一种基于生物膜干涉的多糖与蛋白相互作用亲和力的方法

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种基于生物膜干涉技术的非共价固定多糖检测多糖与蛋白相互作用亲和力的方法。
技术背景
2.生物膜干涉技术(biolayer interferometry，bli)是继表面等离子体共振技术后另一种研究分子间相互作用的有效方法。bli是一种光学分析技术，其原理是将一种分子固定在光纤生物传感器的末端使之形成一层分子薄层，当一束光照射到分子薄层的内表面和外表面时，反射的两束光线互相干扰产生干涉现象，从而形成信号。当传感器上固定的分子和溶液中的待测分子相结合时，分子薄层厚度会继续增加，这种变化可以被实时检测出来。而未结合的分子由于未能影响分子层的改变则不会生成信号。bli技术的应用十分广泛，可以检测生物分子之间是否存在相互作用，得出平衡解离常数kd值，结合、解离速率k
on
和k
off
值；测定蛋白的浓度，对蛋白定量；还可以进行药物筛选，对抗体亚型分型等。
3.传感器上的分子固定方式可以分为特异性结合和非特异性结合两种。特异性结合是利用传感器上键合的基团与分子上特定的基团高度专一的识别，例如protein a传感器结合igg-fc标签的蛋白，抗gst传感器结合gst标签的蛋白，链霉亲和素传感器结合生物素化的抗体、蛋白、多肽或核酸等。而非特异性结合的专一性不高，例如ni-nta传感器通过静电作用结合his标签的蛋白、aps传感器通过疏水作用将蛋白或膜片段吸附到传感器表面。
4.近年来，多糖和蛋白的相互作用逐渐成为研究热点。生物膜干涉技术作为测定亲和力的重要手段，被广泛用于多糖与蛋白相互作用的研究中。由于多糖的活性基团较少，不利于有效地标记，因此目前的检测方式主要是通过固定带有标签的蛋白，检测游离的多糖分子的结合和解离过程，拟合得到二者结合的亲和力。但是该检测方式存在许多问题，例如多糖分子量较大，结合信号容易出现负值；多糖分子量不均一，而生物膜干涉技术测定亲和力需要明确游离配体的摩尔浓度，因此得到的亲和力难以评价；此外，线性结构的多糖难于得到较明显的结合信号，许多重要的多糖(如肝素等)因此被限制了用该方法进行亲和力的检测。


技术实现要素：

5.针对上述背景及问题，本发明利用氨基丙基硅烷(aps)传感器(fortebio，货号：18 5045)上键合的氨基丙基硅烷基团固定糖胺聚糖、植物果胶类多糖等多糖。测定多糖与已知浓度的配体蛋白之间的结合亲和力。有效解决了游离配体摩尔浓度难以表征、多糖分子量大易出现负信号、线性多糖难以检测的问题。
6.具体操作为：
7.1、传感器的预湿：在黑色96孔板中每孔分别加入200μl h2o。将aps传感器放在传感器架上，96孔板放置在传感器架下方，使传感器光纤末端浸入水中预湿5至30min。
8.2、多糖的离线固定：将h2o吸出，对应加入200μl多糖溶液。将传感器末端与多糖孵
育2h。多糖需用纯水溶解，浓度在mg/ml级别。
9.3、传感器的封闭：在另一个96孔板对应传感器的孔中加入200μl 1％至5％(g/ml)bsa(牛血清白蛋白)溶液。替换多糖溶液的96孔板，将传感器末端于bsa溶液中封闭1h。
10.4、亲和力检测：用1％bsa梯度稀释的200μl蛋白样品加至96孔板对应位置，并将封闭好的传感器放置于芯片架上。在软件中设定运行程序，进行亲和力检测。
11.说明：
12.1、多糖需用纯水溶解，即多糖的固定在多糖水溶液中进行。
13.2、封闭用的1％bsa溶液需用不含有tween-20等去污剂的缓冲液溶解。
14.3、为避免配体蛋白与传感器的非特异性吸附，亲和力检测过程中用到的缓冲液中应加入1％至5％bsa，0.01％至0.1％(ml/ml)tween-20(或其他类型的去污剂)。
15.本发明利用非共价结合的方式将多糖吸附固定在氨基丙基硅烷(aps)传感器表面，再通过生物膜干涉技术检测蛋白与多糖的亲和力。该方法适用于高分子量、带有负电荷的多糖，解决了生物膜干涉技术中多糖不易固定、多糖分子量不均一造成的亲和力难于表征等问题。该方法操作简便，蛋白样品用量小，多糖样品可重复多次利用、可行性高。
附图说明
16.图1.实施例1中采用ni-nta传感器固定新冠病毒s蛋白(s trimer)，λ-卡拉胶与s trimer无明显结合信号。
17.图2.实施例1中采用aps传感器固定λ-卡拉胶，新冠病毒s trimer与λ-卡拉胶有结合信号。
18.图3.实施例2中柴胡多糖的分子量分布。色谱柱为tskgel g3000pw
xl
(7.8
×
300mm，tosoh)，流动相为0.1m nacl，流速为0.5ml/min。
19.图4.实施例2中采用aps传感器固定柴胡多糖，测定其与新冠病毒s trimer的亲和力。
具体实施方式
20.实施例1.
21.新型冠状病毒s蛋白与卡拉胶结合的亲和力检测
22.采用传统方式，利用ni-nta传感器固定his标签的新冠病毒s蛋白(s trimer，北京百普赛斯，cat.no.spn-c52h8)，将2mg/mlλ-卡拉胶(sigma，cas:9064-57-7)倍比稀释5个浓度，检测新冠病毒s trimer与卡拉胶的亲和力。结果如附图1所示，卡拉胶结合出现负信号。降低λ-卡拉胶浓度至0.01mg/ml，负信号问题仍不能解决。
23.改用传感器固定λ-卡拉胶的方式：
24.1、传感器的预湿：取6根aps传感器，放置于96孔板的传感器架a1-f1位置。在下面的96孔板(第一块96孔板)中对应每孔加入200μl h2o，使传感器光纤末端浸润预湿5min。
25.2、多糖的离线固定：称取λ-卡拉胶，用纯水溶解，浓度为2mg/ml。将孔中h2o吸出，分别加入200μlλ-卡拉胶溶液。将传感器末端与λ-卡拉胶孵育2h，移去96孔板(第一个块96孔板)。
26.3、传感器的封闭：用tbs缓冲液(150mm nacl，20mm tris-hcl，ph 7.4)配置质量体
积浓度(g/ml)3％bsa(牛血清白蛋白)。
27.分别取200μl3％bsa溶液加入另一96孔板(第二块96孔板)中，将步骤2)得到的传感器末端浸入3％bsa溶液中，封闭1h。
28.4、亲和力检测：将封闭后的传感器放置于1％bsa(g/ml)溶液(溶于tbs缓冲液，含有终体积浓度0.05％(ml/ml)tween-20)中。分别将200μl1％bsa溶液加至样品板(第三块96孔板)a1-f1(第1列)，a3-f3孔(第3列)中，将1％bsa溶液梯度稀释的200μl新冠病毒strimer(终浓度20，10，5，2.5，1.25，0μg/ml)分别加至a2-f2孔(第2列)中。将传感器和样品板放置于生物膜干涉仪的样品仓内。在生物膜干涉仪的“data acquisition”软件中输入s trimer相应摩尔浓度，设定运行程序：baseline-第1列-60s；association-第2列-100s；dissociation-第3列-200s。检测结果如附图2所示。利用“data analysis”软件进行拟合分析，得到新冠病毒s trimer与λ-卡拉胶的结合亲和力为0.97nm。
29.实施例2.
30.新型冠状病毒s蛋白与柴胡多糖结合的亲和力检测
31.柴胡多糖(上海源叶，s29870)的分子量分布范围较宽，如附图3所示。如采用传统方式，固定his标签的新冠病毒s trimer，检测柴胡多糖，需要输入柴胡多糖的摩尔浓度，但其摩尔浓度难于表征。故采用aps传感器固定柴胡多糖的方式：
32.1、传感器的预湿：取6根aps传感器，放置于96孔板的传感器架a1-f1位置。在下面的96孔板(第一块96孔板)中对应每孔加入200μl h2o，使传感器光纤末端浸润预湿5min。
33.2、多糖的离线固定：称取柴胡多糖，用纯水溶解，浓度为2mg/ml。将孔中h2o吸出，分别加入200μlλ-卡拉胶溶液。将传感器末端与λ-卡拉胶孵育2h，移去96孔板(第一个块96孔板)。
34.3、传感器的封闭：用tbs缓冲液(150mm nacl，20mm tris-hcl，ph 7.4)配置质量体积浓度(g/ml)3％bsa(牛血清白蛋白)。
35.分别取200μl3％bsa溶液加入另一96孔板(第二块96孔板)中，将步骤2)得到的传感器末端浸入3％bsa溶液中，封闭1h。
36.4、亲和力检测：将封闭后的传感器放置于1％bsa(g/ml)溶液(溶于tbs缓冲液，含有终体积浓度0.05％(ml/ml)tween-20)中。分别将200μl1％bsa溶液加至样品板(第三块96孔板)a1-f1(第1列)，a3-f3孔(第3列)中，将1％bsa溶液梯度稀释的200μl新冠病毒s trimer(终浓度20，10，5，2.5，1.25，0μg/ml)分别加至a2-f2孔(第2列)中。将传感器和样品板放置于生物膜干涉仪的样品仓内。在生物膜干涉仪的“data acquisition”软件中输入s trimer相应摩尔浓度，设定运行程序：baseline-第1列-60s；association-第2列-100s；dissociation-第3列-200s。检测结果如附图4所示。利用“data analysis”软件进行拟合分析，得到新冠病毒s trimer与柴胡多糖的结合亲和力为0.62nm。