抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种茶树油纳米乳剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂及其制备方法和应用，属于医药生产技术领域。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是生活中重要的致病菌。目前人们普遍喜欢使用抗生素类来有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，但随着这些抗生素的广泛应用，使细菌对抗生素产生了耐药性，所以人们越来越关注对天然抗菌药物的使用。
3.近年来，从食用和药用部位提取植物精油(essential oil)引起了广泛关注。作为一种天然物质，在生物医学领域已被广泛报道。茶树油是从桃金娘科互叶白千层属的新鲜枝叶中提取出来的一种无色至淡黄色油状液体，具有浓郁的芳香气味。作为一种被食品行业广泛接受的抗菌剂和抗氧化剂，茶树油不仅具有分子小、毒性低、极性低的特点，而且有着很强的抗菌和抗氧化作用，是一种可替代抗生素的优良天然抗菌剂。茶树油的抗菌能力非常强，抗菌谱较广，对葡萄球菌属、大肠杆菌属等细菌均存在一定的抑制作用，但不足之处在于茶树油易挥发，水溶性差，限制了其应用，在使用过程中有着诸多的不便。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的是提供一种提高茶树油的生物利用度的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂；本发明的另一目的是提供一种抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法；本发明的另一目的是提供一种抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂在抗菌中的应用。
5.技术方案：本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油5％～10％，聚山梨酯型表面活性剂5％～8％，防腐剂0.05～0.2％，余量为去离子水。所述茶树油纳米乳剂呈稳定的o/w型。
6.优选地，茶树油为7％，聚山梨酯型表面活性剂为6％，防腐剂为0.05％。其中茶树油的纯度为98wt％，茶树油纳米乳剂的抗菌功效与茶树油的纯度相关，纯度低的茶树油其中包含的杂醇含量很高，使得纳米乳剂抑菌效果变差。
7.优选地，所述聚山梨酯型表面活性剂为吐温40；吐温系列是一类亲水性非离子型表面活性剂，具有优良的乳化、分散、润湿等性能，对人体安全无毒，无刺激性，是理想的乳化剂。
8.优选地，所述防腐剂为苯甲酸钠；以水为溶剂的液体制剂，易被微生物污染而发霉变质，更容易引起微生物的滋长与繁殖；污染微生物的液体制剂会产生细菌毒素有害于人体，因此选择加入适量的防腐剂，以防止污染。
9.另一方面，本发明提供一种上述抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)将茶树油和表面活性剂按比例混合搅拌；
11.(2)继续加入去离子水，剪切处理后加入防腐剂，得到茶树油纳米乳剂。
12.进一步地，步骤(1)中，搅拌为磁力搅拌，搅拌的时间为15-20min，搅拌的转速为600-800r/min；磁力搅拌器噪音小，调速平稳，适合搅拌低粘稠度的液体或固液混合物。其中搅拌时间和转速经过预实验选择。
13.进一步地，步骤(2)中，使用高速分散均质机进行剪切处理。
14.进一步地，剪切的时间为4～8min，剪切的转速为8000-10000r/min；通过实践证明，当剪切时间过短时，制备过程中可能发生不完全剪切，导致液滴尺寸变大；当剪切时间过长时，会增加了液滴之间的碰撞概率，促进了液滴的融合，进而导致液滴尺寸变大。
15.优选地，高速剪切是以10000r/min的转速剪切5min；合适的剪切时间和转速能够获得粒径更小、分散更均匀、稳定性更高的纳米乳剂。
16.另一方面，本发明提供一种上述抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂在抗菌中的应用。
17.优选地，抗菌中的菌为革兰氏阳性菌。
18.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
19.(1)本发明所制备的茶树油纳米乳剂，解决了茶树油不稳定、水溶性差的问题，从而减少了茶树油在使用过程中的挥发消耗，可提高茶树油的生物利用度；
20.(2)本发明提供的茶树油纳米乳剂的制备方法，操作简单、生产成本低，所制得的茶树油纳米乳剂稳定性高、生物活性好；
21.(3)稳定性强，选用水为溶剂，减少了有机溶剂的使用，制备过程不造成污染，更加安全环保，在运输贮存过程中更加稳定。
附图说明
22.图1为实施例1-9所制备的茶树油纳米乳剂的平均粒径与pdi图；
23.图2为实施例1-9所制备的茶树油纳米乳剂的zeta电位图；
24.图3为经实施例1-9所制备的茶树油纳米乳剂处理后的金黄色葡萄球菌抑菌圈直径图。
具体实施方式
25.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
26.实施例1
27.本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
28.(1)将10g茶树油，12g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以600r/min搅拌15min；
29.(2)将称取好的177.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切5min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
30.利用上述方法制备的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油5％，聚山梨酯型表面活性剂5％，防腐剂0.1％，余量为去离子水。
31.实施例2：
32.本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
33.(1)将12g茶树油，12g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以600r/min搅拌15min；
34.(2)将称取好的175.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切5min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
35.利用上述方法制备的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油6％，聚山梨酯型表面活性剂6％，防腐剂0.1％，余量为去离子水。
36.实施例3：
37.本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
38.(1)将14g茶树油，12g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以600r/min搅拌15min；
39.(2)将称取好的173.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切5min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
40.利用上述方法制备的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油7％，聚山梨酯型表面活性剂6％，防腐剂0.1％，余量为去离子水。
41.实施例4：
42.本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
43.(1)将16g茶树油，12g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以600r/min搅拌15min；
44.(2)将称取好的171.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切5min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
45.利用上述方法制备的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油8％，聚山梨酯型表面活性剂6％，防腐剂0.1％，余量为去离子水。
46.实施例5：
47.本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
48.(1)将18g茶树油，12g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以600r/min搅拌15min；
49.(2)将称取好的169.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切5min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
50.利用上述方法制备的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油9％，聚山梨酯型表面活性剂6％，防腐剂0.1％，余量为去离子水。
51.实施例6：
52.本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
53.(1)将20g茶树油，12g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以600r/min搅拌15min；
54.(2)将称取好的167.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切5min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
55.利用上述方法制备的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油10％，聚山梨酯型表面活性剂6％，防腐剂0.1％，余量为去离子水。
56.实施例7：
57.本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
58.(1)将20g茶树油，14g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以600r/min搅拌15min；
59.(2)将称取好的165.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切5min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
60.利用上述方法制备的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油10％，聚山梨酯型表面活性剂7％，防腐剂0.1％，余量为去离子水。
61.实施例8：
62.本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
63.(1)将20g茶树油，16g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以600r/min搅拌15min；
64.(2)将称取好的163.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切5min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
65.利用上述方法制备的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油10％，聚山梨酯型表面活性剂8％，防腐剂0.1％，余量为去离子水。
66.实施例9：
67.本发明的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的制备方法，包括以下步骤：
68.(1)将20g茶树油，10g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以600r/min搅拌15min；
69.(2)将称取好的169.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切5min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
70.利用上述方法制备的抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂，按重量百分比计，包含以下原料：茶树油10％，聚山梨酯型表面活性剂5％，防腐剂0.1％，余量为去离子水。
71.茶树油纳米乳剂稳定性考察:
72.使用马尔文粒度仪在25℃条件下对实施例1-9所制备的茶树油纳米乳剂的粒径、多分散指数(pdi)和zeta电位进行分析；为了避免多重散射效应，在测量前，用去离子水将各样品稀释200倍；
73.在乳剂体系中，平均粒径是表明其物理稳定性的关键特征，描述了分散的油滴平均尺寸。pdi指的是纳米乳液滴在整个系统中的分布，其值一般为0-1，pdi越小，液滴尺寸分布越窄，纳米乳剂越稳定；
74.茶树油纳米乳剂的平均粒径和pdi如图1所示，从图中可以看出，茶树油纳米乳剂的粒径均低于200nm，多分散指数pdi在0.3左右，表明所有实施例茶树油纳米乳剂的平均液滴粒径较小，分散较均匀，具有较高的稳定性；
75.zeta电位(ζ电位)是测量乳剂液滴表面净电荷的最常用参数，是描述乳剂稳定性的指标。茶树油纳米乳剂的ζ-电位值的降低有利于乳剂的长期稳定；
76.从图2中可以看出，茶树油纳米乳剂的ζ电位随着茶树油含油量的增加而降低。
77.茶树油纳米乳剂抗菌性能测试：
78.采用纸片扩散法评判实施例1-9所制备的茶树油纳米乳剂对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抑制效果：于-80℃冰箱中取出金黄色葡萄球菌(atcc6538)的冻存菌株，在
无菌条件下，于37℃进行水浴加热，移液枪移至已灭菌的15ml离心管中，加入5ml lb液体培养基，37℃，180rpm，于振荡培养箱中培养。12h后，把菌种接种于lb固体培养基平板上，37℃培养，每次重复这个过程，直到有单个的菌落长出来，将菌的单菌落接种于5ml lb液体培养基中，在37℃下，180rpm，振荡培养12h；
79.将活化好的菌悬液离心后得到的菌泥用85％生理盐水洗涤两次(洗去死菌和lb培养基)，用生理盐水将其稀释至od
600
＝0.5后，吸取100μl菌液至lb固体培养基平板表面，用涂布器涂布均匀，并在培养基中心垂直放置7mm空白药敏纸片，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，滴加20μl的茶树油纳米乳剂，在37℃培养12h，观察并测量抑菌圈直径。将100μl菌液均匀涂布的lb固体培养基作为对照；
80.采用纸片扩散法对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)进行抗菌效果评估，如图3所示，结果显示：实施例1-9中所制备的纳米乳剂中茶树油的含量越高，其抑菌圈越大；当茶树油含量一定时，表面活性剂含量越高，其抑菌圈越大。
81.实施例10：
82.抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的配方与实施例1相同，制备方法略有不同，区别点主要是搅拌的时间和转速、剪切的时间和转速，具体的步骤如下：
83.(1)将10g茶树油，12g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以800r/min搅拌20min；
84.(2)将称取好的177.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以8000r/min剪切8min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
85.制得的茶树油纳米乳剂抗菌性能与实施例1相似。
86.实施例11：
87.抗金黄色葡萄球菌的茶树油纳米乳剂的配方与实施例1相同，制备方法略有不同，区别点主要是搅拌的时间和转速、剪切的时间和转速，具体的步骤如下：
88.(1)将10g茶树油，12g聚山梨酯吐温40，制得乳化剂与油的混合物，置于磁力搅拌器上以800r/min搅拌20min；
89.(2)将称取好的177.8g去离子水加入以上混合物中，利用高速分散均质机以10000r/min剪切4min；剪切完成后，加入0.2g的苯甲酸钠，混合均匀，即得茶树油纳米乳剂。
90.制得的茶树油纳米乳剂抗菌性能与实施例1相似。