一种植物在体体细胞杂交的方法与流程

1.本发明属于植物改良领域。具体涉及一种植物在体体细胞杂交的方法。


背景技术：

2.虽然早在1972年，植物离体体细胞杂交就已成功，然而由于体细胞杂交在室内进行，受体数量受到极大限制，更重要的是，由于离开了母体，导致杂交阳性率太低，供后代选择优良个体的群体太小，育成优良品种的概率太低，因而至今鲜有大面积应用于生产的体细胞杂交育成品种。而在体体细胞杂交则可弥补上述居多不足之处。然而在本发明前，未见有关在体体细胞杂交成功的报道。因而目前有性杂交仍然是最常用的植物改良方法。
3.然而，由于有性杂交不仅要求父母本均为有母本是显花植物，而且需要父本的精子。这就不仅使数量及其巨大的微生物不能用于授精，而由于精子获取要么十分困难，要么价格昂贵，大量以动物为父本的杂交受到极大限制，而微生物和动物具有植物所没有又亟需的数量巨大的极其优良的性状。因而，体细胞杂交具有极其重要的植物改良价值。然而，在本发明前，同样未见植物和微生物，植物和动物体细胞杂交成功的报道。
4.在体体细胞杂交之所以难以成功，对于植物来说主要是因为植物性器官和体细胞表面存在生殖隔离物质—识别蛋白，即糖蛋白，它就像一把锁，把供体的遗传物质拒之门外。
5.然而现代科学研究表明，不同生物种类间虽然外形相去甚远，却存在相同基因序列(毛黎，不同植物种类存在相同基因序列，科技日报，2012年4月11日，第1版)。所以，只要父母本染色体相遇，无论亲缘关系远近，均可以配对或部分配对，即使不能配对，还可以加倍染色体。因此，父母本染色体不能同处一隅，是亲缘关系远的物种间杂交不孕的根本原因。而远缘杂交父母本染色体之所以不能同处一隅，是由于植物柱头和花粉/精子存在识别蛋白，即糖蛋白，细胞上存在细胞膜(动物)或同时存在细胞膜和细胞壁(植物)，它们就像一把锁，把远缘花粉/精子拒之门外。所以只要降解受体和供体外层的糖蛋白，就能使远缘供体的遗传物质靠近受体染色体等遗传物质，使亲缘关系远的父母本染色体/遗传物质配对/部分配对/结合，就可获得远缘杂交种子。


技术实现要素：

6.本发明的目的是克服现有技术的不足，采用有效措施突破杂交瓶颈实现在体体细胞杂交方法，彻底打破生殖隔离限制，选育期望的植物品种，甚至人工主导生物进化。
7.因而，本发明提供一种植物在体体细胞杂交的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：
8.(1)将父本供体与体细胞杂交剂混合，获得授精液；其中，选择具有期望获得的品种的性状的生物的个体、器官、组织、体细胞团、细胞、染色体或染色体片段、dna或dna片段和基因作为父本供体；其中，所述体细胞杂交剂的组成为：50-300mg/l果胶酶、100-700mg/l纤维素酶、100-300mg/l赤霉素、10-100mg/l生长素、1500-5000μl/l酶解液和1500-5000mg/
l复合氨基酸；
9.(2)将授精液给受体授精；其中，选择期望获得的植物类型的优良品种的雌性器官或繁殖单位的体细胞团作为母本受体，授精前处理，并去除生殖隔离；
10.(3)授精后获得的受精卵，优选地对受精卵进行胚挽救并培养成苗；
11.进一步地，还包括下述步骤：
12.(4)对所获得的苗进行染色体加倍，随后移植至土壤，鉴别并去除假杂种，获得杂交种植株。
13.在优选实施方式中，第(1)步中所述父本供体生物的个体、器官、组织、体细胞团、细胞,其通过打浆获得授精浆液，再与体细胞杂交剂混合；所述父本供体为生物的染色体或染色体片段、dna或dna片段，其直接与体细胞杂交剂混合。
14.在优选实施方式中，第(2)步中所述对母本受体进行授精前处理，是在精子成熟前去除雌雄同体植物的雄性器官、或者基本无性繁殖单位生长点外部的覆盖层；更具体地，对大型孢子植物，在精子成熟前去雄，授精前剪去子房等雌性器官外层覆盖物，如花萼、花瓣等，并短截柱头、子房壁、珠被、果皮、种皮等子房内层覆盖物，使子房裸露；对于受体为雌雄异株种子植物和可杂交繁殖的大型孢子植物雌株，授精前剪去子房等雌性器官外层覆盖物，如花萼、花瓣等，并短截柱头、子房壁、珠被、果皮、种皮等子房内层覆盖物，使子房裸露；对于受体为无性繁殖植物和大型孢子繁殖孢子植物以及有必要进行体细胞杂交的种子植物的植株、器官、组织和细胞团等繁殖单位，选择生长最旺盛处作为受精部位，如生长点等，去除其外部的覆盖层，如叶片、叶鞘和皮层等，使之裸露；对于受体为小型孢子植物，如苔藓、微藻、小型真菌和细菌等时，将受体洗净后放入打浆机内转动30秒，造成伤口。
15.在具体实施方式中，所述去生殖隔离的方法为，授精前向受体受精部位滴入1至数滴酶解液，使之湿透；所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解。
16.在优选实施方式中，所述体细胞杂交剂的成分为：100-200mg/l果胶酶、300-500mg/l纤维素酶、150-250mg/l赤霉素、40-70mg/l生长素、2500-4000μl/l酶解液和2500-4000mg/l复合氨基酸；优选地，所述酶解液为动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。
17.在优选实施方式中，所述第(2)步用父本供体给受体授精的方法为：当受体为雌性器官或繁殖单位的体细胞团时，按植物品种间有性杂交方法进行；优选地，先往子房或经授精前处理的无性繁殖受体受精部位滴1至数滴浓度为1500-5000μl/l的酶解液，使之湿透，然后用涂上准备好的授精液，最后套袋隔离，进一步优选，如此连续授精6-12天，每天1次，直至成功受精；所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。其中所述酶解液用于降解识别蛋白—糖蛋白，因而使在体体细胞杂交成为可能。
18.在优选实施方式中，所述第(3)步授精后获得的受精卵进行胚挽救并培养成苗，具体是用ms培养基对受精卵进行胚挽救。
19.在优选实施方式中，所述第(4)步中对所获得的苗进行染色体加倍是采用秋水仙碱进行的。
20.在优选实施方式中，所述第(4)步中所述鉴别假杂种的方法选自以下三种中的一种或多种:
21.1)通过形态鉴别去除与母本接近的假杂种；2)通过成分鉴别去除与母本接近的个体；3)通过遗传鉴别去除与母本接近的个体。
22.在一个具体实施实施方式中，进一步包括:(5)采用广泛靶向代谢组技术检测所述品种个体代谢物的方法辅助提纯复壮，其中繁殖所述品种的方法为，在田间初选和室内复选具有所述品种典型性状个体的基础上，用广泛靶向代谢组技术检测决选杂交母本没有而父本有的特有代谢物的个体用于繁殖所述品种。
23.本发明还提及提供一种用于植物在体体细胞杂交的体细胞杂交剂，其特征在于，其组成为50-300mg/l果胶酶、100-700mg/l纤维素酶、100-300mg/l赤霉素、10-100mg/l生长素、1500-5000μl/l酶解液和1500-5000mg/l复合氨基酸，优选地，其成分为：100-200mg/l果胶酶、300-500mg/l纤维素酶、150-250mg/l赤霉素、40-70mg/l生长素、2500-4000μl/l酶解液和2500-4000mg/l复合氨基酸。
24.本发明突破远缘杂交瓶颈，能够培育高产优质品种，具有广泛的应用前景。
附图说明
25.图1牡蛎玉米体细胞杂交种(左)及其母本4131(右)
26.图2部分图牡蛎基因在牡蛎玉米中的表达量分布图
27.注：x轴表示样品名称，y轴表示基因数目，颜色深浅表示不同表达量水平：fpkm《＝1的为极低表达水平的基因，fpkm在1-10之间的为较低表达水平的基因，fpkm》＝10的为中高表达水平的基因fpkm值，fpkm值即每一百万条序列中，每个基因以一千个碱基为单位，比对上的reads个数。
28.图3桦树茸水稻3205-2各成分含量占比。
29.图4桦树茸水稻3205-1田间表现。
30.图5巨型玉米稻(后)和母本f14(前)。
31.图6巨型玉米稻(左)和母本f14(右)的籽粒比较
32.图7巨型玉米稻茎基来自玉米的气生根。
具体实施方式
33.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
34.实施例一：在体半体细胞杂交1育成品种—牡蛎玉米的选育
35.供试玉米自交系为4131(选自杂交玉米先玉335分离世代)，供试父本体细胞来自湛江牡蛎，购自湛江海鲜市场。先按所需体细胞杂交剂的体积分别加入200mg/l果胶酶、500mg/l纤维素酶、150mg/l赤霉素、155mg/l生长素、2300μl/l酶解液和2500mg/l复合氨基酸至量杯，加蒸馏水定容并搅匀，冷藏备用(所述复合氨基酸购买自上海哈灵生物科技有限公司的复合氨基酸粉，所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液，本实施例采用的酶解液具体购自上海哈灵生物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒)。
36.每天7时去海鲜市场购买活牡蛎，取出鲜肉，打浆后随即按体积比1：1加入体细胞杂交剂中并搅匀，得到牡蛎体细胞授精液。
37.授精前用剪刀剪去雌穗穗轴上部苞叶，使花丝整齐外露，先往花丝上滴3-6滴浓度为2000μl/l的所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液(本实施例采用的酶解液具体购自上海哈灵生物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒)，使之湿透，然后
用毛刷蘸上牡蛎体细胞授精液，然后以干净透明塑料袋密封，次日重复授精时解开塑料袋，剪掉长出的花丝后涂上授精液并密封，如此重复授精7次。以只涂清水为对照。
38.10d后取回，用ms培养基进行胚挽救并培养成苗，用0.3％的秋水仙碱加倍染色体后以组合为单位隔离移植至选种圃，每穗1行，抽雄期选取纯合优良穗行和单株套袋自交，混收纯合优良穗行，单收优良单株。同时处理和对照各随机抽取10穗并在各穗随机抽取1行计数每穗总小花数和结实粒数，用以下公司计算结实率：
39.杂交结实率(％)＝每行结实粒数/每行总小花数
×
100％
40.当选优良株行和单株用波通da-7250近红外分析仪分析成分，选蛋白质含量较高者。杂交一代当选的混收纯合优良株行杂交二代隔离种植，开花期去杂，成熟期混收，杂交一代当选的优良单株以组合为单位隔离种植，抽雄期选取纯合优良穗行和单株套袋自交，混收纯合优良株行，单收优良单株，如此重复4代，f5代纯合。当选纯合优良株行室内用da7200成分分析仪分析成分，随机取样，重复10次，选蛋白质较高者。
41.由表1看出，牡蛎玉米体细胞杂交结实率介于69％-83.9％之间，平均为73.6％。
42.表1牡蛎与玉米体细胞杂交结实率
[0043][0044][0045]
注:**为差异极显著，p＜0.01。
[0046]
由表2看出，牡蛎玉米蛋白质含量达19.0％，分别比4131和先玉335高出6.9％和7.8％。
[0047]
表2牡蛎玉米部分品质数据(n＝10)
[0048]
品种蛋白质含量/％脂肪含量/％淀粉含量/％牡蛎玉米19.0
±
0.31a2.5
±
0.13a68.9
±
2.26a4131/ck112.1
±
0.27b3.4
±
0.22a68.6
±
2.22a先玉335/ck211.2
±
0.19b2.9
±
0.14a72.2
±
2.78a[0049]
注:同列不同小写字母表示差异显著，p＜0.05，同列相同小写字母表示差异不显著，p＞0.05。
[0050]
杂交种的验证：
[0051]
华大基因对牡蛎玉米体细胞杂交育成品系牡蛎玉米的检测结果为：
[0052]
牡蛎玉米比对玉米基因组的平均比对率为82.33％；未比对上玉米基因组的reads与牡蛎参考基因组比对率0.05％，reads为2953，新reads为5872046；共检测到牡蛎基因8个，均为已知基因；检测到2个新转录本，均属于长链非编码rna。部分牡蛎基因在牡蛎玉米上的表达量见表4。
[0053]
表4部分牡蛎基因在牡蛎玉米上的表达量
[0054][0055][0056]
注：fpkm：该基因的fpkm值，即每一百万条序列中，每个基因以一千个碱基为单位，比对上的reads个数。
[0057]
实施例二在体半体细胞杂交1育成品种—桦树茸水稻的选育
[0058]
供试水稻品种(母本)为超级稻y两优900，由湖南杂交水稻研究中心提供。供试功能成分供体为桦树茸(桦褐孔菌)，引自俄罗斯布拉戈维申斯克市。桦树茸用改良姚竞桦树茸繁殖配方(姚竞.药用真菌桦褐孔菌的驯化条件试验[j].食药用菌，2018.26(2)：99-100)激活并扩繁，然后按所需体细胞杂交剂的体积分别加入150mg/l果胶酶、230mg/l纤维素酶、110mg/l赤霉素、235mg/l生长素、2000μl/l酶解液和3100mg/l复合氨基酸至量杯，加蒸馏水定容并搅匀，冷藏备用(所述复合氨基酸购买自上海哈灵生物科技有限公司的复合氨基酸粉，所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液具体购自上海哈灵生物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒)。镜检合格后按重量比1：1加入体细胞杂交剂，配制成桦树茸授精液。
[0059]
水稻抽穗先天移植50株至塑料桶内，用白色透明塑料袋密封穗部，置于太阳下高温杀雄(温度为38-42℃)2小时，开花时逐穗检查雄性育性，剪除可育穗。
[0060]
每天开花时段(9-11或14-16时)先往涂抹浓度为2500μl/l的酶解液，所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液(本实施例采用的酶解液具体购自上海哈灵生
物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒)，使之湿透。然后用毛刷蘸桦树茸授精液成把涂刷不育穗后套袋，每天一次，直至不育穗所有小花不再张颖(共计11次)，10d后取回，用ms培养基进行胚挽救并培养成苗。以仅套袋不授精者为对照。同时随机取10穗计数总小花数和结实粒数，按以下公式计算结实率：
[0061]
杂交结实率(％)＝每穗结实粒数/每穗总小花数
×
100％
[0062]
幼苗用0.3％的秋水仙碱加倍染色体后以组合为单位移植于田间，谷粒变黄时混收纯合穗行，选择优良单株。
[0063]
室内阴干后用波通da-7250近红外分析仪分析成分，淘汰直链淀粉含量高于21％和胶稠度低于70％的混收穗行和单株。杂交二代及以后各代用系谱法选育，直至f4纯合。
[0064]
纯合桦树茸稻及其母本y两优900各随机抽取3.5g糙米交武汉迈特维尔生物科技有限公司作广泛靶向代谢组学检测，重复3次。
[0065]
桦树茸与y两优900界间体细胞杂交当代结实率见表5。在连续授精11次时，桦树茸与y两优900界间体细胞杂交当代结实率在4.7％-27.9％间，平均结实率为15.8％。
[0066]
表5桦树茸与y两优900杂交结实率
[0067][0068][0069]
注:**为差异极显著，p＜0.01。
[0070]
桦树茸水稻3205-2各成分含量占比见图3，各成分变化概况见表6，表7。共检测出429种主要成分，其中较母本增加的238种，增加幅度0.2-2068.6％，平均增加93.6％，减少
的191种，减少幅度0.4-85.4％，平均减少20.7％(表6)。其中增幅最大的20种成分和减幅最大的6种成分列于表7。
[0071]
桦树茸稻3205-2重要功能成分的功能及其提高幅度见表8。由表8看出，桦树茸稻总黄酮等不少重要功能成分提高幅度较大，为多功能成分水稻。
[0072]
表6桦树茸稻3205-2功能成分变化概况
[0073]
项目成分数量增减幅度/％增减幅度/％增加2380.2-2068.693.6减少1910.4-85.4-20.7共计429
‑‑
[0074]
表7桦树茸稻3205-2增幅/减幅最大20/6种功能成分变化幅度
[0075][0076][0077]
表8桦树茸稻3205-2的重要功能成分与母本y两优900的差异(n＝3)
[0078][0079][0080]
注：(a)资料来源于网络和广东海洋大学图书馆数据库，参考文献略。
[0081]
(b)y两优900总黄酮含量按叶新福对13个早籼白米品种均值81.3mg/kg计(见叶新福.不同基因型稻米营养保健品质及其利用技术研究[d].福州：福建农林大学，2009.)则桦树茸水稻的总黄酮含量估计值为：81.3mg/kg
×
(125.6 1)＝1.0％。
[0082]
(c)y两优900生物碱含量按谢勇武等对336个重组自交系均值18.0mg/kg计(见谢勇武，杨树明，曾亚文，等.粳稻02428突变体重组自交系糙米功能成分含量及其与农艺性状的相关分析[j].西南农业学报，2011，24(5)：1620-1624.)，则桦树茸水稻的生物碱含量估计值为：18.0mg/kg
×
(52.78 1)＝1.0％。
[0083]
(d)y两优900酚胺含量按董学奎的13.7μg/g计，见董学奎.水稻苯丙烷代谢物时空分布及其自然变异的遗传基础研究[d].武汉：华中农业大学，2015.)，则桦树茸水稻的酚胺含量估计值为：13.7μg/g
×
(30.5 1)＝0.04％。
[0084]
桦树茸水稻2579和3201-1功能成分变化检测结果见表9。桦树茸水稻3205-1田间
表现见图4。
[0085]
表9桦树茸水稻2541和2592能成分迈维检测结果(n＝3)
[0086][0087][0088]
注:**为差异极显著，p＜0.01。
[0089]
由表9得知，桦树茸稻2541和2592的总黄酮含量分别是母本y两优900的2230倍和1510倍，多糖含量分别是母本y两优900的78倍和57倍。由于黄酮和多糖的重要功能是降低血糖(表9)，所以桦树茸水稻又称降糖水稻。
[0090]
实施例三在体半体细胞杂交1育成品种功能蕨新品种—桦树茸肾蕨的选育
[0091]
先把蕨类优良品种肾蕨配子体着生颈卵器的上半部切下，去掉着生精子器的部分，在新的培养器内培养至颈卵器成熟时，再按实施例二的桦树茸授精液的配制方法准备桦树茸授精液，往颈卵器上滴1至数滴浓度为2700μl/l的酶解液，使颈卵器湿透后用毛刷刷上准备好的授精液，最后用羊皮纸袋紧密套袋隔离。如此连续授精6-12天，每天1次，直至成功受精，获得桦树茸肾蕨孢子体。
[0092]
将桦树茸肾蕨孢子体培养成小苗后用0.3％的秋水仙碱加倍染色体，待加倍小苗长大，比较杂交种与母本肾蕨的形态差异、成分差异和基因差异去除假杂种，择优繁殖，获得全球首个功能蕨新品种
‑‑
桦树茸肾蕨。
[0093]
实施例四在体半体细胞杂交2育成品种—玉米稻的选育
[0094]
高产玉米品种津巴布韦白玉米在广东湛江冬播，雄穗散粉前套袋。先按所需体细胞杂交剂的体积分别加入130mg/l果胶酶、270mg/l纤维素酶、160mg/l赤霉素、215mg/l生长素、2800μl/l酶解液和3050mg/l复合氨基酸至量杯，加蒸馏水定容并搅匀，冷藏备用(所述复合氨基酸购买自上海哈灵生物科技有限公司的复合氨基酸粉，所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液具体购自上海哈灵生物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒)。
[0095]
散粉时取粉，加同体积体细胞杂交剂搅匀备用。常规水稻新品系f14种子催芽，芽长达0.5cm时剪去芽鞘和生长点顶部，滴上1滴浓度为3240μl/l的酶解液(所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液，本实施例采用的是购自上海哈灵生物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒)，然后用毛刷刷上前述玉米花粉授精液，最后用羊皮纸袋紧密套袋隔离。如此连续授精3天，每天1次。
[0096]
受精谷芽与对照相间播于选种圃，成熟期比较杂交种与母本的形态差异、收获后比较杂交种与母本的成分差异和基因差异，去除假杂种，真杂种用系谱法选种，获得巨型玉米稻(图5)，其千粒重高达37.6g，比母本f14的20.9g增加16.7g，增加79.9％(如图6所示，左边为杂效后的巨型玉米稻种子，右边为母本水稻种子)，而玉米稻细胞dna含量、气孔保卫细胞数接近或达到母本f14的两倍，玉米稻茎基来自于米的气生根数平均为4.2条(表10，图7)。
[0097]
表10巨型玉米部分稻细胞学特征、气生根条数和抗倒性(n＝30)
[0098][0099]
注：a、b、c和**表示差异极显著，p＜0.01。
[0100]
实施例五在体全体细胞杂交种—桦树茸功能紫薯的选育
[0101]
按实施例二的授精液的配制方法准备桦树茸授精液，紫薯新品种济薯18号洗净，
切去芽眼外皮层，滴上1滴浓度为3350μl/l的酶解液，然后用毛刷刷上前述桦树茸授精液，最后用羊皮纸袋紧密套袋隔离。如此连续授精3天，每天1次。
[0102]
受精薯种与母本济薯18号相间种植于选种圃，成熟期比较杂交种与母本的形态差异、收获后比较杂交种与母本的成分差异和基因差异，去除假杂种，择优繁殖，获得全球首个功能红薯新品种
‑‑
桦树茸紫薯。
[0103]
上述实施例仅为最佳例举，并非对本发明的实施方式的限定。