一种抗仔猪腹泻的蜘蛛香复方制剂

1.本发明属于中药制剂技术领域，具体涉及到一种抗仔猪腹泻的蜘蛛香复方制剂。


背景技术：

2.中草药的提取工艺的设计需要考虑处方的中医理论基础，功能主治和化学成分等特点。设计中要注意处方的君臣佐使。较大的复方和三四类药物的复方要注意采取复方提取和分类提取，如含挥发油类、普类、黄酮类、生物碱类、有机酸类、多糖类，根据药物的化学成分分类提取。要注意从药效、化学成分双重考虑。设计提取工艺路线要保证提取物的安全、疗效，要尽可能富集有效成分，除去无效杂物。在保证安全有效的前提下尽可能缩小提取物的得量。
3.中草药是我国优秀文化与传统医学的宝贵遗产，就我国药物研究的基础、积累、现状、整体实力而言，与国际先进水平尚存较大差一距，但我国生物资源丰富，加强天然药物的研制是缩小这种差距、减少入世给兽药业带来的影响的一个重要决策。对中草药进行筛选和深入系统的研究，研制和开发应用性强、疗效好的兽用中草药制剂，是生产具有国人自己知识产权药物最有效的途径，对充分利用我国丰富的中草药资源，促进中国兽药业生产和畜牧业发展，都有十分重要的意义。
4.腹泻是仔猪阶段最为常见的疾病，是一种典型的多因素性疾病，引起仔猪腹泻的病原种类繁多，病性复杂。腹泻总体可归纳为细菌性腹泻如大肠杆菌引起的仔猪黄痢和白痢、魏氏梭菌引起的仔猪红痢等，病毒性腹泻如传染性胃肠炎、流行性腹泻、轮状病毒病、伪狂犬病，还有寄生虫性腹泻如球虫病、蛔虫病等和非病原性腹泻如应激(断奶、转群、换料等)、温度(天气骤冷)、低血糖、日粮粗蛋白含量过高、缺乏维生素、矿物质，电解质不平衡等。仔猪腹泻会导致饲料报酬率低，仔猪成活率下降，生长发育缓慢，甚至停滞(僵猪)，严重者可死亡，给养猪业带来巨大的经济损失，故而如何防治仔猪腹泻已成为一个引人注目的世界性问题。
5.近年来，国内外众多的研究机构转向从纯天然植物(包括中草药)中提取有效成份，研制成安全高效的饲用添加剂，调控畜禽消化道内环境，替代饲用抗生素和合成抗菌药物的使用。然而，目前国内外中草药饲料添加剂的专利产品仍存在以下缺点：(1)过分注重单一中草药、单一成分的功效，不能根据饲养实际进行辩证分析(论治)，故往往得不到良好的饲养效果；(2)组方研究未能从中医基础理论着手，综合考虑对各种有效成分的需求；(3)大部分产品仍然停留在将中草药直接饲喂的水平，用量偏大，质量指标难以控制，成本居高，不利于在集约化规模化的现代养猪模式中使用推广。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种抗仔猪腹泻的蜘蛛香复方制剂，可以安全高效替代现在普遍使用的饲用抗生素和化学合成药物饲料添加剂，可以根据仔猪腹泻、炎症等病因对症下药，提高疗效。
7.为达上述目的，本发明提供了一种抗仔猪腹泻的蜘蛛香复方制剂，包括中草药提取液，中草药提取液包括等质量的蜘蛛香提取液、板蓝根提取液和连翘提取液。
8.进一步地，中草药提取液还包括等质量的大青叶提取液。
9.进一步地，还包括等质量的盐酸黄连素，盐酸黄连素的体积分数为1％。
10.采用上述方案的有益效果是：盐酸黄连素又名盐酸小檗碱，具有清热解毒、抗菌消炎的功效。
11.进一步地，包括质量比为1:1:1:1的蜘蛛香提取液、板蓝根提取液、连翘提取液和盐酸黄连素。
12.进一步地，包括质量比为1:1:1:1:1的蜘蛛香提取液、板蓝根提取液、连翘提取液、大青叶提取液和盐酸黄连素。
13.进一步地，蜘蛛香提取液通过以下方法制备得到：
14.(1)将蜘蛛香药材粉碎后过40-180目筛，使用1:10的石油醚回流脱脂1-3次，抽滤并洗涤后干燥；
15.(2)将干燥的蜘蛛香粉末浸泡于溶剂中，超声提取即得。
16.进一步地，溶剂为体积分数为60％的乙醇，蜘蛛香粉末与乙醇的质量比为1:25。
17.采用上述方案的有益效果是：随着乙醇浓度的升高，总黄酮得率急剧升高，在乙醇浓度达到60％时，总黄酮得率达到最大值；溶剂用量过大将给后续的浓缩等操作带来不便，同时由于已经浸出的黄酮对未浸出的黄酮有协同浸提作用，溶剂用量过大不利于协同浸提，因此本发明以固液比1:25左右为宜。
18.进一步地，浸泡的时间为24h，超声提取的时间为30min。
19.采用上述方案的有益效果是：随着浸泡时间的延长，总黄酮得率逐渐升高，但超过24h后，对提取效果的影响不大，为了防止其它成分浸出而产生许多杂质成分，浸泡时间最好为24h；随着超声时间的延长，总黄酮得率先上升后下降，在30min时达到最大值。
20.进一步地，大青叶提取液和板蓝根提取液均采用水提醇沉淀法制备得到。
21.进一步地，连翘提取液采用双提法制备得到，双提法具体包括采用水提醇沉淀法及蒸馏法制备出两种提取液，并将两种提取液按1:1比例混合制成连翘提取液。
22.综上所述，本发明具有以下优点：
23.1、本发明中提取蜘蛛香提取液的方法为超声法，通过单因素和正交试验得到的最佳工艺条件为：浸泡24小时，浓度60％乙醇，固液比1:20，超声时间30min。在此条件下，提取率最高，总黄酮得率可达3.410％。
24.2、本发明的中草药制剂组方科学，配合合理，对症下药具有多种配伍可能，协同应用具有很好的预防仔猪腹泻，同时具有很好的消炎抑菌抗病毒作用。
附图说明
25.图1为标准溶液浓度；
26.图2为浸泡时间对总黄酮提取效率的影响；
27.图3为乙醇浓度对总黄酮提取效率的影响；
28.图4为固液比对总黄酮提取效率的影响；
29.图5为超声时间对总黄酮提取效率的影响。
具体实施方式
30.本发明中的青叶、板蓝根为十字花科植物菘蓝的干燥叶和根。主要含有靛玉红、靛蓝、吲哚醇、吲哚酮等吲哚类化合物及色胺酮等。对于大青叶、板蓝根采用水提醇沉淀法提取其有效成分。
31.连翘为木犀科植物连翘的干燥果实。含有的主要成分为木脂素及其苷类、苯乙醇苷类、黄酮类、三萜类、挥发油类等。蜘蛛香为败酱科缬草属植物，根及其根茎入药。含有的主要成分为挥发油类、苷类、环烯醚萜类及有机酸类。由于蜘蛛香和连翘的有效成分中包括挥发油，本试验采用双提法即将水提醇沉淀法和蒸馏法结合使用提取蜘蛛香和连翘，可兼顾挥发性成分和非挥发性成分的提取，以避免有效成分损失。
32.以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
33.实施例1
34.本实施例提供了一种抗仔猪腹泻的蜘蛛香复方制剂，包括质量比为1:1:1的蜘蛛香提取液、板蓝根提取液和连翘提取液。
35.实施例2
36.本实施例提供了一种抗仔猪腹泻的蜘蛛香复方制剂，包括质量比为1:1:1:1的蜘蛛香提取液、板蓝根提取液、连翘提取液和盐酸黄连素，盐酸黄连素的体积分数为1％。
37.实施例3
38.本实施例提供了一种抗仔猪腹泻的蜘蛛香复方制剂，包括质量比为1:1:1:1:1的蜘蛛香提取液、板蓝根提取液、连翘提取液、大青叶提取液和盐酸黄连素，盐酸黄连素的体积分数为1％。
39.实施例4
40.本实施例提供了一种抗仔猪腹泻的蜘蛛香复方制剂，包括质量比为1:1:1:1:1的蜘蛛香提取液、板蓝根提取液、连翘提取液和大青叶提取液。
41.试验例1
42.选取乙醇浓度、浸泡时间、固液比和超声时间4个可能影响提取效果的因素做单因素试验。以总黄酮得率为考察指标，确定各因素的合适范围。在考察某一因素对蜘蛛香总黄酮得率的影响时，固定其他因素及其水平。
43.试验方法：
44.1.1标准工作曲线的制定
45.准确称取橙皮苷标准品0.0051g，加甲醇溶解并定容至50ml，即得浓度为0.102g/l的橙皮苷标准溶液。分别移取上述标准溶液0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml于5只10ml容量瓶中，加甲醇定容，以甲醇作空白，于284nm处测吸光度。以吸光度a对橙皮苷标准溶液浓度c作图，绘制标准工作曲线。
46.1.2总黄酮的测定
47.将蜘蛛香药材粉碎并过筛(40-180目)，用1:10的石油醚回流脱脂两次，抽滤，洗涤，再放入40℃条件下的鼓风干燥箱中干燥1h左右，备用。
48.称取1.0g已脱脂的蜘蛛香粉末，加入一定量的溶剂，密塞，摇匀，称定质量，超声提
取，取出放冷，再称定质量，用溶剂补足减失的质量，摇匀，离心分离，取上清液(溶剂量的1/5)，于旋转蒸发器上浓缩至干，加30ml甲醇溶解，滤去不溶物，滤液加甲醇定容至50ml，即得样品溶液。移取1ml样品溶液，加甲醇定容至10ml，以甲醇作空白，于284nm处测吸光度。并根据线性回归方程计算蜘蛛香总黄酮得率。
49.1.3单因素试验结果
50.图1-5分别为标准溶液浓度、浸泡时间对总黄酮提取效率的影响、乙醇浓度对总黄酮提取效率的影响、固液比对总黄酮提取效率的影响和超声时间对总黄酮提取效率的影响。
51.由图2可以看出：随着浸泡时间的延长，总黄酮得率逐渐升高，但超过24h后，对提取效果的影响不大，为了防止其它成分浸出而产生许多杂质成分，浸泡时间最好为24h。
52.由图3可以看出：随着乙醇浓度的升高，总黄酮得率急剧升高，在乙醇浓度达到60％时，总黄酮得率达到最大值，之后随着乙醇浓度的增加，总黄酮得率又逐渐变低，主要原因是乙醇浓度不同，极性也不同，60％的乙醇的极性与黄酮类物质的极性相似，随着乙醇浓度的升高，一些脂溶性物质的溶出增加，影响了黄酮类物质的浸出。
53.由图4可以看出：一般来说，溶剂用量越大对黄酮类物质的溶解能力越强，越有利于黄酮类物质的扩散，提取效果越好。但是溶剂用量过大将给后续的浓缩等操作带来不便，同时由于已经浸出的黄酮对未浸出的黄酮有协同浸提作用，溶剂用量过大不利于协同浸提。图4表明，当固液比为1:25时总黄酮得率达到最大值，因此，固液比选取1:25左右为宜。
54.由图5可以看出：随着超声时间的延长，总黄酮得率先上升后下降，在30min时达到最大值。原因是时间过短，黄酮类物质还未充分溶出，时间在30min时，黄酮类物质溶出已达到平衡，再延长超声时间，一些热敏性组分被破坏或超声时间过长溶剂挥发导致乙醇浓度降低而使总黄酮得率下降。
55.综上所述，本发明中的最佳工艺条件为：浸泡24小时，浓度60％乙醇，固液比1:20，超声时间30min。在此条件下，提取率最高，总黄酮得率可达3.410％。该工艺经实验重现性好，对进一步的工艺开发有较好的参考价值。
56.试验例2
57.2.1单味药材的制备：
58.蜘蛛香和连翘采用双提法制备提取液，即醇提和蒸馏法分别制备出提取液，按照1:1的比例混合后制得蜘蛛香提取液；大青叶和板蓝根采用水提醇沉淀法制备提取液。
59.2.2试剂
60.酪蛋白水解物、酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白陈、氯化钠、琼脂粉、葡萄糖、硫柳汞、磷酸氢二钾、二氯化锰、三氯化铁等，以上试剂均为国产分析纯。
61.2.3培养基
62.普通营养琼脂培养基、蛋白陈水培养基按常规方法制成后灭菌4℃冰箱保存备用；
63.caye(酪蛋白酸-酵母抽提物)培养液；
64.微量盐类混合物：硫酸镁5％、二氯化锰0.5％、二氯化铁0.5％，依次溶于0.001mh2so4溶液中；
65.caye培养液：酪蛋白水解物20g、氯化钠2.5g、酵母浸膏6g、三水磷酸氢二钾11.41g、微量盐类混合物lml，上述各试剂依次加入蒸馏水中溶解，定容为1000ml，调ph值至
8.5。分装于锥形瓶中，13.5磅灭菌20分钟。
66.2.4实验动物
67.日本大耳白兔，体重2.2
±
0.2kg，雌雄各半，从上海实验动物中心分批购入。预饲一周，喂饲全价饲料。定期进行临床检查，若发现异常者，及时剔除并查明原因，选用健康者进行试验。手术前禁食48h，自由饮水，术后自由活动，禁食禁水。
68.2.5lt的制备
69.将大肠杆菌接种于普通营养琼脂斜面培养基，37℃培养12h，再移植于蛋白胨水中，37℃培养12h。在加有caye培养液的锥形瓶中用无菌方法按1:0.4(v/v)的比例加入蜘蛛香提取液并调整所含培养液成分的含量、ph值及渗透压，使其与作为对照组的不加蜘蛛香提取液的caye培养液一致。再按10:1(v/v)的比例加入上述蛋白胨水12h培养物，同时加入微量葡萄糖使其终浓度为2.5g/l。然后置hzs-d水浴振荡器上37℃以170r/min连续有氧震摇培养18h，培养物取出后加入0.1g/l的硫柳汞过夜杀菌，以4℃10000r/min离心30min，收集上清液4℃冰箱保存备用(不超过3d)。试验中的大肠杆菌接种物的浓度均为1.5
×
105个/ml。
70.2.6兔回肠结扎试验
71.用1％盐酸普鲁卡因作局部麻醉，以无菌手术切开腹壁，自盲肠游离端的回肠开始，沿向心方向用4号丝线结扎肠拌，注射段4cm，间隔段2cm。每只兔结扎六个肠拌，每个肠拌随机注入lml lt 0.4ml蜘蛛香提取液或l.4ml提取液的培养物，对照组注入1ml lt 0.4ml生理盐水，上述每种液体各需要6个肠拌。注射完毕后缝合腹壁切口。11h后扑杀试验兔，取出结扎肠拌，测定每个肠拌的长度(cm)和液体蓄积量(ml)，并求出二者的比值(ml/cm)，根据二者的比值判定中草药复方配伍抗肠毒素作用的强弱。
72.2.7实验结果
73.2.7.1五种药物及其复方配伍对大肠杆菌的抑菌效果见表1。
74.表1体外抑菌试验结果
[0075][0076]
由表1可知，单味药中，蜘蛛香、板蓝根、连翘、大青叶均显示出良好的抗菌效果，其
(蜘蛛香 连翘)拮抗肠毒素的作用最强(p《0.01)，复方i(连翘 板蓝根)亦可显著减少lt所致结扎肠拌液体蓄积量(p《0.05)。
[0091]
各药物组间相比较，复方ⅳ(蜘蛛香 连翘)与复方ⅵ(蜘蛛香 板蓝根 大青叶 连翘)的差异极显著(p《0.01)，与复方ii(连翘 板蓝根 大青叶)差异显著(p《0.05)。表中含有大青叶的复方组(ii、iii、vi)未表现出较好的效果，与对照组相比差异不显著，可见大青叶在与其它药物配伍时，拮抗lt所致结扎肠拌的液体蓄积量的作用较小。
[0092]
2.7.2.4
[0093]
表5组合二加入到细菌培养液中对lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响
[0094]
组别肠拌数液体蓄积量(ml/cm)1ml lt 0.4ml生理盐水61.40
±
0.09
aa
1.4ml复方i培养物61.18
±
0.06
ab
1.4ml复方ⅱ培养物60.85
±
0.05
bc
1.4ml复方ⅲ培养物61.30
±
0.05
aab
1.4ml复方ⅳ培养物60.83
±
0.07
bc
[0095]
将蜘蛛香、连翘、板蓝根和盐酸黄连素(实施例4)组成的复方配伍分别加入到培养液中培养大肠杆菌，用所得培养物lt进行兔回肠结扎试验，试验结果见表5。与对照组相比，复方ii(蜘蛛香 连翘 板蓝根)和复方ⅳ(蜘蛛香 连翘 板蓝根 盐酸黄连素)表现出极显著的拮抗肠毒素的作用(p《0.01，p《0.01)；复方i(蜘蛛香 连翘)也表现出显著的拮抗作用(p《0.05)。各药物组间比较，复方ii(蜘蛛香 连翘 板蓝根)和复方ⅳ(蜘蛛香 连翘 板蓝根 盐酸黄连素)拮抗肠毒素的作用极显著地优于复方i(连翘 蜘蛛香)及复方ⅲ(蜘蛛香 连翘 盐酸黄连素)(p《0.01，p《0.01)，但二者之间差异不显著。
[0096]
2.7.2.5
[0097]
表6连翘和蜘蛛香对lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响
[0098]
组别肠拌数液体蓄积量(ml/cm)1ml lt 0.4ml生理盐水62.29
±
0.22a1.4ml蜘蛛香提取液61.65
±
0.06b1.4ml连翘提取液61.90
±
0.14
ab
[0099]
由表6可知：将蜘蛛香提取液及lt一起注入结扎肠拌，试验结果表明，蜘蛛香可显著地(p《0.05)减少液体蓄积量，而连翘提取液未达到显著水平。
[0100]
2.7.2.6
[0101]
表7大青叶和板蓝根对lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响
[0102]
组别肠拌数液体蓄积量(ml/cm)1ml lt 0.4ml生理盐水61.55
±
0.051.4ml大青叶提取液61.53
±
0.171.4ml板蓝根提取液61.53
±
0.14
[0103]
由表7可知，与对照组相比，大青叶提取液及板蓝根提取液对肠拌中的液体蓄积量没有明显的影响，二者均未表现出显著的抗肠毒素效果。
[0104]
2.7.2.7
[0105]
表8组合一对lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响
[0106]
组别肠拌数液体蓄积量(ml/cm)1ml lt 0.4ml生理盐水61.55
±
0.06a1.4ml复方i61.51
±
0.16
ab
1.4ml复方ⅱ61.52
±
0.13a1.4ml复方ⅲ61.28
±
0.07
ab
1.4ml复方ⅳ61.28
±
0.05
ab
1.4ml复方
ⅴ
61.18
±
0.06b1.4ml复方ⅵ61.53
±
0.13a[0107]
由表8可知：根据lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响，六种复方组合中复方v(蜘蛛香 板蓝根)抑制肠毒素作用最明显，它显著优于对照组〔p》0.05〕。其次是复方iii(连翘 大青叶)和复方ⅳ(连翘 蜘蛛香)，与对照组相比，二者使lt所致结扎肠拌液体蓄积量都减少了17.42％(p》0.05))。各药物组间比较，复方v(蜘蛛香 板蓝根)抑制肠毒素作用显著优于复方ii(连翘 板蓝根 大青叶)和复方ⅵ(连翘 蜘蛛香 板蓝根 大青叶)(p《0.05，p《0.05)。而含有大青叶的复方组(ii、vi)拮抗lt所致结扎肠拌的液体蓄积量，与对照组相比无差异，表明这些复方组合对肠毒素无拮抗作用。
[0108]
2.7.2.8
[0109]
表9组合二对lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响
[0110]
组别肠拌数液体蓄积量(ml/cm)1ml lt 0.4ml生理盐水61.40
±
0.091.4ml复方i61.34
±
0.081.4ml复方ⅱ61.26
±
0.051.4ml复方ⅲ61.31
±
0.051.4ml复方ⅳ61.29
±
0.05
[0111]
由表9可知：与对照组相比，组合二各试验组对lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响无明显差异。虽然复方ii(连翘 蜘蛛香 板蓝根)和复方ⅳ(连翘 蜘蛛香 板蓝根 盐酸黄连素)抑制肠拌中的液体蓄积量的作用较其它组稍强，分别减少了10.0％和7.83％，但差异不显著。
[0112]
2.7.3对药物性腹泻的影响
[0113]
表10几种中草药提取液对蓖麻油所致小鼠腹泻的影响
[0114][0115]
由表10可知：中草药拮抗蓖麻油所致小鼠腹泻的试验结果表明，中草药复方组合提取液(连翘 板蓝根 蜘蛛香)能明显地减少蓖麻油引起的腹泻发生率和腹泻频率。与对照组比较，在1-3h内复方组极显著地(p《0.01)降低了小鼠腹泻次数，其效果明显优于板蓝根、连翘和盐酸黄连素组(p《0.05，p《0.05，p《0.05)。从表10中数据可以看出，在同一时相内，与对照组相比，蜘蛛香及复方组的腹泻发生率有降低的趋势，1h均降低了40％，2h分别降低了10％和30％，3h分别降低了30％和50％。其它单味中草药在对抗蓖麻油所致小鼠腹泻方面差异不显著。
[0116]
2.7.4对小肠推进运动的影响
[0117]
表11几种中草药提取液对小鼠小肠墨汁推进运动的影响
[0118]
组别样本数推进率％抑制率％对照组100.61
±
0.01
aa-蜘蛛香100.59
±
0.02
aba
3.29板蓝根100.48
±
0.02
bb
21.31连翘100.55
±
0.03
abab
9.84盐酸黄连素100.58
±
0.03
aba
4.92复方100.52
±
0.04
abab
14.75
[0119]
由表11可知：各药物组均能不同程度地减少小鼠小肠墨汁推进率，其中，板蓝根作用最强，与对照组相比，差异极显著(p《0.01)，与蜘蛛香组和盐酸黄连素组相比，差异显著(p《0.05)。其次是复方组(蜘蛛香 板蓝根 连翘)和连翘组，抑制率分别为13.11％和8.20％(p》0.05，p》0.05)，但未达到显著水平。
[0120]
2.7.5对炎性渗出的抑制作用
[0121]
表12几种中草药提取液对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响
[0122][0123][0124]
由表12可知：各药物组对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高均有不同程度的抑制作用。与对照组相比，复方组(蜘蛛香 板蓝根 连翘)能极显著地抑制醋酸所致小鼠腹腔染料渗出(p《0.01)，抑制率达59.07％，蜘蛛香和板蓝根可显著地抑制醋酸所致小鼠腹腔染料的渗出(p《0.05，p《0.05)，抑制率分别为36.29％和35.44％。
[0125]
综上所述：
[0126]
(1)大青叶、板蓝根、连翘、蜘蛛香对大肠杆菌o149k88都显示出良好的体外抗菌活性，由它们组成的复方i(连翘 蜘蛛香)、复方ii(连翘 蜘蛛香 板蓝根)和复方iii(连翘 板蓝根 大青叶)的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度较单味药均有所增强，表明这四味中草药在抗菌活性方面具有协同作用。
[0127]
(2)复方ⅳ(蜘蛛香 连翘 板蓝根 盐酸黄连素〕的抗菌效果相对来说差一点，分析其原因可能是因为配方中加入盐酸黄连素后影响了该复方的抑菌活性，降低了其它三味中草药的有效抑菌浓度所致。
[0128]
(3)抗肠毒素作用
[0129]
将中草药提取液加入到细菌培养液中培养大肠杆菌，用所产lt进行兔回肠结扎试验，根据中草药提取液对lt致结扎肠拌液体蓄积量的影响来研究中草药对大肠杆菌肠毒素的拮抗作用。从表2和表3的试验结果可知，大青叶组、板蓝根组、连翘组可显著或极显著地减少培养物上清液所致结扎肠拌的液体蓄积量。表4的结果显示，除含有大青叶的复方组外，其它各复方组均显著或极显著地减少了结扎肠拌的液体蓄积量，表明用板蓝根、连翘和蜘蛛香组成的复方配伍在抗肠毒素lt方面具有协同作用，而大青叶与其它药物配方组合反而不如单味药的效果好，可推测在抗肠毒素lt方面大青叶与其它三味药间可能存在拮抗作用，不宜配伍。将组合一中效果较好的连翘、蜘蛛香、板蓝根和盐酸黄连素组成复方用同样方法处理并进行兔回肠结扎试验，均显著或极显著地减少了lt所致结扎肠拌的液体蓄积量。其中，复方ii(蜘蛛香 连翘 板蓝根)和复方ⅳ(蜘蛛香 连翘 板蓝根 盐酸黄连素)拮抗肠毒素的效果极显著地优于复方i(蜘蛛香 连翘)和复方ⅲ(蜘蛛香 连翘 盐酸黄连素)。由蜘蛛香、连翘、板蓝根组成的复方和由蜘蛛香、连翘、板蓝根、盐酸黄连素组成的复方对在大肠杆菌致腹泻中起重要作用的lt的强拮抗作用表明，这两种复方是治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的最佳复方配伍。
[0130]
本试验中盐酸黄连素在l％浓度对大肠杆菌无抑菌作用，但将其与板蓝根、连翘和
蜘蛛香组成复方加入到培养液中可极显著降低lt所致结扎肠拌的液体蓄积量，可见，盐酸黄连素对仔猪大肠杆菌性腹泻的疗效并非依赖于其抑菌作用而是由于它的抗毒素作用。
[0131]
(4)中草药抗lt作用
[0132]
直接将中草药提取液或复方配伍的提取液与lt一同注入结扎肠拌，根据药物对lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响研究中草药对lt有无直接的拮抗作用，试验结果见表6-9。从表6和表7可以看出，与将中草药提取液加入到培养液中对lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响结果不同，与对照组相比，在四种单味中草药中，蜘蛛香能明显减少lt所致结扎肠拌液体蓄积量(p《0.05)，说明蜘蛛香对大肠杆菌肠毒素lt有直接的拮抗作用，而板蓝根、大青叶和连翘未达到显著水平，说明这三味中草药对lt无直接的拮抗作用。表8所列数据显示，蜘蛛香和板蓝根组成的复方组抑制lt所致结扎肠拌液体蓄积量作用显著。由组合一对lt所致结扎肠拌液体蓄积量的影响结果中可以再次证明在抗肠毒素lt方面大青叶与其它二味药能产生拮抗作用，不宜配伍，因此可剔除大青叶。由板蓝根、蜘蛛香、连翘和盐酸黄连素组成的四种复方配伍中，复方ii(蜘蛛香 连翘 板蓝根)和复方iv(蜘蛛香 连翘 板蓝根 盐酸黄连素)抑制肠拌中的液体蓄积量的作用较其它组稍强。
[0133]
加入培养液中的中草药提取液抗lt的作用和中草药提取液抗lt的作用的综合分析结果表明，连翘 蜘蛛香 板蓝根和连翘 蜘蛛香 板蓝根 盐酸黄连素均能有效拮抗大肠杆菌热敏肠毒素所致的小肠中液体蓄积，对大肠杆菌也有较强的体外抑制作用，本试验结果为临床应用中草药治疗仔猪大肠杆菌性腹泻提供了重要理论依据。
[0134]
(5)中草药抗炎及抑制泻下作用
[0135]
小鼠药物性腹泻模型和小鼠小肠推进运动试验是研究药物抗腹泻机理常用的方法。患大肠杆菌性腹泻的仔猪主要表现为急性肠炎的变化，且主要的病变部位是在小肠。本试验选用蓖麻油所致小鼠小肠性腹泻为试验模型，研究中草药对药物性腹泻的对抗作用。蓖麻油的主要作用部位是小肠，通过促进炎性介质的合成和释放，致使肠腔积液，肠蠕动加快，而导致腹泻。连翘、板蓝根、蜘蛛香所组成的复方配伍能极显著地减少蓖麻油所致的小鼠腹泻频率，腹泻发生率也较对照组和其它药物组有所降低，表明该复方具有较好的抗炎止泻之功效。而该复方配伍对小鼠小肠推进运动无明显影响，因此，抑制肠运动不是其抗腹泻的机理。
[0136]
本发明的试验结果表明，无论单味药(蜘蛛香或板蓝根)还是复方配伍(板蓝根 连翘 蜘蛛香)，均能显著或极显著地抑制醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增高，也就是说，它们对急性炎性渗出过程有抑制作用。由蜘蛛香、连翘、板蓝根组成的复方配伍可以通过抑制病原菌的繁殖、拮抗热敏肠毒素的致泻作用、抑制炎症过程、对抗药物性腹泻等多种途径发挥其治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的作用。可见，中草药在发挥其临床疗效时，其作用往往是多靶点的。
[0137]
结论：
[0138]
1、蜘蛛香、板蓝根、连翘、大青叶提取液及其复方配伍对引起仔猪大肠杆菌性腹泻的主要病原菌-大肠杆菌o149k88均具有较好的体外抑菌活性。
[0139]
2、由蜘蛛香、连翘、板蓝根组成的复方配伍和由蜘蛛香、连翘、板蓝根、盐酸黄连素组成的复方配伍对大肠杆菌热敏肠毒素所致的小肠中液体蓄积均有极显著地拮抗作用。
[0140]
3、蜘蛛香、板蓝根及由蜘蛛香、板蓝根、连翘组成的复方配伍均能显著或极显著地
抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高，即对炎症过程有对抗作用。
[0141]
4、由蜘蛛香、板蓝根、连翘组成的复方配伍能极显著地降低蓖麻油所致小鼠腹泻频率，具有抗炎止泻之功效。
[0142]
5、板蓝根能极显著地抑制小鼠小肠推进运动，其它各药物组对小鼠小肠推进运动无明显影响。
[0143]
6、由蜘蛛香、板蓝根、连翘组成的复方配伍在有效抑制大肠杆菌的同时，能有效地拮抗大肠杆菌肠毒素所致的腹泻，对炎症过程、药物性腹泻也有抑制和对抗作用，为筛选出的抗仔猪大肠杆菌性腹泻的最佳中草药复方组合。
[0144]
虽然对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。