用于细胞冷冻保存的无血清细胞冷冻保存液及其冷冻保存方法与流程

1.本发明有关一种无血清细胞冷冻保存液及其冷冻保存方法，尤其是用于包含细胞因子诱导的杀伤细胞等免疫细胞的冷冻保存。


背景技术：

2.相较于普遍使用的干细胞疗法，免疫细胞治疗为较新颖的细胞治疗技术。现行所使用的细胞冷冻保存液大多沿用干细胞保存液，专利项目亦多以干细胞或肿瘤细胞为主。然现今主流细胞冷冻保存液鲜有主张能够保存经细胞因子诱导的杀伤性免疫细胞，对于免疫细胞解冻后的功能性亦无相关验证信息。
3.免疫细胞相较于干细胞对于冷冻保存更为敏感，且冷冻过程对细胞会造成显著功能性损伤及细胞凋亡(j immunol methods.1989；125(1-2):185-9；j immunol.1997；45(6):618-22.；j immunolmethods.2007；326(1-2):93-115；faseb j.2002；16(12):1651-3.)。目前市售的细胞冷冻保存液大多适用于干细胞的保存，鲜有适用于免疫细胞，且宣称的功效仅限于细胞存活率，对于细胞功能的保存付之阙如。
4.因应未来免疫细胞制剂工业化生产制造、扩大业务范围、并确保产品有效性，冷冻保存技术不应只局限于细胞存活，亦须确保其细胞功能性得以保存。
5.此外，目前市售的细胞冷冻保存液，其细胞浓度的使用范围大多仅为0.5～10
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106/ml，在细胞制剂的工业化生产上，仍有进一步改进的空间。


技术实现要素：

6.于是，本发明提供一种无血清细胞冷冻保存液，其冻存的细胞浓度可达1
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108/ml，细胞经解冻后，相较于冻存前可保持90％细胞存活率，适用于一般性渐冻盒及程序降温仪。
7.本发明的成分由下列成分组成的混合物：(1)混合式基础培养基、(2)二甲基亚砜、(3)血清取代物、(4)右旋糖酐。
8.于本发明的一些具体实施例中，其中该混合式基础培养基选自于罗斯威尔帕克纪念研究所培养基、干细胞生长培养基及aim-v培养基或其组合。
9.于本发明的一些具体实施例中，其中二甲基亚砜的浓度介于2.5～10％(v/v)之间。
10.于本发明的一些具体实施例中，其中该血清取代物为血小板裂解液。
11.于本发明的一些具体实施例中，其中该右旋糖酐(dextran)的浓度介于2.5～10％(v/v)之间。
12.于本发明的一些具体实施例中，其中该右旋糖酐(dextran)的分子量介于40～78.5kda之间。
13.本发明于另一方面，提供一种细胞冷冻保存方法，包含：将一细胞以上述的细胞冷
冻保存液配制一细胞悬浮液；降温至-80℃；及置于液态氮中保存。
14.于本发明的一些具体实施例中，其中该细胞为一免疫细胞。
15.于本发明的一些具体实施例中，其中该免疫细胞为自然杀手细胞。
16.于本发明的一些具体实施例中，其中该细胞为cd56

细胞。
17.于本发明的一些具体实施例中，其中该细胞为cd56

cd16

细胞。
18.于本发明的一些具体实施例中，其中该细胞为cd56

cd16

cd314

cd107a

细胞。
19.于本发明的一些具体实施例中，其中该细胞悬浮液的细胞浓度系介于1
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106～1
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108/ml。
20.本发明具有以下有益效果：
21.本发明的无血清细胞冷冻保存液，其冻存的细胞浓度可达1
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108/ml，细胞经解冻后，相较于冻存前可保持90％细胞存活率，适用于一般性渐冻盒及程序降温仪。
附图说明
22.图1揭示了使用两种不同冷冻保存液配方在解冻后相较于解冻前的细胞存活率。
23.图2揭示了使用两种不同冷冻保存液配方在解冻后相较于解冻前的cd56细胞族群比例。
24.图3揭示了使用两种冷冻保存液配方在解冻后相较于解冻前的具cd107a细胞毒杀标志比例。
25.图4揭示了使用两种不同冷冻保存液配方在解冻后相较于解冻前的具cd314细胞活化标志比例。
26.图5揭示了使用两种不同冷冻保存液配方在解冻后相较于解冻前的具cd16抗体受体标志比例。
27.图6揭示了使用两种不同冷冻保存液配方在解冻后相较于解冻前的细胞毒杀能力。
具体实施方式
28.用于本说明书，术语“冷冻保存液”(cryoprotective agent,cpa)意指用于保护生物细胞免于因冷冻冰晶造成伤害的液态保存成分。
29.用于本说明书，术语“自然杀手细胞”(nature killer cell；nk cell)意指一种隶属于先天免疫系统(innate immune system)的毒杀性淋巴球(cytotoxic lymphocyte)，可被诱发以执行非专一性细胞毒杀效应。
30.用于本说明书，术语“不含血清”意指不需额外添加周边血检体来源的自体血浆或血清，或其他动物来源的血清。
31.熟谙本领域的技术人员当参考详细说明与附图时将更了解本发明许多其他优点与特色，其中包括本发明原则的较佳结构具体实施例仅为实例说明。
32.实施例一 冷冻保存液制备
33.于无菌作业环境下，取用包含罗斯威尔帕克纪念研究所培养基、干细胞生长培养基或aim-v培養基其中任两种以30～70wt％不等比例混合制备混合培养基。
34.于无菌作业环境下，以混合培养基为基底配置包含旋糖酐(dextran)的高分子聚
合物。其中右旋糖酐(dextran)分子量为40～78.5kda，配制置储备溶液浓度为20％(v/v)。将不同比例的储备浓度加入冷冻保存液，最终浓度介于5～10％(v/v)之间。
35.于无菌作业环境下，取用二甲基亚砜加入冷冻保存液，其最终浓度范围介于2.5～10％(v/v)之间。
36.于无菌作业环境下，取用血小板裂解液加入冷冻保存液，其最终浓度范围介于1～10％(v/v)之间。
37.将配置完成的冷冻保存液预冷至4℃。
38.于一些较佳的实施例中，冷冻保存液成分为体积百分比7.5％的dmso、5％的血小板裂解液、5％的dextran 40及rpmi/scgm混合式培养液(冷冻保存液#1)；7.5％的dmso、5％的血小板裂解液、10％的dextran 40及rpmi/scgm混合式培养液(冷冻保存液#2)。
39.实施例二 细胞降温冷冻
40.欲冻存的细胞经过细胞清洗后，以1
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106～1
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108/ml细胞浓度将其以冷冻保存液悬浮细胞，并分装于冷冻小管中。
41.已盛装细胞悬浮液的冷冻小管置入市售的细胞渐冻盒(coolcell lx,corning)，并将渐冻盒置入-80℃超低温冷冻柜降温8～16小时。隔日将已降温的冷冻小管移入液态氮桶保存。
42.除使用细胞渐冻盒，亦可改采微电脑程序降温仪(icecube 14s,sy-lab)进行全程温控降温。降温完成后可直接移入液态氮桶保存。
43.实施例三 细胞解冻
44.将冷冻小管移出液态氮桶，移置过程中全程置于预冷的合金金属导热管架(coolrack cf15,corning)。在37℃水浴槽中将细胞完全解冻后，得进行后续实验或培养步骤。
45.实施例四 细胞存活率测试
46.取样培养细胞体积百分之一，将适量细胞混合trypan blue染剂染色，已染色的悬浮细胞液置入细胞计数盘。在倒立式显微镜下辨识存活(无染色)及死亡(被染色)细胞或以自动细胞计数仪。存活率计算公式为：存活细胞/(存活细胞 死亡细胞)。结果如图1所示。
47.实施例五 细胞族群分析
48.取1
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106个细胞数，以dulbecco's磷酸盐缓冲液(dpbs)洗涤后悬浮于200μl dpbs溶液，依照原厂建议使用量加cd56抗体在避光环境下置于冰上染色30分钟。最后以流式细胞仪分析目标细胞所占百分比。族群分析计算公式为：解冻后cd56阳性细胞百分比/解冻前cd56阳性细胞百分比。结果如图2所示。
49.实施例六 细胞活化标志分析
50.取1
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106个细胞数，以dpbs洗涤后悬浮于200μl dpbs溶液，依照原厂建议使用量加入cd314(自然杀手细胞活化标志)、cd107a(毒杀能力标志)及cd16(抗体受体标志)抗体在避光环境下置于冰上染色30分钟。最后以流式细胞仪分析目标细胞所占百分比。族群分析计算公式为：解冻后cd314阳性、cd107a阳性或cd16阳性细胞百分比/解冻前cd314阳性、cd107a阳性或cd16阳性细胞百分比。结果如图3-图5所示。
51.实施例七 细胞毒杀能力分析
52.取1
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106个细胞数的k562细胞作为自然杀手细胞毒杀标的，并使用羧基荧光素琥
珀酰亚胺酯(carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester,cfse)荧光染记标记目标癌细胞，再加入5
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106个细胞数的解冻细胞制剂，放入细胞培养箱后共培养4小时。细胞取出以dpbs洗涤后使用7-氨基放线菌素(7-aminoactinomycin d,7-aad)细胞染剂侦测凋亡细胞，搭配流式细胞仪分析目标细胞(cfse

的凋亡细胞数(7-aad

)作为细胞制剂毒杀率。细胞毒杀率计算为：目标细胞凋亡数(cfse

,7-aad

)/目标细胞总数(cfse

)。结果如图6所示。
53.本发明提供的一种无血清细胞冷冻保存液，其冻存的细胞浓度可达1
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108/ml，高于市售的细胞冻存液，且相较于冻存前可保持90％的细胞存活率。另一方面，本发明也提供一种用于细胞因子诱导的杀伤细胞的无血清免疫细胞的冷冻保存方法，细胞经解冻后，细胞族群百分比(cd56)解冻后不改变，细胞活化标志(cd314、cd16、cd107a)解冻后可保持80％以上，毒杀效率可保持80％。