.59 (4h, t, j = 6.0 hz)。c
32h36
n2o9的计算值：[m h] 593，实测值593，[m na] 615，实测值615(4b)3-[[3-(2-羧乙基氨基甲酰氧基)-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]丙酸(化合物4b)的合成[式76]以与步骤(2b)中相同的方式使用化合物4a(1.62g，2.73mmol)代替步骤(2b)中使用的化合物2a来得到目标物质4b(0.89g，定量)。
[0237]1h-nmr (d2o) δ：4.22-4.04 (5h, m), 3.46-3.32 (4h, m), 2.57 (4h, t, j = 6.7 hz)。
[0238]
(4c)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-3-氧代-丙基]氨基甲酰氧基]-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]丙酰基氨基]丙氧基]-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物4c)的合成[式77]以与步骤(2c)中相同的方式使用化合物4b(300mg，0.93mmol)代替步骤(2c)中使用的化合物2b来得到目标物质4c(950mg，收率63％)。
[0239]1h-nmr (cdcl3) δ：7.32-7.24 (18h, m), 6.82-6.80 (8h, m), 6.64-6.61 (1h, br), 6.27-6.24 (1h, br), 5.91-5.88 (1h, br), 5.56 (2h, d, j = 3.0 hz), 5.10 (2h, d, j = 11.5 hz), 4.46-3.05 (43h, m), 2.47-2.37 (4h, m), 2.02 (6h, s), 1.98 (6h, s), 1.90 (6h, s), 1.78-1.67 (4h, m)。
[0240]c83h102
n6o
27
的计算值：[m na] 1638，实测值1638
4.68 (1h, d, j = 7.9 hz), 4.20-4.09 (2h, m), 3.97-3.86 (3h, m), 3.49-3.44 (1h, m), 3.20-3.17 (2h, m), 2.14 (3h, s), 2.05 (3h, s), 2.01 (3h, s), 1.93 (3h, s), 1.66-1.34 (6h, m)。c
27h38
n2o
11
的计算值：[m h]
567，实测值567。
[0251]
(6b)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(5-氨基戊氧基)四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯盐酸盐(化合物6b)的合成[式84]将步骤(6a)中合成的化合物6a(3.87g，6.83mmol)溶解在四氢吡喃(32ml)/1 n盐酸(8ml)中。向其中加入10％钯/碳(湿)(2g)，随后在氢气气氛下在室温下剧烈搅拌。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除通过流体，以得到目标物质6b的粗产物(3.1g，收率97％)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0252]c19h32
n2o9的计算值：[m h]
433，实测值433。
[0253]
(6c)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[5-[[3-[5-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧戊基氨基甲酰氧基]-2-苄氧基-丙氧基]氨基甲酰氨基]戊氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物6c)的合成[式85]将2-苄氧基-1,3-丙二醇(600mg，3.29mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(1.39g，6.91mmol)溶解在四氢呋喃(22ml)中，并向其中加入吡啶(1.1ml，13.2mmol)，随后在室温下搅拌15分钟。过滤析出的固体后，向其中加入四氢呋喃(16ml)。随后，加入步骤(6b)中合成的化合物(6b)(3.09g，6.59mmol)在四氢呋喃(15ml)/二氯甲烷(5ml)和n,n-二异丙基乙胺(3.4ml，19.8mmol)中的溶液，随后在40℃下搅拌2小时。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂。向其中加入二氯甲烷，并将有机层用0.5n盐酸、饱和生理盐水、0.2n氢氧化钠水溶液和饱和生理盐水洗涤，随后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇=100:0-90:10，v/v)纯化，以得到主要含有目标物质6c的混
合物(2.1g)。
[0254]c50h74
n4o
23
的计算值：[m h]
1099，实测值1099。[m na]
1121，实测值1121。
[0255]
(6d)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[5-[[3-[5-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧戊基氨基甲酰氧基]-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]戊氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物6d)的合成[式86]将步骤(6c)中得到的含有化合物6c的混合物(2.1g)溶解在四氢吡喃(20ml)/纯水(1ml)中。向其中加入1n盐酸(0.38ml)和10％钯/碳(湿)(1g)，随后在氢气气氛下在室温下剧烈搅拌。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除所得到的通过流体，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:甲醇=100:0-90:15，v/v)纯化，以得到作为固体的目标物质6d(1.38g，收率72%)。
[0256]1h-nmr(cdcl3) δ：6.10-5.96 (1h, m), 5.38-4.94 (6h, m), 4.70-4.64 (2h, m), 4.23-3.44 (19h, m), 3.20-3.15 (4h, m), 2.15 (6h, s), 2.05 (6h, s), 2.01 (6h, s), 1.97 (6h, s), 1.67-1.38 (12h, m)。
[0257]c43h68
n4o
23
的计算值：[m h]
1009，实测值1009。[m na]
1031，实测值1031。
[0258]
(6e)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[5-[[3-[5-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧戊基氨基甲酰氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基-丙氧基]氨基甲酰氨基]戊氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物6e)的合成[式87]
以与步骤(2d)中相同的方式使用化合物6d(1.38g，1.37mmol)代替步骤(2d)中使用的化合物2c来得到目标物质6e(850mg，收率51％)。
[0259]1h-nmr (cdcl3) δ：5.95-5.89 (1h, m), 5.38-5.26 (4h, m), 5.20-5.16 (1h, m), 5.00-4.95 (1h, m), 4.71-4.68 (2h, m), 4.36-3.44 (22h, m), 3.15 (4h, q, j = 6.4 hz), 2.67 (2h, t, j = 6.3 hz), 2.15 (6h, s), 2.05 (6h, s), 2.01 (6h, s), 1.96 (6h, s), 1.67-1.33 (12h, m), 1.18 (12h, d, j = 6.7 hz)。
[0260]
(实施例7) 与galnac单元x
20
对应的亚酰胺试剂的合成(7a)[(2r,3r,4r,5r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(3-氨基丙氧基)四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯盐酸盐(化合物7a)的合成[式88]将步骤(1a)中合成的化合物1a(10g，18.6mmol)溶解在四氢呋喃(200ml)/1n盐酸(20ml)中。向其中加入10％钯/碳(湿)(1g)，随后在氢气气氛下在室温下剧烈搅拌1小时。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除通过流体，以得到含有目标物质7a的粗产物(8.97g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0261]c17h28
n2o9的计算值：[m h] 405，实测值405。
[0262]
(7b)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-3-氧代-丙基]氨基甲酰氧基]-2-羟基-丙氧基]氨基甲酰氨基]丙酰氨基]丙氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物7b)的合成[式89]
= 3.0 hz), 5.09-5.05 (2h, m), 4.50-4.45 (2h, m), 4.26-3.37 (28h, m), 3.17 (2h, br), 2.67 (2h, t, j = 6.3 hz), 2.52-2.42 (4h, m), 2.17 (6h, s), 2.05 (6h, s), 2.02 (6h, s), 1.99 (6h, s), 1.81-1.70 (4h, m), 1.18 (12h, d, j = 6.7 hz)。
[0267]
(实施例8)x
18-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-t
e2s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用abi 392 dna/rna synthesizer(可获自applied biosystems)作为核酸自动合成仪和nittophase unylinker 100、10
µ
mol(可获自nitto denko corporation)作为固相载体，根据亚磷酰胺法(nucleic acids research, 12, 4539 (1984))合成寡核苷酸序列15e_001，然后使用在实施例2中合成的作为glcnac单元亚酰胺的化合物2d缩合一次。通过用6ml浓缩氨水处理受保护的寡核苷酸类似物而从支持物中切离低聚物，并去除作为磷原子上的保护基团和核碱基上的保护基团的氰乙基。使用clarity qsp(可获自phenomenex inc.)，根据所附手册进行纯化。
[0268]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92位至第106位的序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6247.96)。
[0269]
(实施例9)x
18-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用前述序列15e_001.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0270]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位的序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6233.97)。
[0271]
(实施例10)x
18-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：44)使用前述序列15e_005.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0272]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第105位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1，mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6235.97)。
[0273]
(实施例11)x
18-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2s-u
mlt-h(seq id no：45)
使用上述序列15e_006.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0274]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第90至第104位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6200.94)。
[0275]
(实施例12)x
18-a
m1s-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：42)使用前述序列16e_001.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0276]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第90至第107位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6593.02)。
[0277]
(实施例13)x
18-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m12-c
e2t-h(seq id no：47)使用前述序列16e_002.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0278]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6595.01)。
[0279]
(实施例14)x
18-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2s-u
mlt-h(seq id no：48)使用上述序列16e_003.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0280]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第90至第105位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6571.98)。
[0281]
(实施例15)x
20-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用实施例4中制备的化合物4d作为galnac单元亚酰胺代替化合物2d，将x
18
替换为x
20
，以与实施例8中相同的方式进行合成。使用的序列是前述序列15e_001.5。
[0282]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第
106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6261.98)。
[0283]
(实施例16)x
20-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：44)使用前述序列15e_005.5，以与实施例15中相同的方式进行合成。
[0284]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第105位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6264.00)。
[0285]
(实施例17)x
20-a
mls-a
mls-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：42)使用前述序列16e_001.5，以与实施例15中相同的方式进行合成。
[0286]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第107位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6621.04)。
[0287]
(实施例18)x
20-a
mls-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：47)使用前述序列16e_002.5，以与实施例15中相同的方式进行合成。
[0288]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6623.05)。
[0289]
(实施例19)x
21-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用实施例5中合成的化合物5d作为galnac单元亚酰胺，将x
18
替换为x
21
，以与实施例8中相同的方式进行合成。使用的序列是前述序列15e_001.5。
[0290]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6290.02)。
[0291]
(实施例20)x
22-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)
使用实施例6中合成的化合物6d作为galnac单元亚酰胺，将x
18
替换为x
22
，以与实施例8中相同的方式进行合成。使用的序列是前述序列15e_001.5。
[0292]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6175.96)。
[0293]
(实施例21)x
22-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：44)使用前述序列15e_005.5，以与实施例20中相同的方式进行合成。
[0294]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第105位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6177.98)。
[0295]
(实施例22)x
22-a
m1s-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：42)使用前述序列16e_001.5，以与实施例20中相同的方式进行合成。
[0296]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第107位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6535.03)。
[0297]
(实施例23)x
22-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：47)将该序列替换为前述序列16e_002.5，以与实施例20中相同的方式进行合成。
[0298]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6537.05)。
[0299]
(实施例24)x
20-g
e2s-c
e2s-a
s-t
s-t
s-g
s-g
s-t
s-a
s-t
s-t
e2s-c
e2s-a
e2t-h(seq id no：96)使用前述与人载脂蛋白b (apob) genbank登录号nm_000384.2的第10177-10189位核酸序列互补的序列代替实施例15中使用的序列，以与实施例15相同的方式合成galnac单元与寡核苷酸的偶联物(apob-aso偶联物)。在前述方法中，合成具有前述序列的寡核苷酸后，终止合成，随后切除/收集，以合成没有结合galnac单元的寡核苷酸(apob-aso)。该化合物通过负离子esi质谱进行鉴定(测量值：5296.83(apob-aso偶联物)和4392.50(apob-aso))。
[0300]
(实验例1)使用培养细胞评价实施例化合物对异常剪接的修复
(1-1) 293a细胞(人胎肾细胞)的培养如下培养293a细胞(r705-07 invitrogen)。
[0301]
293a细胞在维持培养基(dmem，10�s)中维持和培养。在实验中，细胞以2
×
105个细胞/孔的密度接种在6孔板上，并以1
×
105个细胞/孔的密度接种在12孔板上，并且如后所述，在第二天同时导入每个实施例的化合物和质粒载体以用于评价。
[0302]
(1-2)人g6pc全长质粒载体的制备如下制备人g6pc全长质粒载体(pcdna hg6pc、pcdna hg6pc (c.648g》t) int4)。
[0303]
使用human multiple tissuec dna panel作为模板，使用以下g6pc cdna扩增引物扩增g6pc cdna，然后使用g6pc cdna if引物进一步扩增。使用infusion system(pcdna hg6pc)将扩增的片段插入到pcdna3.1的bamhi位点中。
[0304]
g6pc cdna扩增引物：正向引物5'-atagcagagcaatcaccaccaagcc-3'(seq id no：49)反向引物5'-attccacgacggcagaatggatggc-3'(seq id no：50)g6pc if引物：正向引物5'-taccgagctcggatccaccaccaagcctggaataactgc-3'(seq id no：51)反向引物5'-ctggactagtggatcctggcatggttgttgactttaaac-3'(seq id no：52)使用人类基因组dna作为模板并使用以下g6pc int4 扩增引物，扩增出g6pc intron4和部分含有外显子5的区域，并用g6pc int4 if引物进一步扩增g6pc intron4。此外，使用以下hg6pc载体if引物扩增在步骤1-1中产生的pcdna hg6pc。将第5位外显子中的c.648g》t突变导入infusion引物中。两个片段通过infusion system连接，并将g6pc intron4序列插入pcdna hg6pc(pcdna hg6pc(c.648g》t) int4)中。
[0305]
g6pc int4扩增引物：正向引物5'-tctgggctgtgcagctgaatgtctg-3'(seq id no：53)反向引物5'-gtaggggatgacactgacggatgcc-3'(seq id no：54)g6pc int4 if引物：正向引物5'-ctggagtcctgtcaggtatgggc-3'(seq id no：55)反向引物5'-agctgaaaaggaagaaggtaatgag-3'(seq id no：56)hg6pc载体if引物：正向引物5'-tcttccttttcagcttcgccatcgg-3'(seq id no：57)反向引物5'-ctgacaggactccagcaacaac-3'(seq id no：58)(1-3)实施例化合物与质粒载体的共转染如下共转染各实施例的化合物和质粒载体。
[0306]
制备以下溶液a和溶液b，然后混合。
[0307]
在使用6孔板、250
µ
l opti-mem培养基(gibco)的情况下，每孔制备0.50
µ
l质粒载体(1mg/ml)和4.0
µ
l(最终：20nm)每个实施例中产生的化合物(12.5
µ
m)作为溶液a以及250
µ
l opti-mem培养基(gibco)和6.0
µ
l lipofectamine2000(invitrogen)作为溶液b，并将溶液a和溶液b混合。在使用12孔板125
µ
l、opti-mem培养基(gibco)的情况下，每孔制备0.25
µ
l质粒载体(1mg/ml)和2.0
µ
l(最终：20nm)每个实施例中产生的化合物(12.5
µ
m)作为溶液a以及125
µ
l opti-mem培养基(gibco)和3.0
µ
l lipofectamine2000(invitrogen)作为溶液b，
并将溶液a和溶液b混合。
[0308]
混合溶液在室温下孵育20分钟，然后在传代后的第二天添加到细胞中(共转染)。添加6小时后用新鲜的维持培养基更换培养基，并从添加混合溶液开始，将混合物在co2培养箱中培养24小时。
[0309]
(1-4)通过rt-pcr评价mrna[1] rna提取(体外)如下提取rna。
[0310]
共转染后孵育24小时的细胞用冷pbs洗涤一次。以每孔300
µ
l的量向其中加入rneasy微试剂盒或rneasy96试剂盒(qiagen k.k.)的细胞溶解物，并在室温下孵育5分钟后收集。根据包括dnase处理的试剂盒手册对收集的溶液进行rna纯化。rnase-free dnase set(qiagen k.k. 89254)用于dnase处理。对纯化/洗脱的rna进行后述的逆转录反应。
[0311]
[2] 逆转录反应如下进行逆转录反应。
[0312]
将提取的rna调整至25-100mg/ml后，每个样品使用high capacity rna-to-cdna试剂盒(applied biosystems)将10
µ
l缓冲剂混合物、1
µ
l酶混合物、9
µ
l纯化水和提取的rna混合，用于逆转录反应(37℃ 60分钟，95℃ 5分钟，4℃ 保持)。
[0313]
20
µ
l的逆转录反应产物用80
µ
l纯化水稀释5倍并在-30℃下储存。
[0314]
[3] qrt-pcr(sybr green)如下设计qrtpcr引物(sybr green)。
[0315]
修复的hg6pc引物(sybr)：正向引物5'-ttgtggttgggattctgggc-3'(seq id no：59)反向引物5'-atgctgtggatgtggctgaa-3'(seq id no：60)hactin引物(sybr)：正向引物5'-tggcacccagcacaatgaa-3'(seq id no：61)反向引物5'-ctaagtcatagtccgcctagaagca-3'(seq id no：62)每孔悬浮5
µ
l 2x fast sybr green master mix(applied biosystems)、2
µ
l纯化水、1
µ
l 引物混合物(10
µ
m)和2
µ
l cdna(稀释5倍)作为pcr反应溶液，以使用viia7(applied biosystems)(程序：sybr green regents，fast，包括解链曲线)进行pcr反应。
[0316]
[4] qrt-pcr(taqman检测)如下设计修复的hg6pc引物组和总hg6pc引物组，并调整20x引物探针混合物(引物浓度：1000nm探针浓度：250nm)。对于hactin引物组和mactin引物组，原液按原样使用。
[0317]
修复的hg6pc引物组(taqman)：正向引物5'-gctgctcattttcctcatcaagtt-3'(seq id no：63)反向引物5'-tggatgtggctgaaagtttctgta-3'(seq id no：64)探针5'-tcctgtcaggcatgc-3' fam(seq id no：65)hactin引物组(taqman)：abi hs01060665_g1 fammactin引物组(taqman)：abi mm02619580_g1 fam18s引物组(taqman)：abi hs99999901_s1 fam每孔悬浮5
µ
l 2x taqman fast advanced master mix(applied biosystems)、
2.5
µ
l纯化水、0.5
µ
l 20x 引物探针混合物(10
µ
m)和2
µ
l cdna(稀释5倍)以调整pcr反应溶液(每管)并以使用viia7或quantstadio7(applied biosystems)进行pcr反应(程序：taqman regents，fa)。
[0318]
(1-5) 使用人g6pc全长质粒载体(pcdna hg6pc(c.648g》t) int4)评价实施例寡核苷酸对g6pc mrna异常剪接的修复对人g6pc全长质粒载体(pcdna hg6pc(c.648g》t) int4)和各个寡核苷酸(15e_001、15e_002和国际公开号wo 2004/048570的实施例93的化合物作为对照)进行共转染并通过qrt-pcr(sybr green)评价是否修复了由g6pc(c.648g》t)引起的异常剪接。结果，g6pc mrna的异常剪接在15e_001和15e_002的化合物中被正常化。
[0319]
(实验例2)使用模型小鼠评价实施例化合物对异常剪接的修复(2-1)小鼠的产生载体的产生根据以下程序，制备g6pc ki载体。
[0320]
使用小鼠基因组dna作为模板并使用以下mg6pc 5'臂扩增引物，扩增出g6pc 5'臂区域。用mg6pc 5'臂if引物进一步扩增，然后插入pbluescriptii( /-)的xhoi位点(g6pc 5'臂载体)中。
[0321]
mg6pc 5'臂扩增引物：正向引物5'-gggaaacatgcatgaagccctgggc-3'(seq id no：67)反向引物5'-tcccttggtacctcaggaagctgcc-3'(seq id no：68)mg6pc5'臂if引物：正向引物5'-cgggccccccctcgaaaactaggcctgaagagatggc-3'(seq id no：69)反向引物5'-taccgtcgacctcgagggttggccttgatccctctgcta-3'(seq id no：70)然后，使用小鼠基因组dna作为模板并使用以下mg6pc 3'臂扩增引物，扩增出g6pc 3'臂区域。用mg6pc 3'臂if引物进一步扩增，并插入g6pc 5'臂载体(g6pc 5' 3'臂载体)的noti位点中。
[0322]
mg6pc 3'臂扩增引物：正向引物5'-ggttgagttgatcttctacatcttg-3'(seq id no：71)反向引物5'-gcaagagagccttcaggtagatccc-3'(seq id no：72)mg6pc 3'臂if引物：正向引物5'-agttctagagcggccgcccatgcaaaggactaggaacaac-3'(seq id no：73)反向引物5'-accgcggtggcggccaatgttgcctgtcttcctcaatc-3'(seq id no：74)使用前述pcdna hg6pc(c.648g》t) int4作为模板并使用以下hg6pc int4 if引物，扩增出hg6pc(c.648g》t) intron4。使用g6pc 5' 3'臂载体作为模板和以下臂载体if引物进一步扩增。使用infusion system连接这两个片段以产生g6pc ki载体。
[0323]
hg6pc int4 if引物：正向引物5'-ggccaaccctggaataactgcaagggctctg-3'(seq id no：75)反向引物5'-ttgcatggttgttgactttaaacaccgaaga-3'(seq id no：76)臂载体if引物：正向引物5'-tcaacaaccatgcaaaggactaggaacaac-3'(seq id no：77)
反向引物5'-attccagggttggccttgatccctctgcta-3'(seq id no：78)将以下ki 5' grna和ki 3' grna序列导入pspgrna(addgene)的grna序列导入区域中以产生pspgrna(ki 5')和pspgrna(ki 3')。
[0324]
ki 5' grna：5'-gggatcaaggccaaccggctgg-3'(seq id no：79)ki 3' grna：5'-taaagtcaaccgccatgcaaagg-3'(seq id no：80)(2-2) 显微注射使用无菌蒸馏水将各种载体调整到最终浓度：g6pc ki载体为10ng/
µ
l、pspgrna(ki 5')为5ng/
µ
l、pspgrna(ki 3')为5ng/
µ
l和pspcas9(addgene)为5ng/
µ
l，并通过millex-gv注射器过滤器(millipore)分别注射到c57bl/6j小鼠受精卵的原核充分膨胀的程度(约2pl)。将受精卵移植到受体c57bl/6j小鼠的输卵管中以得到f0小鼠。
[0325]
(2-3) 基因分型、f1系统化通过以下程序进行基因分型以进行f1系统化。
[0326]
使用自动核酸提取器(pi-200，可获自kurabo industries ltd.)和特殊试剂盒从f0小鼠的尾部组织中提取基因组dna。使用amplitaq gold master mix(thermo fisher scientific)和以下ki筛选引物对提取的dna进行扩增(95℃ 10分钟、35个循环(95℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 30秒)，72℃ 2分钟，4℃保持)。
[0327]
ki筛选引物：正向引物5'-tacgtcctcttccccatctg-3'(seq id no：81)，反向引物5'-ctgacaggactccagcaaca-3'(seq id no：82)将前述pcr产物进行凝胶电泳，并使用以识别为433bp左右的条带的个体的基因组dna作为模板、primestar gxl(takara bio inc.)和以下ki基因分型引物(98℃ 2分钟、38个循环(95℃ 15秒、68℃ 5分钟)，68℃ 7分钟，15℃保持)进行扩增。
[0328]
ki基因分型引物(5')：正向引物5'-ttccttccaaagcagggactctctatgt-3'(seq id no：83同(1))反向引物5'-cttgcagaaggacaagacgtagaagacc-3'(seq id no：84同(2))ki基因分型引物(3')：正向引物5'-gagtctatattgagggcaggctggagtc-3'(seq id no：85)，反向引物5'-tagtctgcctgctcactcaacctctcct-3'(seq id no：86)对前述pcr产物进行凝胶电泳。使用个体基因组dna的ki基因分型引物(5')的pcr产物使用gentetic分析仪(lifetechnology)和以下ki序列引物进行直接测序，所述个体基因组dna的序列长度(4705bp和4026bp)如预期是使用ki基因分型引物(5')和ki基因分型引物(3')中任何一个扩增的。具有ki为预期序列的那些被用作ki阳性f0。
[0329]
ki序列引物(5')：5'-gagtctatattgagggcaggctggagtc-3'(seq id no：87)ki阳性f0与c57bl/6j交配以获得f1。使用dneasy 96 blood & tissue kit(qiagen k.k.)从f1的耳廓组织中提取基因组dna，并使用primestar gxl(takara bio inc.)和前述ki基因分型引物(5')进行扩增(98℃ 2分钟、38个循环(95℃ 15秒、68℃ 5分钟)，68℃ 7分钟，15℃ 保持)。
[0330]
将前述pcr产物进行凝胶电泳，将具有如预期扩增的序列长度的个体(4705b)用作ki阳性f1。将从ki阳性f1中选择的一个系进行增殖以产生hg6pc(c.648g》t) int4 ki系。
[0331]
(2-4) hg6pc(c.648g》t) int4系的基因分型使用dneasy 96 blood & tissue kit(qiagen k.k.)从耳廓组织中提取基因组dna，并使用kod fx(toyobo co., ltd.)和以下ki基因分型引物和mg6pc wt引物进行复合扩增(98℃ 2分钟、32个循环(95℃ 15秒，68℃ 5.5分钟)，68℃ 5分钟，4℃保持)。
[0332]
ki基因分型引物(5')：正向引物5'-ttccttccaaagcagggactctctatgt-3'(seq id no：83同(1))反向引物5'-cttgcagaaggacaagacgtagaagacc-3'(seq id no：84同(2))mg6pc wt引物：正向引物5'-taaatttgaccaatgagcactggagggtc-3'(seq id no：88)反向引物5'-aaaatcatgtgtatgcgtgcctttccta-3'(seq id no：89)，将前述pcr产物进行凝胶电泳，并确定后代的基因分型(wt、ht或homo)，同时将4705b附近的扩增指定为ki等位基因，并将2536bp附近的扩增指定为mg6pc wt等位基因。
[0333]
(2-5) 小鼠的采样如下进行小鼠的采样。
[0334]
在采样前一天的晚上，在安装地板网后开始禁食以避免食粪。次日，在麻醉下开腹，并在充分放血后取出肝和肾。用冰冷的pbs清洗各个器官，然后修剪成适当的大小，并保存在预先装有均质化的珠子(nikkato corporation)的试管中。每个器官立即用液氮冷却，然后在-80℃下储存。
[0335]
(2-6) 通过qrtpcr评价mrna[1]rna提取(体内)如下提取rna。
[0336]
以每个组织储存管600
µ
l的量添加rneasy微试剂盒或qiacube系统(qiagen k.k.)的细胞溶解物，用于在组织lyserii(qiagen k.k.)中以25khz均质化2分钟。在冰冷却下孵育10分钟后，通过在室温下以8000g离心10分钟来收集上清液。根据包括dnase处理的每个试剂盒的手册对上清液进行rna纯化。rnase-free dnase set(qiagen k.k.)用于dnase处理。将纯化/洗脱的rna进行前述逆转录反应，并根据前述qrt-pcr(taqman测定)对修复的g6pc mrna进行定量。
[0337]
(2-7) 使用hg6pc(c.648g》t) int4 ht ki小鼠评价实施例化合物对异常剪接的修复将实施例8至14的化合物各自溶解在otsuka生理盐水注射液中，并以30mg/kg皮下施用于hg6pc(c.648g》t) int4 ht ki小鼠。施用7天后，在过夜禁食的条件下收集小鼠的肝组织，并且通过qrt-pcr(taqman)评价g6pc(c.648g》t)引起的异常剪接是否得到修复。结果，hg6pc(c.648g》t) int4 ht ki小鼠肝脏中mrna的异常剪接被实施例8至14的化合物正常化，如图1中所示。此外，以相同方式评价实施例15至23的化合物。结果，hg6pc(c.648g》t) int4 ht ki小鼠肝脏中mrna的异常剪接被实施例15至23的化合物正常化，如图2中所示。
[0338]
(实验例3)使用apob敲低试验评价通过galnac单元偶联物向肝细胞递送寡核苷酸(3-1)人原代肝细胞的培养如下培养人原代肝细胞。
[0339]
将fbs(gibco)添加至modified lanford medium(nissui pharmaceutical co.,
ltd.)至10％，以制备粘附培养基。从液氮罐中取出冷冻的人原代肝细胞(gibco，hu8105)，37℃下解冻，然后立即倒入chrm(invitrogen)中，并轻轻混合，随后在室温下离心(100g，10分钟)。用抽吸器去除上清液，然后将粘附介质加热至37℃加入，以制备细胞悬液。通过自动计数器(bio-rad laboratories, inc.)对活细胞数进行计数，然后将细胞接种在胶原包被的24孔板上(接种的活细胞数：1.4-2.1
×
105细胞/孔)。在co2培养箱中培养4至5小时后，用显微镜确认贴壁的细胞，并且进行下述的化合物添加实验。
[0340]
(3-2)实施例化合物的添加每个实施例的化合物如下添加到人原代肝细胞中。
[0341]
向含有10% fbs的modified lanford medium中加入没有结合galnac衍生物的参考实施例45的化合物或结合有galnac衍生物的实施例208的化合物，以制备具有目标浓度(其为apob mrna表达评价中的100nm(1)和apob mrna表达评价中的10nm和100nm(2)，如下所述)的含有化合物的培养基。在通过抽吸已去除24孔板中培养的各孔中的人原代肝细胞培养基后，以各0.5ml的量加入含有化合物的培养基，以开始孵育。72小时后，进行后述的rna提取实验。
[0342]
(3-3) 通过qrt-pcr评价mrna[1] rna提取(体外)如下提取rna。
[0343]
孵育后，通过抽吸去除人原代肝细胞的每个孔中的含有化合物的培养基，并用冰冷的pbs(0.5ml)洗涤细胞。将1/100量的2-巯基乙醇添加到rneasy mini qiacube kit(qiagen k.k.)的rlt缓冲剂中以制备细胞溶解物。以每孔400
µ
l的量添加细胞溶解物并在室温下孵育5分钟后收集。rna是根据rneasy mini-animal组织和细胞-dnase消化的手册使用qiacube从350
µ
l收集的溶液中纯化rna。rnase-free dnase set(qiagen k.k.)用于dnase处理。对纯化/洗脱的rna进行后述的逆转录反应。
[0344]
[2] 逆转录反应如下进行逆转录反应。将提取的rna调整至25-100mg/ml后，使用high capacity rna-to-cdna试剂盒(applied biosystems)对10
µ
l缓冲剂混合物、1
µ
l酶混合物、9
µ
l纯化水和提取的rna进行每样品混合以用于逆转录反应(37℃ 60分钟，95℃ 5分钟，4℃ 保持)。用80
µ
l纯化水将20
µ
l逆转录反应产物稀释5倍并在-30℃下储存或如下通过qrt-pcr评价。
[0345]
[3] qrt-pcr(taqman检测)使用以下apob引物探针组(x20)和actinb引物探针组(x20)。
[0346]
apob引物探针组(x20) (taqman)：abi hs00181142_m1 famactinb引物探针组(x20) (taqman)：abi hs01060665_g1 fam每孔悬浮5
µ
l 2x taqman fast advanced master mix(applied biosystems)、2.5
µ
l纯化水、0.5
µ
l 20x引物探针混合物(10
µ
m)和2
µ
l cdna(稀释5倍)以调整pcr反应溶液(每管)并使用quantstadio7(applied biosystems)进行pcr反应(95℃ 20秒、40个循环(95℃ 1秒，60℃ 20秒)，4℃ 保持)。使用actinb作为内源性对照，评价apob mrna的相对表达水平。
[0347]
(3-4) 使用人肝培养细胞评价实施例化合物对apob mrna表达的抑制(2)添加实施例24中合成的调整为10nm和100nm的化合物，同时接种人原代肝细胞，并
且通过qrt-pcr(taqman测定)评价培养72小时后细胞中apob mrna的表达。如图3中所示，当以未添加化合物的4个孔中apob mrna的平均表达为100%时，10nm apob-aso被抑制4.4%的表达并且apob-aso偶联物被抑制30.3%的表达。100nm apob-aso被抑制41.2%的表达并且apob-aso偶联物被抑制68.6%的表达。这表明与没有结合galnac衍生物的化合物相比，结合有galnac衍生物的化合物可以更强烈地抑制表达。
[0348]
(实施例25) 与galnac单元结合的寡核苷酸的dmtr-on离子交换柱纯化，所述galnac单元在galnac部分中的6位羟基上具有4,4'-二甲氧基三苯甲基(1) 低聚物的合成及混合溶液的制备合成实施例16中描述的化合物。然而，akta oligopilot(可获自ge healthcare)用作核酸自动合成仪，primer support 5g unylinker 350、390
µ
mol(可获自ge healthcare)用作固相载体，并使用适合于规模的合成程序。在合成完成后，获得了偶联物和具有靶寡核苷酸序列的寡核苷酸类似物的混合物，其中所述靶寡核苷酸序列的galnac部分的6位羟基被4,4'-二甲氧基三苯甲基保护。将所得混合物分成两份，并且每份用25ml浓缩氨水处理以从支持物中切除寡核苷酸，同时去除作为磷原子上的保护基团和核碱基上的保护基团的氰乙基和使用具有过滤器的试管过滤，以得到含有目标偶联物的寡核苷酸混合溶液(25ml) (两瓶)。使用akta pure150(可获自ge healthcare)作为纯化装置，用填料source 15q(96ml)(可获自ge healthcare)填充柱fineline pilot(35mm x 100mm)(可获自ge healthcare)，前述寡核苷酸混合物通过以下方法分两批进行纯化。将uv检测波长设定为260nm、280nm或350nm，并且以下三个步骤用作一个纯化程序。图5显示了在检测波长260nm和350nm下检测吸收的色谱图，因为在这些步骤中检测到柱通过流体。
[0349]
(i) dmtr-on寡核苷酸吸附在柱上的步骤将流速设定为40ml/min，并倒入1cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。将流速更改为10ml/min，将寡核苷酸混合物(25ml)添加到柱顶部，并释放170ml缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。随后，将流速设定为40ml/min，并倒入1cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。随后，倒入6cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)：缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)(35:65)，以洗去没有结合x
20
的寡核苷酸和杂质。最后，倒入2cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。
[0350]
(ii) 柱上脱-dmtr转换步骤将流速设定为40ml/min，并倒入1cv缓冲剂a2(0.4％三氟乙酸水溶液)。随后，将流速更改为20ml/min，并倒入6.25cv，从而对吸附在柱填料上的结合有x
20
的寡核苷酸进行脱-dmtr转化。
[0351]
(iii) 洗脱目标物质的步骤将流速设定为40ml/min，并倒入3cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)进行平衡。从(75:25)至(25:75)来梯度进料(15cv)缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)：缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)后，倒入2cv缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)，以分级分离脱-dmtr转化的寡核苷酸(分级分离的量为48ml)。
[0352]
使用显微分光光度计xpose(可获自trinean nv)检查洗脱期间通过uv(260nm)检测到的级分，以获得级分溶液(第一次：432ml，并且第二次：480ml)(图5)。
[0353]
在柱使用一次后，在进行下一次纯化前用含有30％异丙醇的2m氯化钠水溶液洗
涤。
[0354]
(2) 浓缩、透析以及冷冻干燥将级分溶液(第一次：432ml，并且第二次：480ml)合并为一个，并且向其中加入适量乙酸，以制备ph为7.5至8.0的混合物。之后，使用配备有xampler超滤筒3k、140cm2(ge healthcare)的kr2i tff系统(repligen corporation)进行浓缩，然后相对otsuka蒸馏水透析，随后冷冻干燥。得到目标物质的冻干粉(总计1.14g)。
[0355]
(比较例1) 用在寡核苷酸附近导入dmtr相来dmtr-on离子交换柱纯化偶联物为了与实施例25进行比较，对如下所示的由x
13
组成的galnac偶联物进行dmtr-on离子交换柱纯化。x
13
所含的galnac上的3位羟基、4位羟基和6位羟基的保护基团可以统一为乙酰基。这消除了在合成步骤中区分保护基团的需求，并因此有助于合成galnac单元部分。另外，通过调整固相合成步骤中与5'端的寡核苷酸的偶联次数，可以容易地增加或减少galnac的数量。然而，在完成低聚物的固相合成后，可以仅留下一个4,4'-二甲氧基三苯甲基。
[0356]
[比较例1-1] 与x13对应的galnac单元亚酰胺(化合物ref1f)的合成(ref1a) 9h-芴-9-基甲基n-[2-[2-[(2r)-3-苄氧基-2-羟基-丙氧基]乙氧基]乙基]氨基甲酸酯(化合物ref1a)的合成[式91]将作为文献(bioconjugate chemistry, 2000, 11, 755-761)中已知的化合物9h-芴-9-基甲基n-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]氨基甲酸酯(3.11g，10mmol)和苄基(s)-( )-缩水甘油醚(0.8g，5mmol)溶解于二氯甲烷(30ml)中，并向其中加入三氟化硼-乙醚络合物(0.1ml，1mmol)，随后在室温下搅拌16小时。在反应完成后，加入饱和碳酸氢钠水溶液。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和生理盐水洗涤，随后用无水硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(己烷:乙酸乙酯=80:20-0:100，v/v)进行纯化，以得到油状目标物质ref1a(0.74g，收率30%)。
[0357]1h-nmr (cdcl3) δ：7.76 (2h, d, j = 7.9 hz), 7.60 (2h, d, j= 7.3 hz), 7.42-7.37 (2h, m), 7.35-7.27 (7h, m), 5.40 (1h, s), 4.53 (2h, s), 4.39 (2h, d, j = 6.7 hz), 4.25-4.19 (1h, m), 4.04-3.97 (1h, m), 3.69-3.35 (12h, m)。
[0358]c29h33
no6的计算值：[m h]
492，实测值492。
[0359]
(ref1b) (2r)-1-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]-3-苄氧基-丙烷-2-醇,三氟乙酸酯(化合物ref1b)的合成[式92]
将步骤(ref1a)中合成的化合物ref1a(13.8g，28.1mmol)溶解在乙醇/四氢呋喃(50ml/50ml)中，并向其中加入1n氢氧化钠水溶液(100ml)，随后在室温下搅拌2小时。在反应完成后，减压蒸馏去除有机溶剂，并加入1n盐酸(100ml)。通过过滤去除所产生的固体产物。将作为通过流体的水层中所含的副产物用乙酸乙酯提取并减压蒸馏去除，并在得到的残留物中加入乙腈，随后进行过滤。在减压下蒸馏去除通过流体以获得粗产物。使用0.1％三氟乙酸水溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液作为洗脱液，通过反相hplc(gl sciences inc.，inertsil ods-3)进行分离和纯化，合并含有目标物质的级分，并且减压蒸馏去除溶剂，以得到油状目标物质ref1b(7.1g，收率66％)。
[0360]1h-nmr (cdcl3) δ：7.38-7.27 (5h, m), 4.55 (2h, s), 4.07-3.99 (1h, m), 3.77-3.48 (10h, m), 2.96-2.88 (2h, m)。
[0361]
(ref1c) 乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2r)-3-苄氧基-2-羟基-丙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯(化合物ref1c)的合成[式93]将作为文献(国际公开号wo 2012037254)中已知化合物的2-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸(6g，14.8mmol)、1-(-3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.4g，17.8mmol)、3h-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶-3-醇(2.0g，14.8mmol)、n,n-二异丙基乙胺(9.0ml，51.8mmol)和步骤(ref1b)中合成的化合物ref1b(6.7g，17.5mmol)溶解在二氯甲烷(130ml)中，随后在室温下搅拌4小时。在反应完成后，有机层用1n盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和生理盐水洗涤，随后用无水硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:甲醇=100:0-90:10，v/v)纯化，以得到无定形目标物质ref1c(7.9g，收率81%)。
[0362]1h-nmr (cdcl3) δ：7.39-7.28 (5h, m), 7.00-6.93 (1h, m), 6.50-6.44 (1h, m), 5.33-5.29 (1h, m), 5.16 (1h, dd, j = 11.5, 3.6 hz), 4.63-4.53 (3h, m), 4.34 (1h, d, j = 15.1 hz), 4.22-3.83 (5h, m), 3.73-3.26 (13h, m), 2.15 (3h, s), 2.05 (3h, s), 1.99 (6h, s)。
[0363]c30h44
n2o
14
的计算值：[m h]
657，实测值657。
[0364]
(ref1d)乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2r)-2,3-二羟基丙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基乙酸
酯(化合物ref1d)的合成[式94]将步骤(ref1c)中合成的化合物ref1c(7.9g，12mmol)溶解在乙醇(80ml)中。向其中加入20％氢氧化钯/碳(湿)(2.0g)，随后在50℃下在氢气气氛下剧烈搅拌8小时。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除通过流体。获得无定形目标物质ref1d(6.7g，收率98%)。
[0365]1h-nmr (cdcl3) δ：7.03-6.98 (1h, m), 6.43 (1h, d, j = 9.1 hz), 5.35 (1h, d, j = 3.3 hz), 5.15 (1h, dd, j = 11.2, 3.3 hz), 4.58 (1h, d, j = 7.9 hz), 4.35 (1h, d, j = 15.7 hz), 4.28-3.82 (5h, m), 3.77-3.34 (13h, m), 2.18 (3h, s), 2.06 (3h, s), 2.03 (3h, s), 2.01 (3h, s)。
[0366]c23h38
n2o
14
的计算值：[m h]
568，实测值568。
[0367]
(ref1e) 乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2s)-3-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-2-羟基-丙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯(化合物ref1e)的合成[式95]将适量的吡啶加入步骤(ref1d)中合成的化合物ref1d(6.8g，12mmol)中并减压共沸。将其溶解在吡啶(40ml)中，并向其中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.5g，13mmol)，随后在室温下搅拌2小时。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂。在加入适量甲苯并共沸后，得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:乙酸乙酯/甲醇(5/1)=100:0-50:50，v/v，含有1%三乙胺)纯化，以得到无定形目标物质ref1e(6.9g，收率66%)。
[0368]1h-nmr (cdcl3) δ: 7.42 (2h, d, j = 7.9 hz), 7.33-7.19 (7h, m), 7.01-6.94 (1h, m), 6.83 (4h, d, j = 9.1 hz), 6.37 (1h, d, j = 8.5 hz), 5.33 (1h, d, j = 3.3 hz), 5.15 (1h, dd, j = 11.2, 3.3 hz), 4.58 (1h, d, j = 7.9 hz), 4.32 (1h, d, j = 15.7 hz), 4.22-3.86 (5h, m), 3.79 (6h, s), 3.66-3.12 (13h, m), 2.13 (3h, s), 2.03 (3h, s), 1.97 (3h, s), 1.95 (3h, s)。
[0369]c44h56
n2o
16
的计算值：[m na]
893，实测值892。
[0370]
(ref1f) 乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2s)-3-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基-丙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯(化合物ref1f)的合成[式96]将步骤(ref1e)中合成的化合物ref1e(6.9g，7.9mmol)与适量甲苯共沸，然后溶解于二氯甲烷(80ml)中。向其中加入n,n-二异丙基乙胺(5.5ml，32mmol)和2-氰基乙基二异丙基氯亚磷酰胺(2.1ml，9.5mmol)，随后在室温下搅拌1小时。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:乙酸乙酯/甲醇(5/1)=100:0-50:50，v/v，含有1%三乙胺)纯化，以得到无定形目标物质ref1f(6.6g，收率78%)。
[0371]1h-nmr (cdcl3) δ: 7.47-7.40 (2h, m), 7.35-7.17 (7h, m), 6.98-6.91 (1h, m), 6.85-6.78 (4h, m), 6.05-5.89 (1h, m), 5.37-5.33 (1h, m), 5.17-5.07 (1h, m), 4.59-4.49 (1h, m), 4.37-4.30 (1h, m), 4.23-3.06 (28h, m), 2.69-2.42 (2h, m), 2.15 (3h, s), 2.05 (3h, s), 2.02-1.98 (3h, m), 1.97-1.94 (3h, m), 1.30-1.00 (12h, m)。
[0372]
[比较例1-2] 导入有x13的偶联物的合成ho-x
13-x
13-x
13-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-t
e2s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用化合物ref1f作为galnac单元亚酰胺将x
18
替换为x
13
，以与实施例8中相同的方式进行合成。然而，galnac单元亚酰胺的加成反应重复3次以结合三个x13。
[0373]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6878.11)。
[0374]
[比较例1-3] 与galnac单元结合的寡核苷酸的dmtr-on离子交换柱纯化，所述galnac单元在5'端具有4,4'-二甲氧基三苯甲基(1) 低聚物的合成及混合溶液的制备ho-x
13-x
13-x
13-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-t
e2s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)akta oligopilot(可获自ge healthcare)用作核酸自动合成仪，primer support 5g unylinker 350、390
µ
mol(可获自ge healthcare)用作固相载体，并使用适合于规模的合成程序。使用10
µ
mol获得的固相载体，galnac单元x
13
用abi 392 dna/rna合成仪(可获自
applied biosystems)浓缩3次。在合成完成后，获得具有目标寡核苷酸序列并与在5'端具有4,4'-二甲氧基三苯甲基的galnac单元结合的寡核苷酸类似物的混合物。通过用6ml浓缩氨水处理从支持物中切下寡核苷酸，并去除作为磷原子上的保护基团和核碱基上的保护基团的氰乙基。
[0375]
纯化方法1：clarity qsp(可获自phenomenex inc.)纯化通过以与实施例8中相同的方式进行纯化来得到目标物质。
[0376]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位的序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6878.11)。
[0377]
纯化方法2：dmtr-on离子交换柱纯化在dmtr-on离子交换柱纯化之前，用10mm氢氧化钠水溶液取代寡核苷酸混合物。
[0378]
使用akta pure150(可获自ge healthcare)作为纯化装置和使用resource q 6ml(可获自ge healthcare)作为纯化柱，通过以下方法纯化前述寡核苷酸混合物。紫外线检测波长设定为260nm，并且以下三个步骤用作一个纯化程序。图6显示了在这些步骤中柱的通过流体在260nm检测波长下的色谱图。
[0379]
(i) 将dmtr-on寡核苷酸吸附在离子交换柱上的步骤以3ml/min的流速倒入2cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。以2ml/min的流速将寡核苷酸混合物(1.5ml，10mm氢氧化钠水溶液)加入到柱顶部，并倒入2.5cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。随后，以3ml/min的流速倒入1cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)，然后以2.4ml/min的流速倒入缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液):缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)(2cv为40:60至25:75和4cv为25:75)。
[0380]
(ii) 离子交换柱上脱-dmtr转化的步骤以1.2ml/min的流速倒入7cv缓冲剂a2(0.4%三氟乙酸水溶液)。
[0381]
(iii) 洗脱目标物质的步骤以3ml/min的流速倒入5cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)进行平衡。随后，在以3ml/min的流速从(30:70)至(0:100)来梯度进料(10cv)缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液):缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)后，倒入2cv缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)。
[0382]
由图6的结果可知，由于在脱保护后的洗脱步骤中未检测到260nm下的吸收，因此dmt-on偶联物在第一吸附步骤中没有被吸附在柱上并且经由那里通过。因此，通过离子交换柱纯化不能产生目标物质。由此，对于galnac单元与寡核苷酸的偶联物的dmtr-on柱纯化认为重要的是疏水性保护基团结合到galnac上，和/或包含在一个galnac单元中的疏水性保护基团的数量等于或大于galnac的数量。
[0383]
在本说明书中，a
t
、g
t
、5mec
t
、c
t
、t
t
、u
t
、a
p
、g
p
、5mec
p
、c
p
、t
p
、u
p
、as、gs、5mecs、cs、ts、us、a
m1t
、g
m1t
、c
m1t
、5mec
m1t
、u
m1t
、a
m1p
、g
m1p
、c
m1p
、5mec
m1p
、u
m1p
、a
m1s
、g
m1s
、c
m1s
、5mec
m1s
、u
m1s
、a
2t
、g
2t
、c
2t
、t
2t
、a
e2p
、g
e2p
、c
e2p
、t
e2p
、a
e2s
、g
e2s
、c
e2s
、t
e2s
、a
1t
、g
1t
、c
1t
、t
1t
、a
e1p
、g
e1p
、c
e1p
、t
e1p
、a
e1s
、g
e1s
、c
e1s
、t
e1s
、a
m2t
、g
m2t
、5mec
m2t
、t
m2t
、a
m2p
、g
m2p
、5mec
m2p
、t
m2p
、a
m2s
、g
m2s
、5mec
m2s
、t
m2s
、x、x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x
10
、x
11
、x
12
、x
13
、x
14
、x
15
、x
16
、x
17
、x
18
、x
19
、x
20
、x
21
和x
22
是具有下面显示
的结构的基团。
[0384]
[式97][式98]
[式99]
[式100]
[式101]
[式102]
[式103][式104]本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体并入本文。
[0385]
产业实用性本发明可用于治疗ia型糖原贮积病。
[0386]
序列表自由文本seq id no：1至48和93至96各自代表反义寡核苷酸的序列。构成反义寡核苷酸的核苷酸可以是天然dna、天然rna、dna/rna嵌合体以及它们的修饰形式中的任何一种，但优
选它们中的至少一种是修饰核苷酸。seq id no：49至65和67至92各自代表引物的序列。seq id no：66代表肽的序列。
技术领域
1.本发明涉及双触角n-乙酰基-d-半乳糖胺(galnac)配体-寡核苷酸偶联物，以及用于制备该偶联物的方法。
背景技术：
2.作为能够与去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)结合的配体，与n-乙酰基-d-半乳糖胺(galnac)等共价结合的核酸疗法(例如反义和sirna)的偶联物已被报道为将寡核苷酸递送至肝脏的肝实质细胞(非专利文献1、专利文献1至9)。在这些报告中，一至三个galnac与一个寡核苷酸结合。此外，非专利文献2描述了其中结合两个galnac的实例。
3.在寡核苷酸的固相合成后的纯化步骤中使用反相hplc的情况下，在固相合成步骤中产生的具有短链长度的寡聚体的保留时间通常接近目标寡聚体的保留时间，并且大规模获得高纯度精炼产物是非常困难的。在寡核苷酸的固相合成中，通常使用其中核苷的5'-羟基被4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmtr)基团保护的核酸单元，且因此位于待合成的寡核苷酸的5'端处的核苷的5'-羟基具有dmtr基团。非专利文献3和4描述了使用dmtr基团的高疏水性的反相柱纯化(在下文中，也称为dmtr-on反相柱纯化；“dmtr-on”表示使用具有在其5'端导入的dmtr基团的寡核苷酸)和使用dmtr-on的离子交换柱纯化(在下文中，也称为dmtr-on离子交换柱纯化)的实例。然而，由于通常通过使dmtr基团脱保护而将galnac单元导入寡核苷酸的5'端处的羟基，因此待合成的偶联物不具有dmtr基团。因此，为了从没有偶联galnac单元的寡核苷酸进行分离/纯化，需要通过hplc进行纯化，这既费力又费时(非专利文献5)。迄今为止，尚未报道使用用于galnac单元-寡核苷酸偶联物的诸如dmtr-on反相柱纯化或dmtr-on离子交换柱纯化的方法的实例。
4.因此，期望开发能够有效地将寡核苷酸递送至肝实质细胞并且在大量生产方面具有有利结构的galnac单元，以及该galnac单元与对疾病具有治疗效果的寡核苷酸的偶联物，以及期望其有效的生产方法。
5.引用列表专利文献专利文献1：国际公开号 wo2009/073809专利文献2：国际公开号 wo2014/076196专利文献3：国际公开号 wo2014/179620专利文献4：国际公开号 wo2015/006740专利文献5：国际公开号 wo2015/105083专利文献6：国际公开号 wo2016/055601专利文献7：国际公开号 wo2017/023817专利文献8：国际公开号 wo2017/084987专利文献9：国际公开号 wo2017/131236非专利文献
非专利文献1：methods in enzymology，1999，第313卷，第297至321页非专利文献2：bioorganic & medicinal chemistry letters 26 (2016) 3690-3693非专利文献3：akta design purification-user manual 18-1124-23 edition ad非专利文献4:organic process research & development 2005，9，212-215非专利文献5:molecules 2017，22，1356。
技术实现要素：
6.发明所要解决的问题在用于使用galnac单元将合成核酸递送至肝脏的研究中常规使用的接头强调使配体位点远离核酸，采用在非常长的骨架中具有长直链烷基和环结构的结构，并且还具有在许多情况下具有三个或更多个支链的复杂结构。然而，本发明人的研究新揭示了一个问题，即当浓缩使用这种常规长链烷基接头的偶联物时，在高浓度溶液中形成胶束，并且难以制备合适的剂量。另外，在常规方法中，还没有确立对结合有galnac单元的寡核苷酸进行柱分离的方法，并且难以大量生产。
7.用于解决的问题的手段作为用于解决上述问题的深入研究的结果，本发明人发现具有本发明的接头结构的双触角galnac单元与寡核苷酸的偶联物即使在高剂量溶液中也表现出良好的溶解性，同时保持有效递送至肝实质细胞的能力。此外已发现，与在galnac的6位羟基上具有高度疏水性保护基团(例如4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmtr)基团)的galnac单元结合的寡核苷酸可以通过疏水性树脂柱以更好的效率进行纯化，从而完成本发明。因此，可以预期大规模的偶联物的离子交换柱纯化或dmtr-on反相柱纯化是容易的。
8.本发明的主旨如下。
9.(a1) 具有预期在肝实质细胞中具有药理作用的核酸序列的寡核苷酸与双触角galnac单元的偶联物或其药学上可接受的盐，其中，在偶联物中，双触角galnac单元由下式表示并与寡核苷酸的5'端或3'端结合，并且其中偶联物在体内特异性地递送至肝实质细胞：[式1]其中w是由下式表示的基团：[式2]
g代表5-乙酰氨基-2-羟甲基-3,4-二羟基四氢吡喃-6-基(galnac)；z代表氧原子或硫原子；l1和l2中的一个表示亚甲基(ch2)，而另一个表示不插入原子；o、q、r和s各自独立地表示0或1；n表示1至15的整数；m表示0至5的整数；并且v表示1至7，条件是n为1时，则m为0至5的整数，并且n为2至15的整数时，则m为0。
[0010]
(a2) 根据(a1)的偶联物或其药学上可接受的盐，其中在双触角galnac单元的式中，o和q各自为0。
[0011]
(a3) 根据(a1)或(a2)的偶联物或其药学上可接受的盐，其中双触角galnac单元与寡核苷酸的5'端结合。
[0012]
(a4) 根据(a1)的偶联物或其药学上可接受的盐，其中双触角galnac单元是由下式中的任一个表示的基团：[式3][式4]
[式5][式6]
[式7](a5) 包含根据(a1)至(a4)中任一项的偶联物或其药学上可接受的盐的药物。
[0013]
另外，本发明提供以下的制备方法和作为该制备方法的中间体使用的包含含有疏水性保护基团的galnac单元的化合物或偶联物。
[0014]
(b1) 一种用于制备寡核苷酸与galnac单元的偶联物的方法，包括以下步骤：a：合成包含与寡核苷酸的5'端或3'端结合的由下式表示的含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构的偶联物：[式8]其中ra、rb和rc中的至少一个为疏水性保护基团，而其余为氢原子或在游离条件下
会被去除的保护基团；x1和x2各自独立地表示接头结构，其可以在x1和x2之间分支；t为接头结构中的支链的数量并且为1至10的整数；并且y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的键。
[0015]
b：使含有步骤a的产物的溶液通过填充有由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂的柱，并且使水性洗涤溶液通过该柱；和c：在步骤b之后从柱上洗脱寡核苷酸的步骤。
[0016]
(b2) 根据(b1)的制备方法，其中，疏水性保护基团是在碱性条件或酸性条件下被去除的保护基团，优选在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，更优选任选取代的三苯甲基或任选取代的甲硅烷基。
[0017]
(b3) 根据(b1)的制备方法，其中包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构与位于寡核苷酸的5'端的核苷的5位处的羟基结合。
[0018]
(b4) 根据(b1)的制备方法，其中在包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构中，ra为疏水性保护基团，rb和rc各自为氢原子，并且t为1至3的整数。
[0019]
(b5) 根据(b1)的制备方法，其中由于疏水性相互作用而具有吸附性的树脂为选自苯乙烯-二乙烯基苯吸附树脂、苯乙烯-二乙烯基苯改性吸附树脂、甲基丙烯酸类吸附树脂以及酚类吸附树脂中的任一种。
[0020]
(b6) 根据(b1)的制备方法，其中填充有由于疏水性相互作用而具有吸附性的树脂的柱是离子交换柱或反相柱。
[0021]
(b7) 根据(b1)的制备方法，其中步骤a包括以下步骤：a1：在支持物上合成所需的寡核苷酸，该支持物能够通过重复地对位于5'端的核苷的5'-羟基的保护基团进行脱保护和使用支持物缩合核苷以延长寡核苷酸的链，使寡核苷酸在从3'端至5'端的方向上延伸，其中所选择的保护基团是除所用的核苷的5'-羟基的保护基团之外的、在允许切割寡核苷酸的3'端与支持物之间的结合的条件(在下文中称为“游离条件”)下进行脱保护的保护基团，该保护基团被选作所用的核苷的5'-羟基的保护基团以外的保护基团，并且在游离条件下不会发生脱保护的保护基团被选作核苷的5'-羟基的保护基团；a2：将含有疏水性保护基团的galnac单元导入位于在支持物上合成的寡核苷酸的5'端的核苷的5'-羟基中，其中选择在游离条件下不会发生脱保护的疏水性保护基团；和a3：在游离条件下用溶液处理在步骤a2中得到的支持物以得到含有疏水性保护基团的galnac单元与寡核苷酸的偶联物溶液。
[0022]
(b8) 根据(b1)的制备方法，在步骤b之后且在步骤c之前，包括使吸附在柱上的偶联物的疏水性保护基团脱保护。
[0023]
(b9) 根据(b1)的制备方法，其中游离条件为碱性，并且疏水性保护基团是在酸性条件下被去除的保护基团。
[0024]
(b10) 根据(b1)的制备方法，其中包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构由下式中的任一项表示：[式9]
其中r1表示在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，x表示接头结构，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的原子键，并且下同：[式10][式11]
[式12][式13]
[式14]
[式15][式16]
[式17][式18][式19]
(b11) 由下式表示的化合物：[式20]其中ra、rb和rc中的至少一个为疏水性保护基团，而其余为在游离条件下会被去除的保护基团；x1和x2各自独立地表示接头结构，其可以在x1和x2之间分支；t为接头结构中的支链的数量并且为1至10的整数；并且y表示亚磷酰胺基团(优选由-p(och2ch2cn)n(ch(ch3)2)2或-p(och3)n(ch(ch3)2)2表示的基团)或h-膦酸酯基团(-ph(=o)(oh))；或其盐。
[0025]
(b12) 根据(b11)的化合物或其盐，其中ra是在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，rb和rc各自是乙酰基，y表示亚磷酰胺基或h-膦酸酯基团，并且t为1至3的整数。
[0026]
(b13) 根据(b11)或(b12)的化合物或其盐，其由下式中的任一个表示：[式21]其中r1为在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，并且y表示亚磷酰胺基或h-膦酸酯基团，并且下同：[式22]
[式23][式24][式25]
(b14) 根据(b11)或(b12)的化合物或其盐，其由下式中的任一个表示：[式26]其中r1表示在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，x表示接头结构，并且y表示亚磷酰胺基团或h-膦酸酯基团，并且下同：[式27][式28]
[式29][式30]
和[式31](b15) 根据(b11)至(b14)中任一项的化合物或其盐，其中疏水性保护基团为任选取代的三苯甲基，并且亚磷酰胺基团为-p(och2ch2cn)n(ch(ch3)2)2或-p(och3)n(ch(ch3)2)2。
[0027]
(b16) 包含与寡核苷酸的5'端或3'端结合的由下式表示的包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构的偶联物或其盐：[式32]
其中，ra、rb和rc中的至少一个为疏水性保护基团，并且其余为氢原子或在游离条件下会被去除的保护基团；x1和x2各自独立地表示接头结构，其可以在x1和x2之间分支；t为接头结构中的支链的数量并且为1至10的整数；并且y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的键。
[0028]
(b17) 根据(b16)所述的偶联物或其盐，其中包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构由下式中的任一项表示：[式33]其中r1表示在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的原子键，并且下同：[式34][式35]
[式36][式37](b18) 根据(b16)的偶联物或其盐，其中包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构由下式中的任一项表示：[式38]
其中r1表示在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，x表示接头结构，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的原子键，并且下同：[式39][式40]
[式41][式42]
和[式43]
(b19) 根据(b16)至(b18)中任一项的偶联物或其盐，其中疏水性保护基团是任选取代的三苯甲基，并且y表示通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键与位于寡核苷酸的5'端的核苷的5'-羟基结合的原子键。
[0029]
发明效果本发明的偶联物实现了各种寡核苷酸向肝脏的适当递送及其高水溶性。此外，它通过建立一种用于galnac单元与寡核苷酸的偶联物的dmtr-on柱纯化的方法来实现大规模生产。这些使得增加剂量以增强药理作用和制备用于应用长期连续制剂的高浓度化学溶液成为可能，从而使核酸治疗的产品设计能够满足各种需要。
附图说明
[0030]
[图1] 图1是显示当将实施例8至14的化合物施用于异源敲入小鼠时肝脏中g6pc mrna异常剪接的校正效果的图。通过qrt-pcr相对定量地评价校正后的异源敲入小鼠肝脏中具有异常剪接的g6pc mrna的量(通过肌动蛋白mrna的量校正)。y轴表示以生理盐水施用组为1时施用组中正常g6pc mrna表达量的相对值(rq：相对量；mpk：mg/kg)。
[0031]
[图2] 图2是显示当将实施例15至23的化合物施用于异源敲入小鼠时肝脏中g6pc mrna异常剪接的校正效果的图。通过qrt-pcr定量地评价校正后的异源敲入小鼠肝脏中具有异常剪接的g6pc mrna的量(通过肌动蛋白mrna的量校正)。y轴与图1中的相同。rq：相对量；mpk：mg/kg。
[0032]
[图3] 图3是显示当将apob-aso(白色柱)和apob-aso偶联物(填充柱)添加到细胞中时apob mrna在人原代培养肝细胞中的降解效果的图。细胞中apob mrna的量通过qrt-pcr相对定量地评价(通过肌动蛋白mrna的量校正)。y轴表示以未处理的人原代培养肝细胞
中apob mrna的量为100%时添加组中的相对值(%)。
[0033]
[图4] 图4是dmtr-on离子交换柱纯化步骤和色谱图的相关图。
[0034]
[图5] 图5是在dmtr-on离子交换柱纯化(检测波长：260nm)中在galnac的羟基上具有dmtr基团的偶联物的色谱图。
[0035]
[图6] 图6是在dmtr-on离子交换柱纯化(检测波长：260nm)中在寡核苷酸附近具有dmtr基团的偶联物的色谱图。
具体实施方式
[0036]
在下文中，将详细描述本发明的实施方案。在本说明书中，术语“偶联物”是指其中galnac单元与寡核苷酸的5'端和/或3'端结合的化合物。
[0037]
在本说明书中，术语“galnac单元”是指含有能够与肝脏的肝实质细胞上的去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)结合的n-乙酰基-d-半乳糖胺(galnac)的部分结构。galnac单元含有磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团，用于将直链或支链接头结构与寡核苷酸结合。这样的含有用于结合的一个磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团的结构单元可称为“galnac单元”。除非另有说明，一个galnac单元中包含的galnac的数量没有限制，并且可以采用本说明书中已知和公开的那些。只要保持与asgpr结合的能力，就可以修饰galnac的结构。此外，还包括在制备过程中导入的具有保护基团的galnac。
[0038]
在本说明书中，除非另有说明，双触角galnac单元是指由上式(a1)表示的galnac单元。
[0039]
在本说明书中，术语“寡核苷酸”是指链长为100个碱基或更短的可合成核酸，其可以是单链或双链的。如后所述，可以根据目的选择性地使用dna、rna、天然核酸、修饰核酸等作为所要采用的核酸，并且这些核酸可以混合在一个寡核苷酸中。
[0040]
在本说明书中，术语“游离条件”是指在寡核苷酸的合成过程中，当支持物与寡核苷酸之间的结合被切割以从支持物游离寡核苷酸时所采用的处理条件。在通用固相合成中，游离条件为碱性。
[0041]
在本发明中，“疏水性保护基团”是指可以作为羟基的保护基团使用的、具有高度疏水性的结构以及在游离条件下不会被去除的保护基团。例如，当游离条件为碱性时，优选在酸性条件下被去除的保护基团，而当游离条件为酸性时，优选在碱性条件下被去除的保护基团。
[0042]
在本说明书中，术语“亚磷酰胺基团”是在核酸合成中采用的用于亚酰胺试剂的由-p(or)n(ch(ch3)2)2(这里的r是c1-c3烷基或氰基-c1-c3亚烷基)表示的官能团。优选地，其实例包括-p(och2ch2cn)n(ch(ch3)2)2和-p(och3)n(ch(ch3)2)2，但不限于这些实例。
[0043]
在本说明书中，“h-膦酸酯基团”是在核酸合成中采用的由-ph(＝o)(oh)表示的官能团或其盐。具有h-膦酸酯基团的化合物可以与-ph(＝o)(o-)一起形成盐。这样的盐的实例可以包括金属盐；所述金属盐包括碱金属盐如钠盐、钾盐和锂盐，碱土金属盐如钙盐和镁盐，铝盐，铁盐，锌盐，铜盐，镍盐和钴盐；胺盐包括无机盐如铵盐和有机盐如叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n,n'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐；无机酸盐包括氢卤化
物如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；有机酸盐包括低级烷烃磺酸盐如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐，芳基磺酸盐如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐，乙酸盐，苹果酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，草酸盐和马来酸盐；以及氨基酸盐如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐，优选有机盐，更优选三乙胺盐。这些盐可以通过已知方法来制备。
[0044]
在本说明书中，核苷酸之间的结合或核苷酸和偶联物的结构中的术语“通过磷酸酯基团结合”和“含有磷酸酯基团的结构”是指两个结构单元以核酸合成中常用的结合方式结合，例如磷酸二酯键或其修饰形式(例如硫代磷酸酯键)，或含有这样的结合方式的结构。
[0045]
《1.寡核苷酸》在本说明书中，术语“核酸”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指含有至少两个单链、双链和三链中的任一种形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。
[0046]
除非另有说明，特定核酸序列隐含地包括保守修饰的突变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、snp和互补序列，并且还包括明确指出的序列。
[0047]
1-1.核酸的种类本发明的核酸可以包括本领域技术人员已知的任何形式。核酸形式的具体实例可以包括单链dna、单链rna和其中混合有dna和rna的单链寡核苷酸。其他形式的核酸的具体实例可以包括双链dna、双链rna、dna-rna杂合多核苷酸和由其中混合有dna和rna的两个寡核苷酸组成的双链多核苷酸。
[0048]
构成本发明的核酸的核苷或核苷酸的实例除了天然核苷或核苷酸以外还包括经化学修饰的修饰核苷或修饰核苷酸。修饰核苷/核苷酸的实例包括糖修饰的核苷/核苷酸、核碱基修饰的核苷/核苷酸、骨架修饰的核苷/核苷酸或其组合(例如，参见nucleic acid research，1997，第25卷，第22号，4429-4443)。
[0049]
在本说明书中，“天然核苷”是指2'-脱氧核苷如2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧胞苷、2'-脱氧-5-甲基胞苷和胸苷，和核糖核苷如腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基胞苷和尿苷。此外，“寡核苷酸”是指由其中核苷的糖部分与磷酸形成酯的化合物构成的寡核苷酸。在本说明书中，寡核苷酸和多核苷酸以相同的含义使用。
[0050]
在本说明书中，2'-脱氧腺苷可称为a
t
，2'-脱氧鸟苷可称为g
t
，2'-脱氧胞苷可称为c
t
，2'-脱氧-5-甲基胞苷可称为5mec
t
，胸苷可称为t
t
，2'-脱氧尿苷可称为u
t
，腺苷可称为a
rt
，鸟苷可称为g
rt
，胞苷可称为c
rt
，5-甲基胞苷可称为5mec
rt
，以及尿苷可称为u
rt
。在本说明书中，2'-脱氧腺苷核苷酸可称为a
p
，2'-脱氧鸟苷核苷酸可称为g
p
，2'-脱氧胞苷核苷酸可称为c
p
，2'-脱氧-5-甲基胞苷核苷酸可称为5mec
p
，胸苷核苷酸可称为t
p
，2'-脱氧尿苷核苷酸可称为u
p
，腺苷核苷酸可称为a
rp
，鸟苷核苷酸可称为g
rp
，胞苷核苷酸可称为c
rp
，5-甲基胞苷核苷酸可称为5mec
rp
，以及尿嘧啶核苷酸可称为u
rp
。
[0051]
在本说明书中，与a
p
对应的代替核苷酸中的磷酸酯而含有的硫代磷酯盐可称为as，与g
p
对应的那些可称为gs，与c
p
对应的那些可称为cs，与5mec
p
对应的那些可称为5mecs，与t
p
对应的那些可称为ts，与u
p
对应的那些可称为us，与a
rp
对应的那些可称为a
rs
，与g
rp
对应的那些可称为g
rs
，与c
rp
对应的那些可称为c
rs
，与5mec
rp
对应的那些可称为5mec
rs
，以及与u
rp
对应的那些可称为u
rs
。
[0052]
在本说明书中，“糖修饰的核苷”是指其中核苷的糖部分被修饰的核苷。糖修饰的
核苷的实例包括2'-o-甲基核苷、2'-o,4'-c-亚乙基核苷(ena)和2'-o,4'-c-亚甲基核苷酸(bna/lna)。
[0053]
其中，2'-o-甲基修饰的实例包括2'-o-甲基核苷和2'-o-甲基核苷酸。与a
rt
对应的那些可称为a
m1t
，与g
rt
对应的那些可称为g
m1t
，与c
rt
对应的那些可称为c
m1t
，与5mec
rt
对应的那些可称为5mec
m1t
，与u
rt
对应的那些可称为u
m1t
，与a
rp
对应的那些可称为a
m1p
，与g
rp
对应的那些可称为g
m1p
，与c
rp
对应的那些可称为c
m1p
，与5mec
rp
对应的那些可称为5mec
m1p
，与u
rp
对应的那些可称为u
m1p
，与a
rs
对应的那些可称为a
m1s
，与g
rs
对应的那些可称为g
m1s
，与c
rs
对应的那些可称为c
m1s
，与5mecs对应的那些可称为5mec
m1s
，以及与u
rs
对应的那些可称为u
m1s
。
[0054]
在本说明书所附的序列表中，“cm”表示2'-o-甲基胞苷，“um”表示2'-o-甲基尿苷，以及“gm”表示2'-o-甲基鸟苷，在每个序列的条目《223》中。
[0055]
在本说明书中，2'-o,4'-c-亚乙基核苷酸单元和“ena单元”是指具有ena的上述核苷和核苷酸中的每一个。可以表达具有ena单元的核苷和核苷酸，例如与a
t
对应的那些可称为a
2t
，与a
p
对应的那些可称为a
e2p
，与as对应的那些可称为a
e2s
，与g
t
对应的那些可称为g
2t
，与g
p
对应的那些可称为g
e2p
，与gs对应的那些可称为g
e2s
，与5mec
t
对应的那些可称为称为c
2t
，与5mec
p
对应的那些可称为c
e2p
，与5mecs对应的那些可称为c
e2s
，与t
t
对应的那些可称为t
2t
，与t
p
对应的那些可称为t
e2p
，以及与ts对应的那些可称为t
e2s
。
[0056]
在本说明书中，2'-o,4'-c-亚甲基核苷酸单元和“2',4'-bna/lna单元”是指具有2',4'-bna/lna的上述核苷和核苷酸中的每一个。可以表达具有2',4'-bna/lna单元的核苷和核苷酸，例如，与a
t
对应的那些可称为a
1t
，与a
p
对应的那些可称为a
e1p
，与as对应的那些可称为a
e1s
，与g
t
对应的那些可称为g
1t
，与g
p
对应的那些可称为g
e1p
，与gs对应的那些可称为g
e1s
，与5mec
t
对应的那些可称为c
1t
，与5mec
p
对应的那些可称为c
e1p
，与5mecs对应的那些可称为c
e1s
，与t
t
对应的那些可称为t
1t
，与t
p
对应的那些可称为t
e1p
，以及与ts对应的那些可称为t
e1s
。
[0057]
1-2.靶基因在本说明书中，只要是其中导入了该靶基因的细胞、组织或个体中的rna(在下文中，其可以称为“导入对象”)，“靶基因”就不特别限定，并且可以是要翻译成蛋白的mrna或不翻译成蛋白的非编码rna。非编码rna的实例包括功能性rna，例如mrna、trna、rrna、mrna型ncrna(mrna类非编码rna)、长链ncrna(长非编码rna)、snrna(小核rna)、snorna(小核仁rna)和mirna(微rna)的非翻译区。具体地，靶基因对于导入对象可以是内源性的，也可以是外源性的，以便通过技术如基因转移来导入。此外，它可以是存在于染色体上的基因或染色体外的基因。外源基因的实例包括源自能够感染导入对象的病毒、细菌、真菌或原生动物的那些，但不限于这些实例。该基因的功能可以是已知的或未知的。
[0058]
靶基因的实例可以包括在肝脏中具有特异性增加的表达的基因和/或在肝脏中具有特定疾病的患者中特异性突变的基因。这样的疾病的实例可以包括心血管疾病(例如，高血压、心脏肥大、心绞痛、动脉硬化和高胆固醇血症)、癌症(例如，肝癌)、呼吸系统疾病(例如，肺炎、支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺病和肺纤维化)、糖尿病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、贫血(例如，与慢性疾病相关的贫血和铁难治性缺铁性贫血)、年龄相关性黄斑变性、免疫系统疾病(例如，自身免疫性疾病、免疫缺陷和白血病)、肝/胆疾病(例如，非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝炎、肝功能衰竭、胆汁淤积和结石)、消化道疾病(例如，溃疡、肠炎和
吸收障碍)、感染、肥胖和纤维化(例如，肝纤维化)。
[0059]
这些疾病的致病基因的实例可以包括纺锤体驱动蛋白(ksp)、血管内皮生长因子(vegf)、转甲状腺素蛋白(ttr)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)、polo类激酶1(plk-1)、apob-100、核糖核苷酸还原酶m2亚基(rrm2)、凝聚素、热休克蛋白27(hsp27)、生存素、真核起始因子-4e(eif-4e)、白细胞介素4受体的α亚基(il-4r-α)、因子xi、因子vii、n-ras、h-ras、k-ras、bcl-2、bcl-xl、her-1、her-2、her-3、her-4、mdr-1、人β-连环蛋白基因、ddx3(dead (asp-glu-ala-asp)框肽3，x连锁)、髓细胞白血病序列1(mcl1)基因、pkr(eif2ak2)、hsp47(serpinh1)、铁调素、活化蛋白c(apc)、信号转导和转录激活因子(stat3)、胶原蛋白、i型、α1(col1a1)、apoc-iii、血管生成素类3蛋白(angptl3)、生长激素受体(ghr)、前激肽释放酶(pkk)、跨膜蛋白酶、丝氨酸6(tmprss6)、脂蛋白(a)、胰高血糖素受体或二酰基甘油酰基转移酶2(dgat2)、血管紧张素原、补体因子b(fb)、氨基乙酰丙酸合酶1(alas1)、抗凝血酶(at)、原发性高草酸尿型1(ph1)、补体的c5成分、α-1抗胰蛋白酶(aat)和肝炎b病毒(hbv)基因组，但不限于这些实例。
[0060]
1-3.双链寡核苷酸在本发明的核酸是对靶基因具有rna干扰作用的核酸的情况下，只要具有该核酸的rna干扰作用，其结构和化学修饰就没有限制。其实例可以包括sirna(例如，参见国际公开号wo 2002/044321，current opinionin chemical biology 570-579)、由其中rna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸组成的aturnai(例如，参见国际公开号wo 2004/015107)、其中具有不同类型的有义链和反义链的核酸与其中dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸中的watson-crick碱基对形成双链的双链寡核苷酸(其将在下文第3-4-1节中描述(例如，参见国际公开号wo 2010/001909))、具有被修饰的寡核苷酸末端的核酸（其将在下文第3-4-1节中描述(例如，参见国际公开号wo 2010/052715)）、以及通过在反义链多核苷酸的5'端和有义链的3'端之间通过接头结合而具有单链并通过在分子中形成watson-crick碱基对而具有双链结构的单链寡核苷酸(其将在3-4-3节中描述(例如，参见国际公开号wo 2012/074038))。
[0061]
在本说明书中，短语“由与靶基因相同的核苷酸序列组成”是指由与靶基因的核苷酸序列的至少一部分相同的序列组成，不仅包括完全相同的序列，还包括基本相同的核苷酸序列，只要对靶基因发挥rna干扰作用和/或基因表达抑制作用即可。短语“由与靶基因互补的核苷酸序列组成”是指由与靶基因的核苷酸序列的至少一部分互补的序列组成，不仅包括完全互补的序列，还包括基本相同的序列，只要对靶基因发挥rna干扰作用和/或基因表达抑制作用即可。此外，在其中靶基因中的snp等已知的情况下，具有这样的突变的序列也包括在同一核苷酸序列中。在本说明书中，将含有与靶基因互补的核苷酸序列且对靶基因具有rna干扰作用和/或基因表达抑制作用的多核苷酸称为用于靶基因的寡核苷酸。
[0062]
本发明的核酸的核苷酸序列没有特别限定，只要其对靶基因具有rna干扰作用和/或基因表达抑制作用即可，但可以通过以下来确定：例如使用计算机软件(例如，genetyx(r)：可从genetyx coorporation获得)基于预期对靶基因具有rna干扰作用的序列确定有义链和反义链的序列，或进一步确认基于选定序列产生的寡核苷酸的rna干扰作用和/或基因表达抑制作用。
[0063]
具有rna干扰作用的双链寡核苷酸的有义链和反义链的链长各自可以是10个核苷
酸至靶基因的开放阅读框(orf)全长的任意长度，只要发挥rna干扰作用和/或基因表达抑制作用，并且优选18个核苷酸至靶基因的开放阅读框(orf)全长的任意长度，进一步优选10至100个核苷酸，进一步优选15至30个核苷酸。
[0064]
在其中使用具有不同类型的有义链和反义链的核酸在其中dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸中形成watson-crick结合的双链寡核苷酸(国际公开号wo 2010/001909)作为具有rna干扰作用的双链寡核苷酸的情况下，有义链优选具有18至21的链长，进一步优选18至19。反义链优选具有19至21的链长，进一步优选21。此外，整个结构不一定具有双链结构，并且也包括在5'和/或3'端部分突出的那些。突出端包括1至5个核苷酸，优选1至3个核苷酸，进一步优选2个核苷酸。此外，最优选的实例是具有其中反义链的寡核苷酸的3'端突出2个核苷酸(突出端结构)并形成18个碱基对的结构的多核苷酸。
[0065]
1-3-1.具有dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸作为要包含在核酸脂质颗粒中的本发明的核酸的实例，可以提及双链寡核苷酸，其中具有不同类型的有义链和反义链的核酸在其中dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸中形成watson-crick结合。
[0066]
这样的双链寡核苷酸的具体实例包括在国际公开号wo 2010/001909、国际公开号wo 2010/001909等中公开的双链寡核苷酸。
[0067]
1-3-2.修饰的双链寡核苷酸在使用具有rna干扰作用的核酸作为要包含在核酸脂质颗粒中的核酸的情况下，可以提及其中寡核苷酸的末端被修饰的核酸作为其实例，只要它具有rna干扰作用即可。例如，一种双链寡核苷酸，可以提及其中在具有rna干扰作用的双链寡核苷酸中反义链的5'端处的磷酸酯基团被修饰为5'-芳基磷酸酯基团(例如，参见国际公开号wo 2010/052715)，例如其中具有不同类型的有义链和反义链的核酸在其中sirna、aturnai或dna和2'-omerna交替结合的寡核苷酸中形成watson-crick结合的双链寡核苷酸(例如，参见国际公开号wo 2010/001909)。
[0068]
这样修饰的双链寡核苷酸的具体实例包括国际公开号wo 2010/052715和国际公开号wo 2015/005253中公开的修饰的双链寡核苷酸。
[0069]
1-4.单链寡核苷酸1-4-1. rna干扰单链核苷酸用于本发明的核酸的实例还包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有用于靶基因的有义链寡核苷酸和具有与有义链互补的核苷酸序列的反义链寡核苷酸，并且具有通过接头在每个反义链寡核苷酸的5'端和有义链寡核苷酸的3'端处形成磷酸二酯结构而结合的单链结构(例如，参见国际公开号wo 2012/074038)，只要它具有rna干扰作用即可。
[0070]
这样的化合物的具体实例可以包括在国际公开号wo 2012/074038和国际公开号wo 2015/005253中描述的那些。
[0071]
1-4-2. 反义核苷酸在由基因突变引起的疾病的治疗中，应用反义核苷酸以治疗可以通过使突变基因的表达正常化或抑制突变基因的表达来治疗的疾病。在抑制基因表达的情况下，使用具有与靶基因的mrna的一部分互补的序列且其中该序列中间的核酸是dna的核苷酸。这样的用于抑制表达的反义核苷酸与靶基因的mrna形成双链。由于所形成的双链中的rna/dna双链
结构在体内被rnaseh特异性分解，所以特异性破坏了靶基因的mrna，从而抑制了靶基因的表达。
[0072]
旨在使基因表达正常化的反义核苷酸的实例包括抑制异常剪接的那些和将基因上的突变位点恢复为正常序列的那些。在将基因上的突变恢复为正常序列的情况下，在反义核苷酸的3'侧包括针对靶基因的有义链中突变位点的5'侧区域的反义序列，以及在其5'侧包括构成核酸酶与其缔合的发夹结构的序列(其中在2个位点彼此互补的序列通过中间接头/环序列连接的序列)。借助于这样的核苷酸，3'侧的反义区域起到引导rna的作用，所述引导rna将核酸酶引导至靶基因的突变位点(mrna或基因组dna的有义链)。这种现象类似于被称为crispr-cas系统的基因组编辑技术，并被广泛认为适用于各种基因编辑。
[0073]
由于基因突变而发生异常剪接的机制如下。在从pre-mrna到成熟mrna的剪接过程中，突变导致剪接因子意外识别并结合至在正常pre-mrna中不结合的位点，使得表达进行异常剪接的mrna，从而引起靶基因表达的蛋白的功能失败或表达失败。当反义核苷酸与突变pre-mrna上被剪接因子错误识别的区域结合时，剪接因子无法识别该区域，且因此抑制异常剪接。由基因突变引起的异常剪接引起的疾病的实例包括抑制由下文详述的1a型糖原贮积病的g6pc基因中的c.648g》t突变引起的异常剪接的反义寡核苷酸，以及可以提及的用于治疗各种已知疾病的其他反义寡核苷酸。
[0074]
本发明提供了一种能够在mrna水平修复ia型糖原贮积病患者的具有c.648g》t突变的g6pc基因并表达正常g6pc蛋白的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。本发明的寡核苷酸是具有15至30个由与具有c.648g》t突变的g6pc基因的cdna互补的核苷酸序列组成的碱基的寡核苷酸，并且由与包含具有c.648g》t突变的g6pc基因的外显子5的5'端的第82位点至第92位点中任何一个的区域互补的序列组成。
[0075]
在患有ia型糖原贮积病的患者中，具有c.648g》t突变的患者可以在本发明中被靶向。不仅可以靶向具有c.648g》t突变的纯合子患者，还可以靶向具有c.648g》t突变和其他突变的复合杂合子患者。
[0076]
g6pc基因的c.648g》t突变是智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸从g到t的突变。它位于外显子5的5'端的第86位。本发明的寡核苷酸可以由与具有c.648g》t突变的g6pc基因的外显子5的5'端的第82位点至第92位点中的任何一个的区域互补的序列组成，优选地由与包含第92位点的区域互补的序列组成。
[0077]
具有15至30个由与具有c.648g》t突变的g6pc基因的cdna互补的核苷酸序列组成的碱基并且由与具有c.648g》t突变的g6pc基因的外显子5的5'端的第82位点至第92位点中的任何一个的区域互补的序列组成的寡核苷酸的实例，可包括含有seq id nos：1至32、40至42和44至48的任何序列的全部或一部分的那些(假设在序列中t或t可以是u或u，或者u或u可以是t或t)。在本发明中，术语“序列的一部分”通常是整个序列中的80％或更多，优选85％，进一步优选90％，最优选94％或更多。本发明的寡核苷酸适当地具有15至30，优选15至21，更优选15至18个碱基。
[0078]
构成本发明的寡核苷酸的核苷酸可以是天然dna、天然rna、dna/rna嵌合体以及它们的修饰形式中的任何一种，但优选核苷酸中的至少一种是修饰核苷酸。
[0079]
本发明中的修饰核苷酸的实例可以包括其中糖被修饰(例如，其中d-呋喃核糖是
2'-o-烷基化的那些，其中d-呋喃核糖是2'-o,4'-c-亚烷基化的的那些，以及其中d-呋喃核糖是2'-,4'-交联的那些)的那些，其中磷酸二酯键被修饰(例如，硫代化)的那些，其中碱基被修饰的那些，以及它们的组合。其中构成反义寡核苷酸的至少一个d-呋喃核糖被2'-o-烷基化或2'-o,4'-c-亚烷基化的那些可以预期具有比天然核苷酸(即寡dna和寡rna)更高的治疗效果，因为它们与rna的高结合力和对核酸酶的高耐受性。此外，其中构成寡核苷酸的至少一个磷酸二酯键被硫代化的那些也可以预期具有比天然核苷酸(即，寡dna和寡rna)更高的治疗效果，因为它们对核酸酶的高耐受性。含有上述修饰的糖和修饰的磷酸二酯键二者的寡核苷酸对核酸酶具有更高的耐受性，且因此可以预期具有更高的治疗效果。
[0080]
本发明的寡核苷酸中的糖修饰的实例可以包括d-呋喃核糖的2'-o-烷基化(例如，2'-o-甲基化、2'-o-氨基乙基化、2'-o-丙基化、2'-o-烯丙基化、2'-o-甲氧基乙基化、2'-o-丁基化、2'-o-戊基化和2'-o-炔丙基化)、d-呋喃核糖的2'-o,4'-c-亚烷基化(例如，2'-o,4'-c-亚乙基化、2'-o,4'-c-亚甲基化、2'-o,4'-c-亚丙基化、2'-o,4'-c-四亚甲基化以及2'-o,4'-c-五亚甲基化)、d-呋喃核糖的2'-脱氧-2'-c,4'-c-亚甲氧基亚甲基化、s-cet(2',4'-约束乙基)、amna(酰胺桥核酸)、3'-脱氧-3'-氨基-2'-脱氧-d-呋喃核糖和3'-脱氧-3'-氨基-2'-脱氧-2'-氟-d-呋喃核糖。
[0081]
本发明的寡核苷酸中的糖2'-,4'-交联修饰的实例可以包括d-呋喃核糖的2'-o,4'-c-亚烷基化(例如，2'-o,4'-c-亚乙基化)、2'-o,4'-c-亚甲基化、2'-o,4'-c-亚丙基化、2'-o,4'-c-四亚甲基化和2'-o,4'-c-五亚甲基化)、d-呋喃核糖的2'-脱氧-2'-c,4'-c-亚甲氧基亚甲基化、s-cet(2',4'-约束乙基)和amna。
[0082]
本发明的寡核苷酸中的磷酸二酯键的修饰的实例可以包括硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、甲基硫代膦酸酯键、二硫代磷酸酯键和氨基磷酸酯键。
[0083]
在本发明中，碱基修饰的实例可以包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化和n4-甲基化，胸腺嘧啶的5-去甲基化(尿嘧啶)、5-氟化、5-溴化和5-碘化，腺嘌呤的n6-甲基化和8-溴化，以及鸟嘌呤的n2-甲基化和8-溴化。
[0084]
本发明的寡核苷酸可以根据文献(nucleic acids research，12，4539(1984))中描述的方法，使用市售合成仪(例如，型号392，可从perkinelmer，inc.获得，通过磷酰胺方法)来合成。作为其中使用的核苷亚磷酰胺试剂，对于天然核苷和2'-o-甲基核苷(即2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基胞苷和2'-o-甲基尿苷)可以使用市售试剂。具有含2至6个碳原子的烷基的2'-o-烷基鸟苷、腺苷、胞苷和尿苷可以如下合成。
[0085]
2'-o-氨基乙基鸟苷、2'-o-氨基乙基腺苷、2'-o-氨基乙基胞苷和2'-o-氨基乙基尿苷可以根据文献(blommers et al. biochemistry(1998)，37，17714-17725.)来合成。
[0086]
2'-o-丙基鸟苷、2'-o-丙基腺苷、2'-o-丙基胞苷和2'-o-丙基尿苷可以根据文献(lesnik, e.a. et al. biochemistry(1993)，32，7832-7838.)来合成。
[0087]
对于2'-o-烯丙基鸟苷、2'-o-烯丙基腺苷、2'-o-烯丙基胞苷、2'-o-烯丙基尿苷可使用市售试剂。
[0088]
2'-o-甲氧基乙基鸟苷、2'-o-甲氧基乙基腺苷、2'-o-甲氧基乙基胞苷和2'-o-甲氧基乙基尿苷可以根据专利(us6261840)或文献(martin, p. helv.chim. acta. (1995) 78，486-504.)来合成。
[0089]
2'-o-丁基鸟苷、2'-o-丁基腺苷、2'-o-丁基胞苷和2'-o-丁基尿苷可根据文献
(lesnik, e.a. et al. biochemistry (1993)，32，7832-7838.)来合成。
[0090]
2'-o-戊基鸟苷、2'-o-戊基腺苷、2'-o-戊基胞苷和2'-o-戊基尿苷可根据文献(lesnik, e.a. et al. biochemistry (1993)，32，7832-7838.)来合成。
[0091]
对于2'-o-炔丙基鸟苷、2'-o-炔丙基腺苷、2'-o-炔丙基胞苷和2'-o-炔丙基尿苷可以使用市售试剂。
[0092]
2'-o,4'-c-亚甲基鸟苷、2'-o,4'-c-亚甲基腺苷、2'-o,4'-c-亚甲基胞苷、2'-o,4'-c-亚甲基-5-甲基胞苷和2'-o,4'-c-亚甲基胸苷可以根据国际公开号wo 99/14226中描述的方法制备，以及具有含2至5个碳原子的亚烷基的2'-o,4'-c-亚烷基鸟苷、2'-o,4'-c-亚烷基腺苷、2'-o,4'-c-亚烷基胞苷、2'-o,4'-c-亚烷基-5-甲基胞苷和2'-o,4'-c-亚烷基胸苷可以根据国际公开号wo 00/47599中描述的方法制备。
[0093]
其中d-呋喃核糖被2'-脱氧-2'-c,4'-c-亚甲氧基亚甲基化的核苷可以根据文献(wang, g. et al. tetrahedron (1999), 55, 7707-7724.)来合成。
[0094]
s-cet(约束乙基)可以根据文献(seth, p. p. et al. j. org. chem (2010), 75, 1569-1581.)来合成。
[0095]
amna可以根据文献(yahara, a. et al. chembiochem (2012), 13, 2513-2516.)或国际公开号wo 2014/109384来合成。
[0096]
本发明中，在核酸核苷酸序列中腺嘌呤可分别记为(a)或(a)，鸟嘌呤可分别记为(g)或(g)，胞嘧啶可分别记为(c)或(c)，胸腺嘧啶可分别记为(t)或(t)，以及尿嘧啶可分别记为(u)或(u)。可以使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。在核碱基中，尿嘧啶(u)或(u)和胸腺嘧啶(t)或(t)彼此相容。尿嘧啶(u)或(u)和胸腺嘧啶(t)或(t)均可用于与互补链的腺嘌呤(a)或(a)形成碱基对。
[0097]
具有硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸可以通过偶联核苷亚磷酰胺试剂，然后与硫、二硫化四乙基秋兰姆(tetd, applied biosystems)、beaucage试剂(glen research)或试剂如氢化黄原烷(tetrahedron letters, 32, 3005 (1991), j. am. chem. soc. 112, 1253 (1990), pct/国际公开号wo 98/54198)反应来合成。
[0098]
作为合成仪中使用的可控孔度玻璃(cpg)，可以使用结合有2'-o-甲基核苷的市售产品。此外，对于2'-o,4'-c-亚甲基鸟苷、2'-o,4'-c-亚甲基腺苷、2'-o,4'-c-亚甲基-5-甲基胞苷和2'-o,4'-c-亚甲基胸苷，根据国际公开号wo 99/14226中描述的方法制备的核苷可以与cpg结合，并且对于具有含2至5个碳原子的亚烷基的2'-o,4'-c-亚烷基鸟苷、2'-o,4'-c-亚烷基腺苷、2'-o,4'-c-亚烷基-5-甲基胞苷和2'-o,4'-c-亚烷基胸苷，根据国际公开号wo 00/47599中描述的方法制备的核苷根据文献(oligonucleotide synthesis, edited by m. j. gait, oxford university press, 1984)可以结合至此。其中2-羟乙基磷酸酯基团与3'端结合的寡核苷酸可以通过使用修饰的cpg(公开于日本专利公开号7-87982的实施例12b中)来合成。此外，此外，其中羟基烷基磷酸酯基团或氨基烷基磷酸酯基团与3'端结合的寡核苷酸可通过使用3'-氨基-修饰剂c3 cpg、3'-氨基-修饰剂c7 cpg、glyceryl cpg（glen research）、3'-specer c3 synbase cpg 1000或3'-specer c9 synbase cpg 1000（链接技术）来合成。
[0099]
《2.galnac单元》在本发明的偶联物中，寡核苷酸可以具有通过接头和磷酸酯基团结合的galnac。
[0100]
本发明中的galnac单元是与其中结合有galnac的接头结合的磷酸酯基团，并且可以具有一个进一步的键。galnac单元的磷酸酯基团可以与寡核苷酸的5'端和/或3'端结合，优选地，与寡核苷酸的5'端结合。在其中galnac单元具有键的情况下，该键可以与羟基、galnac、其中结合有galnac的接头、另一galnac单元的磷酸酯基团或寡核苷酸的3'端处的磷酸酯基团结合。一个galnac单元包含两个galnac。
[0101]
在偶联物中，1个galnac单元可以与寡核苷酸结合，或者多个galnac单元可以与寡核苷酸串联结合。与一个寡核苷酸结合的galnac单元的数量优选为1至7，更优选1至5，特别优选1至3，最优选1。
[0102]
在其中将2个galnac单元导入本发明的寡核苷酸的5'端中的情况下，symmetric doubler phosphoramidite(1,3-双-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊氨基]丙基-2-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，glen research)等可以在合成寡核苷酸时使用，并且在其中三个galnac单元导入寡核苷酸的5'端中的情况下，trebler phosphoramidite(三-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧基甲基]乙基-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，glen research)、long trebler phosphoramidite(三-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧基甲基]亚甲氧基丙基-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，glen research)等可以在合成寡核苷酸时使用。在其中将4个galnac单元导入寡核苷酸的5'端中的情况下，偶联2次的symmetric doubler phosphoramidite等可以在合成寡核苷酸时使用。在其中将5个galnac单元导入寡核苷酸的5'端中的情况下，各自偶联一次的symmetric doubler phosphoramidite和trebler phosphoramidite或long trebler phosphoramidite可以在合成寡核苷酸时使用。在其中将5或更多个galnac单元导入寡核苷酸的5'端中的情况下，可以适当组合symmetric doubler phosphoramidite、trebler phosphoramidite或long trebler phosphoramidite用于合成。
[0103]
在其中将这样的galnac单元导入本发明中的寡核苷酸的3'端中的情况下，asymmetric doubler (lev) phosphoramidite(1-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊氨基]-3-[5-乙酰丙酰氧基戊氨基]-丙基-2-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，glen research)等可以在合成寡核苷酸时使用。具体地，在将市售的unylinker support(例如，glen unysuppor 1000，glen research)与asymmetric doubler (lev) phosphoramidite偶联以去除dmtr基团之后，感兴趣的寡核苷酸的链被延长。在达到预期的链长后，可以通过使用试剂如肼将乙酰丙酰基脱保护并根据asymmetric doubler (lev) phosphoramidite试剂所附的方案偶联galnac单元，来将其导入寡核苷酸的3'端中。
[0104]
在本发明中，附加寡核苷酸序列是与发挥药用作用的寡核苷酸的核苷酸序列不同的核苷酸序列，其由磷酸二酯键构成并且可在体内切割，可以包含在与galnac单元结合的寡核苷酸的5'端和/或3'端。可切割的寡核苷酸的链长优选为1至6个核苷酸，进一步优选1至3个核苷酸。可以切割的寡核苷酸没有特别限制，只要它可以切割，但是其实例可以包括完全由dna组成的天然寡脱氧核苷酸和完全由rna组成的天然寡核苷酸。核苷酸序列没有特别限制，只要它是可以被切割的序列，但其实例可以包括5'-tcatca-3'、5'-catca-3'、5'-atca-3'5'-tca-3'、5'-ca-3'和5'-a-3'。
[0105]
在一方面，本发明的双触角galnac单元为由下式表示的基团：[式44]
其中w是由下式表示的基团：[式45]g表示5-乙酰氨基-2-羟甲基-3,4-二羟基四氢吡喃-6-基(galnac)；z表示氧原子或硫原子；l1和l2中的一个表示亚甲基(ch2)，而另一个表示不插入原子。o、q、r和s各自独立地表示0或1；n表示1至15的整数；m表示0至5的整数；并且v表示1至7，条件是n为1时，则m为0至5的整数，并且n为2至15的整数时，则m为0，优选o和q各自为0。
[0106]
在上述式中，优选的是l2表示亚甲基(ch2)，并且l1表示在l1和l2中不插入原子。优选地，n为1至10的整数，更优选2至7的整数，进一步优选2至4的整数。优选地，m为0至3的整数。优选地，v为1至5的整数。更优选地，s为1，n为2至7的整数，m为0、1或2，并且v为1至5的整数，进一步优选地，它是一个基团，其中在上式表示的基团中s为1、n为2或3、m为0以及v为1至3的整数。
[0107]
本发明的双触角galnac单元优选地具有双触角结构，每一个均具有距磷酸酯基团3个原子内的甘油结构，并且在支链的每个末端具有galnac，其中从支链点到galnac的每个接头结构几乎相同，连接galnac部分和磷酸酯基团部分的接头骨架具有15个原子或更短的长度，杂原子含量高，并且连续烷基链长度为c5或更短，因此在水中表现出良好的溶解性。
[0108]
本发明的双触角galnac单元的具体实例可包括由下式表示的基团：[式46]
[式47][式48]
[式49][式50]。
[0109]
《3.制备偶联物的方法》与本发明的galnac单元结合的寡核苷酸可以根据文献(nucleic acids research, 12, 4539 (1984))中描述的方法，使用市售合成仪(例如，型号392，可从perkinelmer, inc.获得，通过亚磷酰胺法)等，并且通过以与核苷亚磷酰胺试剂相同的方式使用包含在galnac单元中的亚磷酰胺来合成。
[0110]
合成含galnac单元的亚磷酰胺的方法含有本发明的galnac单元的亚磷酰胺或h-膦酸酯可以根据下面将描述的方法a或方法b来制备。在方法a或方法b中，在根据常规方法完成反应后，从反应混合物中收集每个反应的目标化合物。例如，通过以下来得到目标化合物：适当地中和反应混合物，滤出不溶物(如果存在)，然后向其中加入水和不混溶的有机溶剂如乙酸乙酯，分离含有目标物质的有机层，用水等对其进行洗涤，用无水硫酸钠对其进行干燥，以及蒸去溶剂。如果必要，可以通过常规方法，例如硅胶柱色谱法分离/纯化所获得的化合物。或者，可以通过再沉淀和重
结晶对其进行纯化。条件是如果r=0，则方法c代替方法a或方法b来使用。
[0111]
[方法a]方法a是使用化合物(3)制备支链化合物(7)和化合物(7')的方法。化合物(1)的构型不受限制。通过施用化合物(3)，可以适当地选择galnac部分的6位羟基的保护基团。如果r=0，则使用方法c。
[0112]
[式51]其中r
13
是羟基的常规保护基团，但理想的是苄基，r
14
是羟基的常规保护基团，但理想的是乙酰基或疏水性保护基团(更理想的是4,4'-二甲氧基三苯甲基)，r
15
是羰基的常
规保护基团，但理想的是苄基，在-p(r3)r4中，r3和r4可以相同或不同并且各自表示羟基、被保护的羟基、巯基、被保护的巯基、氨基、具有1至4个碳原子的烷氧基、具有1至4个碳原子的烷硫基、具有1至5个碳原子的氰基烷氧基或被具有1至4个碳原子的烷基取代的氨基，x为碳或氧，n为整数1至15的整数，m为0至5的整数，条件是n为1时，m为0至5的整数，并且n为2至15的整数时m为0，r独立地为0或1，并且v为1至7。
[0113]
步骤a-1为氨基甲酸酯化步骤，其中化合物(1)在惰性溶剂中在活化剂和碱的存在下转化为活性酯，然后与化合物(2)反应进行氨基甲酸酯化。
[0114]
反应中使用的惰性溶剂的实例包括烃、芳烃、卤化烃和醚，优选二氯甲烷。
[0115]
反应中使用的活化剂没有特别限定，只要其形成活化酯，而其实例包括碳酸双(五氟苯基)酯、碳酸双(4-硝基苯基)酯和氯甲酸4-硝基苯基酯。优选地，活化剂是氯甲酸4-硝基苯基酯。
[0116]
作为反应中使用的碱的实例包括三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、吡啶和4-二甲氨基吡啶，并且优选的是在制备活性酯时使用吡啶，并且在随后与胺反应时添加n,n-二异丙基乙胺。
[0117]
反应温度根据活化剂、碱、惰性溶剂等而不同，而一般为-20℃至回流温度。优选地，反应温度为10℃至30℃。
[0118]
反应时间根据活化剂、碱、惰性溶剂、反应温度等而不同，而通常为15分钟至24小时，优选1小时至4小时。
[0119]
步骤a-2是去除作为保护基团的r
13
和r
15
的步骤。保护基团的去除根据其类型而不同，而通常可以根据合成有机化学技术中众所周知的方法进行，例如在t. h. greene, p. g. wuts, protective groups in organic synthesis. third edition, 1999, john wiley & sons, inc.中公开的方法。
[0120]
步骤a-3是在惰性溶剂中在缩合剂和碱的存在下与化合物(3)进行酰胺缩合的步骤。
[0121]
反应中使用的惰性溶剂可以根据要使用的缩合剂的类型来适当地选择。其实例包括水、醇和极性非质子溶剂，优选二氯甲烷或n,n-二甲基甲酰胺。
[0122]
反应中使用的碱的实例包括三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、吡啶和4-二甲氨基吡啶，优选n,n-二异丙基乙胺。
[0123]
反应中使用的缩合剂的实例包括作为碳二亚胺缩合剂的wsc(1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺)和dic(n,n'-二异丙基碳二亚胺)、作为咪唑缩合剂的cdi(n,n'-羰基二咪唑)、作为三嗪缩合剂的dmt-mm(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉=氯化物n水合物)、作为脲缩合剂的hatu(o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐)和tstu(o-(n-琥珀酰亚胺基)-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐)、以及作为鏻缩合剂的pybop(1h-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻)，优选wsc或hatu。此外，可以根据需要添加作为添加剂的hoat(1-羟基-7-氮杂苯并三唑)、hobt(1-羟基苯并三唑)和oxyma((羟基亚氨基)氰基乙酸乙酯)。
[0124]
反应温度根据缩合剂、碱、溶剂等而不同，但通常为-20℃至回流温度。优选地，其为10℃至30℃。
[0125]
反应时间根据缩合剂、碱、溶剂、反应温度等而不同，但通常为15分钟至72小时，优
选1小时至24小时。
[0126]
步骤a-4是制备化合物(7)的步骤，其中在惰性溶剂中在2-氰乙基二异丙基氯亚磷酰胺和碱的存在下将-p(r3)r4导入到化合物(6)的仲羟基中。
[0127]
反应中使用的惰性溶剂的实例包括烃、芳烃、卤化烃、醚和乙腈，优选二氯甲烷。
[0128]
反应中使用的碱的实例包括三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、吡啶和4-二甲氨基吡啶，优选n,n-二异丙基乙胺。
[0129]
反应温度根据碱、惰性溶剂等而不同，但通常为-20℃至回流温度。优选地，其为10℃至30℃。
[0130]
反应时间根据碱、惰性溶剂、反应温度等而不同，但通常为15分钟至24小时，优选1小时至4小时。
[0131]
步骤a-5是由化合物(7)合成化合物(8)的步骤，其中仅去除作为保护基团的r
15
。保护基团的去除根据其类型而不同，但通常可以根据合成有机化学技术中众所周知的方法进行，例如在t.h.greene, p.g.wuts, protective groups in organic synthesis. third edition, 1999, john wiley & sons, inc.中公开的方法。
[0132]
步骤a-6是对化合物(8)进行酰胺化的步骤。可以以与上述步骤a-3中相同的方式进行。
[0133]
步骤a-7是去除作为保护基团的r
13
的步骤。保护基团的去除根据其类型而不同，但通常可以根据合成有机化学技术中众所周知的方法进行，例如在t.h.greene, p.g.wuts, protective groups in organic synthesis. third edition, 1999, john wiley & sons, inc.中公开的方法。
[0134]
步骤a-8是由化合物(6)合成作为h-膦酸酯的化合物(7')的步骤。h-膦酸酯可以例如通过以下来获得：使根据文献(b. c. freohler, p. g. ng and md. matteucci, nucleic acids res., 14 5399 (1986))由三氯化磷和1,2,4-三唑预先制备的3-(1,2,4-三唑基)亚磷酸酯(代替亚磷酰胺试剂)与化合物(6)在惰性溶剂中反应，然后向其中加入水以终止反应，并进行后处理。使用的溶剂没有特别限制，只要其不阻碍反应，但优选的是卤代烃如二氯甲烷。反应温度在-20℃至100℃范围内没有特别限制，但一般是室温。反应时间根据使用的溶剂和反应时间而不同，但反应时间在室温下在二氯甲烷中反应的情况下为30分钟。
[0135]
[方法b]方法b是使用化合物(3)制备支链化合物(14)和化合物(14')的方法。化合物(10)的构型不受限制。通过使用(3)，可以适当地选择galnac部分的6位羟基的保护基团。如果r=0，则使用方法c。
[0136]
[式52]r12
是羟基的常规保护基团，但理想的是苄基。在式中，r3、r4、x、n、m、r、v、r
14
和r
15
各自具有与上述相同的含义。
[0137]
步骤b-1是对化合物(10)进行氨基甲酸酯化的步骤，并且可以以与上述步骤a-1相同的方式进行。
[0138]
步骤b-2是去除作为保护基团的r
12
和r
15
的步骤。步骤b-2可以以与上述步骤a-2相同的方式进行。
[0139]
步骤b-3是对化合物(12)进行酰胺化步骤，并且可以以与上述步骤a-3相同的方式进行。
[0140]
步骤b-4是将-p(r3)r4导入化合物(13)的羟基的步骤，并且可以以与上述步骤a-3相同的方式进行。
[0141]
步骤b-5是由化合物(11)合成化合物(15)的步骤，其中仅去除作为保护基团的r
15
。
步骤b-5可以以与上述步骤a-5相同的方式进行。
[0142]
步骤b-6是对化合物(15)进行酰胺化的步骤。步骤b-6可以以与上述步骤a-6相同的方式进行。
[0143]
步骤b-7是去除作为保护基团的r
12
的步骤。步骤b-7可以以与上述步骤a-7相同的方式进行。
[0144]
步骤b-8是由化合物(13)合成化合物(14')的步骤。步骤b-8可以以与上述步骤a-8相同的方式进行。
[0145]
[方法c]方法c是使用化合物(3)制备支链化合物(19)或化合物(22)和化合物(19')或化合物(22')的方法。化合物(1)和化合物(10)的构型不受限制。通过使用化合物(3)可以适当地选择galnac部分的6位羟基的保护基团。
[0146]
[式53]
其中r3、r4、x、n、m、r、r
12
、r
13
和r
14
各自具有与上述相同的含义。
[0147]
步骤c-1是对化合物(1)或化合物(10)进行氨基甲酸酯化的步骤，并且可以使用化合物(3)代替化合物(2)以与上述步骤a-1相同的方式进行。
[0148]
步骤c-2是去除作为保护基团的r
12
或r
13
的步骤。保护基团的去除根据其类型而不
同，但通常可以根据合成有机化学技术中众所周知的方法进行，例如在t.h.greene, p.g.wuts, protective groups in organic synthesis. third edition, 1999, john wiley & sons, inc.中公开的方法。
[0149]
步骤c-3是将-p(r3)r4导入化合物(19)或化合物(22)的羟基中的步骤，并且可以以与上述步骤a-3相同的方式进行。
[0150]
步骤c-4是由化合物(18)合成化合物(19')或由化合物(21)合成化合物(22')的步骤。步骤c-4可以以与上述步骤a-8相同的方式进行。
[0151]
《4.使用疏水性保护基团的制备方法》本发明提供：一种制备galnac单元与合成寡核苷酸的偶联物的方法，通过将galnac单元与寡核苷酸的5'端或3'端结合，其中在galnac部分的3位、4位和6位中任一个处的一个或多个羟基上导入了高度疏水的保护基团，并通过由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂的吸附来将galnac单元与杂质分离；一种结合化合物(例如亚磷酰胺和h-膦酸酯)，其包含含有疏水性保护基团的galnac，用作制备方法、偶联物等中的中间体。
[0152]
本发明的制备方法包括以下步骤：a:合成包含与寡核苷酸的5'端或3'端结合的含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构的偶联物；b：使含有步骤a中获得的产物的溶液通过填充有由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂的柱，并且使水性洗涤溶液通过该柱；和c：在步骤b之后从柱上洗脱寡核苷酸。
[0153]
在该制备方法中，可以采用各种疏水性保护基团，只要它们符合上述定义即可。在正常的核酸合成中，寡核苷酸通过使用氨水等的碱处理从支持物中游离，且因此可以使用通过在酸性条件下的处理而去除的保护基团，例如任选取代的三苯甲基和任选取代的甲硅烷基。任选取代的三苯甲基的具体实例包括三苯甲基、单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。任选取代的甲硅烷基的实例包括三苯基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基，优选4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmtr基团)。
[0154]
作为在碱性条件下被去除的疏水性保护基团，可以采用各种酯基团，但其优选实例包括乙酰基和苯甲酰基。
[0155]
在本发明中，术语“包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构”是指由下式表示的结构。
[0156]
[式54]在式中，作为galnac上羟基的取代基的ra、rb和rc中的至少一个为疏水性保护基团，而其余为氢原子或在游离条件下会被去除的保护基团。它们中的全部可以为疏水性保护基团，它们中的任意两个可以为疏水性保护基团，或者它们中的仅任意一个为疏水性保护基团。优选地，ra是疏水性保护基团(更优选地，在酸性条件下被去除的疏水性保护基团，
进一步优选任选取代的三苯甲基，最优选dmtr基团)，并且rb和rc是氢原子。在其中该取代基不是疏水性保护基团的情况下，其中可以与在游离条件下会被去除的保护基团结合，但是这些保护基团在从支持物中切割寡核苷酸的过程中被去除以便在步骤a中使用时的阶段成为氢原子(galnac上的羟基)。
[0157]
x1和x2各自独立地表示接头结构，其可以在x1和x2之间分支。作为本文采用的接头结构，可以采用各种骨架如烷基链、peg链和肽链。该接头结构可以通过在中间分支而包含多个galnac。接头结构中支链的数量(t)为约1至10，优选1至3。在具有两个或更多个支链的情况下，支链点和galnac之间的接头结构可以相同或不同。在含有多个galnac的情况下，至少一个疏水性保护基团与每个galnac结合。
[0158]
在上述式中，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的键。在与寡核苷酸的5'端结合的情况下，磷酸二酯键或硫代磷酸酯键与末端处的核苷的5'-羟基一起形成。这样的结合可以通过固相合成寡核苷酸，然后使用其中y(具有包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构)形成亚磷酰胺结构或h-膦酸酯结构的化合物(含有疏水性保护基团的glcnac单元亚酰胺类化合物)以与核苷亚磷酰胺试剂相同的方式来合成。与本发明的二等分galnac单元对应的含有疏水性保护基团的galnac单元亚酰胺类化合物的具体实例在上述(b13)中进行了描述。
[0159]
本发明的制备方法不限于适用于上述本发明的双触角galnac单元，并且也可以适用于公知的galnac单元(例如，在专利文献1至9和非专利文献1和2中描述的那些)与寡核苷酸的偶联物的制备。在这种情况下，具有与已知glcnac单元对应的结构的化合物被用作含有疏水性保护基团的glcnac单元亚磷酰胺或h-膦酸酯。与已知的galnac单元对应的亚酰胺类化合物的实例可以包括以下化合物。
[0160]
以下化合物可参考j. med. chem. 2016, 59, 2718-2733及其引用的参考文献等。
[0161]
对于基于tris的galnac单元[式55]对于基于triacid的galnac单元
[式56]对于基于pentaerythritol的galnac单元[式57]对于基于lys的galnac单元[式58]
下式表示的含有疏水性保护基团的galnac单元亚磷酰胺可以参照国际公开号wo 19027009来制备。
[0162]
对于基于aryl的galnac单元[式59]
以下化合物可参考j. med. chem. 2016, 59, 2718-2733及引用的参考文献等来制备。
[0163]
用于基于hydroxyprolinol的galnac单元/基于piperidine的galnac单元[式60]在与已知glcnac单元对应的亚酰胺类化合物的上述式中，r1表示疏水性保护基团。x表示接头结构，优选c3至c6直链烷基。y表示亚磷酰胺基团或h-膦酸酯基团。
[0164]
与已知的glcnac单元对应的含有疏水性保护基团的galnac单元-亚磷酰胺或含有疏水性保护基团的galnac单元-h-膦酸酯可以通过适当地使用属于在合成galnac单元的过程中的方法a至方法c中的上述化合物(3)的galnac衍生物来合成。例如通过参照实施例1的
方法，可以合成在3位、4位和6位的至少一个羟基被疏水性保护基团保护的各种galnac衍生物。
[0165]
通过将上述含有疏水性保护基团的galnac单元亚酰胺类化合物导入以与根据前述方法的核苷亚酰胺试剂相同的方式合成的寡核苷酸的5'端或3'端中，可以合成具有包括含有疏水性保护基团的galnac-磷酸酯基团(在前述式中，y表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与寡核苷酸结合的键)的结构的偶联物。由此合成的偶联物的实例可以包括(b17)和(b18)中描述的偶联物。
[0166]
将含有疏水性保护基团的galnac单元-h-膦酸酯化合物导入所合成的寡核苷酸的5'端或3'端中的反应所使用的溶剂没有特别限制，只要它不抑制反应即可。优选地，使用无水乙腈。用作缩合剂的试剂的实例包括羧酸和磷酸的酸氯化物，优选新戊酰氯。用于将h-膦酸酯键氧化成磷酸二酯键的氧化剂没有特别限制，只要它通常用于氧化反应即可。其实例可以包括无机金属氧化剂，所述无机金属氧化剂包括锰氧化物如高锰酸钾和二氧化锰；氧化钌如四氧化钌；硒化合物如二氧化硒；铁化合物如氯化铁；锇化合物如四氧化锇；银化合物如氧化银；汞化合物如乙酸汞；氧化铅化合物如氧化铅和四氧化铅；铬酸盐化合物如铬酸钾、铬酸-硫酸盐络合物和铬酸-吡啶络合物；以及铈化合物如硝酸铵铈(can)，无机氧化剂包括卤素分子例如氯分子、溴分子和碘分子；高碘酸如高碘酸钠；臭氧；过氧化氢溶液；亚硝酸化合物如亚硝酸；亚氯酸化合物如亚氯酸钾、亚氯酸钠；以及过硫酸盐化合物如过硫酸钾和过硫酸钠，以及有机氧化剂，包括用于dmso氧化的试剂(二甲亚砜和二环己基碳二亚胺、草酰氯、乙酸酐或五氧化二磷，或吡啶-乙酸酐络合物)；过氧化物如叔丁基过氧化氢；稳定的阳离子如三苯甲基阳离子；琥珀酰亚胺如n-溴琥珀酰亚胺；次氯酸盐化合物如次氯酸叔丁酯；偶氮二羧酸酯化合物如偶氮二羧酸甲酯；二硫化物如二甲基二硫化物、二苯基二硫化物、和二吡啶基二硫化物和三苯基膦；亚硝酸酯如亚硝酸甲酯；四卤代烃如四溴甲烷；和醌化合物如2,3-二氯-5,6-二氰基-对苯醌(ddq)，优选碘分子。所使用的脱氧剂的实例包括杂环胺如吡啶、二甲氨基吡啶，和脂族胺如三甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺，优选杂环胺(特别是吡啶)。在形成硫代磷酸酯键的情况下是没有限制的，只要是能够使h-膦酸酯键反应而形成硫代磷酸酯键的试剂即可。其实例包括硫、四乙基秋兰姆二硫化物、beaucage试剂和苯乙酰基二硫化物，优选硫。所合成的偶联物可以以与寡核苷酸的通用dmtr-on纯化相同的方式从支持物中游离，同时保留疏水性保护基团。
[0167]
这样的具有包含含有疏水性保护基团的galnac单元-磷酸酯基团的结构的偶联物可以以与寡核苷酸的通用dmtr-on纯化相同的方式从支持物中游离，同时保留疏水性保护基团。一般而言，寡核苷酸的3'端与支持物之间的键被氨水切割，并且寡核苷酸在碱性条件下游离。因此，将不被碱性去除的保护基团，例如在酸性条件下被去除的基团选作疏水性保护基团。同时，在采用其中在酸性条件下将寡核苷酸的3'端与支持物之间的键切割的结合方式作为结合方式的情况下，寡核苷酸的游离条件是酸性的，且因此选择在酸性条件下不被去除的保护基团，例如在碱性条件下被去除的保护基团作为疏水性保护基团。
[0168]
将由此获得的含有疏水性保护基团的galnac单元-寡核苷酸偶联物吸附到填充有由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂的柱，然后用水性洗涤溶液洗涤该柱，使得可以分离没有疏水性保护基团的杂质。
[0169]“由于疏水相互作用而具有吸附性的树脂”没有特别限制，只要它是其中高度疏水
性组分用于基材的树脂即可。为此使用各种树脂，并且其实例包括苯乙烯-二乙烯基苯吸附树脂、改性苯乙烯-二乙烯基苯吸附树脂、甲基丙烯酸类吸附树脂或酚醛吸附树脂。
[0170]
作为将含有疏水性保护基团的galnac单元-寡核苷酸偶联物吸附到柱上时使用的填充溶液，不含有大量有机溶剂的碱性水溶液是理想的。例如，可以使用用于在固相合成后从支持物中切除低聚物的浓缩氨水或通过用适量的溶剂(如水和缓冲剂)稀释氨水而获得的碱性水溶液。
[0171]
可以采用各种溶液作为用于从柱上去除杂质的洗涤溶液，只要它们是具有使得疏水保护基团不会发生脱保护并且保持与树脂的疏水相互作用的性质的溶液即可。通过使用含有浓度足够低以保持与树脂的疏水相互作用的有机溶剂的水溶液作为洗涤溶液来提高去除杂质的效率。具体地，在其中疏水性保护基团为dmtr基团的情况下，可以使用含有适量的盐的水溶液、含有乙腈的水溶液等作为洗涤溶液。
[0172]
与galnac结合的疏水性保护基团可以通过在与所采用的保护基团对应的脱保护条件下处理偶联物来进行脱保护。在一般的寡核苷酸合成之后应用该制备方法的情况下，采用在酸性条件下进行脱保护的疏水性保护基团如dmtr基，因此脱保护通过用酸性溶液处理来进行。
[0173]
对吸附偶联物的柱上适当地进行脱保护处理，从而能够获得脱保护的galnac-寡核苷酸偶联物，同时源自保护基团的杂质被吸附到柱上。
[0174]
此外，可以通过对尚未脱保护且未从柱洗脱的含有疏水性保护基团的galnac-寡核苷酸偶联物进行脱保护处理并将脱保护处理后的溶液再次通过由于疏水相互作用而具有吸附力的同一树脂柱，来将源自保护基团的杂质从脱保护的偶联物中分离。
[0175]
galnac-寡核苷酸偶联物可以通过使保留偶联物的柱经受与所采用的树脂相对应的适当梯度洗脱方法以高纯度进行分级分离。在从柱上洗脱而不脱保护疏水性保护基团的情况下，可以通过梯度洗脱将偶联物洗脱，这增加了有机溶剂的含量，以抑制疏水性保护基团与吸附树脂之间的疏水相互作用。
[0176]
在其中在柱上的吸附状态下进行脱保护处理的情况下，可以根据将脱保护的偶联物保留在柱上的模式来适当地选择适当的洗脱条件。
[0177]
在使用由于疏水相互作用而具有吸附性的离子交换柱的情况下，在将偶联物吸附到柱上的同时进行脱保护处理，并且可以根据所采用的使用洗脱液中的盐浓度从离子交换柱洗脱的常规方法，来将galnac-寡核苷酸偶联物从柱上洗脱/分级分离。具体地，在使用resource q(可获自ge healthcare japan corporation)作为柱的情况下，可以使用将氢氧化钠/氯化钠的混合水溶液中氯化钠的含量从0逐渐增加到2m(2 mol/l)的梯度洗脱液。
[0178]
在使用反相柱的情况下，可以根据所采用的使用合适的有机溶剂从反相柱洗脱的常规方法来将galnac-寡核苷酸偶联物从柱上洗脱/分级分离。具体地，在使用clarity qsp(可获自phenomenex inc.)作为柱的情况下，可以使用含有适量乙腈的三羟甲基氨基甲烷(tris)-盐酸缓冲剂。
[0179]
为了检测目标物质，使用作为核酸检测波长的260nm下的吸光度。目标物质可以通过随时间测量柱的通过流体在260nm下的吸光度并收集洗脱步骤中要检测的级分来获得。
[0180]
《5.药物》本发明的偶联物可以用作治疗由其中所含的寡核苷酸靶向的疾病的药物。治疗包
括预防性治疗和后治疗二者。
[0181]
本发明的偶联物可以以药学上可接受的盐的形式使用。“药学上可接受的盐”是指寡核苷酸的盐，并且这样的盐的实例可以包括金属盐，包括碱金属盐如钠盐、钾盐和锂盐，碱土金属盐如钙盐和镁盐，铝盐，铁盐，锌盐，铜盐，镍盐和钴盐；胺盐，包括无机盐如铵盐和有机盐如叔辛胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n,n'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基-苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐；无机酸盐，包括氢卤化物如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐，硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；有机酸盐，包括低级烷烃磺酸盐如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐，芳基磺酸盐如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐，乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐；以及氨基酸盐，例如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐，优选碱金属盐，更优选钠盐。这些盐可以通过已知方法来制备。
[0182]
此外，偶联物及其药学上可接受的盐也可以作为溶剂化物(例如，水合物)存在并且可以使用这样的溶剂化物。在本发明中，这样的溶剂化物被视为在寡核苷酸或偶联物的盐的范围内。
[0183]
在使用本发明的偶联物或其药学上可接受的盐作为药物产品的情况下，该药物产品本身，或与适当的药学上可接受的赋形剂或稀释剂混合，可以以片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或糖浆剂的形式口服施用，或以注射剂、栓剂、贴剂或外用药物的形式肠胃外施用。
[0184]
这些制剂(preparation)是通过公知方法使用添加剂如赋形剂(例如，有机赋形剂，包括糖衍生物如乳糖、白糖、右旋糖、甘露醇和山梨糖醇；淀粉衍生物如玉米淀粉、马铃薯淀粉、α淀粉和糊精；纤维素衍生物，例如结晶纤维素；阿拉伯树胶；右旋糖酐；和普鲁兰多糖，以及无机赋形剂，包括硅酸盐衍生物如轻质无水硅酸盐、合成硅酸铝、硅酸钙和偏硅酸铝酸镁；磷酸盐如磷酸盐氢钙；碳酸盐如碳酸钙；以及硫酸盐如硫酸钙)、润滑剂(例如，硬脂酸；金属硬脂酸盐如硬脂酸钙和硬脂酸镁；滑石；胶体二氧化硅；蜡如蜂蜡和gay蜡；硼酸；己二酸；硫酸盐如硫酸钠；乙二醇；富马酸；苯甲酸钠；dl亮氨酸；月桂基硫酸盐如月桂基硫酸钠和月桂基硫酸镁；硅酸如无水硅酸盐和硅酸盐水合物；以及上述淀粉衍生物)、粘合剂(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和与上述赋形剂相同的化合物)、崩解剂(例如，纤维素衍生物如低取代度的羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙和内部交联的羧甲基纤维素钠；以及化学改性淀粉/纤维素如羧甲基淀粉、羧甲基淀粉钠、交联的聚乙烯吡咯烷酮)、乳化剂(例如，胶体粘土如膨润土和硅酸铝镁(veegum)；金属氢氧化物如氢氧化镁和氢氧化铝；阴离子表面活性剂如月桂基硫酸钠和硬脂酸钙；阳离子表面活性剂如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)；以及非离子表面活性剂如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯)、稳定剂(对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；醇如氯丁醇、苄基醇和苯乙醇；苯扎氯铵；酚如苯酚和甲酚；硫柳汞；脱氢乙酸；和山梨酸)、调味剂(例如，常用的甜味剂、酸味剂和香料)和稀释剂来制备的。
[0185]
本发明的药物可含有0.1至250微摩尔/毫升的寡核苷酸(反义寡核苷酸)，优选1至50微摩尔/毫升的寡核苷酸或其药学上可接受的盐、0.02-10% w/v的碳水化合物或多元醇
aldrichco.llc)或解封溶液-1(3w/v%三氯乙酸/二氯甲烷溶液，产品号042-28921，可获自fujifilm wako pure chemical corporation)用作解封剂(deblock)。
[0197]
苯基乙酰二硫化物(产品号fp07495，可从carbosynth holdings limited获得)使用1:1(v/v)的乙腈(脱水的，产品号01837-05，kanto chemical co., inc.)和吡啶(脱水的，产品号11339-05，kanto chemical co., inc.)的溶液溶解至0.2m用作硫代试剂以形成硫代磷酸酯键。
[0198]
oxdizer 0.05m(产品号l560250-04，可获自sigma-aldrich co. llc)或碘(产品号20035-00，可获自kanto chemical co., inc.)使用78:20:2(v/v/v)的四氢呋喃(脱水的，产品号40993-05，可获自kanto chemical co., inc.)、吡啶(脱水的，产品号11339-05，可获自kanto chemical co., inc.)和蒸馏水的溶液溶解至0.02m用作氧化剂。
[0199]
可获自chemgenes corporation的2'-o-me核苷(腺苷，产品号anp-5751，胞苷，产品号anp-5752，鸟苷，产品号anp-5753，或尿苷，产品号anp-5754)的亚磷酰胺用作核苷亚磷酰胺试剂。
[0200]
作为非天然核苷的亚磷酰胺，使用根据日本专利公开号2000-297097的实施例14(5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-o,4'-c-亚乙基-6-n-苯甲酰腺苷-3'-o-(2-氰乙基n,n-二异丙基)亚磷酰胺)、实施例27(5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-o,4'-c-亚乙基-2-n-异丁酰鸟苷-3'-o-(2-氰乙基n,n)-二异丙基)亚磷酰胺)、实施例22(5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-o,4'-c-亚乙基-4-n-苯甲酰基-5-甲基胞苷-3'-o-(2-氰乙基n,n)-二异丙基)亚磷酰胺)或实施例9(5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-o,4'-c-亚乙基-5-甲基尿苷-3'-o-(2-氰乙基n,n-二异丙基)亚磷酰胺)的化合物。
[0201]
根据作为固相载体的合成规模来适当地选择nittophase unylinker 100、10
µ
mol(可获自nitto denko corporation)，primer support 5g unylinker 350、10
µ
mol(可获自ge healthcare)，primer support 5g unylinker 350、100
µ
mol(可获自ge healthcare)或glen unysupport cpg 500、1
µ
mol(可获自glen research)。
[0202]
(实施例1)含有疏水性保护基团的galnac的合成(1a)[(2r,3r,4r,5r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[3-(苄氧羰基氨基)丙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物1a)的合成[式61]向n-(3-羟丙基)氨基甲酸苄酯(6.4g，30.8mmol)和作为文献(国际公开号wo 2011053614)中已知的化合物的[(2r,3r,4r,5r)-5-乙酰氨基-3,4,6-三乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(10g，25.7mmol)在二氯甲烷(200ml)中的悬浮液加入三氟甲磺酸(450
µ
l，5.1mmol)，然后在45℃下搅拌4小时。在反应完成后，减压蒸馏去除约一半的溶剂进行浓缩。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和生理盐水洗涤，随后用无水硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。向其中加入异丙醚(100m)，随后搅拌3小时。过滤得到
的固体产物，以得到目标物质1a(11.9g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0203]1h-nmr (cdcl3) δ： 7.43-7.29 (5h, m), 6.26 (1h, d, j = 8.5 hz), 5.36-5.29 (1h, m), 5.12 (1h, d, j = 12.1 hz), 5.08 (1h, d, j = 12.1 hz), 5.03-4.95 (2h, m), 4.33 (1h, d, j = 9.1 hz), 4.21-4.06 (3h, m), 4.01-3.93 (1h, m), 3.80-3.73 (1h, m), 3.62-3.49 (1h, m), 3.44-3.35 (1h, m), 3.14-3.04 (1h, m), 2.15 (3h, s), 2.05 (3h, s), 2.01 (3h, s), 1.95 (3h, s), 1.88-1.75 (1h, m), 1.69-1.56 (1h, m)。
[0204]c25h34
n2o
11
的计算值：[m h] 539，实测值539。
[0205]
(1b)n-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢吡喃-2-基]氧丙基]氨基甲酸苄酯(化合物1b)的合成[式62]向步骤(1a)中合成的化合物(12.4g，23mmol)在乙醇(200ml)中的悬浮液中加入28％甲醇钠甲醇溶液(0.85ml)，随后在室温下搅拌。随着反应的进行，溶液变成澄清溶液。通过静置60分钟得到沉淀物。过滤沉淀物并用乙醇和二异丙醚洗涤，随后减压干燥。以固体形式得到含有目标物质1b的粗产物(10g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0206]1h-nmr (dmso-d6) δ： 7.60 (1h, d, j = 9.1 hz), 7.40-7.17 (5h, m), 5.01 (2h, s), 4.62-4.55 (2h, m), 4.49 (1h, d, j = 4.2 hz), 4.20 (1h, d, j = 8.5 hz), 3.76-3.27 (6h, m), 3.08-2.99 (2h, m), 1.81 (3h, s), 1.66-1.56 (2h, m)。
[0207]c19h28
n2o8的计算值：[m na] 435，实测值435。
[0208]
(1c)n-[(2r,3r,4r,5r,6r)-2-(3-氨基丙氧基)-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢吡喃-3-基]乙酰胺盐酸盐(化合物1c)的合成[式63]将步骤(1b)中合成的化合物(22.8g，55.3mmol)溶解在四氢呋喃(280ml)/1n盐酸(61ml)中。向其中加入10％钯/碳(湿)(5.56g)，然后在氢气氛下在室温下剧烈搅拌3.5小时。在反应完成后，过滤混合物，并且减压蒸馏去除得到的通过流体。过滤通过加入适量乙醇产生的固体产物，并用乙醇和乙醚洗涤，随后减压干燥。得到含有目标物质1c的粗产物(17g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0209]1h-nmr (d2o) δ：4.27 (1h, d, j = 8.5 hz), 3.90-3.50 (8h, m), 2.93 (2h, t, j = 7.0 hz), 1.89 (3h, s), 1.82-1.75 (2h, m)。
[0210]
(1d)9h-芴-9-基甲基n-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢吡喃-2-基]氧丙基]氨基甲酸酯(化合物1d)的合成[式64]将步骤(1c)中合成的化合物(16.4g，52.1mmol)溶解在四氢呋喃(200ml)/纯水(50ml)中，并且向其中加入n,n-二异丙基乙胺(12.7ml，72.9mmol)。在冰冷却下，向其中加入n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基氧基]琥珀酰亚胺(21.1g，62.5mmol)，随后在室温下搅拌1.5小时。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂。向其中加入乙醚(100ml)，随后搅拌1小时。将固体产物依次用乙醇、乙酸乙酯和乙醚洗涤，随后减压干燥，以得到含有目标物质1d的粗产物(22.9g)。
[0211]1h-nmr (dmso-d6) δ：7.89 (2h, d, j = 7.3 hz), 7.69 (2h, d, j = 7.3 hz), 7.61 (1h, d, j = 9.1 hz), 7.42 (2h, t, j = 7.3 hz), 7.33 (2h, t, j = 7.3 hz), 7.24 (1h, t, j = 5.7 hz), 4.60-4.57 (2h, m), 4.49 (1h, d, j = 4.2 hz), 4.31-4.18 (4h, m), 3.76-3.28 (8h, m), 3.05-2.97 (2h, m), 1.81 (3h, s), 1.62-1.57 (2h, m)。
[0212]
c26h32n2o8的计算值：[m na] 523，实测值523。
[0213]
(1e)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[3-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)丙氧基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物1e)的合成[式65]向步骤(1d)中合成的化合物(1.56g，3.1mmol)在吡啶(20ml)中的悬浮液中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(1.27g，3.7mmol)，随后在室温下搅拌30分钟。随后，向其中加入乙酸酐(1.18ml，12.5mmol)，随后在室温下搅拌20小时。在反应完成后，加入n,n-二异丙基乙胺(1.1ml，6.2mmol)和乙醇(2ml)，并减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色
谱法(己烷:乙酸乙酯＝75:25-0:100，v/v，含有1％三乙胺)纯化，以得到无定形目标物质1e(2.8g，定量)。
[0214]1h-nmr (cdcl3) δ: 7.77 (2h, d, j = 7.3 hz), 7.62 (2h, d, j = 7.3 hz), 7.43-7.18 (13h, m), 6.83-6.79 (4h, m), 6.03 (1h, d, j = 9.1 hz), 5.55 (1h, d, j = 3.0 hz), 5.14-5.03 (2h, m), 4.46-4.43 (3h, m), 4.24-4.04 (2h, m), 3.97-3.91 (1h, m), 3.85-3.82 (1h, m), 3.77 (6h, s), 3.72-3.71 (1h, m),3.54-3.33 (3h, m), 3.09-3.04 (2h, m), 2.03 (3h, s), 1.89 (6h, s), 1.65-1.56 (2h, m)。
[0215]c52h55
no
12
的计算值：[m na] 908，实测值909。
[0216]
(1f)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-4-乙酰氧基-6-(3-氨基丙氧基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物1f)的合成[式66]向步骤(1e)中合成的化合物(2.49g，2.8mmol)的二氯甲烷(8ml)溶液中加入哌啶(0.45ml，4.5mmol)，随后在室温下搅拌。如果反应不完全，则酌情加入哌啶。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过nh-硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇=100:0-85:15，v/v)纯化，以得到无定形目标物质1f(1.48g，收率79%)。
[0217]1h-nmr (cdcl3) δ：7.39-7.18 (9h, m), 6.83-6.80 (4h, m), 5.55 (1h, d, j = 3.0 hz), 5.51 (1h, d, j = 9.1 hz), 5.27 (1h, dd, j = 11.2, 3.3 hz), 4.64 (1h, d, j = 8.5 hz), 3.98-3.90 (2h, m), 3.84-3.82 (1h, m), 3.79 (6h, s), 3.75-3.74 (1h, m), 3.58-3.56 (1h, m), 3.35 (1h, dd, j = 9.1, 5.4 hz), 3.07 (1h, t, j = 8.5 hz), 2.82-2.74 (4h, m), 2.01 (3h, s), 1.96 (3h, s), 1.89 (3h, s), 1.74-1.69 (2h, m)。
[0218]c37h45
no
10
的计算值：[m na] 687，实测值687。
[0219]
(实施例2)与galnac单元x
18
对应的亚酰胺试剂(具有含有疏水性保护基团的galnac-磷酸酯基团的化合物)的合成(2a)2-[[2-苄氧基-3-[(2-苄氧基-2-氧代-乙基)氨基甲酰氧基]丙氧基]羰基氨基]苄基乙酸酯(化合物2a)的合成[式67]
将2-苄氧基-1,3-丙二醇(2.5g，14mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(5.8g，29mmol)溶解在四氢呋喃(100ml)中，并向其中加入吡啶(5.0ml，61.8mmol)，随后在室温下搅拌20分钟。过滤析出的固体，然后向其中加入四氢呋喃(70ml)。随后，向其中加入甘氨酸苄酯tfa盐(9.2g，33mmol)和n,n-二异丙基乙胺(9.6ml，55mmol)，随后在室温下搅拌过夜。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(己烷:乙酸乙酯=100:0-40:60，v/v)纯化，以得到胶状目标物质2a(6.5g，收率84%)。
[0220]1h-nmr (cdcl3) δ: 7.37-7.33 (15h, m), 5.48 (2h, t, j = 5.4 hz), 5.18 (4h, s), 4.64 (2h, s), 4.23 (4h, d, j = 5.4 hz), 3.99 (4h, d, j = 5.4 hz), 3.84 (1h, t, j = 5.4 hz)。
[0221]c30h32
n2o9的计算值：[m h] 565，实测值565，[m na] 587，实测值587(2b)2-[[3-(羧甲基氨基甲酰氧基)-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]乙酸的合成(化合物2b)[式68]将步骤(2a)中合成的化合物2a(7.3g，2.8mmol)溶解于四氢呋喃(200ml)/纯水(50ml)中。向其中加入20％氢氧化钯-活性炭(约50％水)(3g)，随后在氢气氛下在室温下剧烈搅拌5小时。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除通过流体，以得到含有目标物质2b的粗产物(3.2g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0222]1h-nmr (d2o) δ：4.21-4.14 (5h, m), 3.86 (4h, s)。
[0223]
(2c)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基 1-甲氧基]甲基]四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酰氧基]-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]乙酰基]氨基]丙氧基]-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物2c)的合成[式69]
向步骤(2b)中合成的化合物2b(0.31g，1.05mmol)、步骤(1e)中合成的化合物1f(1.47g，2.21mmol)和n,n-二异丙基乙胺(0.91ml，5.27mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(9ml)的溶液中加入1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(11.3g，29.6mmol)，随后在室温下搅拌3小时。在反应完成后，将反应溶液逐滴加入乙醚(总计185ml)中。将上清液中的溶剂去除后得到的胶状粗产物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇=100:0-15:85，v/v，含有1%三乙胺)纯化，以得到作为固体的目标物质2c(1.05g，收率63%)。
[0224]1h-nmr (cdcl3) δ：7.39-7.17 (18h, m), 6.83-6.80 (8h, m), 6.70-6.27 (2h, m), 5.56-5.54 (2h, m), 5.10 (2h, d, j = 10.9 hz), 4.49-3.02 (44h, m), 2.01 (6h, s), 1.96 (6h, s), 1.90 (6h, s), 1.80-1.63 (4h, m)。
[0225]c81h98
n6o
27
的计算值：[m na] 1611，实测值1611(2d)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酰氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基-丙氧基]羰基氨基]乙酰基]氨基]丙氧基]-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物2d)的合成[式70]
6.70-6.50 (1h, m), 6.16-6.02 (1h, m), 5.56-5.54 (2h, br), 5.11-5.00 (2h, m), 4.53-2.99 (44h, m), 2.01 (6h, s), 1.95 (6h, s), 1.88 (6h, s), 1.77-1.68 (4h, m)。
[0233]c81h98
n6o
27
的计算值：[m na] 1611，实测值1611(3d)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[[2-[[2-[[2-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酰氧基]-3-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基-丙氧基]羰基氨基]乙酰基]氨基]丙氧基]-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物3d)的合成[式74]以与步骤(2d)中相同的方式使用化合物3c(0.31g，1.05mmol)代替化合物2c来得到目标物质3d(0.60g，收率72％)。
[0234]1h-nmr (cdcl3) δ：7.38-7.18 (18h, m), 7.13-6.97 (1h, m), 6.83-6.81 (8h, m), 6.58-6.36 (1h, m), 5.56-5.52 (2h, m), 5.10-5.04 (2h, m), 4.46-2.97 (47h, m), 2.65-2.63 (2h, m), 2.02 (6h, s), 1.95 (3h, s), 1.94 (3h, s), 1.90 (3h, s), 1.89 (3h, s), 1.77-1.67 (4h, m), 1.20-1.16 (12h, m)。
[0235]
(实施例4) 与galnac单元x
20
对应的亚酰胺试剂(具有含有疏水性保护基团的galnac-磷酸酯基团的化合物)的合成(4a)3-[[2-苄氧基-3-[(3-苄氧基-3-氧代-丙基)氨基甲酰氧基]丙氧基]羰基氨基]丙酸苄酯(化合物4a)的合成[式75]
以与步骤(2a)中相同的方式使用3-氨基丙酸苄酯tfa盐(2.4g，8.17mmol)代替步骤(2a)中使用的甘氨酸苄酯tfa盐来得到目标物质4a(1.62g，收率80％)。
[0236]1h-nmr (cdcl3) δ：7.39-7.27 (15h, m), 5.21 (2h, br s), 5.14 (4h, s), 4.63 (2h, s), 4.24-4.10 (4h, m), 3.79-3.74 (1h, m), 3.48-3.44 (4h, m), 2.59 (4h, t, j = 6.0 hz)。c
32h36
n2o9的计算值：[m h] 593，实测值593，[m na] 615，实测值615(4b)3-[[3-(2-羧乙基氨基甲酰氧基)-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]丙酸(化合物4b)的合成[式76]以与步骤(2b)中相同的方式使用化合物4a(1.62g，2.73mmol)代替步骤(2b)中使用的化合物2a来得到目标物质4b(0.89g，定量)。
[0237]1h-nmr (d2o) δ：4.22-4.04 (5h, m), 3.46-3.32 (4h, m), 2.57 (4h, t, j = 6.7 hz)。
[0238]
(4c)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-3-氧代-丙基]氨基甲酰氧基]-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]丙酰基氨基]丙氧基]-4-乙酰氧基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]四氢吡喃-3-基]乙酸酯(化合物4c)的合成[式77]以与步骤(2c)中相同的方式使用化合物4b(300mg，0.93mmol)代替步骤(2c)中使用的化合物2b来得到目标物质4c(950mg，收率63％)。
[0239]1h-nmr (cdcl3) δ：7.32-7.24 (18h, m), 6.82-6.80 (8h, m), 6.64-6.61 (1h, br), 6.27-6.24 (1h, br), 5.91-5.88 (1h, br), 5.56 (2h, d, j = 3.0 hz), 5.10 (2h, d, j = 11.5 hz), 4.46-3.05 (43h, m), 2.47-2.37 (4h, m), 2.02 (6h, s), 1.98 (6h, s), 1.90 (6h, s), 1.78-1.67 (4h, m)。
[0240]c83h102
n6o
27
的计算值：[m na] 1638，实测值1638
4.68 (1h, d, j = 7.9 hz), 4.20-4.09 (2h, m), 3.97-3.86 (3h, m), 3.49-3.44 (1h, m), 3.20-3.17 (2h, m), 2.14 (3h, s), 2.05 (3h, s), 2.01 (3h, s), 1.93 (3h, s), 1.66-1.34 (6h, m)。c
27h38
n2o
11
的计算值：[m h]
567，实测值567。
[0251]
(6b)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(5-氨基戊氧基)四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯盐酸盐(化合物6b)的合成[式84]将步骤(6a)中合成的化合物6a(3.87g，6.83mmol)溶解在四氢吡喃(32ml)/1 n盐酸(8ml)中。向其中加入10％钯/碳(湿)(2g)，随后在氢气气氛下在室温下剧烈搅拌。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除通过流体，以得到目标物质6b的粗产物(3.1g，收率97％)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0252]c19h32
n2o9的计算值：[m h]
433，实测值433。
[0253]
(6c)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[5-[[3-[5-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧戊基氨基甲酰氧基]-2-苄氧基-丙氧基]氨基甲酰氨基]戊氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物6c)的合成[式85]将2-苄氧基-1,3-丙二醇(600mg，3.29mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(1.39g，6.91mmol)溶解在四氢呋喃(22ml)中，并向其中加入吡啶(1.1ml，13.2mmol)，随后在室温下搅拌15分钟。过滤析出的固体后，向其中加入四氢呋喃(16ml)。随后，加入步骤(6b)中合成的化合物(6b)(3.09g，6.59mmol)在四氢呋喃(15ml)/二氯甲烷(5ml)和n,n-二异丙基乙胺(3.4ml，19.8mmol)中的溶液，随后在40℃下搅拌2小时。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂。向其中加入二氯甲烷，并将有机层用0.5n盐酸、饱和生理盐水、0.2n氢氧化钠水溶液和饱和生理盐水洗涤，随后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷:甲醇=100:0-90:10，v/v)纯化，以得到主要含有目标物质6c的混
合物(2.1g)。
[0254]c50h74
n4o
23
的计算值：[m h]
1099，实测值1099。[m na]
1121，实测值1121。
[0255]
(6d)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[5-[[3-[5-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧戊基氨基甲酰氧基]-2-羟基-丙氧基]羰基氨基]戊氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物6d)的合成[式86]将步骤(6c)中得到的含有化合物6c的混合物(2.1g)溶解在四氢吡喃(20ml)/纯水(1ml)中。向其中加入1n盐酸(0.38ml)和10％钯/碳(湿)(1g)，随后在氢气气氛下在室温下剧烈搅拌。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除所得到的通过流体，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:甲醇=100:0-90:15，v/v)纯化，以得到作为固体的目标物质6d(1.38g，收率72%)。
[0256]1h-nmr(cdcl3) δ：6.10-5.96 (1h, m), 5.38-4.94 (6h, m), 4.70-4.64 (2h, m), 4.23-3.44 (19h, m), 3.20-3.15 (4h, m), 2.15 (6h, s), 2.05 (6h, s), 2.01 (6h, s), 1.97 (6h, s), 1.67-1.38 (12h, m)。
[0257]c43h68
n4o
23
的计算值：[m h]
1009，实测值1009。[m na]
1031，实测值1031。
[0258]
(6e)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[5-[[3-[5-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧戊基氨基甲酰氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基-丙氧基]氨基甲酰氨基]戊氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物6e)的合成[式87]
以与步骤(2d)中相同的方式使用化合物6d(1.38g，1.37mmol)代替步骤(2d)中使用的化合物2c来得到目标物质6e(850mg，收率51％)。
[0259]1h-nmr (cdcl3) δ：5.95-5.89 (1h, m), 5.38-5.26 (4h, m), 5.20-5.16 (1h, m), 5.00-4.95 (1h, m), 4.71-4.68 (2h, m), 4.36-3.44 (22h, m), 3.15 (4h, q, j = 6.4 hz), 2.67 (2h, t, j = 6.3 hz), 2.15 (6h, s), 2.05 (6h, s), 2.01 (6h, s), 1.96 (6h, s), 1.67-1.33 (12h, m), 1.18 (12h, d, j = 6.7 hz)。
[0260]
(实施例7) 与galnac单元x
20
对应的亚酰胺试剂的合成(7a)[(2r,3r,4r,5r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-(3-氨基丙氧基)四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯盐酸盐(化合物7a)的合成[式88]将步骤(1a)中合成的化合物1a(10g，18.6mmol)溶解在四氢呋喃(200ml)/1n盐酸(20ml)中。向其中加入10％钯/碳(湿)(1g)，随后在氢气气氛下在室温下剧烈搅拌1小时。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除通过流体，以得到含有目标物质7a的粗产物(8.97g)。无需进一步纯化即可用于下一步反应。
[0261]c17h28
n2o9的计算值：[m h] 405，实测值405。
[0262]
(7b)[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧丙基氨基]-3-氧代-丙基]氨基甲酰氧基]-2-羟基-丙氧基]氨基甲酰氨基]丙酰氨基]丙氧基]-3,4-二乙酰氧基-四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物7b)的合成[式89]
= 3.0 hz), 5.09-5.05 (2h, m), 4.50-4.45 (2h, m), 4.26-3.37 (28h, m), 3.17 (2h, br), 2.67 (2h, t, j = 6.3 hz), 2.52-2.42 (4h, m), 2.17 (6h, s), 2.05 (6h, s), 2.02 (6h, s), 1.99 (6h, s), 1.81-1.70 (4h, m), 1.18 (12h, d, j = 6.7 hz)。
[0267]
(实施例8)x
18-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-t
e2s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用abi 392 dna/rna synthesizer(可获自applied biosystems)作为核酸自动合成仪和nittophase unylinker 100、10
µ
mol(可获自nitto denko corporation)作为固相载体，根据亚磷酰胺法(nucleic acids research, 12, 4539 (1984))合成寡核苷酸序列15e_001，然后使用在实施例2中合成的作为glcnac单元亚酰胺的化合物2d缩合一次。通过用6ml浓缩氨水处理受保护的寡核苷酸类似物而从支持物中切离低聚物，并去除作为磷原子上的保护基团和核碱基上的保护基团的氰乙基。使用clarity qsp(可获自phenomenex inc.)，根据所附手册进行纯化。
[0268]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92位至第106位的序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6247.96)。
[0269]
(实施例9)x
18-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用前述序列15e_001.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0270]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位的序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6233.97)。
[0271]
(实施例10)x
18-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：44)使用前述序列15e_005.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0272]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第105位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1，mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6235.97)。
[0273]
(实施例11)x
18-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2s-u
mlt-h(seq id no：45)
使用上述序列15e_006.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0274]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第90至第104位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6200.94)。
[0275]
(实施例12)x
18-a
m1s-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：42)使用前述序列16e_001.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0276]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第90至第107位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6593.02)。
[0277]
(实施例13)x
18-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m12-c
e2t-h(seq id no：47)使用前述序列16e_002.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0278]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6595.01)。
[0279]
(实施例14)x
18-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2s-u
mlt-h(seq id no：48)使用上述序列16e_003.5代替实施例8中使用的序列，以与实施例8中相同的方式进行合成。
[0280]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第90至第105位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6571.98)。
[0281]
(实施例15)x
20-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用实施例4中制备的化合物4d作为galnac单元亚酰胺代替化合物2d，将x
18
替换为x
20
，以与实施例8中相同的方式进行合成。使用的序列是前述序列15e_001.5。
[0282]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第
106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6261.98)。
[0283]
(实施例16)x
20-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：44)使用前述序列15e_005.5，以与实施例15中相同的方式进行合成。
[0284]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第105位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6264.00)。
[0285]
(实施例17)x
20-a
mls-a
mls-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：42)使用前述序列16e_001.5，以与实施例15中相同的方式进行合成。
[0286]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第107位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6621.04)。
[0287]
(实施例18)x
20-a
mls-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：47)使用前述序列16e_002.5，以与实施例15中相同的方式进行合成。
[0288]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6623.05)。
[0289]
(实施例19)x
21-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用实施例5中合成的化合物5d作为galnac单元亚酰胺，将x
18
替换为x
21
，以与实施例8中相同的方式进行合成。使用的序列是前述序列15e_001.5。
[0290]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6290.02)。
[0291]
(实施例20)x
22-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)
使用实施例6中合成的化合物6d作为galnac单元亚酰胺，将x
18
替换为x
22
，以与实施例8中相同的方式进行合成。使用的序列是前述序列15e_001.5。
[0292]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6175.96)。
[0293]
(实施例21)x
22-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：44)使用前述序列15e_005.5，以与实施例20中相同的方式进行合成。
[0294]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第105位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6177.98)。
[0295]
(实施例22)x
22-a
m1s-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：42)使用前述序列16e_001.5，以与实施例20中相同的方式进行合成。
[0296]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第107位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6535.03)。
[0297]
(实施例23)x
22-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
e2s-u
m1s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1s-c
e2t-h(seq id no：47)将该序列替换为前述序列16e_002.5，以与实施例20中相同的方式进行合成。
[0298]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第91至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中的第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6537.05)。
[0299]
(实施例24)x
20-g
e2s-c
e2s-a
s-t
s-t
s-g
s-g
s-t
s-a
s-t
s-t
e2s-c
e2s-a
e2t-h(seq id no：96)使用前述与人载脂蛋白b (apob) genbank登录号nm_000384.2的第10177-10189位核酸序列互补的序列代替实施例15中使用的序列，以与实施例15相同的方式合成galnac单元与寡核苷酸的偶联物(apob-aso偶联物)。在前述方法中，合成具有前述序列的寡核苷酸后，终止合成，随后切除/收集，以合成没有结合galnac单元的寡核苷酸(apob-aso)。该化合物通过负离子esi质谱进行鉴定(测量值：5296.83(apob-aso偶联物)和4392.50(apob-aso))。
[0300]
(实验例1)使用培养细胞评价实施例化合物对异常剪接的修复
(1-1) 293a细胞(人胎肾细胞)的培养如下培养293a细胞(r705-07 invitrogen)。
[0301]
293a细胞在维持培养基(dmem，10�s)中维持和培养。在实验中，细胞以2
×
105个细胞/孔的密度接种在6孔板上，并以1
×
105个细胞/孔的密度接种在12孔板上，并且如后所述，在第二天同时导入每个实施例的化合物和质粒载体以用于评价。
[0302]
(1-2)人g6pc全长质粒载体的制备如下制备人g6pc全长质粒载体(pcdna hg6pc、pcdna hg6pc (c.648g》t) int4)。
[0303]
使用human multiple tissuec dna panel作为模板，使用以下g6pc cdna扩增引物扩增g6pc cdna，然后使用g6pc cdna if引物进一步扩增。使用infusion system(pcdna hg6pc)将扩增的片段插入到pcdna3.1的bamhi位点中。
[0304]
g6pc cdna扩增引物：正向引物5'-atagcagagcaatcaccaccaagcc-3'(seq id no：49)反向引物5'-attccacgacggcagaatggatggc-3'(seq id no：50)g6pc if引物：正向引物5'-taccgagctcggatccaccaccaagcctggaataactgc-3'(seq id no：51)反向引物5'-ctggactagtggatcctggcatggttgttgactttaaac-3'(seq id no：52)使用人类基因组dna作为模板并使用以下g6pc int4 扩增引物，扩增出g6pc intron4和部分含有外显子5的区域，并用g6pc int4 if引物进一步扩增g6pc intron4。此外，使用以下hg6pc载体if引物扩增在步骤1-1中产生的pcdna hg6pc。将第5位外显子中的c.648g》t突变导入infusion引物中。两个片段通过infusion system连接，并将g6pc intron4序列插入pcdna hg6pc(pcdna hg6pc(c.648g》t) int4)中。
[0305]
g6pc int4扩增引物：正向引物5'-tctgggctgtgcagctgaatgtctg-3'(seq id no：53)反向引物5'-gtaggggatgacactgacggatgcc-3'(seq id no：54)g6pc int4 if引物：正向引物5'-ctggagtcctgtcaggtatgggc-3'(seq id no：55)反向引物5'-agctgaaaaggaagaaggtaatgag-3'(seq id no：56)hg6pc载体if引物：正向引物5'-tcttccttttcagcttcgccatcgg-3'(seq id no：57)反向引物5'-ctgacaggactccagcaacaac-3'(seq id no：58)(1-3)实施例化合物与质粒载体的共转染如下共转染各实施例的化合物和质粒载体。
[0306]
制备以下溶液a和溶液b，然后混合。
[0307]
在使用6孔板、250
µ
l opti-mem培养基(gibco)的情况下，每孔制备0.50
µ
l质粒载体(1mg/ml)和4.0
µ
l(最终：20nm)每个实施例中产生的化合物(12.5
µ
m)作为溶液a以及250
µ
l opti-mem培养基(gibco)和6.0
µ
l lipofectamine2000(invitrogen)作为溶液b，并将溶液a和溶液b混合。在使用12孔板125
µ
l、opti-mem培养基(gibco)的情况下，每孔制备0.25
µ
l质粒载体(1mg/ml)和2.0
µ
l(最终：20nm)每个实施例中产生的化合物(12.5
µ
m)作为溶液a以及125
µ
l opti-mem培养基(gibco)和3.0
µ
l lipofectamine2000(invitrogen)作为溶液b，
并将溶液a和溶液b混合。
[0308]
混合溶液在室温下孵育20分钟，然后在传代后的第二天添加到细胞中(共转染)。添加6小时后用新鲜的维持培养基更换培养基，并从添加混合溶液开始，将混合物在co2培养箱中培养24小时。
[0309]
(1-4)通过rt-pcr评价mrna[1] rna提取(体外)如下提取rna。
[0310]
共转染后孵育24小时的细胞用冷pbs洗涤一次。以每孔300
µ
l的量向其中加入rneasy微试剂盒或rneasy96试剂盒(qiagen k.k.)的细胞溶解物，并在室温下孵育5分钟后收集。根据包括dnase处理的试剂盒手册对收集的溶液进行rna纯化。rnase-free dnase set(qiagen k.k. 89254)用于dnase处理。对纯化/洗脱的rna进行后述的逆转录反应。
[0311]
[2] 逆转录反应如下进行逆转录反应。
[0312]
将提取的rna调整至25-100mg/ml后，每个样品使用high capacity rna-to-cdna试剂盒(applied biosystems)将10
µ
l缓冲剂混合物、1
µ
l酶混合物、9
µ
l纯化水和提取的rna混合，用于逆转录反应(37℃ 60分钟，95℃ 5分钟，4℃ 保持)。
[0313]
20
µ
l的逆转录反应产物用80
µ
l纯化水稀释5倍并在-30℃下储存。
[0314]
[3] qrt-pcr(sybr green)如下设计qrtpcr引物(sybr green)。
[0315]
修复的hg6pc引物(sybr)：正向引物5'-ttgtggttgggattctgggc-3'(seq id no：59)反向引物5'-atgctgtggatgtggctgaa-3'(seq id no：60)hactin引物(sybr)：正向引物5'-tggcacccagcacaatgaa-3'(seq id no：61)反向引物5'-ctaagtcatagtccgcctagaagca-3'(seq id no：62)每孔悬浮5
µ
l 2x fast sybr green master mix(applied biosystems)、2
µ
l纯化水、1
µ
l 引物混合物(10
µ
m)和2
µ
l cdna(稀释5倍)作为pcr反应溶液，以使用viia7(applied biosystems)(程序：sybr green regents，fast，包括解链曲线)进行pcr反应。
[0316]
[4] qrt-pcr(taqman检测)如下设计修复的hg6pc引物组和总hg6pc引物组，并调整20x引物探针混合物(引物浓度：1000nm探针浓度：250nm)。对于hactin引物组和mactin引物组，原液按原样使用。
[0317]
修复的hg6pc引物组(taqman)：正向引物5'-gctgctcattttcctcatcaagtt-3'(seq id no：63)反向引物5'-tggatgtggctgaaagtttctgta-3'(seq id no：64)探针5'-tcctgtcaggcatgc-3' fam(seq id no：65)hactin引物组(taqman)：abi hs01060665_g1 fammactin引物组(taqman)：abi mm02619580_g1 fam18s引物组(taqman)：abi hs99999901_s1 fam每孔悬浮5
µ
l 2x taqman fast advanced master mix(applied biosystems)、
2.5
µ
l纯化水、0.5
µ
l 20x 引物探针混合物(10
µ
m)和2
µ
l cdna(稀释5倍)以调整pcr反应溶液(每管)并以使用viia7或quantstadio7(applied biosystems)进行pcr反应(程序：taqman regents，fa)。
[0318]
(1-5) 使用人g6pc全长质粒载体(pcdna hg6pc(c.648g》t) int4)评价实施例寡核苷酸对g6pc mrna异常剪接的修复对人g6pc全长质粒载体(pcdna hg6pc(c.648g》t) int4)和各个寡核苷酸(15e_001、15e_002和国际公开号wo 2004/048570的实施例93的化合物作为对照)进行共转染并通过qrt-pcr(sybr green)评价是否修复了由g6pc(c.648g》t)引起的异常剪接。结果，g6pc mrna的异常剪接在15e_001和15e_002的化合物中被正常化。
[0319]
(实验例2)使用模型小鼠评价实施例化合物对异常剪接的修复(2-1)小鼠的产生载体的产生根据以下程序，制备g6pc ki载体。
[0320]
使用小鼠基因组dna作为模板并使用以下mg6pc 5'臂扩增引物，扩增出g6pc 5'臂区域。用mg6pc 5'臂if引物进一步扩增，然后插入pbluescriptii( /-)的xhoi位点(g6pc 5'臂载体)中。
[0321]
mg6pc 5'臂扩增引物：正向引物5'-gggaaacatgcatgaagccctgggc-3'(seq id no：67)反向引物5'-tcccttggtacctcaggaagctgcc-3'(seq id no：68)mg6pc5'臂if引物：正向引物5'-cgggccccccctcgaaaactaggcctgaagagatggc-3'(seq id no：69)反向引物5'-taccgtcgacctcgagggttggccttgatccctctgcta-3'(seq id no：70)然后，使用小鼠基因组dna作为模板并使用以下mg6pc 3'臂扩增引物，扩增出g6pc 3'臂区域。用mg6pc 3'臂if引物进一步扩增，并插入g6pc 5'臂载体(g6pc 5' 3'臂载体)的noti位点中。
[0322]
mg6pc 3'臂扩增引物：正向引物5'-ggttgagttgatcttctacatcttg-3'(seq id no：71)反向引物5'-gcaagagagccttcaggtagatccc-3'(seq id no：72)mg6pc 3'臂if引物：正向引物5'-agttctagagcggccgcccatgcaaaggactaggaacaac-3'(seq id no：73)反向引物5'-accgcggtggcggccaatgttgcctgtcttcctcaatc-3'(seq id no：74)使用前述pcdna hg6pc(c.648g》t) int4作为模板并使用以下hg6pc int4 if引物，扩增出hg6pc(c.648g》t) intron4。使用g6pc 5' 3'臂载体作为模板和以下臂载体if引物进一步扩增。使用infusion system连接这两个片段以产生g6pc ki载体。
[0323]
hg6pc int4 if引物：正向引物5'-ggccaaccctggaataactgcaagggctctg-3'(seq id no：75)反向引物5'-ttgcatggttgttgactttaaacaccgaaga-3'(seq id no：76)臂载体if引物：正向引物5'-tcaacaaccatgcaaaggactaggaacaac-3'(seq id no：77)
反向引物5'-attccagggttggccttgatccctctgcta-3'(seq id no：78)将以下ki 5' grna和ki 3' grna序列导入pspgrna(addgene)的grna序列导入区域中以产生pspgrna(ki 5')和pspgrna(ki 3')。
[0324]
ki 5' grna：5'-gggatcaaggccaaccggctgg-3'(seq id no：79)ki 3' grna：5'-taaagtcaaccgccatgcaaagg-3'(seq id no：80)(2-2) 显微注射使用无菌蒸馏水将各种载体调整到最终浓度：g6pc ki载体为10ng/
µ
l、pspgrna(ki 5')为5ng/
µ
l、pspgrna(ki 3')为5ng/
µ
l和pspcas9(addgene)为5ng/
µ
l，并通过millex-gv注射器过滤器(millipore)分别注射到c57bl/6j小鼠受精卵的原核充分膨胀的程度(约2pl)。将受精卵移植到受体c57bl/6j小鼠的输卵管中以得到f0小鼠。
[0325]
(2-3) 基因分型、f1系统化通过以下程序进行基因分型以进行f1系统化。
[0326]
使用自动核酸提取器(pi-200，可获自kurabo industries ltd.)和特殊试剂盒从f0小鼠的尾部组织中提取基因组dna。使用amplitaq gold master mix(thermo fisher scientific)和以下ki筛选引物对提取的dna进行扩增(95℃ 10分钟、35个循环(95℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 30秒)，72℃ 2分钟，4℃保持)。
[0327]
ki筛选引物：正向引物5'-tacgtcctcttccccatctg-3'(seq id no：81)，反向引物5'-ctgacaggactccagcaaca-3'(seq id no：82)将前述pcr产物进行凝胶电泳，并使用以识别为433bp左右的条带的个体的基因组dna作为模板、primestar gxl(takara bio inc.)和以下ki基因分型引物(98℃ 2分钟、38个循环(95℃ 15秒、68℃ 5分钟)，68℃ 7分钟，15℃保持)进行扩增。
[0328]
ki基因分型引物(5')：正向引物5'-ttccttccaaagcagggactctctatgt-3'(seq id no：83同(1))反向引物5'-cttgcagaaggacaagacgtagaagacc-3'(seq id no：84同(2))ki基因分型引物(3')：正向引物5'-gagtctatattgagggcaggctggagtc-3'(seq id no：85)，反向引物5'-tagtctgcctgctcactcaacctctcct-3'(seq id no：86)对前述pcr产物进行凝胶电泳。使用个体基因组dna的ki基因分型引物(5')的pcr产物使用gentetic分析仪(lifetechnology)和以下ki序列引物进行直接测序，所述个体基因组dna的序列长度(4705bp和4026bp)如预期是使用ki基因分型引物(5')和ki基因分型引物(3')中任何一个扩增的。具有ki为预期序列的那些被用作ki阳性f0。
[0329]
ki序列引物(5')：5'-gagtctatattgagggcaggctggagtc-3'(seq id no：87)ki阳性f0与c57bl/6j交配以获得f1。使用dneasy 96 blood & tissue kit(qiagen k.k.)从f1的耳廓组织中提取基因组dna，并使用primestar gxl(takara bio inc.)和前述ki基因分型引物(5')进行扩增(98℃ 2分钟、38个循环(95℃ 15秒、68℃ 5分钟)，68℃ 7分钟，15℃ 保持)。
[0330]
将前述pcr产物进行凝胶电泳，将具有如预期扩增的序列长度的个体(4705b)用作ki阳性f1。将从ki阳性f1中选择的一个系进行增殖以产生hg6pc(c.648g》t) int4 ki系。
[0331]
(2-4) hg6pc(c.648g》t) int4系的基因分型使用dneasy 96 blood & tissue kit(qiagen k.k.)从耳廓组织中提取基因组dna，并使用kod fx(toyobo co., ltd.)和以下ki基因分型引物和mg6pc wt引物进行复合扩增(98℃ 2分钟、32个循环(95℃ 15秒，68℃ 5.5分钟)，68℃ 5分钟，4℃保持)。
[0332]
ki基因分型引物(5')：正向引物5'-ttccttccaaagcagggactctctatgt-3'(seq id no：83同(1))反向引物5'-cttgcagaaggacaagacgtagaagacc-3'(seq id no：84同(2))mg6pc wt引物：正向引物5'-taaatttgaccaatgagcactggagggtc-3'(seq id no：88)反向引物5'-aaaatcatgtgtatgcgtgcctttccta-3'(seq id no：89)，将前述pcr产物进行凝胶电泳，并确定后代的基因分型(wt、ht或homo)，同时将4705b附近的扩增指定为ki等位基因，并将2536bp附近的扩增指定为mg6pc wt等位基因。
[0333]
(2-5) 小鼠的采样如下进行小鼠的采样。
[0334]
在采样前一天的晚上，在安装地板网后开始禁食以避免食粪。次日，在麻醉下开腹，并在充分放血后取出肝和肾。用冰冷的pbs清洗各个器官，然后修剪成适当的大小，并保存在预先装有均质化的珠子(nikkato corporation)的试管中。每个器官立即用液氮冷却，然后在-80℃下储存。
[0335]
(2-6) 通过qrtpcr评价mrna[1]rna提取(体内)如下提取rna。
[0336]
以每个组织储存管600
µ
l的量添加rneasy微试剂盒或qiacube系统(qiagen k.k.)的细胞溶解物，用于在组织lyserii(qiagen k.k.)中以25khz均质化2分钟。在冰冷却下孵育10分钟后，通过在室温下以8000g离心10分钟来收集上清液。根据包括dnase处理的每个试剂盒的手册对上清液进行rna纯化。rnase-free dnase set(qiagen k.k.)用于dnase处理。将纯化/洗脱的rna进行前述逆转录反应，并根据前述qrt-pcr(taqman测定)对修复的g6pc mrna进行定量。
[0337]
(2-7) 使用hg6pc(c.648g》t) int4 ht ki小鼠评价实施例化合物对异常剪接的修复将实施例8至14的化合物各自溶解在otsuka生理盐水注射液中，并以30mg/kg皮下施用于hg6pc(c.648g》t) int4 ht ki小鼠。施用7天后，在过夜禁食的条件下收集小鼠的肝组织，并且通过qrt-pcr(taqman)评价g6pc(c.648g》t)引起的异常剪接是否得到修复。结果，hg6pc(c.648g》t) int4 ht ki小鼠肝脏中mrna的异常剪接被实施例8至14的化合物正常化，如图1中所示。此外，以相同方式评价实施例15至23的化合物。结果，hg6pc(c.648g》t) int4 ht ki小鼠肝脏中mrna的异常剪接被实施例15至23的化合物正常化，如图2中所示。
[0338]
(实验例3)使用apob敲低试验评价通过galnac单元偶联物向肝细胞递送寡核苷酸(3-1)人原代肝细胞的培养如下培养人原代肝细胞。
[0339]
将fbs(gibco)添加至modified lanford medium(nissui pharmaceutical co.,
ltd.)至10％，以制备粘附培养基。从液氮罐中取出冷冻的人原代肝细胞(gibco，hu8105)，37℃下解冻，然后立即倒入chrm(invitrogen)中，并轻轻混合，随后在室温下离心(100g，10分钟)。用抽吸器去除上清液，然后将粘附介质加热至37℃加入，以制备细胞悬液。通过自动计数器(bio-rad laboratories, inc.)对活细胞数进行计数，然后将细胞接种在胶原包被的24孔板上(接种的活细胞数：1.4-2.1
×
105细胞/孔)。在co2培养箱中培养4至5小时后，用显微镜确认贴壁的细胞，并且进行下述的化合物添加实验。
[0340]
(3-2)实施例化合物的添加每个实施例的化合物如下添加到人原代肝细胞中。
[0341]
向含有10% fbs的modified lanford medium中加入没有结合galnac衍生物的参考实施例45的化合物或结合有galnac衍生物的实施例208的化合物，以制备具有目标浓度(其为apob mrna表达评价中的100nm(1)和apob mrna表达评价中的10nm和100nm(2)，如下所述)的含有化合物的培养基。在通过抽吸已去除24孔板中培养的各孔中的人原代肝细胞培养基后，以各0.5ml的量加入含有化合物的培养基，以开始孵育。72小时后，进行后述的rna提取实验。
[0342]
(3-3) 通过qrt-pcr评价mrna[1] rna提取(体外)如下提取rna。
[0343]
孵育后，通过抽吸去除人原代肝细胞的每个孔中的含有化合物的培养基，并用冰冷的pbs(0.5ml)洗涤细胞。将1/100量的2-巯基乙醇添加到rneasy mini qiacube kit(qiagen k.k.)的rlt缓冲剂中以制备细胞溶解物。以每孔400
µ
l的量添加细胞溶解物并在室温下孵育5分钟后收集。rna是根据rneasy mini-animal组织和细胞-dnase消化的手册使用qiacube从350
µ
l收集的溶液中纯化rna。rnase-free dnase set(qiagen k.k.)用于dnase处理。对纯化/洗脱的rna进行后述的逆转录反应。
[0344]
[2] 逆转录反应如下进行逆转录反应。将提取的rna调整至25-100mg/ml后，使用high capacity rna-to-cdna试剂盒(applied biosystems)对10
µ
l缓冲剂混合物、1
µ
l酶混合物、9
µ
l纯化水和提取的rna进行每样品混合以用于逆转录反应(37℃ 60分钟，95℃ 5分钟，4℃ 保持)。用80
µ
l纯化水将20
µ
l逆转录反应产物稀释5倍并在-30℃下储存或如下通过qrt-pcr评价。
[0345]
[3] qrt-pcr(taqman检测)使用以下apob引物探针组(x20)和actinb引物探针组(x20)。
[0346]
apob引物探针组(x20) (taqman)：abi hs00181142_m1 famactinb引物探针组(x20) (taqman)：abi hs01060665_g1 fam每孔悬浮5
µ
l 2x taqman fast advanced master mix(applied biosystems)、2.5
µ
l纯化水、0.5
µ
l 20x引物探针混合物(10
µ
m)和2
µ
l cdna(稀释5倍)以调整pcr反应溶液(每管)并使用quantstadio7(applied biosystems)进行pcr反应(95℃ 20秒、40个循环(95℃ 1秒，60℃ 20秒)，4℃ 保持)。使用actinb作为内源性对照，评价apob mrna的相对表达水平。
[0347]
(3-4) 使用人肝培养细胞评价实施例化合物对apob mrna表达的抑制(2)添加实施例24中合成的调整为10nm和100nm的化合物，同时接种人原代肝细胞，并
且通过qrt-pcr(taqman测定)评价培养72小时后细胞中apob mrna的表达。如图3中所示，当以未添加化合物的4个孔中apob mrna的平均表达为100%时，10nm apob-aso被抑制4.4%的表达并且apob-aso偶联物被抑制30.3%的表达。100nm apob-aso被抑制41.2%的表达并且apob-aso偶联物被抑制68.6%的表达。这表明与没有结合galnac衍生物的化合物相比，结合有galnac衍生物的化合物可以更强烈地抑制表达。
[0348]
(实施例25) 与galnac单元结合的寡核苷酸的dmtr-on离子交换柱纯化，所述galnac单元在galnac部分中的6位羟基上具有4,4'-二甲氧基三苯甲基(1) 低聚物的合成及混合溶液的制备合成实施例16中描述的化合物。然而，akta oligopilot(可获自ge healthcare)用作核酸自动合成仪，primer support 5g unylinker 350、390
µ
mol(可获自ge healthcare)用作固相载体，并使用适合于规模的合成程序。在合成完成后，获得了偶联物和具有靶寡核苷酸序列的寡核苷酸类似物的混合物，其中所述靶寡核苷酸序列的galnac部分的6位羟基被4,4'-二甲氧基三苯甲基保护。将所得混合物分成两份，并且每份用25ml浓缩氨水处理以从支持物中切除寡核苷酸，同时去除作为磷原子上的保护基团和核碱基上的保护基团的氰乙基和使用具有过滤器的试管过滤，以得到含有目标偶联物的寡核苷酸混合溶液(25ml) (两瓶)。使用akta pure150(可获自ge healthcare)作为纯化装置，用填料source 15q(96ml)(可获自ge healthcare)填充柱fineline pilot(35mm x 100mm)(可获自ge healthcare)，前述寡核苷酸混合物通过以下方法分两批进行纯化。将uv检测波长设定为260nm、280nm或350nm，并且以下三个步骤用作一个纯化程序。图5显示了在检测波长260nm和350nm下检测吸收的色谱图，因为在这些步骤中检测到柱通过流体。
[0349]
(i) dmtr-on寡核苷酸吸附在柱上的步骤将流速设定为40ml/min，并倒入1cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。将流速更改为10ml/min，将寡核苷酸混合物(25ml)添加到柱顶部，并释放170ml缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。随后，将流速设定为40ml/min，并倒入1cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。随后，倒入6cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)：缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)(35:65)，以洗去没有结合x
20
的寡核苷酸和杂质。最后，倒入2cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。
[0350]
(ii) 柱上脱-dmtr转换步骤将流速设定为40ml/min，并倒入1cv缓冲剂a2(0.4％三氟乙酸水溶液)。随后，将流速更改为20ml/min，并倒入6.25cv，从而对吸附在柱填料上的结合有x
20
的寡核苷酸进行脱-dmtr转化。
[0351]
(iii) 洗脱目标物质的步骤将流速设定为40ml/min，并倒入3cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)进行平衡。从(75:25)至(25:75)来梯度进料(15cv)缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)：缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)后，倒入2cv缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)，以分级分离脱-dmtr转化的寡核苷酸(分级分离的量为48ml)。
[0352]
使用显微分光光度计xpose(可获自trinean nv)检查洗脱期间通过uv(260nm)检测到的级分，以获得级分溶液(第一次：432ml，并且第二次：480ml)(图5)。
[0353]
在柱使用一次后，在进行下一次纯化前用含有30％异丙醇的2m氯化钠水溶液洗
涤。
[0354]
(2) 浓缩、透析以及冷冻干燥将级分溶液(第一次：432ml，并且第二次：480ml)合并为一个，并且向其中加入适量乙酸，以制备ph为7.5至8.0的混合物。之后，使用配备有xampler超滤筒3k、140cm2(ge healthcare)的kr2i tff系统(repligen corporation)进行浓缩，然后相对otsuka蒸馏水透析，随后冷冻干燥。得到目标物质的冻干粉(总计1.14g)。
[0355]
(比较例1) 用在寡核苷酸附近导入dmtr相来dmtr-on离子交换柱纯化偶联物为了与实施例25进行比较，对如下所示的由x
13
组成的galnac偶联物进行dmtr-on离子交换柱纯化。x
13
所含的galnac上的3位羟基、4位羟基和6位羟基的保护基团可以统一为乙酰基。这消除了在合成步骤中区分保护基团的需求，并因此有助于合成galnac单元部分。另外，通过调整固相合成步骤中与5'端的寡核苷酸的偶联次数，可以容易地增加或减少galnac的数量。然而，在完成低聚物的固相合成后，可以仅留下一个4,4'-二甲氧基三苯甲基。
[0356]
[比较例1-1] 与x13对应的galnac单元亚酰胺(化合物ref1f)的合成(ref1a) 9h-芴-9-基甲基n-[2-[2-[(2r)-3-苄氧基-2-羟基-丙氧基]乙氧基]乙基]氨基甲酸酯(化合物ref1a)的合成[式91]将作为文献(bioconjugate chemistry, 2000, 11, 755-761)中已知的化合物9h-芴-9-基甲基n-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]氨基甲酸酯(3.11g，10mmol)和苄基(s)-( )-缩水甘油醚(0.8g，5mmol)溶解于二氯甲烷(30ml)中，并向其中加入三氟化硼-乙醚络合物(0.1ml，1mmol)，随后在室温下搅拌16小时。在反应完成后，加入饱和碳酸氢钠水溶液。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和生理盐水洗涤，随后用无水硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(己烷:乙酸乙酯=80:20-0:100，v/v)进行纯化，以得到油状目标物质ref1a(0.74g，收率30%)。
[0357]1h-nmr (cdcl3) δ：7.76 (2h, d, j = 7.9 hz), 7.60 (2h, d, j= 7.3 hz), 7.42-7.37 (2h, m), 7.35-7.27 (7h, m), 5.40 (1h, s), 4.53 (2h, s), 4.39 (2h, d, j = 6.7 hz), 4.25-4.19 (1h, m), 4.04-3.97 (1h, m), 3.69-3.35 (12h, m)。
[0358]c29h33
no6的计算值：[m h]
492，实测值492。
[0359]
(ref1b) (2r)-1-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]-3-苄氧基-丙烷-2-醇,三氟乙酸酯(化合物ref1b)的合成[式92]
将步骤(ref1a)中合成的化合物ref1a(13.8g，28.1mmol)溶解在乙醇/四氢呋喃(50ml/50ml)中，并向其中加入1n氢氧化钠水溶液(100ml)，随后在室温下搅拌2小时。在反应完成后，减压蒸馏去除有机溶剂，并加入1n盐酸(100ml)。通过过滤去除所产生的固体产物。将作为通过流体的水层中所含的副产物用乙酸乙酯提取并减压蒸馏去除，并在得到的残留物中加入乙腈，随后进行过滤。在减压下蒸馏去除通过流体以获得粗产物。使用0.1％三氟乙酸水溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液作为洗脱液，通过反相hplc(gl sciences inc.，inertsil ods-3)进行分离和纯化，合并含有目标物质的级分，并且减压蒸馏去除溶剂，以得到油状目标物质ref1b(7.1g，收率66％)。
[0360]1h-nmr (cdcl3) δ：7.38-7.27 (5h, m), 4.55 (2h, s), 4.07-3.99 (1h, m), 3.77-3.48 (10h, m), 2.96-2.88 (2h, m)。
[0361]
(ref1c) 乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2r)-3-苄氧基-2-羟基-丙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯(化合物ref1c)的合成[式93]将作为文献(国际公开号wo 2012037254)中已知化合物的2-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸(6g，14.8mmol)、1-(-3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.4g，17.8mmol)、3h-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶-3-醇(2.0g，14.8mmol)、n,n-二异丙基乙胺(9.0ml，51.8mmol)和步骤(ref1b)中合成的化合物ref1b(6.7g，17.5mmol)溶解在二氯甲烷(130ml)中，随后在室温下搅拌4小时。在反应完成后，有机层用1n盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和生理盐水洗涤，随后用无水硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:甲醇=100:0-90:10，v/v)纯化，以得到无定形目标物质ref1c(7.9g，收率81%)。
[0362]1h-nmr (cdcl3) δ：7.39-7.28 (5h, m), 7.00-6.93 (1h, m), 6.50-6.44 (1h, m), 5.33-5.29 (1h, m), 5.16 (1h, dd, j = 11.5, 3.6 hz), 4.63-4.53 (3h, m), 4.34 (1h, d, j = 15.1 hz), 4.22-3.83 (5h, m), 3.73-3.26 (13h, m), 2.15 (3h, s), 2.05 (3h, s), 1.99 (6h, s)。
[0363]c30h44
n2o
14
的计算值：[m h]
657，实测值657。
[0364]
(ref1d)乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2r)-2,3-二羟基丙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基乙酸
酯(化合物ref1d)的合成[式94]将步骤(ref1c)中合成的化合物ref1c(7.9g，12mmol)溶解在乙醇(80ml)中。向其中加入20％氢氧化钯/碳(湿)(2.0g)，随后在50℃下在氢气气氛下剧烈搅拌8小时。在反应完成后，过滤混合物，并减压蒸馏去除通过流体。获得无定形目标物质ref1d(6.7g，收率98%)。
[0365]1h-nmr (cdcl3) δ：7.03-6.98 (1h, m), 6.43 (1h, d, j = 9.1 hz), 5.35 (1h, d, j = 3.3 hz), 5.15 (1h, dd, j = 11.2, 3.3 hz), 4.58 (1h, d, j = 7.9 hz), 4.35 (1h, d, j = 15.7 hz), 4.28-3.82 (5h, m), 3.77-3.34 (13h, m), 2.18 (3h, s), 2.06 (3h, s), 2.03 (3h, s), 2.01 (3h, s)。
[0366]c23h38
n2o
14
的计算值：[m h]
568，实测值568。
[0367]
(ref1e) 乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2s)-3-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-2-羟基-丙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯(化合物ref1e)的合成[式95]将适量的吡啶加入步骤(ref1d)中合成的化合物ref1d(6.8g，12mmol)中并减压共沸。将其溶解在吡啶(40ml)中，并向其中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.5g，13mmol)，随后在室温下搅拌2小时。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂。在加入适量甲苯并共沸后，得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:乙酸乙酯/甲醇(5/1)=100:0-50:50，v/v，含有1%三乙胺)纯化，以得到无定形目标物质ref1e(6.9g，收率66%)。
[0368]1h-nmr (cdcl3) δ: 7.42 (2h, d, j = 7.9 hz), 7.33-7.19 (7h, m), 7.01-6.94 (1h, m), 6.83 (4h, d, j = 9.1 hz), 6.37 (1h, d, j = 8.5 hz), 5.33 (1h, d, j = 3.3 hz), 5.15 (1h, dd, j = 11.2, 3.3 hz), 4.58 (1h, d, j = 7.9 hz), 4.32 (1h, d, j = 15.7 hz), 4.22-3.86 (5h, m), 3.79 (6h, s), 3.66-3.12 (13h, m), 2.13 (3h, s), 2.03 (3h, s), 1.97 (3h, s), 1.95 (3h, s)。
[0369]c44h56
n2o
16
的计算值：[m na]
893，实测值892。
[0370]
(ref1f) 乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2s)-3-[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-2-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基-丙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯(化合物ref1f)的合成[式96]将步骤(ref1e)中合成的化合物ref1e(6.9g，7.9mmol)与适量甲苯共沸，然后溶解于二氯甲烷(80ml)中。向其中加入n,n-二异丙基乙胺(5.5ml，32mmol)和2-氰基乙基二异丙基氯亚磷酰胺(2.1ml，9.5mmol)，随后在室温下搅拌1小时。在反应完成后，减压蒸馏去除溶剂，以得到粗产物。将其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯:乙酸乙酯/甲醇(5/1)=100:0-50:50，v/v，含有1%三乙胺)纯化，以得到无定形目标物质ref1f(6.6g，收率78%)。
[0371]1h-nmr (cdcl3) δ: 7.47-7.40 (2h, m), 7.35-7.17 (7h, m), 6.98-6.91 (1h, m), 6.85-6.78 (4h, m), 6.05-5.89 (1h, m), 5.37-5.33 (1h, m), 5.17-5.07 (1h, m), 4.59-4.49 (1h, m), 4.37-4.30 (1h, m), 4.23-3.06 (28h, m), 2.69-2.42 (2h, m), 2.15 (3h, s), 2.05 (3h, s), 2.02-1.98 (3h, m), 1.97-1.94 (3h, m), 1.30-1.00 (12h, m)。
[0372]
[比较例1-2] 导入有x13的偶联物的合成ho-x
13-x
13-x
13-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-t
e2s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)使用化合物ref1f作为galnac单元亚酰胺将x
18
替换为x
13
，以与实施例8中相同的方式进行合成。然而，galnac单元亚酰胺的加成反应重复3次以结合三个x13。
[0373]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6878.11)。
[0374]
[比较例1-3] 与galnac单元结合的寡核苷酸的dmtr-on离子交换柱纯化，所述galnac单元在5'端具有4,4'-二甲氧基三苯甲基(1) 低聚物的合成及混合溶液的制备ho-x
13-x
13-x
13-a
m1s-a
e2s-u
m1s-c
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-t
e2s-g
m1s-g
m1s-c
e2s-g
m1s-a
m1s-a
e2s-g
m1t-h(seq id no：40)akta oligopilot(可获自ge healthcare)用作核酸自动合成仪，primer support 5g unylinker 350、390
µ
mol(可获自ge healthcare)用作固相载体，并使用适合于规模的合成程序。使用10
µ
mol获得的固相载体，galnac单元x
13
用abi 392 dna/rna合成仪(可获自
applied biosystems)浓缩3次。在合成完成后，获得具有目标寡核苷酸序列并与在5'端具有4,4'-二甲氧基三苯甲基的galnac单元结合的寡核苷酸类似物的混合物。通过用6ml浓缩氨水处理从支持物中切下寡核苷酸，并去除作为磷原子上的保护基团和核碱基上的保护基团的氰乙基。
[0375]
纯化方法1：clarity qsp(可获自phenomenex inc.)纯化通过以与实施例8中相同的方式进行纯化来得到目标物质。
[0376]
该化合物的核苷酸序列是与c.648g》t突变g6pc基因的外显子5的5'端第92至第106位的序列互补的序列，其中智人葡糖-6-磷酸酶催化亚基(g6pc)、转录变体1、mrna(ncbi-genbank登录号nm_000151.3)中第728位核苷酸发生了从g到t的突变。该化合物通过负离子esi质谱鉴定(测量值：6878.11)。
[0377]
纯化方法2：dmtr-on离子交换柱纯化在dmtr-on离子交换柱纯化之前，用10mm氢氧化钠水溶液取代寡核苷酸混合物。
[0378]
使用akta pure150(可获自ge healthcare)作为纯化装置和使用resource q 6ml(可获自ge healthcare)作为纯化柱，通过以下方法纯化前述寡核苷酸混合物。紫外线检测波长设定为260nm，并且以下三个步骤用作一个纯化程序。图6显示了在这些步骤中柱的通过流体在260nm检测波长下的色谱图。
[0379]
(i) 将dmtr-on寡核苷酸吸附在离子交换柱上的步骤以3ml/min的流速倒入2cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。以2ml/min的流速将寡核苷酸混合物(1.5ml，10mm氢氧化钠水溶液)加入到柱顶部，并倒入2.5cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)。随后，以3ml/min的流速倒入1cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)，然后以2.4ml/min的流速倒入缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液):缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)(2cv为40:60至25:75和4cv为25:75)。
[0380]
(ii) 离子交换柱上脱-dmtr转化的步骤以1.2ml/min的流速倒入7cv缓冲剂a2(0.4%三氟乙酸水溶液)。
[0381]
(iii) 洗脱目标物质的步骤以3ml/min的流速倒入5cv缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液)进行平衡。随后，在以3ml/min的流速从(30:70)至(0:100)来梯度进料(10cv)缓冲剂a1(10mm氢氧化钠水溶液):缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)后，倒入2cv缓冲剂b1(10mm氢氧化钠水溶液/2m氯化钠水溶液)。
[0382]
由图6的结果可知，由于在脱保护后的洗脱步骤中未检测到260nm下的吸收，因此dmt-on偶联物在第一吸附步骤中没有被吸附在柱上并且经由那里通过。因此，通过离子交换柱纯化不能产生目标物质。由此，对于galnac单元与寡核苷酸的偶联物的dmtr-on柱纯化认为重要的是疏水性保护基团结合到galnac上，和/或包含在一个galnac单元中的疏水性保护基团的数量等于或大于galnac的数量。
[0383]
在本说明书中，a
t
、g
t
、5mec
t
、c
t
、t
t
、u
t
、a
p
、g
p
、5mec
p
、c
p
、t
p
、u
p
、as、gs、5mecs、cs、ts、us、a
m1t
、g
m1t
、c
m1t
、5mec
m1t
、u
m1t
、a
m1p
、g
m1p
、c
m1p
、5mec
m1p
、u
m1p
、a
m1s
、g
m1s
、c
m1s
、5mec
m1s
、u
m1s
、a
2t
、g
2t
、c
2t
、t
2t
、a
e2p
、g
e2p
、c
e2p
、t
e2p
、a
e2s
、g
e2s
、c
e2s
、t
e2s
、a
1t
、g
1t
、c
1t
、t
1t
、a
e1p
、g
e1p
、c
e1p
、t
e1p
、a
e1s
、g
e1s
、c
e1s
、t
e1s
、a
m2t
、g
m2t
、5mec
m2t
、t
m2t
、a
m2p
、g
m2p
、5mec
m2p
、t
m2p
、a
m2s
、g
m2s
、5mec
m2s
、t
m2s
、x、x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x
10
、x
11
、x
12
、x
13
、x
14
、x
15
、x
16
、x
17
、x
18
、x
19
、x
20
、x
21
和x
22
是具有下面显示
的结构的基团。
[0384]
[式97][式98]
[式99]
[式100]
[式101]
[式102]
[式103][式104]本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体并入本文。
[0385]
产业实用性本发明可用于治疗ia型糖原贮积病。
[0386]
序列表自由文本seq id no：1至48和93至96各自代表反义寡核苷酸的序列。构成反义寡核苷酸的核苷酸可以是天然dna、天然rna、dna/rna嵌合体以及它们的修饰形式中的任何一种，但优
选它们中的至少一种是修饰核苷酸。seq id no：49至65和67至92各自代表引物的序列。seq id no：66代表肽的序列。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
