用于调节血液中ADMA的装置和方法

用于调节血液中adma的装置和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求以下的优先权：于2019年9月13日提交的美国临时专利申请号62/899,763，其公开内容明确并入本文。
3.通过援引以电子方式提交的材料并入
4.其全部内容通过援引并入本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，并且其标识如下：32千字节acii(文本)文件，命名为“320861seqlisting_st25.txt”，创建于2020年9月6日。


背景技术：

5.不对称二甲基精氨酸(adma)是l-精氨酸的类似物，是人循环中发现的天然存在的新陈代谢产物。adma的血液水平升高在疾病状态包括高血压、先兆子痫、糖尿病、肾病、终末期肾病(esrd)或慢性肾衰竭和心力衰竭下发生。在经历心脏搭桥手术、心脏瓣膜置换术、脓毒症的患者中和在icu的患者中也生成高adma水平。透析患者中心血管死亡率的主要原因与由透析系统无法有效清除的高水平循环心脏毒素相关。尤其，透析系统不能清除蛋白结合的尿毒症毒素。
6.尿毒症毒素adma与心血管疾病和死亡率密切相关。adma在接受透析的患有慢性肾病(ckd)患者的血液中大量蓄积。由于血液中的adma与蛋白结合，因此在透析期间不能使其有效降低。血浆adma水平与进展到透析和死亡有关。研究示出，血浆adma浓度可预测患有esrd患者的死亡率，并预测高、中或低全球血管风险人群中的心血管事件和死亡率。在患有终末期肾病的患者中，adma水平升高与颈动脉粥样硬化和心血管死亡率有关。
7.adma输注减少有效肾血浆流量。此外，老年受试者中的血浆adma是有效降低肾血浆流量并增加肾血管阻力的独立预测因素(predictor)。adma蓄积也可以导致患有慢性肾功能衰竭患者中的高血压。
8.先兆子痫是母体和胎儿死亡率和发病率的主要原因，涉及所有妊娠的5-10％，并且导致全世界每年有超过50,000例与妊娠相关的死亡。众所周知，一氧化氮(no)在先兆子痫的血管发病机制中起重要作用，因为在先兆子痫患者中no的生物利用度降低。no是母体和胎儿血管健康、胎盘血流、血管生成、滋养层侵袭和植入的关键分子。no的损害引起血管收缩、血小板聚集、血管炎症和线粒体功能障碍，从而导致肾功能障碍、蛋白尿和心血管疾病。
9.异常高水平的adma在先兆子痫患者的血液中循环。对1338名孕妇的11项研究的荟萃分析示出，早在妊娠20周，与随后未发展为先兆子痫的女性相比，随后发展为先兆子痫的女性的循环adma水平显著更高。先兆子痫发作前adma的增加表明其在先兆子痫发病机制中的潜在作用。针对631名先兆子痫和498名健康孕妇的另一项研究也得出了类似结论。
10.另外，当体内adma水平升高时，它可以降低一氧化氮(no)的生成，并且从而导致血管功能障碍。no不足导致血管收缩、促炎和促形成血栓(prothrombogenic)状态，从而促进心血管疾病。更具体地，no生物利用度受损导致肾小球血流降低，入球微动脉和出球微动脉
的血管阻力增加，超滤、肾血流量和肾小球滤过率(gfr)降低，肾素(参与体内钠和水平衡的激素)分泌减少，正常条件下钠排泄的能力降低，血压升高和肾功能衰退。esrd患者中的高adma水平与gfr呈负相关，并与进展为esrd和心血管并发症引起的死亡率呈正相关。另外，功能障碍的no途径导致产生直接参与器官损伤的氧活性物质。
11.各种实验和临床研究已经确定adma是一氧化氮合成的抑制剂。高水平的adma通过作为由一氧化氮合酶(nos)生成一氧化氮的竞争性抑制剂发挥致病作用。通过与阳离子氨基酸转运蛋白结合，它抑制精氨酸转运。no产生不足与多种多样的血管疾病，包括高血压、肺动脉高压、勃起功能障碍、急性和慢性心力衰竭、心房颤动、镰状细胞病和脓毒症、伤口愈合有关，另外，如在患有冠状动脉疾病、高血压、肾病、糖尿病、肥胖症的患者中所观察到的，在精氨酸浓度降低的病理病症下，adma可能在减弱nos活性中具有甚至更大的作用。
12.通过降低no生物利用度，高水平的adma可以促进血管功能障碍、血管收缩、促炎和促形成血栓状态。另外，高水平的adma可以解耦nos，从而引起其产生氧自由基形成和器官损伤。由于血管稳态在正常生理和生存中发挥根本作用，血管内皮的持续功能障碍可以导致各种疾病状态和死亡。
13.二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(ddah)是存在于所有哺乳动物细胞中的酶。该酶降解甲基精氨酸，特别是不对称二甲基精氨酸(adma)和ng-单甲基-l-精氨酸(mma)。在ddah表达或活性受损的疾病状态下，adma清除率降低，导致其在组织和血液中蓄积。例如，在病理病症诸如糖尿病、动脉粥样硬化或炎症下，ddah-1基因表达降低并且adma升高。在氧化应激下，如在缺血-再灌注后观察到的，活性位点半胱氨酸249的氧化已示出失活的ddah活性。在肺病诸如肺动脉高压(pah)中，ddah mrna和蛋白表达降低并且adma水平升高。因此，可以增加体内酶水平的方法将降低adma并在预防或治疗疾病中产生治疗益处。
14.ddah的两种同工型由位于人染色体1(ddah-1)和6(ddah-2)上的单独基因编码。这两种蛋白具有63％氨基酸同源性，但表现出相似的催化特性。两种酶均将adma代谢为瓜氨酸和二甲胺。ddah可以水解ng-单甲基-l-精氨酸(l-nmma)和adma两者，因此ddah可以降低甲胺的抑制浓度并允许更多的no生成。
15.本公开的一个方面涉及固定的酶二甲基精氨酸二氨基水解酶(ddah)或者ddah酶的类似物或生物活性片段的合成和用途，其中ddah类似物或其片段能够将不对称二甲基精氨酸(adma)水解为瓜氨酸和/或adma的其他分解产物。已经制备编码ddah蛋白的cdna，并被用于表达和产生重组生物活性ddah蛋白，并且已经与固体担载体(solid support)共价连接。
16.然后根据本公开通过将固定的ddah或其生物活性片段与患者的血液或血浆或组织接触以降低血浆adma水平来使用固定的ddah或其生物活性片段。ddah或其类似物在与血液透析系统部件或血浆置换术结合使用或者作为血液透析系统部件或血浆置换术的一部分使用以体外处理患者的血液以降低adma水平时，可以特别有效地降低adma。


技术实现要素：

17.根据本公开的一种实施方式，提供了用于降解不对称二甲基精氨酸(adma)的组合物和方法。更具体地，本公开的一方面涉及降低需要这种治疗的患者中的adma的方法。根据一种实施方式，通过在适合由ddah降解adma的条件下使adma与酶二甲基精氨酸二甲基氨基
水解酶(ddah)接触来降低adma水平。
18.根据一种实施方式，提供了一种装置，所述装置包括与固体担载体共价连接的生物活性二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(ddah)多肽。根据一种实施方式，ddah经由所述固体担载体上的官能化基团和ddah的羧酸之间的酰化反应与所述固体担载体共价连接。在一种实施方式中，ddah多肽经由ddah的c-末端羧酸与固体担载体表面共价连接以形成酰胺键。在一种实施方式中，固体担载体的表面经n-羟基琥珀酰胺基团官能化，并且ddah多肽经由ddah的氨基基团或经由间隔基(spacer)与固体担载体缀合。在另一种实施方式中，ddah可以通过其羧基基团与固体担载体连接。
19.根据一种实施方式，提供了一种装置，所述装置包括与固体担载体共价连接的生物活性二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(ddah)多肽，其中，所述固体担载体包括合成聚合物。固体担载体可以是任何不溶性材料并且可以形成为颗粒(例如，多个珠粒)或为不溶性材料的整体条或片。在一种实施方式中，所述固体担载体是多孔，并且所述ddah多肽固定在所述固体担载体的表面上，遍及所述固体担载体的外部和内部空间。根据一种实施方式，所述固体担载体包括不溶性材料的基质，其中，所述ddah多肽与基质支架共价连接。
20.ddah多肽可以是能够将adma代谢为瓜氨酸和二甲胺的任何已知多肽或其变体。本领域技术人员已知的任何ddah多肽均可以根据本公开使用，包括例如选自由以下项组成的组的ddah多肽：人ddah多肽、牛ddah多肽、鼠ddah多肽、大鼠ddah多肽、细菌多肽和非人灵长类ddah多肽。根据一种实施方式，一种或多种生物活性ddah多肽与固体担载体共价连接，所述生物活性ddah多肽与seq id no:1或seq id no:2、seq id no:5、seq id no 6、seq id no 7、seq id no 9、seq id no 10、seq id no 11、seq id no 12、seq id no 13或seq id no 14具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在一种实施方式中，所述ddah多肽包括与选自由以下项组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13和seq id no:14。在一种实施方式中，所述ddah多肽包括seq id no:1、seq id no:2的氨基酸序列，或者与seq id no:1或seq id no:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一种实施方式中，所述ddah多肽包括seq id no:1或seq id no:2的氨基酸序列。在一种实施方式中，所述ddah多肽包括seq id no:1的氨基酸序列。在一种实施方式中，所述ddah多肽包括seq id no:2的氨基酸序列。在一种实施方式中，所述ddah多肽包括seq id no:13的氨基酸序列。
21.在一种实施方式中，提供了一种血液处理装置，所述血液处理装置包括动脉管线；血液泵；血液处理单元；和静脉管线，其中，所述动脉管线和静脉管线可以与患者的血管相连以形成体外血液回路，其中，所述血液处理单元包括与固体担载体共价连接的生物活性二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(ddah)多肽。因此，当使用所述装置形成体外血液回路时，所述患者的血液流动通过血液处理装置并在返回至所述患者之前接触所述ddah多肽。
22.本公开的固定的ddah构建体可以用作较大体外装置的部件，所述装置引导血液流动至与固定在所述固体担载体上的ddah接触。在一种实施方式中，提供了体外血液处理系统，所述体外血液处理系统包括用于从人患者抽取血液的装备；用于通过装置输送抽取的血液的装备，所述装置包括：生物活性二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(ddah)多肽；和，装置中的基底，其中，生物活性ddah多肽固定在基底上，并且其中生物活性ddah多肽降解血液
中的不对称二甲基精氨酸(adma)；以及，用于将处理过的血液返回至人患者的装备。在一种实施方式中，提供了体外装置，所述体外装置包括限定腔室的壳体；位于所述壳体内的血液处理单元、动脉管线和静脉管线以及血液泵，其中，所述动脉管线和静脉管线与所述腔室和血液处理单元流体连通，其中，所述血液处理单元包括与固体担载体共价连接的生物活性二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(ddah)多肽，并且所述血液泵使血液移动通过所述血液处理单元。根据一种实施方式，所述体外装置的动脉管线被放置为与患者的动脉血管流体连通，并且所述体外装置的静脉管线被放置为与患者的静脉血管流体连通，并且所述血液泵辅助血液从患者体内移动通过所述血液处理单元并经由所述静脉管线返回至患者的血流。
23.在一种实施方式中，本公开的所述体外装置的血液处理单元包括固体担载体，所述固体担载体是珠粒、整体条或片，任选地其中，所述固体担载体是多孔，其中，ddah与所述固体担载体的表面共价连接。
24.根据一种实施方式，提供了一种降低患者的血液中adma水平的方法。在一种实施方式中，通过在其中ddah将adma代谢为瓜氨酸和二甲胺的条件下，使患者的血液或血液级分(包括例如透析液或血浆置换后的血液血浆)与ddah接触来降低adma水平。在一种实施方式中，ddah被固定在固体担载体上，并且在其中ddah将adma代谢为瓜氨酸和二甲胺的条件下，将患者的血液或血液级分与固定的ddah接触。在一种实施方式中，使患者的血液或血液级分与固定的生物活性ddah多肽接触的步骤在离体进行，并且所述血液和/或血液级分在与所述ddah多肽接触后返回至患者。在一种实施方式中，将患者的血液或血液级分通过包括与固体担载体共价连接的生物活性二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(ddah)多肽的装置，其中，在血液或血液级分返回至患者之前，血液或血液级分与生物活性ddah多肽接触。在一种实施方式中，所述固体担载体是多孔，并且所述ddah多肽固定在所述固体担载体的表面上，遍及所述固体担载体的外部和内部空间。
附图说明
25.图1ddah缀合的基质的生成。通过在室温下将n-羟基琥珀酰胺官能化珠粒与1mg/ml ddah孵育1小时，实现ddah与基质缀合。然后用盐水或10mm tris缓冲剂洗涤珠粒。将ddah-缀合的珠粒储存在4c。
26.图2基质缀合的ddah的酶活性保存。通过使用不同浓度的未缀合的或基质缀合的ddah使用实施例1中所述的比色测定来确定酶活性。基质缀合的ddah保留了大于90％的活性。
27.图3基质缀合的ddah使血浆中adma降低。将包含2um的adma的人或猪血浆与ddah缀合的珠粒孵育不同时长。使用hplc测定，确定基质缀合的ddah使adma降低。
28.图4通过使用ddah基质柱使adma降低。制备基质缀合的ddah柱(1ml体积)作为原型治疗性医疗装置。用盐水溶液平衡该柱。然后adma溶液或血浆以1ml/min的流速通过该柱。然后使用hplc方法确定起始溶液(预柱)或经过ddah基质柱后(柱后)的adma浓度。色谱图中示出了hplc峰降低。
29.图5a和5b使用血浆置换系统和原型基于ddah的治疗性体外医疗装置降低血液中的adma。使用类似于临床环境中患者中使用的baxter prismaflex治疗性血浆交换系统对猪血液进行血浆置换(图5a)。血浆中14％的级分以10ml/min的流速通过9ml ddah-基质装
置(治疗性体外医疗装置)循环。然后将来自血浆置换膜的血液和来自temd的血浆合并并返回至原始血液。然后使用hplc测定，确定血液中adma随时间的降低(结果在图5b中示出)。
具体实施方式
30.定义
31.在描述和要求保护本公开时，将根据以下阐述的定义使用以下术语。
32.如本文所用，术语“药学上可接受的负载体”包括任何标准药用负载体，诸如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(诸如油/水或水/油乳剂)以及各种类型的润湿剂。该术语还涵括经美国联邦政府监管机构批准或在美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何剂。
33.如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的生物活性并且在生物学或其他方面不是非期望的化合物的盐。由于存在氨基和/或羧基基团或与其类似的基团，本文公开的许多化合物能够形成酸和/或碱盐。
34.如本文所用，术语“治疗”包括预防特定疾患或病症，或减轻与特定疾患或病症相关的症状和/或预防或消除所述症状。
35.如本文所用，“有效”量或“治疗有效量”是指改变患者体内的化合物浓度以提供期望作用。例如，一种期望作用将是减轻与疾病状态相关的症状，其中，疾病状态因adma水平升高而恶化。在该实施方式中，患者的血液或血浆将与治疗有效量的ddah接触。根据个体的年龄和一般病症、给药方式等，“有效”量将因受试者而异。因此，并不总是可以指定确切的“有效量”。然而，任何个体情况下的适当“有效”量可以由本领域普通技术人员使用常规实验确定。
36.如本文所用，术语“纯化的”和类似术语涉及以基本上不含通常与天然或自然环境中的分子或化合物相关的污染物的形式分离分子或化合物。
37.如本文所用，术语“纯化的”不要求绝对纯度；相反，它旨在作为相对定义。本文所用术语“纯化的rna”是以描述已经与其他化合物(包括但不限于多肽、脂质和碳水化合物)分离的rna序列。
38.术语“分离的”要求将引用的材料从其原始环境(例如，天然环境，如果它是天然存在的)中移除。例如，存在于活体动物中的天然存在的核酸不是分离的，但与天然系统中的一些或所有共存材料相分离的相同核酸是分离的。
39.如本文所用，没有进一步指定的术语“患者”旨在涵括任何温血脊椎动物家养动物(包括例如但不限于家畜、马、小鼠、猫、犬和其他宠物)和人。
40.如本文所用，术语“固体担载体”涉及能够与可溶性分子形成键(优选共价键)的溶剂不溶性基底。担载体可以是生物性质的，诸如但不限于细胞或噬菌体颗粒，或合成的，诸如但不限于丙烯酰胺衍生物、玻璃、塑料、琼脂糖、纤维素、尼龙、二氧化硅或磁化颗粒。担载体可以是颗粒形式或整体条或片。这种担载体的表面可以是实心的或多孔的并且具有任何方便的形状。
41.如本文所用，术语“血浆置换系统”定义了进行血浆置换(包括将血液从患者体内取出、血浆与血细胞分离以及随后将血浆和其他血液组分返回至体内)所需的所有必要部件。
[0042]“基本上”一词不排除“完全”，例如“基本上不含”y的组合物可以完全不含y。必要
时，本公开的定义中可以省略“基本上”一词。
[0043]
除非另有说明，否则术语“包括(comprising)和“包括(comprise)”及其语法变形旨在表示“开放性”或“包括性”语言，使得它们包括列举的元素但也允许包括额外的、未列举的元素。
[0044]
如本文所用，在制剂组分浓度的背景下，术语“约”通常意指所述值的 /-5％，更通常所述值的 /-4％，更通常所述值的 /-3％，更通常所述值的 /-2％，甚至更通常所述值的-/-1％，以及甚至更通常所述值的 /-05％。
[0045]
术语“环氧化物”、“环氧基团”或“环氧乙烷”描述了由两个碳原子和一个氧原子的三元环排列组成的化学官能团。三元环中的两个碳原子可以独立地被取代。术语“环氧化物”还可以描述包括至少一个环氧基团的分子或化合物。
[0046]
术语“含环氧化物的化合物”意指是环氧化物或包含环氧化物部分的化合物的任何化合物。示例性含环氧化物的化合物是环氧烷，并且尤其是低级环氧烷诸如环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷，醇环氧化物诸如缩水甘油，和环氧卤丙烷诸如环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、环氧碘丙烷、1,2-环氧-4-氯丁烷、1,2-环氧-4-溴丁烷、1,2-环氧-4-碘丁烷、2,3-环氧-4-氯丁烷、2,3-环氧-4-溴丁烷、2,3-环氧-4-碘丁烷、2,3-环氧-5-氯戊烷、2,3-环氧-5-溴戊烷、1,2-环氧-5-氯戊烷等，环氧化合物诸如2,2-双(对-1,2-环氧丙氧基苯基)-丙烷1,4-双(1,2-环氧丙氧基)苯-、n,n'-双(2,3-环氧丙基)哌嗪等。
[0047]
如本文所用，术语“亲电子基团”、“亲电体”等是指可以接受电子对以形成共价键的原子或原子基团。本文所用的“亲电子基团”包括但不限于含卤化物、羰基和环氧化物的化合物。常见的亲电体可以是卤化物，诸如硫光气、甘油二氯丙醇(glycerin dichlorohydrin)、邻苯二甲酰氯、琥珀酰氯、氯乙酰氯、氯代琥珀酰氯等；酮，诸如氯丙酮(chloroacctone)、溴丙酮等；醛，诸如乙二醛等；异氰酸酯，诸如六亚甲基二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯、间苯二甲基二异氰酸酯、环己基甲烷-4,4-二异氰酸酯等，以及这些化合物的衍生物。
[0048]
如本文所用，术语“亲核基团”、“亲核体”等是指具有能够形成共价键的电子对的原子或原子基团。这种类型的基团可以是作为阴离子基团反应的可电离基团。本文所用的“亲核基团”包括但不限于羟基、伯胺、仲胺、叔胺和硫醇。
[0049]
作为辅助，下表提供了各种起始亲电体和亲核体，它们可以组合以产生期望官能团。所提供的信息意指说明性的，并且不限制本文所述的合成技术。
[0050]
表1：共价键联及其前体的实例
[0051]
[0052][0053]
通常，碳亲电体易受互补亲核体(包括碳亲核体)的攻击，其中，攻击的亲核体将电子对带到碳亲电体以在亲核体和碳亲电体之间形成新键。
[0054]
碳亲核体的非限制性实例包括但不限于烷基、烯基、芳基和炔基格氏试剂(grignard)，有机锂，有机锌，烷基-、烯基、芳基-和炔基-锡试剂(有机锡烷)，烷基-、烯基-、芳基-和炔基-硼烷试剂(有机硼烷和有机硼酸盐)；这些碳亲核体具有在水或极性有机溶剂中动力学稳定的优点。碳亲核体的其他非限制性实例包括磷内鎓盐(phosphorus ylid)、烯醇和烯醇化物试剂；这些碳亲核体具有相对容易从合成有机化学领域的技术人员熟知的前体生成的优点。碳亲核体与碳亲电体结合使用时，在碳亲核体和碳亲电体之间产生新碳-碳键。
[0055]
适合与碳亲电体偶联的非碳亲核体的非限制性实例包括但不限于伯胺和仲胺、硫醇、硫醇盐和硫醚、醇、醇盐、叠氮化物、氨基脲等。这些非碳亲核体在与碳亲电体结合使用时，通常生成杂原子键(c-x-c)，其中，x是杂原子，包括但不限于氧、硫或氮。
[0056]
术语“醚”或“含醚”是指具有通式r
‑‑o‑‑
r的一类有机化合物，其中，r是碳。如本文所用，术语“醚”或“含醚”旨在排除其中r不是碳的那些化合物，例如sialyl ether、si
‑‑o‑‑
si。
[0057]
术语“多胺”是指具有至少两个正氨基基团的有机化合物，该正氨基基团选自包括伯氨基基团、仲氨基基团和叔氨基基团的基团。因此，多胺涵盖二胺、三胺和更高级胺。
[0058]
如本文所用，术语“可生物降解的”或“可生物降解的聚合物”是指可降解和/或可分解的材料。此类材料可以通过各种活生物或通过暴露于光和/或氧而降解。因此，本文所用的术语“可生物降解的”将被理解为包括可氧生物降解、可光生物降解和可微生物生物降解的材料。
[0059]
术语“生物相容的”或“生物相容的聚合物”是指当与生物流体(例如血浆或血液)接触时，以所用的量，无毒、无迁移、化学惰性且基本无免疫原性的聚合物。合适的生物相容的聚合物包括，例如，多糖，诸如纤维素或甲壳质。
[0060]
术语“生物聚合物”是指由活生物产生或衍生的聚合物。示例性生物聚合物包括多肽、核酸和多糖，例如纤维素和甲壳质。
[0061]
如本文所用，术语“水溶性聚合物”是指溶于水性溶剂的任何聚合物。此类水溶性聚合物包括但不限于，聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单c
1-c
10
烷氧基或其芳氧基衍生物(于美国专利号5,252,714中描述，其通过援引并入本文)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、n-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、右旋糖酐、右旋糖酐衍生物(包括硫酸右旋糖酐)、聚丙二醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、血清白蛋白、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-dl-天冬酰胺等，或其混合物。
[0062]
术语“官能的”或“官能团”在用于描述分子或物质时，是指以某种方式排列的原子基团，该原子基团决定了物质和它所连接的分子的化学性质。官能团的实例包括卤素原子、酰胺基团、羟基基团、羧酸基团等。
[0063]
本文所用的术语“功能性物质”等广泛地意指具有能够与靶分子反应或结合或与靶分子具有亲和力的位点的分子或活性物质。术语“功能性物质”等广义地涵括生物物质和生物分子。
[0064]
本文所用的术语“生物物质”或“生物分子”等是指基本上生物来源的任何物质和化合物。因此，这些术语仅涵括天然分子，诸如可以是从天然来源分离的那些，但也涵括从其衍生的形式、片段和衍生物以及重组形式和人工分子，只要至少存在天然分子的特性。因此，该术语涵盖了由活生物产生的有机分子，包括大聚合物分子诸如蛋白、多糖和核酸，以及小分子诸如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。
[0065]
本文所用的术语“生物学上活性物质”、“生物活性物质”等广泛地意指具有能够与靶分子反应或结合或与靶分子具有亲和力的位点的生物分子或生理活性物质。这包括但不
限于具有催化活性位点的物质诸如酶，具有能够与特定化合物或特定类别化合物结合的位点的物质诸如核酸寡核苷酸、脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)，或凝集素、维生素、肽、蛋白、激素、内分泌干扰化学品、糖、脂质等。
[0066]
术语“合适的基质”意指未明显与如上定义的未改性生物物质发生化学或生物学反应的材料组成的基质。在一些实施方式中，生物物质可以包括生物分子，并且合适的基质由生物相容的材料组成，因为该基质材料是无毒的并且未对人体引起任何不利的健康影响。还具有生物相容的合适基质通常是聚合材料，它们通常是不溶的、柔韧的并且可以符合许多不同的形状，包括曲面。应注意，术语“聚合物”用于表示由通过共价键连接在一起的由多个结构单元组成的具有高分子量的化合物。适用于如上定义的生物物质并且与如上定义的生物物质生物相容的示例性聚合物材料包括但不限于多糖、纤维素、安伯来特(amberlite)、戊二醛活化的壳聚糖、藻酸盐、plga-peg和p(hema-egdma)。
[0067]
如本文所用，术语“烷基”在其含义内包括单价(“烷基”)和二价(“亚烷基”)直链或支链或环状饱和脂肪族基团，其具有1至25个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碳原子。例如，术语烷基包括但不限于，甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、戊基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基丙基、戊基、异戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1,2,2-三乙基丙基、1,1,2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、1-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1,2-二甲基戊基、1,3-二甲基戊基、1,4-二甲基戊基、1,2,3-三甲基丁基、1,1,2-三甲基丁基、1,1,3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基等。低级烷基是如上定义的具有1至6个碳原子，优选1至4个碳原子的烷基基团。
[0068]
如本文所用的术语“烯基”在其含义内包括具有2至25个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碳原子)并具有至少一个双键，在适用的情况下，在烷基链中的任何位置具有e、z、顺式或反式立体化学的单价(“烯基”)和二价(“亚烯基”)直链或支链或环状不饱和脂肪烃基团。烯基基团的实例包括但不限于乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基(1-pehtenyl)、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1,3-戊二烯基、2,4-戊二烯基、1,4-戊二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、2-甲基戊烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、1-壬烯基、1-癸烯基等。低级烯基是如上定义的具有2至6个碳原子，优选2至4个碳原子的烯基基团。如本文所用，术语“炔基”在其含义内包括具有2至10个碳原子并在碳链任意位置具有至少一个三键的单价(“炔基”)和二价(“亚炔基”)直链或支链或环状不饱和脂肪烃基团。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-甲基-2-丁炔基、3-甲基-1-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、甲基戊炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基、1-壬基、1-癸炔基等。低级亚炔基是如上定义的具有2至6个碳原子，优选2至4个碳原子的亚炔基基团。
[0069]
如本文所用，术语“芳基”是指具有一个或多个芳环的单环或多环碳环环体系，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。芳基基团(包括二环芳基基团)可以是未取代的或被独立地选自由以下项组成的组的1至5个或更多个取代基(通常对于单环芳基为
1至5个取代基，以及对于二环/低聚环(oligocylic)芳基为多于5个取代基)取代：烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、巯基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、氨酰基、烷氧基羰基、芳氧羰基、叠氮基、氰基、卤素、硝基、甲醛、羧基、甲酰胺、尿素、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、膦和受保护的羟基。另外，取代的芳基基团包括四氟苯基和五氟苯基。
[0070]
术语“杂芳基”，无论是单独使用还是作为另一基团的一部分使用，均是指取代或未取代的芳香族杂环环体系(单环或二环)。杂芳基基团可以具有，例如，约3至约50个碳原子。杂芳基基团通常包括具有约4至约14个环原子并且包含碳原子和选自氧、氮或硫的1、2、3或4个杂原子的芳香族杂环环体系。示例性杂芳基基团包括但不限于呋喃、噻吩、吲哚、氮杂吲哚、噁唑、噻唑、异噁唑、异噻唑、咪唑、n-甲基咪唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、吡咯、n-甲基吡咯、吡唑、n-甲基吡唑、1,3,4-噁二唑、1,2,4-三唑、1-甲基-1,2,4-三唑、1h-四唑、1-甲基四唑、苯并噁唑、苯并噻唑、苯并呋喃、苯并异噁唑、苯并咪唑、n-甲基苯并咪唑、氮杂苯并咪唑、吲唑、喹唑啉、喹啉和异喹啉。二环芳香族杂芳基基团包括苯基、吡啶、嘧啶或吡啶环，它们是(a)稠合成具有一个氮原子的6元芳香族(不饱和)杂环；(b)稠合成具有两个氮原子的5元或6元芳香族(不饱和)杂环；(c)稠合成具有一个氮原子连同一个氧原子或一个硫原子的5元芳香族(不饱和)杂环；或(d)稠合成具有选自o、n或s的一个杂原子的5元芳香族(不饱和)杂环。术语“杂芳基”还包括被取代的芳香族杂环的环，例如被独立地选自由以下项组成的组的1至5个取代基取代：烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、巯基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、氨基酰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、叠氮基、氰基、卤素、硝基、甲醛、羧基、甲酰胺、尿素、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、膦和受保护的羟基。
[0071]
如本文所用的术语“任选取代的”意指该术语所指的基团可以是指未取代的或可以被独立地选自以下项的一个或多个基团取代：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、硫代烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤素、羧基、羧基烷基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、硫代烷氧基、巯基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、炔基氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰基氨基、二酰基氨基、氨基酰基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、叠氮基、甲醛、羧基、羧酰胺、尿素、氨基甲酸酯、肟、羟胺、硫酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、烷基亚磺酰基、烷基羰氧基、烷硫基、酰硫基、含磷基团(诸如磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯和膦)、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、c(o)nh(烷基)、
‑‑
c(o)n(烷基).sub.2和
‑‑
c(o)nr'r'’，其中r'和r”独立地为如本文所定义的氢、烷基芳基或杂芳基。
[0072]
如本文所用，术语“卤素”或变体例如“卤化物”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。
[0073]
如本文所用，术语“氨基”或“胺”是指r
a-n-rb形式的基团，其中ra和rb单独地选自包括但不限于氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基和任选取代的芳基基团的组。
[0074]
术语“化学偶联的”和“化学偶联”及其语法变体是指分子的共价和非共价键合，并且具体包括但不限于共价键合、静电键合、氢键合和范德瓦尔斯(van der waals)键合。这些术语涵括分子的间接和直接键合。因此，如果第一化合物与第二化合物化学偶联，则该连
接可以通过直接化学键，或通过经由其他化合物、接头或连接体的间接化学键。
[0075]
术语“重组宿主细胞”，也称为“宿主细胞”，是指包括外源多核苷酸的细胞，其中，用于将外源多核苷酸插入细胞的方法包括但不限于直接摄取、转导、f-交配或本领域已知的其他方法以创建重组宿主细胞。仅作为示例，此类外源多核苷酸可以是非整合载体，包括但不限于质粒，或者可以整合到宿主基因组中。
[0076]
如本文所用，“ddah1”或“ddah2”应包括具有人ddah酶的至少一种生物活性的人或非人来源的那些多肽和蛋白，包括但不限于ddah类似物，ddah同工型，ddah模拟物，ddah片段，杂合ddah蛋白，其融合蛋白寡聚体和多聚体，其同源物、糖基化模式变体和突变蛋白，无论其生物活性如何，并且进一步无论其合成或制造方法如何，包括但不限于重组(无论是由cdna、基因组dna、合成dna或者还是其他形式的核酸产生)、合成、转基因和基因激活方法。如本文所用，术语“ddah单位”或ddah“酶单位”[u]是指在markus knipp and milan vasak.analytical biochem.286,257(2000)中定义的条件下在一分钟内引起产生1毫摩尔瓜氨酸的酶(ddah)的量。来自多种来源的ddah1和ddah2的氨基酸序列和多核苷酸序列如下：
[0077]
表2：人ddah序列
[0078]
[0079]
[0080]
[0081][0082]
表3：牛ddah序列
[0083]
[0084][0085]
表4：鼠ddah序列
[0086][0087]
表5：大鼠ddah序列
[0088]
[0089][0090]
表6：细菌ddah序列
[0091][0092]
表7：非人灵长类ddah序列
[0093]
[0094][0095]
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并且是指分别经由氧原子、氨基基团或硫原子与分子其余部分的那些烷基基团连接。
[0096]
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是直链或支链或环状烃基团或其组合，它可以是完全饱和的、单不饱和或多不饱和的，并且可以包括二价和多价基团，具有指定的碳原子数(即c
1-c
10
意指1至10个碳)。饱和烃基团的实例包括但不限于以下基团诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键或三键的烷基基团。不饱和烷基基团的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基，以及高级同系物和异构体。除非另有说明，否则术语“烷基”还意在包括下文更详细定义的烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于烃基团的烷基基团称为“同烷基(homoalkyl)”。
[0097]
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指衍生自烷烃的二价基团，作为示例性的但不限于结构
–
ch2ch2–
和
–
ch2ch2ch2ch2–
，并且进一步包括以下描述为“杂亚烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)基团将具有1至24个碳原子，具有10个或更少个碳原子的那些基团是本文所述方法和组合物的特定实施方式。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基基团，通常具有8个或更少个碳原子。
[0098]
术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基基团、氨基基团和r基团结合的α碳，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的r基团(诸如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
[0099]
氨基酸在本文中可以通过它们通常已知的三字母符号或通过iupac-iub生化命名委员会(biochemical nomenclature commission)建议的单字母符号来指代。同样地，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母代码来指代。
[0100]“氨基末端修饰基团”是指可以与多肽氨基末端的任何分子连接。作为实例，此类末端胺基基团可以位于聚合物分子的末端，其中此类聚合物分子包括但不限于多肽、多核苷酸和多糖。类似地，“羧基末端修饰基团”是指可以与多肽羧基末端的任何分子连接。末端修饰基团包括但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白，诸如血清白蛋白，或增加肽的血清半衰期的其他部分。末端修饰基团包括但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白。
[0101]“双官能聚合物”，也称为“双官能接头”，是指包括能够与其他部分特异性反应以形成共价或非共价键的两个官能团的聚合物。此类部分可以包括但不限于氨基酸或肽上的侧基。可以连接到双官能接头或双官能聚合物的其他部分可以是相同或不同的部分。仅作为实例，双官能接头可以具有与第一肽上的基团反应的官能团和与第二肽上的基团反应的另一个官能团，从而形成包括第一肽、双官能接头和第二肽的缀合物。
[0102]“多官能聚合物”也称为“多官能接头”，是指包括能够与其他部分反应的两个或更多个官能团的聚合物。此类部分可以包括但不限于天然或非天然氨基酸上的侧基或包含此类天然或非天然氨基酸的肽。(包括但不限于氨基酸侧基)以形成共价或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可以是任何期望的长度或分子量，并且可以被选择以在与化合物连接的一个或多个分子和与其结合的分子或化合物之间提供特定的期望间距或构象。
[0103]“调节生物活性”意指提高或降低化合物、多肽或酶的反应性，改变化合物、多肽或酶的选择性，增强或降低多肽或酶的基质选择性。可以通过比较两种或更多种化合物、多肽或酶的生物活性来进行分析修饰的生物活性。
[0104]
如本文所用，术语“生物材料”是指生物衍生材料，包括但不限于从生物反应器和/或从重组方法和技术获得的材料。
[0105]
如本文所用，术语“生物物理探针”或“生物传感器”是指可以检测或监测分子(包括浓度)的变化的传感器或探针。此类分子包括但不限于化合物(诸如adma和瓜氨酸)、蛋白(诸如ddah)，并且可以用于检测或监测蛋白与其他大分子的相互作用。
[0106]
如本文所用，术语“生物素类似物”或也称为“生物素模拟物”是除生物素之外的以高亲和力与抗生物素蛋白和/或链霉亲和素结合的任何分子。
[0107]
除非另有说明，否则术语“芳基”意指多不饱的、芳香族的烃取代基，其可以是稠合在一起或共价连接的单环或多环(包括但不限于1至3个环)。术语“杂芳基”是指包含选自n、o和s的1至4个杂原子的芳基基团(或环)，其中，氮和硫原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。杂芳基基团可以通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环体系中的每一个的取代基选自下述可接受的取代基的组。
[0108]
为了简洁，当与其他术语(包括但不限于芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)组合使用时，术语“芳基”包括如上定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语“芳烷基”或“烷芳基”意在包括其中芳基基团与烷基基团(包括但不限于苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)连接的那些基团，包括其中碳原子(包括但不限于亚甲基基团)已被例如氧原子(包括但不限于苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)取代的那些烷基基团。
[0109]“双官能聚合物”是指包括能够与其他部分(包括但不限于氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键的两个离散官能团的聚合物。具有与特定生物活性组分上的基团反应的一个官能团和与第二生物组分上的基团反应的另一个基团的双官能接头，可以用于
形成包括第一生物活性组分、双官能接头和第二生物活性组分的缀合物。用于将各种化合物与肽连接的许多程序和接头分子是本领域技术人员已知的。“多官能聚合物”是指包括能够与其他部分(包括但不限于氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键的两个或更多个离散官能团的聚合物。双官能聚合物或多官能聚合物可以是任何期望的长度或分子量，并且可以被选择以在与多肽连接的一个或多个分子和与其结合配偶体或多肽之间提供特定的期望间距或构象。
[0110]
术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”当在本文使用时意指可以影响生物系统、途径、分子或与生物相关的相互作用的任何物理或生化特性的任何物质。
[0111]
如本文所用，“共折叠”具体是指采用彼此相互作用并导致未折叠或不正确折叠的至少两种多肽转化为天然的、正确折叠的多肽的重折叠过程、反应或方法。
[0112]
如本文所用，“比较窗口”包括对选自由20至600个、通常约50至约200个、更通常约100至约150个组成的组的连续位置中的任何一个的区段的指代，其中在两个序列最佳比对后，可以将一个序列与相同数量的连续位置的参比序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过包括但不限于以下项进行：通过smith和waterman的局部同源性算法、通过needleman和wunsch的同源性比对算法、通过pearson和lipman的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实施(wisconsin genetics软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta，遗传学计算机组，575science dr.，madison，wi)，或通过手动比对和目视检查。
[0113]
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是blast和blast 2.0算法。执行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)公开获得。blast算法参数w、t和x确定比对的灵敏度和速度。blastn程序(用于核苷酸序列)默认使用的字长(w)为11，期望值(e)或为10，m＝5，n＝-4以及两条链比较。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用的字长为3，期望值(e)为10，以及blosum62评分矩阵比对(b)为50，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及两条链比较。blast算法通常在关闭“低复杂度”过滤器的情况下执行。
[0114]
blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析。blast算法提供的一种相似性度量是最小和概率(p(n))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参比核酸比较中的最小和概率小于约0.2、小于约0.01或小于约0.001，则认为核酸与参比序列相似。
[0115]
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定的核酸序列，“保守修饰的变体”是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子gca、gcc、gcg和gcu均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置处，可以将密码子改变为所描述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是一种保守修饰的变异。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了该核酸的每个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了atg，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和tgg，其通常是色氨酸的唯一密码子以外)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个描述的序列中。
[0116]
至于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单独置换、缺失或添加可改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸，其是“保守修饰的变体”,其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守置换表是本领域普通技术人员已知的。此类保守修饰的变体是对本文所述方法和组合物的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充而并不排除。
[0117]
以下八组中各自包含彼此保守置换的氨基酸：
[0118]
a.丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；
[0119]
b.天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
[0120]
c.天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；
[0121]
d.精氨酸(r)、赖氨酸(k)；
[0122]
e.异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；
[0123]
f.苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；
[0124]
g.丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；和
[0125]
h.半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)
[0126]
(参见，例如，creighton,proteins:structures and molecular properties(w h freeman&co.；2nd edition(december 1993)
[0127]
除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合分别代表“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和的、部分不饱和的和完全不饱和的环键。此外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于，1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基，四氢呋喃-2-基，四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。此外，该术语涵括二环和三环结构。类似地，术语“杂环亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指衍生自杂环烷基的二价基团，并且术语“亚环烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指衍生自环烷基的二价基团。
[0128]
如本文所用，“变性药剂(denaturing agent)”或“变性剂(denaturant)”被定义为将引起蛋白可逆性伸展的任何化合物或材料。变性药剂或变性剂的强度将由特定变性药剂或变性剂的特性和浓度确定。合适的变性药剂或变性剂可以是离散剂、洗涤剂、有机水混溶性溶剂、磷脂，或两种或更多种此类药剂的组合。合适的离散剂包括但不限于脲、胍和硫氰酸钠。有用的洗涤剂可以包括但不限于,强洗涤剂，诸如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如t吐温或曲通洗涤剂)、肌氨酰(sarkosyl)，温和非离子洗涤剂(例如，毛地黄皂苷)，温和阳离子洗涤剂，诸如n-》2,3-(二油氧基)-丙基-n,n,n-三甲基铵，温和离子洗涤剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)，或两性离子洗涤剂，包括但不限于，磺酸甜菜碱(两性洗涤剂)、3-(3-氯酰胺丙基)二甲基氨基-1-丙烷硫酸盐(chaps)和3-(3-氯酰胺丙基)二甲基氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(chapso)。有机水混溶性溶剂，诸如乙腈、低级烷醇(尤其是c
2-c4烷醇，诸如乙醇或异丙醇)或低级烷二醇(尤其是c
2-c4烷二醇，诸如乙二醇)可已用作变性。可用于本文所述的方法和组合物的磷脂可以是天然存在的磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇，或合成的磷脂衍生物或变体，诸如二己酰磷脂酰胆碱或二庚酰磷脂酰胆碱。
[0129]
如本文所用，术语“有效量”是指患者血液中adma的水解的量，其将在一定程度上缓解待治疗的疾病、病症或疾患的一种或多种症状。
[0130]
术语“增强(enhance)”或“增强(enhancing)”意指在效能或持续时间上增加或延长期望作用。
[0131]
如本文所用，术语“真核生物”是指属于系统发育领域真核生物的生物，诸如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子目、原生生物等。
[0132]
术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应基团”和“化学反应部分”在本领域和本文中使用是指不同的、可定义的分子的部分或单元。这些术语在化学领域中在某些程度上是同义词，并且在本文中用于指示执行一些功能或活性并与其他分子反应的分子部分。
[0133]
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
[0134]
除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一个术语组合意指，稳定的直链或支链、或环状烃基团、或其组合，由所述数量的碳原子以及选自由o、n、si和s组成的组的至少一个杂原子组成，其中氮和硫原子可以任选地被氧化并且氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子o、n和s以及si可以位于杂烷基基团的任何内部位置或位于烷基基团与分子其余部分连接的位置。实例包括但不限于，-ch
2-ch
2-o-ch3、-ch
2-ch
2-nh-ch3、-ch
2-ch
2-n(ch3)-ch3、-ch
2-s-ch
2-ch3、-ch
2-ch2、-s(o)-ch3、-ch
2-ch
2-s(o)
2-ch3、-ch＝ch-o-ch3、-si(ch3)3、-ch
2-ch＝n-och3和
–
ch＝ch-n(ch3)-ch3。至多两个杂原子可以是连续的，诸如例如，-ch
2-nh-och3和
–
ch
2-o-si(ch3)3。类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指衍生自杂烷基的二价基团，作为示例性但不限于，-ch
2-ch
2-s-ch
2-ch
2-和
–
ch
2-s-ch
2-ch
2-nh-ch
2-。对于杂亚烷基基团，相同或不同的杂原子也可以占据一个或两个链末端(包括但不限于亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨基氧亚烷基等)。此外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的化学式的书写方向不隐含连接基团的方向。例如，式
–
c(o)2r
’‑
代表
–
c(o)2r
’‑
和
–
r’c(o)
2-两者。
[0135]
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景中，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个相同的序列或子序列。如果序列具有相同百分比的氨基酸残基或核苷酸，则当使用以下序列比较算法中的一种或通过手动比对和目视检查测量的在比较窗口或指定区域中比较和比对以获得最大对应性时，它们是“基本相同的”(即，在指定区域中具有约60％同一性，任选地约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％同一性)。该定义还涉及测试序列的补充。同一性可以存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域中，或存在于长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域中，或者，在未指定的情况下，存在于多核苷酸或多肽的整个序列中。
[0136]
对于序列比较，通常一个序列充当参比序列，将测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，如有需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定可选参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参比序列的百分比序列同一性。
[0137]
术语“分离的”当应用于核酸或蛋白时，表示该核酸或蛋白不含在天然状态下与其结合的至少一些细胞组分，或者该核酸或蛋白已被浓缩到高于其体内或体外产生浓度的水
平。它可以处于同质状态。分离的物质可以呈干燥或半干燥状态，或呈溶液，包括但不限于水性溶液。它可以是药物组合物的组分，该药物组合物包括额外的药学上可接受的负载体和/或赋形剂。纯度和同质性通常使用分析化学技术诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来确定。制剂中存在的主要种类的蛋白是基本上纯化的。尤其，分离的基因与开放阅读框分离，该开放阅读框位于该基因的侧翼并编码除目的基因之外的蛋白。术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中产生基本上一条条带。特别地，这可以意指核酸或蛋白为至少85％纯度、至少90％纯度、至少95％纯度、至少99％或更高纯度。
[0138]
本文所用术语“键”或“接头”或“间隔基”是指通常作为化学反应的结果形成并且通常为共价键的基团或键。如本文所用，术语“接头”和“间隔基”是指连接化合物的两个部分的有机部分。水解稳定的键意指键在水中基本上稳定并且在有用的ph值下不与水反应，包括但不限于在生理条件下持续延长的时间时期，甚至可能是无限期的。水解不稳定或可降解的键意指这些键在水或水性溶液(包括例如血液)中是可降解的。酶促不稳定的或可降解的键意指该键可以被一种或多种酶降解。如本领域所理解的，peg和相关聚合物可以包括在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的接头基团中的可降解键。例如，由peg羧酸或活化的peg羧酸与生物活性剂上的醇基团反应形成的酯键通常在生理条件下水解以释放该剂。其他可水解降解的键包括但不限于碳酸酯键；由胺和醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键；腙键，其是酰肼和醛的反应产物；缩醛键，其是醛和醇的反应产物；原酸酯键，其是甲酸酯和醇的反应产物；由胺基团(包括但不限于在聚合物(诸如peg)的末端)和肽的羧基基团形成的肽键；以及由亚磷酰胺基团(包括但不限于在聚合物的末端)和寡核苷酸的5'羟基基团形成的寡核苷酸键。在一种实施方式中，接头是非烃，诸如肼、羟胺、氨、水或硫化氢。
[0139]
如本文所用，术语“键”或“接头”或“间隔基”还指连接化合物的两个部分的有机部分。在一种实施方式中，接头是具有2至18个碳原子、2至16个碳原子、2至14个碳原子、2至12个碳原子、或2至10个碳原子、2至8个碳原子、2至6个碳原子和2至4个碳原子的饱和或不饱和脂肪族链。在一种实施方式中，接头是具有4至8个碳原子、更优选6个碳原子的饱和脂肪族链。所述接头的亲核基团可以位于脂肪族链的末端中的一个或脂肪族链的末端之间。在一种实施方式中，所述接头的亲核基团可以通过从其延伸的支链与脂肪族链化学偶联。在一种实施方式中，有两个亲核基团位于所述接头上，优选位于脂肪族链的末端。在一种实施方式中，至少一个亲核基团位于脂肪族链的末端并且与含醚或含环氧化物的部分偶联，其间具有二级脂肪族接头链。二级脂肪族接头链可以具有1至3个碳原子。
[0140]
如本文所用，术语“培养基(medium)”或“培养基(media)”包括可以支持或包含任何宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性担载体，该宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、cho细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌(e.coli)或假单胞菌宿主细胞，以及细胞内容物。因此，该术语可以涵括宿主细胞已在其中生长的培养基，例如多肽已分泌到其中的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。该术语还可以涵括包含宿主细胞裂解物的缓冲剂或试剂，诸如在细胞内产生多肽并且宿主细胞被裂解或破坏以释放多肽的情况下。
[0141]
物质的“代谢物”是该物质代谢时形成的该物质的衍生物。术语“活性代谢物”是指物质代谢时形成的该物质的生物活性衍生物。术语“代谢”是指特定物质被例如酶改变的过
程(包括但不限于水解反应和酶催化的反应)的总和。
[0142]
如本文所用，术语“修饰的”是指在多肽上存在翻译后修饰。
[0143]
如本文所用，术语“非真核生物”是指非真核生物。例如，非真核生物可以属于真细菌(包括但不限于大肠杆菌(escherichia coli)、嗜热栖热菌(thermusthermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)等)系统发育领域，或古菌(包括但不限于詹氏甲烷球菌(methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(methanobacteriumthermoautotrophicum)、嗜盐菌属(halobacterium)诸如沃氏嗜盐富饶菌(haloferaxvolcanii)和嗜盐杆菌属nrc-1、闪烁古生球菌(archaeoglobus fulgidus)、激烈火球菌(pyrococcus furiosus)、掘越氏热球菌(pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(aeuropyrum pernix)等)系统发育领域。
[0144]“非天然氨基酸”是指不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸；可以与术语“非天然氨基酸”同义使用的其他术语是“非天然编码氨基酸”、“非天然氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”，及其各种连字符和非连字符形式。术语“非天然氨基酸”包括但不限于通过修饰天然编码的氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而天然存在的氨基酸，但不限于自身通过翻译复合物掺入不断增长的多肽链中。非天然编码的天然存在的氨基酸的实例包括但不限于n-乙酰葡糖胺-l-丝氨酸、n-乙酰葡糖胺-l-苏氨酸和o-磷酸酪氨酸。
[0145]
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵括包含已知天然核苷酸类似物的核酸，其具有与参比核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有特别限制，否则该术语还指寡核苷酸类似物，包括pna(肽核酸)、反义技术中使用的dna类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含涵括其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子置换)和互补序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子置换可以通过生成其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现。
[0146]
如本文所用关于蛋白重折叠的“氧化剂”被定义为能够从被氧化的化合物中去除电子的任何化合物或材料。合适的氧化剂包括但不限于氧化的谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化的二硫苏糖醇、氧化的赤藓糖醇和氧。各种氧化剂适用于本文所述的方法和组合物。
[0147]
如本文所用，术语“聚亚烷基二醇”是指聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。术语“聚亚烷基二醇”涵括直链和支链聚合物两者，并且平均分子量为1kda至100kda之间。例如，在商业供应商目录中列出了其他示例性实施方式。
[0148]
在本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白的描述，反之亦然。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白或其片段，其中，氨基酸残基通过共价肽键连接。
[0149]
术语“翻译后修饰”是指天然或非天然氨基酸在其被并入多肽链后发生在这样的
氨基酸上的任何修饰。仅作为示例，该术语涵括共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。
[0150]
术语“受保护的”是指存在防止化学反应官能团在某些反应条件下反应的“保护基团”或部分。保护基团将根据被保护的化学反应基团的类型而变化。例如，如果化学反应基团是胺或酰肼，则保护基团可以选自叔丁氧羰基(t-boc)和9-芴基甲氧羰基(fmoc)的组。如果化学反应基团是硫醇，则保护基团可以是邻吡啶基二硫化物。如果化学反应基团是羧酸(诸如丁酸或丙酸)或羟基基团，则保护基团可以是苄基或烷基基团诸如甲基、乙基或叔丁基。本领域已知的其他保护基团也可用于本文所述的方法和组合物中或与本文所述的方法和组合物一起使用，包括光不稳定基团诸如nvoc和menvoc。
[0151]
仅作为实例，封闭/保护基团可以选自：
[0152][0153]
其他保护基团描述于greene and wuts,protective groups in organic synthesis,3rd ed.,john wiley&sons,new york,ny,1999，其全部内容通过援引并入本文。
[0154]“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多核苷酸的细胞，与用于插入的方法(例如，直接摄取、转导、f-交配或本领域已知的用于创建重组宿主细胞的其他方法)无关。外源多核苷酸可以保持为非整合载体，例如质粒，或替代地，可以整合到宿主基因组中。
[0155]
如本文所用关于蛋白重折叠的“还原剂”定义为使硫氢基基团保持在还原状态并还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或材料。合适的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(dtt)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。各种各样的还原剂适用于本文所述的方法和组合物。
[0156]
如本文所用，“重折叠”描述将包含二硫键的多肽从不正确折叠或未折叠状态转变为关于二硫键的天然或正确折叠构象的任何过程、反应或方法。
[0157]
短语“选择性地(或特异性地)杂交”是指当该序列存在于复杂混合物(包括但不限于总细胞或者文库dna或rna)中时，分子在严格杂交条件下仅与特定核苷酸序列结合、双链体化或杂交。
[0158]
短语“严格杂交条件”是指本领域已知的低离子强度和高温条件。通常，在严格条
件下，探针将与其核酸的复杂混合物(包括但不限于总细胞或者文库dna或rna)中的靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其他序列杂交。严格条件具有序列依赖性，并且在不同的情况下将有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。通常，严格条件选择为在确定的离子强度ph下比特定序列的热熔点(tm)低约5-10℃。tm是在该温度(在确定的离子强度、ph和酸浓度下)下与靶标互补的50％的探针在平衡时与靶标序列杂交(因为靶标序列过量存在，在tm下，50％的探针处于平衡状态)的温度。严格条件可以是在ph 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子，通常为约0.01至1.0m钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(包括但不限于10至50个核苷酸)，温度为至少约30℃，以及对于长探针(包括但不限于大于50个核苷酸)，温度为至少约60℃。添加去稳定剂诸如甲酰胺也可以达到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是至少两倍背景，任选地10倍背景杂交。示例性严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5
×
ssc和1％sds，在42℃下孵育，或5
×
ssc、1％sds，在65℃下孵育，在0.2
×
ssc和0.1％sds中于65℃下洗涤。这种洗涤可以进行5、15、30、60、120或更多分钟。
[0159]
如本文所用，术语“受试者”是指动物，在一些实施方式中是哺乳动物，并且在其他实施方式中是人，其是治疗、观察或实验的对象。
[0160]
术语“基本上纯化的”是指可以基本上或大体上不含在其天然存在的环境(即天然细胞，或在重组产生的多肽的情况下的宿主细胞)中发现的通常伴随蛋白或与蛋白相互作用的组分的多肽。可以基本上不含细胞物质的多肽包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、或小于约1％(按干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当多肽或其变体由宿主细胞重组产生时，蛋白可以以约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、或约1％或更少的细胞干重存在。当多肽或其变体由宿主细胞重组产生时，蛋白可以以约5g/l、约4g/l、约3g/l、约2g/l、约1g/l、约750mg/l、约500mg/l、约250mg/l、约100mg/l、约50mg/l、约10mg/l或约1mg/l或更少的细胞干重存在于细胞培养基中。因此，通过本文所述的方法产生的“基本上纯化的”多肽可以具有的纯度水平可以为至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％，具体地，纯度水平为至少约75％、80％、85％，更具体地，纯度水平为至少约90％，纯度水平为至少约95％，纯度水平为至少约99％或更高，如通过适当的方法诸如sds/page分析、rp-hplc、sec和毛细管电泳确定。
[0161]
术语“取代基”包括但不限于“非干扰性取代基”。“非干扰性取代基”是产生稳定化合物的那些基团。合适的非干扰性取代基或基团包括但不限于卤素、c
1-c
10
烷基、c
2-c
10
烯基、c
2-c
10
炔基、c
1-c
10
烷氧基、c
5-c
12
芳烷基、c
3-c
12
环烷基、c
4-c
12
环烯基、苯基、取代的苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯、c
2-c
12
烷氧基烷基、c
5-c
12
烷氧基芳基、c
5-c
12
芳氧基烷基、c
7-c
12
氧芳基、c
1-c6烷基亚磺酰基、c
1-c
10
烷基磺酰基、-(ch2)
m-o-(c
1-c
10
烷基)(其中m是1至8)、芳基、取代的芳基、取代的烷氧基、氟代烷基、杂环基团、取代的杂环基团、硝基烷基、-no2、-cn、-nrc(o)-(c
1-c
10
烷基)、-c(o)-(c
1-c
10
烷基)、c
2-c
10
烷硫基烷基(c
2-c
10 alkthioalkyl)、-c(o)o-(c
1-c
10
烷基)、-oh、-so2、＝s、-cooh、-nr2、羰基、-c(o)-(c
1-c
10
烷基)-cf3、-c(o)-cf3、-c(o)nr2、-(c
1-c
10
芳基)-s-(c
6-c
10
芳基)、-c(o)-(c6-c
10
芳基)、-(ch2)
m-o-(ch2)
m-o-(c
1-c
10
烷基)(其中每个m为1至8)、-c(o)nr2、-c(s)nr2、-so2nr2、-nrc(o)nr2、-nrc(s)nr2、其盐等。前述列表中的每个r基团独立地选自由h、烷基或取代的烷基、芳基
或取代的芳基、或烷芳基组成的组。如果取代基团由它们的常规化学式指定，从左至右书写，它们等同涵括从右至左书写结构所产生的化学相同的取代基，例如，-ch2o-等同于-och
2-。
[0162]
烷基和杂烷基基团(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是多种基团中的一种或多种，选自但不限于-or、＝o、＝nr、＝n-or、-nr2、-sr、-卤素、-sir3、-oc(o)r、-c(o)r、-co2r、-conr2、-oc(o)nr2、-nrc(o)r、-nr-c(o)nr2、-nr(o)2r、-nr-c(nr2)＝nr、-s(o)r、-s(o)2r、-s(o)2nr2、-nrso2r、-cn和
–
no2，数量范围为零至(2m’ 1)，其中，m’是此类自由基中碳原子的总数。前述列表中的每个r基团独立地选自由以下项组成的组：氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(包括但不限于被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基团、或芳烷基基团。当两个r基团与同一氮原子连接时，它们可以与氮原子组合形成5元、6元或7元环。例如，-nr2意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从以上对取代基的讨论中，本领域技术人员将理解术语“烷基”意在包括含有与非氢基团结合的碳原子的基团，诸如卤烷基(包括但不限于-cf3和
–
ch2cf3)和酰基(包括但不限于-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等)。
[0163]
类似于针对烷基基团描述的取代基，芳基和杂芳基基团的取代基是变化的，并且选自但不限于-or、＝o、＝nr、＝n-or、-nr2、-sr、-卤素、-sir3、-oc(o)r、-c(o)r、-co2r、-conr2、-oc(o)nr2、-nrc(o)r、-nr-c(o)nr2、-nr(o)2r、-nr-c(nr2)＝nr、-s(o)r、-s(o)2r、-s(o)2nr2、-nrso2r、-cn、
–
no2、-r、-n3、-ch(ph)2、氟(c
1-c4)烷氧基和氟(c
1-c4)烷基,数量范围为零至芳香族环体系上的开合价总数；并且其中，前述列表中的每个r基团独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。
[0164]
术语“治疗”用于指预防性和/或治疗性治疗。
[0165]
如本文所用，术语“水溶性聚合物”是指溶于水性溶剂的任何聚合物。水溶性聚合物与多肽的连接可以导致变化，包括但不限于增加或调节血清半衰期，或相对于未修饰形式增加或调节治疗半衰期，调节免疫原性，调节物理结合特征(诸如聚集和多聚体形成)，改变受体结合，改变与一种或多种结合配偶体的结合，以及改变受体二聚化或多聚化。水溶性聚合物可以具有或可以不具有其自身的生物活性，并且可以用作将多肽与其他物质连接的接头，包括但不限于一种或多种多肽，或一种或多种生物活性分子。合适的聚合物包括但不限于，聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单c1-c10烷氧基或其芳氧基衍生物(于美国专利号5,252,714中描述，其通过援引并入本文)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、n-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、右旋糖酐、右旋糖酐衍生物(包括硫酸右旋糖酐)、聚丙二醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-dl-天冬酰胺等，或其混合物。这种水溶性聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。
[0166]
实施方式
[0167]
adma从体内消除的主要途径是通过ddah的酶促作用。在患有各种各样疾病和病症的患者(例如肾病、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭、高血压、肺高压，以及尤其是终末期肾
衰竭、外科患者、创伤患者、重症监护病房患者)中发现adma水平升高。急性肾损伤和造影诱导的肾损伤患者的adma水平也增加。另外，已报道adma水平增加是心血管相关死亡风险的指标。
[0168]
在先兆子痫患者中发现高水平的adma和降低的ddah，这可能导致高血压、肾损伤、胎儿生长减慢和早产。高水平的adma与红细胞生成素抗性有关。
[0169]
因此，迫切需要开发降低患者(尤其是先兆子痫患者、急性心力衰竭患者、icu患者和因肾脏相关疾病而接受血液透析治疗的患者)的血液中adma浓度的方法。预期通过将终末期肾病患者的血液与ddah或其生物活性片段接触，结合血液透析治疗来降低终末期肾病患者的血液中的adma的能力可降低adma介导的发病率并延长寿命。
[0170]
本公开的特征是提供固定的ddah酶，该ddah酶可以将adma水解成瓜氨酸和其他反应产物，从而减轻导致血液中adma浓度增加的上述后果的一个或多个。
[0171]
本公开的其他特征是提供组合物，该组合物包含呈共价结合的大分子构成的共价固定的ddah酶。
[0172]
本公开的另一个特征是提供组合物，该组合物包括共价固定的ddah酶，该ddah酶可以被干燥和储存并保持酶活性。
[0173]
本公开的其他特征是提供固定的ddah酶，该ddah酶可以用于从生物流体(包括但不限于血液或血液级分)中去除adma的系统中。
[0174]
本公开的另一个特征是提供用于透析的吸附剂筒，其中该吸附剂筒包括固定在固体表面上的ddah酶，任选地其中，该ddah酶与固体担载体直接或经由间隔基共价结合。
[0175]
本公开的另一个特征是提供用于制备保留adma水解酶活性的固定的ddah酶的方法，任选地其中，该固定的ddah酶与固体担载体共价结合。
[0176]
本公开的另一个特征是提供用于制备固定的ddah酶的方法，该方法可以利用来自天然来源或重组产生的ddah酶的粗制(或原始)未纯化形式。
[0177]
为了实现上述特征并且根据本公开的目的，如本文所体现和广泛描述的，本公开提供了组合物，该组合物包括共价或非共价固定的ddah酶或修饰的ddah，并且具有将adma水解成瓜氨酸和其他代谢物的ddah酶活性。该组合物可以包括ddah酶、聚合物和交联剂。该组合物可以包括形成共价或非共价结合的大分子，并且ddah酶可以与交联剂共价或非共价结合，并且也可以与包括固体担载体的聚合物或玻璃共价或非共价结合。该组合物可以经干燥，并且然后在环境温度和压力下储存，并且仍保持ddah酶活性。这种类型的固定可以防止ddah酶溶解到例如生物流体的液相中。这种类型的固定还可以防止ddah酶从其固定状态被其他化学物质或生物化学物质置换和/或防止ddah酶从支持基质迁移。
[0178]
本公开还提供了用于制备固定的ddah酶的方法。该方法可以包括形成聚合物和ddah酶的水性混合物，将交联剂添加到水性混合物中以形成反应混合物，并且将反应混合物保持足以使反应混合物交联形成共价或非共价结合的大分子的时间。在一种实施方式中，固体担载体包括官能化基团，该官能化基团可以与ddah多肽相互作用以形成共价键并因此将多肽与固体担载体结合。
[0179]
本公开还提供了用于从包括adma的生物流体中去除adma的方法，该生物流体包括但不限于血液或血液级分。该方法可以包括用包括具有ddah酶活性的共价或非共价固定的ddah酶的组合物处理生物流体并回收具有降低的adma浓度的生物流体。由于adma的水解，
回收的生物流体也可能具有增加的瓜氨酸浓度。增加的瓜氨酸浓度可以为用包括本公开的固定的ddah的基质如此治疗的患者提供额外的优势。ddah酶可以经固定使得它不溶解并且不显著释放或迁移到生物流体中。
[0180]
本公开提供了吸附剂筒，该吸附剂筒包括在吸附剂筒中具有ddah酶活性的共价或非共价固定的ddah酶。
[0181]
本公开还提供了透析或血浆置换方法，该方法包括以下步骤：将包含adma的透析液暴露于包括固定的ddah酶的基质，并且从所述基质去除透析液。
[0182]
本公开还提供了用于透析装置的透析器，该透析器包括如本文所述的包括固定的ddah的基质。因此，ddah可以固定在透析膜(诸如例如透析器中包括的乙酸纤维素膜过滤器)上。如本文详细描述的，有许多其他类型的可以固定ddah的基质。
[0183]
基质可以进一步包括布置在所述基质上的涂层，该涂层包括生物活性ddah酶和稳定添加剂。稳定添加剂可以包括但不限于糖(诸如葡萄糖)、有机酸(诸如乙二胺四乙酸)、氨基酸(诸如半胱氨酸)和糖酸(例如抗坏血酸)。
[0184]
在另一种实施方式中，提供了用于透析装置中的吸附剂筒，该吸附剂筒包括基质，该基质具有布置在其上的包括固定的ddah的化合物，每种化合物包括化学偶联至ddah的第一含官能团部分和偶联至基质的第二含官能团部分以通过接头将ddah固定至所述基质而基本上不损失ddah酶活性。
[0185]
在另一种实施方式中，提供了透析或血浆置换方法，该方法包括以下步骤：将包含adma的透析液暴露于基质，该基质具有布置在其上的包括固定的ddah的化合物，并且在所述adma的至少一部分已经被水解后，从所述包括ddah的基质去除透析液。另外，没有显著释放潜在有害物质，因此包括固定的ddah的基质适用于各种各样的医疗应用，诸如血液透析以及腹膜透析。
[0186]
可以固定ddah的基质可以是珠粒、微米级颗粒、纳米级颗粒、磁珠粒、膜、网、玻璃、支架或能够被制备以固定功能性物质(包括其上的生物物质，诸如生物活性ddah)的任何固体担载体。在一种实施方式中，合适的基质包括但不限于聚酯基质、聚酰胺基质、环氧树脂基质、聚丙烯酸酯基质、羟基官能化基质交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、琼脂糖和基于多糖的基质。基于多糖的基质可以是，例如，棉短绒、棉浆、棉织物、纤维素纤维、纤维素珠粒、纤维素粉末、微晶纤维素、纤维素膜、人造丝、玻璃纸、乙酸纤维素、乙酸纤维素膜、壳聚糖、甲壳质、右旋糖酐衍生物和琼脂糖衍生物。基质还可以是生物相容的，使得当将基质植入人体或与人体结合时，例如在透析中，很少或不引发不良健康影响。
[0187]
在一种实施方式中，将固定的ddah与血浆置换系统诸如中空纤维膜或离心血浆置换系统组合使用。
[0188]
在一种实施方式中，将固定的ddah和中空纤维膜构建成可穿戴装置。
[0189]
在一种实施方式中，可穿戴装置可以使用微型泵使血液循环通过装置。
[0190]
中空纤维膜可以具有使得血浆蛋白被过滤，将血细胞保留在中空纤维内的孔径。
[0191]
在一种实施方式中，包括ddah的基质还可以包含其他生物活性物质，诸如酶，例如脲酶。有利地，当将ddah和其他酶(诸如脲酶)固定在基质上时，包含固定酶的基质也可以用于透析应用，诸如腹膜透析或血液透析。除了ddah之外的酶还可以是例如但不限于以下项中的至少一种：尿酸酶、肌酸酐酶、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、过氧化氢酶、酰
化酶、青霉素酰胺酶和蛋白酶-k。
[0192]
在另一种实施方式中，本公开提供了包括ddah的基质在传感器和生物传感器中的用途。此类传感器和生物传感器可以用于检测、监测和/或调节生物流体(诸如血液或血液级分)中的adma浓度。
[0193]
本公开的一种实施方式是具有seqidno:1(ddah-1)或seqidno:2(ddah-2)所示的氨基酸序列的二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(ddah)多肽及其生物活性片段，其中，所述ddah多肽被固定在基质上。ddah多肽可以水解不对称二甲基精氨酸(adma)。ddah多肽可以是全长ddah-1或ddah-2多肽。在一种实施方式中，ddah多肽是全长ddah-1或ddah-2多肽的生物活性片段或部分。在一种实施方式中，ddah多肽水解adma以形成瓜氨酸。在一种实施方式中，ddah多肽水解溶液中的adma以形成瓜氨酸。在一种实施方式中，ddah多肽水解溶液中的adma以形成瓜氨酸，其中，所述溶液是体液。在一种实施方式中，ddah多肽水解溶液中的adma以形成瓜氨酸，其中，所述溶液是体液，并且其中，所述体液是血液、血液级分或血液衍生的流体。在一种实施方式中，ddah多肽在重组宿主细胞中产生。在一种实施方式中，ddah多肽在重组宿主细胞中产生，其中，所述重组宿主细胞是原核细胞。在一种实施方式中，ddah多肽在重组宿主细胞中产生，其中，所述重组宿主细胞是细菌。在一种实施方式中，ddah多肽在重组宿主细胞中产生，其中，所述重组宿主细胞是真核细胞。在一种实施方式中，ddah多肽在重组宿主细胞中产生，其中，所述重组宿主细胞是哺乳动物细胞。在一种实施方式中，ddah多肽在重组宿主细胞中产生，其中，所述重组宿主细胞是酵母细胞。在一种实施方式中，ddah多肽是重组哺乳动物ddah多肽，任选地是重组人ddah多肽。在一种实施方式中，ddah多肽分离自非人来源。ddah多肽可以分离自细菌ddah氨基酸序列铜绿假单胞菌。ddah多肽可以分离自人组织或人体液来源。
[0194]
ddah多肽可以通过ddah多肽和基质之间的共价键与基质缔合。ddah多肽可以通过ddah多肽和基质之间的非共价键固定在基质中。在一种实施方式中，ddah多肽具有式i的结构：ddah-b1-l-b2-m[式i]；其中，ddah是ddah多肽的全长或生物活性片段；b1是共价键或非共价键；l是接头，或不存在；b2是共价键、非共价键或不存在；以及m是基质。在一种实施方式中，ddah多肽通过物理截留在基质内而与基质结合。在一种实施方式中，ddah多肽包括seqidno:1或seqidno:2中所示的氨基酸序列，或其生物活性片段，其中，所述ddah多肽与固体担载体结合。固体担载体可以是板、珠粒或纤维或膜。在一种实施方式中，固体担载体是由以下项组成的基质：树脂、聚合物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺、其共聚物和接枝物、安伯赖特、玻璃、二氧化硅、硅、可控孔玻璃(cpg)、反相二氧化硅、金属、颗粒、珠粒、戊二醛交联壳聚糖粘土珠粒、壳聚糖珠粒、藻酸盐珠粒、聚(hema-egdma)珠粒、链、沉淀物、凝胶、溶胶-凝胶、片材、管材、球体、容器、毛细管、垫、切片、膜、板、油标尺、载玻片、磁珠粒或颗粒、磁乳胶珠粒、氧化铁颗粒、玻璃、陶瓷、塑料、聚合物、金属、类金属、合金、复合材料、有机物、纤维素、石英、碳、氧化铝、二氧化钛、氧化钽、锗、氮化硅、沸石、砷化镓、金、铂、铝、铜、钛、金属合金、聚(四)-氟乙烯(ptfe)、聚偏二氟乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基乙烯(polyvinylethylene)、聚乙烯亚胺、聚(醚醚)酮(poly(etherether)ketone)、聚甲醛(pom)、聚乙烯基苯酚、聚丙交酯、聚甲基丙烯酰亚胺(pmi)、polyatkenesulfone(pas)、聚丙烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸羟乙酯(hema)、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚酰亚胺和嵌段共聚物。基质可以选自由以下项组成的组：水凝胶、
plla、聚氨酯、含氟聚合物、聚砜(ps)、聚碳酸酯、聚醚砜(pes)、聚丙烯腈(pan)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、三乙酸纤维素聚醚醚酮(peek)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚丙烯、海藻盐、聚乳酸(pla)和plga。基质的表面可以通过等离子蚀刻修饰。
[0195]
本公开的另一种实施方式涉及用于通过使ddah多肽的至少一个氨基酸的第一反应基团与连接至基质的第二反应基团反应，将具有seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列的至少一种ddah多肽或其生物活性片段连接至基质的方法，从而形成键并将ddah多肽连接至基质。第一反应基团可以是氨基基团、羧基基团或ddah多肽的任何氨基酸侧链官能团。ddah多肽和基质之间的键可以是共价键或非共价键。
[0196]
本公开的其他实施方式是制造基质的方法，该基质包括具有seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列的ddah多肽或其生物活性片段，该方法通过：提供包括一个或多个结合部分或反应部分的基质；提供包括一个或多个结合部分或反应部分的ddah多肽或其生物活性片段，并且；使ddah多肽或其生物活性片段与基质接触，从而基质的结合部分或反应部分与ddah多肽或其片段的结合部分或反应部分结合或反应，以提供与ddah多肽或其生物活性片段结合的基质。ddah多肽的氨基酸可以与基质的结合部分或反应部分反应以将ddah多肽与基质结合。ddah多肽的氨基酸可以与接头结合或包括接头，该接头与基质的结合部分或反应部分结合以将ddah多肽与基质结合。ddah多肽的氨基酸可以通过接头与基质的结合部分或反应部分结合，该接头与ddah多肽结合或反应，并且还与基质结合或反应以将ddah多肽与基质结合。
[0197]
本公开的又另一种实施方式是用于通过以下方式将ddah多肽连接至支持基质的方法：提供具有包括第一化学部分的至少一个氨基酸的ddah多肽；提供包括第二化学部分的支持基质，提供接头，其中，该接头包括第三和第四化学部分，并且在条件下组合ddah多肽、接头和支持基质，从而ddah多肽上的第一化学部分连接至接头上的第三化学部分并且支持基质上的第二化学部分连接至接头上的第四化学部分，从而在ddah多肽和支持基质之间形成桥连，并且将ddah多肽连接至支持基质。接头可以在与支持基质反应之前与ddah多肽反应。接头可以在与ddah多肽反应之前与支持基质反应。ddah多肽上的第一化学部分和接头上的第三化学部分之间的连接可以是共价连接或非共价连接。支持基质上的第二化学部分和接头上的第四化学部分之间的连接可以是共价连接或非共价连接。第一和第三化学部分之间的连接可以是非共价的并且包括抗生物素蛋白、链霉亲和素或与生物素偶联的中性抗生物素蛋白。接头可以是聚合物。接头可以选自由以下项组成的组：聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单c1-c10烷氧基或其芳氧基衍生物、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、n-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、右旋糖酐、右旋糖酐衍生物(包括硫酸右旋糖酐)、聚丙二醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-dl-天冬酰胺、血清白蛋白，或其混合物。聚合物表面可以通过等离子体蚀刻修饰，并进行官能化以用于ddah交联。
[0198]
本公开的另一种实施方式是通过以下方式降低流体中adma浓度的方法：在合适的条件下，使包含adma的流体与包括具有seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列的固定的ddah多肽或其生物活性片段的基质接触足以使ddah从adma基质酶促产生瓜氨酸的时
间，从而降低所述流体和组织中adma的浓度。流体可以是生物流体。生物流体可以是血液。生物流体可以是血液级分，或血液衍生的流体。该方法可以进一步包括向所述流体添加l-精氨酸和/或瓜氨酸的步骤。
[0199]
本公开的另一种实施方式是用于通过以下方式降低流体中adma浓度并增加瓜氨酸浓度的方法：在合适的条件下，使包括adma的流体与包括固定的ddah多肽或其生物活性片段的基质接触并且持续足以使ddah从adma基质酶促产生瓜氨酸的时间，从而降低所述流体中adma的浓度并增加瓜氨酸的浓度。流体可以是生物流体。生物流体可以是血液。生物流体可以是血液级分，或血液衍生的流体，或血液衍生的流体。该方法可以进一步包括向所述流体添加l-精氨酸或瓜氨酸的步骤。本公开的另一种实施方式是用于通过以下方式降低血液或血液级分或血液衍生的流体中adma浓度的方法：在合适的条件下，使包括adma的所述血液或血液级分与包括具有seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列的固定的ddah多肽或其生物活性片段的基质接触并持续足以使ddah水解所述adma的时间，从而降低所述血液或血液级分中adma的浓度。
[0200]
本公开的其他实施方式是用于通过以下方式降低血液或血液级分或血液衍生的流体中adma浓度的方法：在合适的条件下，使包括adma的血液或血液级分与包括具有seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列的固定的ddah多肽或其生物活性片段的基质接触并持续足以使ddah从adma基质酶促产生瓜氨酸的时间，从而降低所述流体中adma的浓度。本公开的甚至另一种实施方式是用于通过以下方式降低血液或血液级分或血液衍生的流体中adma浓度并增加瓜氨酸浓度的方法：在合适的条件下，使包括adma的所述血液或血液级分与包括具有seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列的固定的ddah多肽或其生物活性片段的基质接触并持续足以使ddah从adma酶促产生瓜氨酸的时间，从而降低所述流体中adma的浓度并增加瓜氨酸的浓度。
[0201]
本公开的额外的实施方式是用于通过以下方式降低血液或血液级分或血液衍生的流体中adma浓度、增加瓜氨酸浓度并增加l-精氨酸浓度的方法：在合适的条件下，使包括adma的血液或血液级分与包括具有seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列的固定的ddah多肽或其生物活性片段的基质接触并持续足以使ddah从adma基质酶促产生瓜氨酸的时间，从而降低所述流体中adma的浓度并增加瓜氨酸的浓度，并且进一步包括将l-精氨酸添加到所述血液或血液级分中。该方法可以使用来自患有与高adma浓度相关的疾病或病症的患者的血液或血液级分或血液衍生的流体体外进行。血液或血液级分可以返回至所述患者。血液或血液级分可以来自血液透析患者。血液或血液级分可以来自肾病患者、心脏病患者、失代偿性心力衰竭患者、利尿剂抵抗心力衰竭患者、手术期间使用造影的患者、脓毒症患者、肝衰竭患者、疟疾患者、镰状细胞患者、外伤患者、以及地中海热患者、先兆子痫患者、红细胞生成素抵抗患者、心脏或非心脏手术患者、输血患者。血液或血液级分可以来自心脏病患者。
[0202]
本公开的实施方式是反应容器，该反应容器包括与基质结合的ddah多肽或其生物活性片段，其中，所述基质在所述容器内部，其中，所述容器包括至少一个开口或端口以添加和/或去除流体，从而允许流体进入接触与基质结合的ddah多肽。基质可以是固体担载体。固体担载体可以是板、珠粒、磁珠、膜或纤维。固体担载体可以是形成小袋的柔性片材。固体担载体可以包括选自由以下项组成的组的一种或多种材料：树脂、聚合物、聚苯乙烯、
聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺、其共聚物和接枝物、玻璃、二氧化硅、硅、可控孔玻璃(cpg)、反相二氧化硅、金属、颗粒、珠粒、链、沉淀物、凝胶、溶胶-凝胶、片材、管材、球体、容器、毛细管、垫、切片、膜、板、油标尺、载玻片、磁珠粒或颗粒、磁乳胶珠粒、氧化铁颗粒、玻璃、陶瓷、塑料、聚合物、金属、类金属、合金、复合材料、有机物、石英、碳、氧化铝、二氧化钛、氧化钽、锗、氮化硅、沸石、砷化镓、金、铂、铝、铜、钛、金属合金、聚(四)氟乙烯(ptfe)、聚偏二氟乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基乙烯、聚乙烯亚胺、聚醚醚酮、聚甲醛(pom)、聚乙烯苯酚、聚丙交酯、聚甲基丙烯酰亚胺(pmi)、聚烯烃砜(pas)、聚丙烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸羟乙酯(hema)、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚酰亚胺和嵌段共聚物。plla、聚氨酯、氟聚合物、聚砜(ps)、聚碳酸酯、聚醚砜(pes)、聚丙烯腈(pan)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、三乙酸纤维素、聚醚醚酮(peek)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚丙烯、海藻盐、聚乳酸(pla)、plga。ddah多肽或其生物活性片段可以与基质结合，其中，ddah多肽或其生物活性片段与包含adma的流体混合。流体可以是生物流体。生物流体可以是血液，生物流体可以是血液级分或血液衍生的流体。ddah多肽或其生物活性片段可以与包括adma的流体混合，其中，所述反应混合物在反应容器内。
[0203]
应当理解，本文所述并以通过援引并入的方法和组合物不限于本文所述的特定方法、方案、装置、程序、细胞系、构建体和试剂，因此可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本文所述的装置、基质、接头、化学、生产、纯化、缀合、方法和组合物的范围，其将仅受所附权利要求的限制。
[0204]
实施例1
[0205]
人ddah的重组表达和纯化
[0206]
用于克隆ddah的方法，如ddah的多肽和多核苷酸序列以及将ddah克隆到宿主细胞中，是本领域普通技术人员已知的。编码人ddah 1和ddah 2的cdna如seq id no:3和seq id no:4所示出，以及人ddah 1和ddah 2多肽氨基酸序列如seq id no:1和seq id no:2所示出。ddah多肽的非人氨基酸序列如seq id no:6；7；9；10；11；12；13；和14所示出。用包含ddah或修饰的ddah或ddah类似物核苷酸序列的质粒转化大肠杆菌实现ddah多肽的生物合成。
[0207]
野生型成熟ddah使用标准方案通过pcr从cdna合成反应扩增，并克隆到pet30(ncoi-bamhi)中。在序列确认之前或可选地之后，在源自大肠杆菌或其他合适来源的合成启动子的组成型或诱导型控制下，将编码ddah的核酸序列亚克隆到表达载体中。ddah的表达受t7启动子的控制。使用标准快速变化突变方案(stratagene；la jolla，california)引入任何期望的突变。构建体经序列验证。
[0208]
将表达质粒(例如pet和pbad)用于转化至大肠杆菌菌株w3110b57以产生在其中在阿拉伯糖诱导型启动子控制下表达t7聚合酶的大肠杆菌菌株。过夜细菌培养物以1:100稀释到包含2
×
yt培养基的摇瓶中，并在37℃下生长至od
600
为～0.8。通过添加阿拉伯糖(最终0.2％)诱导蛋白表达。将培养物在37℃下孵育5小时或过夜。将细胞沉淀并重悬于b-per裂解缓冲剂(pierce)100ul/od/ml 10ug/ml dnase中，并在37℃下孵育30min。通过离心去除细胞材料并去除上清液。将沉淀物重悬于等量的sds-page蛋白负载缓冲剂中。所有样品均负载至具有mes和dtt的4-12％page凝胶上。ddah的纯化方法是本领域普通技术人员已知的并且通过sds-page、蛋白质印迹分析或电喷雾-电离离子阱质谱等确认。
[0209]
可以使用本领域普通技术人员已知的方法纯化带有his标签的突变ddah蛋白。probond镍螯合树脂(life technologies,carlsbad,ca)可以经由生产商提供的标准his标签蛋白纯化程序使用。蛋白的功能测量可以通过本领域已知的方法、本技术中提供的方法和并入的参考文献进行，并且替代地可以开发基于活细胞的elisa来评估本公开的ddah多肽。
[0210]
实施例2
[0211]
大肠杆菌表达ddah多肽。
[0212]
将大肠杆菌菌株w3110用于产生野生型或修饰的ddah。将单个研究细胞库(rcb)小瓶从-80℃中取出并在室温下解冻，然后将50μl用于接种在250ml带挡板锥形瓶中的补充有50μg/ml硫酸卡那霉素的50ml种子培养基(化学成分确定的培养基)。初级种子培养物在37℃和250rpm(1英寸抛物距(throw))下生长大约18小时。将初级种子培养物传代培养成次级种子培养物，在包含补充有50μg/ml硫酸卡那霉素的100ml种子培养基的500ml带挡板锥形瓶中，在600nm波长(od600)下测量的光密度为0.05。次级种子培养物在37℃和250rpm(1英寸抛物距)下生长大约8小时或od600达到2至4之间时。
[0213]
sartorius biostat b 5-l容器填充有补充有50μg/l硫酸卡那霉素的2.1-l生产培养基(化学成分确定的培养基)。将次级种子培养物用于接种到发酵罐至初始od600为0.035。培养物在37℃下生长，并且将溶解氧设置为保持30％(空气饱和度)，主要搅拌(480
–
1200rpm)级联和次级o2级联。在整个发酵中，保持空气流速为5lpm，背压为6psi。将培养物的ph值设定为7.2
±
0.05，添加15％氢氧化铵并根据需要添加dow chemical p2000消泡剂以控制泡沫。当培养物达到od600为35
±
5之间时(当分批培养基中的初始甘油几乎耗竭时)，开始提供200ml的推注进料，并且同时将ph设定点从7.2调整至6.6。在初始推注进料后，以0.25ml/l/min的速率开始连续进料并持续至收获。ddah蛋白的表达通过添加l-阿拉伯糖至2g/l(最终培养体积)的浓度来诱导。在添加阿拉伯糖并收获后，培养物生长6小时或更长时间并且收获。
[0214]
实施例3
[0215]
ddah活性通过修改本领域公开的方法(markus knipp和milan vas
ˇa′
k analytical biochemistry 286,257
–
264(2000))来确定。通过在0.1m磷酸钠缓冲剂ph 6.2中均质化生成的细胞提取物和纯化制剂中的酶活性将通过从adma生成的l-瓜氨酸来确定。将100μl的样品转移到试管中，并添加400μl的在磷酸钠缓冲剂中的1mm adma，并在37℃下孵育45min。通过添加500μl的4％磺基水杨酸终止反应。将混合物以3000g离心10分钟。将60μl的上清液转移至nunc 96孔板中，一式三份。将添加200μl的colder(显色试剂)。colder通过混合1体积的溶液a[80mm damo(二乙酰一肟)和2.0mm tsc(氨基硫脲)]以及3体积的溶液b[3m h3po4、6m h2so4和2mm nh4fe(so4)2]制备。将板密封并在95℃下加热20分钟。冷却后，它们将以530nm读取。ddah活性将表示为在37℃下每克蛋白每分钟产生的μm瓜氨酸。
[0216]
使用上述测定，ddah和修饰的ddah酶活性将以浓度反应、底物浓度反应、时间和km为特征。酶稳定性将在不同的温度和储存条件下确定。ddah多肽可以包括影响或调节酶的一种或多种生物学特性的氨基酸修饰，包括但不限于，更高或更低的酶活性，多肽在结合至基质之前或之后的稳定性增加或降低，以及酶的改进的时间作用特性。具有与其结合的ddah多肽或修饰的ddah多肽的本公开的基质可以表现出例如减少的酶活性，但比未修饰的
或游离的未结合的ddah多肽具有更高的稳定性或时间作用特性。可以确定和调整ddah多肽与基质结合后期望的酶活性水平，例如，通过利用不同的方法将ddah结合至基质，或通过使用具有期望活性和/或稳定性的修饰的ddah多肽。在许多实例中，可以预期ddah酶活性在化学结合至基质后将降低。这种活性损失可以通过使用例如针对特定化学结合过程设计的修饰的ddah多肽来减轻。
[0217]
将酶联免疫吸附测定测量血清中ddah浓度，而动物血清中重组人ddah、peg化重组人ddah或酰化重组人ddah的浓度则通过在meso scale discovery(msd)平台上的电化学发光(ecl)方法测量。测定由五个孵育步骤组成：(1)过夜捕获抗体涂层，(2)封闭2小时，(3)过夜样品孵育，(4)生物素化检测抗体孵育1小时，和(5)sulfo-tag标记的链霉亲和素孵育1小时。在每个孵育步骤之间进行使用包含0.05％吐温20的pbs的洗涤步骤。在第一天，msd高结合板(msd，gaithersburg，md)在4℃下用大鼠抗人ddah mab涂覆过夜。在第二天，用i-block缓冲剂(0.2％i-block/pbs/0.1％吐温-20)在22℃下封闭涂覆有捕获抗体的板2小时。将测试样品在室温下解冻，充分混合并在0.2％i-block/pbs/0.1％吐温-20/5％正常cd-1小鼠血清缓冲剂中以5％最低要求的稀释度进行分析，如有需要在纯血清中进行额外的稀释。使用与研究中使用的相同批次的wt ddah制备质控品(qc)和校准品。制备的样品、qc和校准品在4℃下孵育过夜，以使分析物结合在板上。在第三天，使用生物素化的兔抗人ddah多克隆抗体检测捕获的wt ddah，随后使用sulfo-tag标记的链霉亲和素(货号r32ad-1，批号w0013923s，msd，gaithersburg，md)。添加msd读取缓冲剂(msd,gaithersburg,md)后，用msd sector imager 2400(msd,gaithersburg,md)测量发光强度。标准曲线和qc使用准确度和精密度≤20％的可接受标准进行评价。
[0218]
使用softmax pro 5.4.1软件(molecular devices,sunnyvale,ca)，使用源自校准品的4参数逻辑(4-pl)拟合回归模型对测试样品进行定量。在纯动物血清中，示例性标准曲线范围为3.15至112ng/ml。
[0219]
实施例4
[0220]
目前，没有可用于预防或治疗先兆子痫的药物疗法。疗法的发展将对母体和胎儿的死亡率和发病率具有重大影响。先兆子痫的常见潜在病理学包括血管功能障碍、异常血管重塑、胎盘灌注不足和缺血(8-10)。众所周知，一氧化氮(no)在先兆子痫的血管发病机制中起重要作用(11-14)。no是母体和胎儿血管健康、胎盘血流、血管生成、滋养层侵袭和植入的关键分子。no的损害引起血管收缩、血小板聚集、血管炎症和线粒体功能障碍，从而导致肾功能障碍、蛋白尿和心血管疾病。先兆子痫患者中no生物利用度降低。与在患者中观察的一致，动物模型中抑制no合成导致具有母体血压升高、蛋白尿和肾功能受损的先兆子痫表型。更重要的是，几项临床前研究已经示出，用pde5抑制剂西地那非(sildenafil)或他达拉非(tadalafil)治疗以增加no信号传导可改进先兆子痫的胎儿生长以及母体血压和肾功能。
[0221]
西地那非和他达拉非的初步临床研究产生了有前景的结果。不幸的是，对西地那非的进一步研究已经导致了重大的安全性问题。在最近的试验中，婴儿死亡率显著升高，并且妊娠期西地那非的研究被终止。因此，尽管临床前和临床研究通过改进no生物利用度产生疗法验证，但药物疗法的安全性风险一直是根本障碍。因此，迫切需要开发创新方法来安全地改进先兆子痫患者的no生物利用度。
[0222]
根据一种实施方式，提供了治疗方法，其中，减少了内源性no合成抑制剂，不对称二甲基精氨酸(adma)的浓度。adma是已知的心脏毒素。异常高水平的adma在先兆子痫患者的血液中循环。对1338名孕妇的11项研究的荟萃分析示出，早在妊娠20周，与随后未发展为先兆子痫的女性相比，随后发展为先兆子痫的女性的循环adma水平显著更高(20)。内皮功能障碍和adma升高是先兆子痫的早期病理生理特征。先兆子痫发作前adma的增加表明其在先兆子痫发病机制中的潜在作用(21)。这些数据还表明，adma水平可能是早期识别处于先兆子痫风险的孕妇的标志物。先兆子痫发作前的内皮功能障碍和adma升高被认为是导致先兆子痫并发症的潜在病理机制。
[0223]
根据一种实施方式，通过使用体外装置来减少adma。通过包含ddah或衍生物的珠粒新型基质去除adma。将包含ddah的珠粒的筒制成装置。血液或血浆流经该筒将导致选择性去除adma，而不使患者暴露于药物材料，并且从而提供高度安全的疗法。
[0224]
我们已经开发了包含ddah的专有基质，被指定为治疗性体外医疗装置，已经制造了使用固定的ddah的原型体外筒，并已经完成了减少adma的可行性研究。此外，我们已经进行了概念验证研究，以证明在动物模型中减少adma可降低高血压大鼠中的血压并改进急性肾损伤模型中的肾功能。
[0225]
肾功能障碍是先兆子痫的另一个关键临床表现。因此，我们在急性肾损伤大鼠模型中测试了adma减少的作用。大鼠中肾损伤通过双侧肾动脉结扎缺血40min并且然后再灌注产生。这些研究示出，adma减少导致改进的肾功能。
[0226]
制造了包含adma去除基质的治疗性体外医疗装置(temd)原型装置。使用各种装置尺寸和流速研究在体外从人、猪和大鼠血浆中去除adma。表8中呈现了研究的实验数据的实例。将包含adma的溶液或血浆应用于temd装置。确定起始材料和来自筒的洗脱剂中的adma水平。数据示出，当血浆循环通过temd装置时，adma被有效去除。如预期，adma的去除取决于adma和temd之间相互作用的持续时间。因此，使用包含1ml temd的装置以0.16ml/min的流速去除存在于血浆中100％的20ug adma。增加流速至0.5ml/min导致去除10ug adma或施加于筒中的50％的adma。因此，adma的减少可以通过筒的尺寸和流速来控制。
[0227]
表8：
[0228]
使用原型temd减少adma
[0229][0230]
我们使用来自小型原型的数据来评估猪或人所需的放大倍数。例如，基于人中平均总血浆体积为3000ml和2um(404ug/1)adma，我们预期总目标减少606ug adma以实现50％降低。假设上述流速，将需要预期60倍的放大。这些近似值将基于血浆置换系统的流速要求进行优化。装置尺寸和流速的迭代将用于实现猪研究的最佳装置尺寸。这些可行性研究验证将成为放大的基础，并将改进装置参数以实现减少adma的目标。基于使用1ml装置adma减
少的减低，预期猪研究的放大为40-60倍。
[0231]
ossabaw猪代谢综合征模型将用于temd装置的改进和优化。当接受高脂肪饮食时，该模型已经很好地表征了代谢综合征、糖尿病、高血压和心血管疾病的发展。我们已经示出，这种猪模型中的adma代谢活性显著降低。
[0232]
实施例5
[0233]
adma降低将改进no的生物利用度并减轻先兆子痫的并发症。为了开发概念验证和原型医疗装置，我们在大肠杆菌中克隆并表达了adma代谢酶二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(rddah)。rddah降低了血液中的adma并降低高血压大鼠中的血压。将rddah固定在珠粒基质上并整合到筒中。固定的ddah在降低血浆中的adma方面完全有效。构建了原型体外装置，该装置由用于从血液分离血浆的中空纤维膜和ddah筒组成。