免疫原性组合物的制作方法

1.本发明涉及用于预防和治疗葡萄球菌感染和疾病，特别是金黄色葡萄球菌(s.aureus)感染和疾病的免疫原性组合物。本发明提供了免疫原性组合物，其包含葡萄球菌抗原，特别是hla、clfa、spa和荚膜多糖的缀合物。还提供了佐剂化制剂，以及此类组合物在预防和治疗葡萄球菌感染中的用途。还提供了具体呈现、制备方法和试剂盒。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球形细菌，其为在美国和欧洲的血流、下呼吸道、皮肤和软组织感染的主要原因。其也是全世界骨感染的主要原因，并且这些感染是痛苦的，使人衰弱的和难以治疗的。
3.由于很多金黄色葡萄球菌菌株发展抗生素抗性，对金黄色葡萄球菌的治疗正变得越来越有挑战性。甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(mrsa)在医院中流行，并且社区相关的mrsa菌株正在全世界传播，造成重大的全球挑战。在所有社区和医院感染的超过一半中发现mrsa。近年已经看到这样的mrsa菌株的出现，所述mrsa菌株对万古霉素(最后手段的抗生素)也是抗性的，并且基本上无法治疗。
4.当前没有授权的疫苗。由于抗生素抗性的问题以及金黄色葡萄球菌感染由于其良好发展的免疫逃逸能力而不能提供对未来感染的免疫力的事实，对疫苗的需求尤为迫切。金黄色葡萄球菌的免疫逃逸特性进而使有效疫苗的开发更加困难。免疫逃逸的机制未被完全理解，但至少部分是由于葡萄球菌蛋白a(spa)，一种金黄色葡萄球菌表面分子，其结合免疫球蛋白(ig)的fcγ和vh3-型b细胞受体的fab部分。spa与b细胞受体的相互作用影响感染期间的b细胞发育，干扰适应性免疫应答的发展。spa与ig fc的结合干扰多形核白细胞对葡萄球菌的调理吞噬性清除。
5.因此，迫切需要一种预防葡萄球菌疾病的疫苗。几种疫苗已经在临床试验中进行测试，包括荚膜多糖(cps)缀合物、单个蛋白抗原，以及针对脂磷壁酸的单克隆抗体(mab)。然而，全部都已经在各个开发阶段失败，并且迄今为止，市场上没有针对金黄色葡萄球菌的疫苗。
6.已经在i期人试验中测试了包含金黄色葡萄球菌cps、clfa和mntc的多组分疫苗(anderson等，2012,hum vaccine immunother 8:1585-1594)。该疫苗在i期中诱导调理性抗cp抗体和抑制性抗clfa抗体，并且随后在iib期有效性试验中针对在选择性脊柱融合手术患者中的预防性用途进行测试，但由于无用而终止iib期试验。
7.然而，尚未发现在iii期试验中具有保护效力的针对金黄色葡萄球菌的疫苗。含有与假单胞菌外蛋白a缀合的金黄色葡萄球菌型5和型8荚膜多糖的缀合物的疫苗(staphvax-nabi biopharmaceuticals)已经在临床试验中进行测试，其中其在i期和ii期中表明安全性，但未能在iii期中达到所需的终点，如wo 03/61558中所述。
8.类似地，基于isdb蛋白抗原的疫苗(v710疫苗；kuklin等，infect immun,2006,74:2215-23)在心胸金黄色葡萄球菌感染中进行的iii期试验中未达到有效性终点。
9.因此，持续需要针对葡萄球菌感染，特别是金黄色葡萄球菌感染的有效疫苗。还需要以有效制剂提供所述疫苗，优选一种适合长期储存的制剂。疫苗制剂是一门精细艺术，提供适当、安全、稳定和易于使用的呈现需要非常细致的实验。随着时间的推移，制剂必须优选地保持蛋白抗原的结构和功能。此类考量包括但不限于免疫原性组合物的化学稳定性(例如，蛋白的蛋白水解或片段化)、免疫原性组合物的物理/热稳定性(例如，聚集、沉淀、吸附)、免疫原性组合物与容器/密封系统的相容性、免疫原性组合物和非活性成分(例如，缓冲液、盐、赋形剂、冷冻保护剂)之间的相互作用、生产工艺、剂型(例如，冻干、液体)、运输、储存和处理过程中遇到的环境条件(例如，温度、湿度、剪切力)以及生产和使用之间的时间长度。


技术实现要素：

10.本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含葡萄球菌抗原。在一个方面中，所述免疫原性组合物包含以下两种或更多种：(a)clfa抗原；(b)hla抗原；(c)spa抗原；和/或(d)葡萄球菌荚膜多糖。clfa抗原、hla抗原和spa抗原优选是葡萄球菌抗原，适宜地为金黄色葡萄球菌抗原。在一个方面中，所述组合物是固体形式，例如冷冻干燥形式。在一个方面中，所述组合物是重构的，例如，水溶液形式。
11.在一个实施方式中，所述组合物包含填充剂(bulking agent)，任选地糖，优选蔗糖。在一个实施方式中，所述组合物包含表面活性剂，任选地聚山梨醇酯，任选地聚山梨醇酯80。
12.在一个实施方式中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含clfa抗原、hla抗原、spa抗原、葡萄球菌荚膜多糖、蔗糖和聚山梨醇酯80。在一个实施方式中，所述组合物还包含佐剂，例如，as01e。在一个实施方式中，所述组合物是液体形式。
13.在一个实施方式中，蔗糖以每单位剂量15-25mg，任选地每单位剂量21mg存在；聚山梨醇酯80以每单位剂量50-100μg，任选地每单位剂量80μg存在；和/或spa、hla和/或clfa以每单位剂量50-100μg，任选地每单位剂量60μg存在。
14.在一个实施方式中，所述免疫原性组合物以每人剂量25μg水平包含qs21和3d-mpl。
15.本发明还提供了一种试剂盒，其包含(i)第一容器，所述第一容器包含如本文所公开的固体形式的免疫原性组合物；和(ii)第二容器，所述第二容器包含佐剂，任选地as01e。所述佐剂是在水溶液中。第一容器是瓶(vial)，和/或第二容器是预充式注射器。
16.在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包含clfa抗原；hla抗原；spa抗原；和葡萄球菌荚膜多糖。荚膜多糖可以适宜地是金黄色葡萄球菌血清型5和/或型8荚膜多糖。在一个优选实施方式中，所述免疫原性组合物包含clfa抗原；hla抗原；spa抗原；来自金黄色葡萄球菌血清型5的荚膜多糖和来自金黄色葡萄球菌血清型8的荚膜多糖。
17.在一个实施方式中，所述荚膜多糖与载体蛋白缀合。所述荚膜多糖蛋白可以与上述抗原(a)-(c)之一缀合。在一个优选实施方式中，所述组合物包含与hla抗原缀合的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖和/或与clfa抗原缀合的型8荚膜多糖。
18.在一个实施方式中，所述clfa抗原是包含seq id no.2的氨基酸序列或与seq id no.2至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的clfa蛋
白，或其免疫原性片段。
19.所述clfa抗原可以包含根据seq id no.2的氨基酸序列的选自p116至s和y118至a(或与seq id no.2至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的等同位置)的至少一个氨基酸取代，任选地包含seq id no 5-7或32中的任一序列。
20.所述clfa抗原可以包含选自以下的一个或多个共有序列：d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)，其中x和z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸。所述共有序列可以已经添加在seq id no:2的氨基酸残基313-342之间的一个或多个氨基酸处，或取代seq id no:2的氨基酸残基313-342之间的一个或多个氨基酸，任选地取代位置i337处，或与seq id no.2至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处的氨基酸。在一个实施方式中，x是q(谷氨酰胺)且z是a(丙氨酸)(例如，k-d-q-n-a-t-k，seq id no:31)。
21.在一个优选实施方式中，所述clfa抗原包含seq id no:7或seq id no:32的序列或由其组成。
22.在一个实施方式中，所述hla抗原是具有seq id no.3的氨基酸序列或与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的hla蛋白，或其免疫原性片段。
23.所述hla抗原可以在seq id no.3的位置h35处或在与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处包含氨基酸取代。在一个实施方式中，所述氨基酸取代任选地是h至l。
24.所述hla抗原可以包含选自以下的一个或多个共有序列：d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)，其中x和z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸。所述共有序列可以添加在seq id no.3的氨基酸序列或与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的一个或多个氨基酸处，或取代seq id no.3的氨基酸序列或与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的一个或多个氨基酸。在一个实施方式中，所述共有序列已经取代seq id no:3的seq id no.3的位置k131处或与seq id no:3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处的氨基酸。在一个实施方式中，x是q(谷氨酰胺)且z是r(精氨酸)(例如，k-d-q-n-r-t-k(seq id no 30)。
25.在一个优选实施方式中，所述hla抗原包含seq id no:11或seq id no 12的序列或由其组成。
26.在一个实施方式中，所述spa抗原是包含与seq id no.13、seq id no:26或seq id no:27至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的spa蛋白，或其免疫原性片段。
27.所述spa抗原可以包含(a)结构域e、d、a、b或c的vh3-结合亚结构域中的一个或多个氨基酸取代，其破坏或减少与vh3的结合，和(b)结构域e、d、a、b或c的igg fc结合亚结构域中的一个或多个氨基酸取代，其破坏或减少与igg fc的结合。
28.在一个实施方式中，所述spa抗原包含(i)结构域e，所述结构域e在seq id no:14的氨基酸位置34和35处或在与seq id no:14至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、
98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域d，所述结构域d在seq id no:15的氨基酸位置39和40处或在与seq id no:15至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域a，所述结构域a在seq id no:16的位置36和37处或在与seq id no:16至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域b，所述结构域b在seq id no:17的位置氨基酸位置36和37处或在与seq id no:17至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代，和/或结构域c，所述结构域c在seq id no:18的位置氨基酸位置36和37处或在与seq id no:18至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；和/或(ii)包含：结构域e，所述结构域e在seq id no:14的氨基酸位置7和8处或在与seq id no:14至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域d，所述结构域d在seq id no:15的氨基酸位置12和13处或在与seq id no:15至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域a，所述结构域a在seq id no:16的位置9和10处或在与seq id no:16至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域b，所述结构域b在seq id no:17的位置氨基酸位置9和10处或在与seq id no:17至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代，和/或结构域c，所述结构域c在seq id no:18的位置氨基酸位置9和10处或在与seq id no:18至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代。在一个实施方式中，所述氨基酸取代是赖氨酸取代谷氨酰胺和/或丙氨酸取代天冬氨酸。示例性序列是seq id no:19-23、24和25。
29.在一个实施方式中，所述spa抗原包含结构域d，所述结构域d在seq id no:15的氨基酸位置4和5处或在与seq id no:15至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代。所述氨基酸取代可以适宜地是谷氨酰胺至赖氨酸和/或谷氨酰胺至精氨酸，例如，qq至kr(例如，seq id no 24和seq id no:25)。
30.在一个实施方式中，所述spa抗原包含seq id no:19-23、26或27的氨基酸序列，或与seq id no:19-23、26或27至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，所述spa抗原包含seq id no:27的氨基酸序列。
31.在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包含(i)包含seq id no:7或seq id no:32的氨基酸序列的clfa抗原；(ii)包含seq id no:11或seq id no:12的氨基酸序列的hla抗原；(iii)包含seq id no:27的氨基酸序列的spa抗原；(iv)金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖，和(v)金黄色葡萄球菌血清型型8荚膜多糖。所述clfa抗原可以与金黄色葡萄球菌血清型型8荚膜多糖缀合，且所述hla抗原与金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖缀合。所述clfa-cp8和hla-cp5缀合物可以适宜地是生物缀合物。
32.在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包含(i)包含seq id no:7或seq id no:32的氨基酸序列的clfa抗原；(ii)包含seq id no:11或seq id no:12的氨基酸序列的hla抗原；(iii)包含seq id no:27的氨基酸序列的spa抗原；(iv)与hla抗原缀合的金黄色葡萄
球菌血清型5荚膜多糖，和(v)与clfa抗原缀合的金黄色葡萄球菌血清型型8荚膜多糖。优选地，所述clfa-cp8和hla-cp5缀合物是生物缀合的。所述免疫原性组合物可以另外地包含如本文所述的佐剂。
33.本发明的一个方面提供了一种疫苗，其包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体。
34.本发明的一个方面提供了一种试剂盒，其包含(i)第一容器，所述第一容器包含本发明的免疫原性组合物或疫苗；和(ii)第二容器，所述第二容器包含佐剂。
35.本发明的一个方面提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗用于预防或治疗葡萄球菌感染(例如，金黄色葡萄球菌感染)的方法中的使用。在一个实施方式中，所述免疫原性组合物或疫苗与佐剂组合施用。
36.在本发明的一个方面中，本发明的免疫原性组合物包含佐剂。在另一个方面中，所述免疫原性组合物与佐剂组合施用。所述佐剂可以与所述免疫原性组合物同时施用，例如其可以在施用前与所述免疫原性组合物混合。
37.在一个实施方式中，所述佐剂包含皂苷和tlr4激动剂，其合适地在脂质体制剂中。在一个实施方式中，所述佐剂进一步包含甾醇。所述皂苷可以是源自皂皮树(quillaja saponaria molina)的树皮的免疫活性皂苷级分，优选qs21。在一个实施方式中，所述tlr4激动剂是脂多糖。所述脂多糖可以是脂质a衍生物，优选3d-mpl。所述甾醇可以是胆固醇。在一个实施方式中，所述佐剂包含每人剂量25μg的水平的qs21和/或每人剂量25μg的水平的3d-mpl(例如，as01e)。
38.在一个方面中，本发明提供了预防或治疗葡萄球菌感染，例如金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。所述方法可以进一步包括将佐剂施用于所述受试者。所述佐剂可以与所述免疫原性组合物同时施用，例如其可以在施用前与所述免疫原性组合物混合。
39.在一个进一步方面，本发明提供了制备根据权利要求中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗的方法，其包括将抗原和任选佐剂与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。
40.本发明的一个进一步方面提供了编码本发明的免疫原性组合物的抗原的多核苷酸。还提供了包含这种多核苷酸的载体。还提供了包含本发明的载体或多核苷酸的宿主细胞。
附图说明
41.图1：小鼠中的疫苗-特异性igg。用未佐剂化和用alum/tlr7或as01e佐剂化的疫苗免疫的未处理小鼠中的抗原-特异性igg滴度(抗cp5(1a)、抗cp8(1b)、抗hla(1c)、抗clfa(1d)和抗spa(1e))。每个符号标识一组30只小鼠，其在第1天和第29天用10μg(空心符号)或1μg(实心符号)具有as01(三角形)、alum/tlr7(圆形)或无佐剂(正方形)进行免疫。y-轴：gmt，具有ci 95％。在第一次和第二次免疫后的不同时间点进行采血。igg滴度的gmt和分析的采血时间点分别报告在y和轴。虚线＝lloq/2：定量下限的一半。通过luminex分析每个时间点的30份单独的balb/c血清。
42.图2：在小鼠中由未佐剂化和用alum/tlr7或as01e佐剂化的疫苗诱导的疫苗-特异性cd4 t-细胞应答的量级和质量。来自在第二次免疫后12天处死的单只小鼠的脾细胞在体
外用或不用疫苗蛋白(2a：spa
mut
，1μg/ml；2b：hla
mut
，10μg/ml；2c：clfa
mut
，10μg/ml)刺激，染色并通过ics分析。鉴定产生il-2、tnf、il-4/il-13、ifn-γ或il-17a的cd4

cd44
高
t细胞。上图：cd4

cd44
高
≥cyt

。下图：cd4

cd44
高
≥ifn-γ。从刺激细胞的应答减去未刺激细胞的应答。量级：响应于疫苗蛋白刺激产生分析的细胞因子的至少一种的cd4

cd44
高
t细胞的百分比。质量：产生至少：ifn-γ而非il-4/il-13的cd4

cd44
高
t细胞的百分比。％几何平均值比率的双因素anova，p＜0.05表明：*疫苗(有或没有佐剂)vs.对照组；*具有佐剂的疫苗vs.没有佐剂的疫苗；*具有as01e的疫苗vs.具有alum/tlr7的疫苗；*疫苗-10μg vs.疫苗-1μg。
43.图3：预先暴露的兔中的疫苗-特异性igg。接受有或没有as01e佐剂的疫苗或缓冲液的两次注射的预先暴露的兔中的抗cp5(3a)、抗cp8(3b)、抗hla(3c)、抗clfa(3d)和抗spa(3e)的几何平均滴度。pre：第1次给药前，1wp1：第1次给药后1周，2wp1：第1次给药后2周，4wp1：第1次给药后4周，2wp2：第2次给药后2周，4wp2：第2次给药后4周；5wp2：第2次给药后5周。lloq2虚线：定量下限的一半。三角形：1μg剂量；圆形：10μg剂量；正方形：50μg剂量。空心符号：无佐剂，实心符号：as01e。缓冲液对照显示为实心菱形。灰色虚线指示测定中使用的最低稀释度的倒数。
44.图4a：疫苗在小鼠中诱导中和体外hla活性的功能性igg。在指示剂量下，在没有佐剂的情况下或在alum/tlr7或as01e佐剂存在的情况下，用疫苗免疫小鼠(10只小鼠/组)。在每个时间点测量合并血清的中和滴度，并且表示为三次独立研究的中值(红色和蓝色正方形和星形)。条的上和下值分别代表最大和最小滴度。空心符号：10μg剂量；空心符号：1μg剂量。正方形：无佐剂；三角形：as01e佐剂；圆形：alum/tlr7佐剂。灰色虚线指示测定中使用的最低稀释度的倒数。
45.图4b：疫苗在预先暴露的兔中诱导中和体外hla活性的功能性igg。hla中和滴度和分析的采血时间点分别报告在y和x轴上。灰色虚线指示测定中使用的最低稀释度的倒数。将3的任意滴度分配给未应答者。三角形：1μg剂量；圆形：10μg剂量；正方形：50μg剂量。空心符号：无佐剂，实心符号：as01e。缓冲液对照显示为实心菱形。
46.图5a：疫苗在小鼠中诱导中和体外clfa活性的功能性igg。在三次独立的体内实验中，在指示剂量下，在没有佐剂的情况下或在alum/tlr7或as01e佐剂存在的情况下，用疫苗免疫小鼠(10只小鼠/组)。三次体内实验的合并血清的中和滴度在每个时间点测量，并且表示为中值。条形的上和下值分别代表最大和最小滴度。空心符号：10μg剂量；空心符号：1μg剂量。正方形：无佐剂；三角形：as01e佐剂；圆形：alum/tlr7佐剂。灰色虚线指示测定中使用的最低稀释度的倒数。
47.图5b：疫苗在预先暴露的兔中诱导中和体外clfa活性的功能性igg。在接种疫苗前、在4wp1和2wp2测量单独血清的中和滴度。仅在2wp2，一些中和活性表示为几何平均值(gmt)与95％置信区间(ci)。灰色虚线指示测定中使用的最低稀释度的倒数。将2的任意滴度分配给无应答者。三角形：10μg剂量；圆形：10μg剂量；正方形：50μg剂量。空心符号：无佐剂，实心符号：as01e。缓冲液对照显示为实心菱形。
48.图6：疫苗在预先暴露的兔中诱导具有针对血清型5(图6a)和8(图6b)金黄色葡萄球菌菌株的opk活性的抗体。在接种疫苗前和在2wp2测量12份单独血清的opk滴度。gmt表示为具有95％的置信区间。三角形：无佐剂。圆形：as01e佐剂。菱形：仅缓冲液。
49.图7：接种疫苗在预先暴露的兔中增加具有更高亲和性的抗hla抗体。在接种疫苗
前、在2wp1和2wp2在单独的血清中测定的抗体解离百分比。gmt表示为具有95％的置信区间。三角形：无佐剂。圆形：as01e佐剂。菱形：仅缓冲液。
50.图8：接种疫苗在预先暴露的兔中增加具有更高亲和性的抗spa
mut
抗体。在接种疫苗前、在2wp1和2wp2在单独的血清中测定的抗体解离百分比。gmt表示为具有95％的置信区间。三角形：无佐剂。圆形：as01e佐剂。菱形：仅缓冲液。
51.图9：接种疫苗在预先暴露的兔中增加具有更高亲和性的抗clfa抗体。在接种疫苗前、在2wp1和2wp2在单独的血清中测定的抗体解离百分比。gmt表示为具有95％的置信区间。三角形：无佐剂。圆形：as01e佐剂。菱形：仅缓冲液。
52.图10：接种疫苗在预先暴露的兔中增加具有更高亲和性的抗cp5抗体。在接种疫苗前、在2wp1和2wp2在单独的血清中测定的抗体解离百分比。gmt表示为具有95％的置信区间。三角形：无佐剂。圆形：as01e佐剂。菱形：仅缓冲液。
具体实施方式
53.定义
54.术语
55.载体蛋白：共价附接至抗原(例如，糖抗原)以产生缀合物(例如，生物缀合物)的蛋白。载体蛋白活化t-细胞介导的免疫力，所述免疫力与缀合至载体蛋白的抗原相关。
56.缀合物：与载体蛋白共价连接的糖(诸如荚膜多糖)。
57.生物缀合物：通过在宿主细胞中表达糖合成所需的酶、载体蛋白和缀合所需的酶而重组产生的缀合物，产生这样的缀合物，其中糖经由n-连接的蛋白糖基化(通过酶促作用将碳水化合物分子添加至靶标蛋白的多肽链中的天冬酰胺残基)与载体蛋白n-连接。
58.除脯氨酸(pro，p)外的任何氨基酸：是指选自以下的氨基酸：丙氨酸(ala，a)，精氨酸(arg，r)，天冬酰胺(asn，n)，天冬氨酸(asp，d)，半胱氨酸(cys，c)，谷氨酰胺(gln，q)，谷氨酸(glu，e)，甘氨酸(gly，g)，组氨酸(his，h)，异亮氨酸(ile，i)，亮氨酸(leu，l)，赖氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，苯丙氨酸(phe，f)，丝氨酸(ser，s)，苏氨酸(thr，t)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，和缬氨酸(val，v)。
59.clfa：来自金黄色葡萄球菌的凝集因子a。
60.hla：α-溶血素，也称为α-毒素，其来自金黄色葡萄球菌。
61.clfa：来自金黄色葡萄球菌的葡萄球菌蛋白a。
62.cp：荚膜多糖。
63.lps：脂多糖。
64.还原末端：多糖的还原末端是具有游离异头碳的单糖，所述游离异头碳不参与糖苷键，且因此能够转化为开链形式。
65.如本文所用，术语“生物缀合物”是指在宿主细胞背景中制备的蛋白(例如，载体蛋白)和抗原(例如，多糖)之间的缀合物，其中宿主细胞机构将抗原连接至蛋白(例如，n-连接)。
66.如本文所用，在向受试者施用疗法(例如，本发明的免疫原性组合物或疫苗)的背景中，术语“有效量”是指具有预防和/或治疗效应的疗法的量。在某些实施方式中，“有效量”是指足以实现一种、两种、三种、四种或更多种以下效应的疗法的量：(i)降低或改善细
菌感染或与其相关的症状的严重程度；(ii)缩短细菌感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防细菌感染或与其相关的症状的进展；(iv)引起细菌感染或与其相关的症状的消退；(v)预防细菌感染或与其相关的症状的发展或发作；(vi)预防细菌感染或与其相关的症状的复发；(vii)减少与细菌感染相关的器官衰竭；(viii)减少具有细菌感染的受试者的住院；(ix)缩短具有细菌感染的受试者的住院长度；(x)提高具有细菌感染的受试者的存活；(xi)消除受试者中的细菌感染；(xii)抑制或减少受试者中的细菌复制；和/或(xiii)增强或改善另一疗法的预防或治疗效应。
67.如本文所用，术语“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人)。
68.如本文所用，术语“免疫原性片段”是小于整个抗原的抗原的一部分，其能够在宿主动物(例如人)中引发对该片段特异性的体液和/或细胞免疫应答。使用本领域中已知的技术，例如重组、通过蛋白水解消化或通过化学合成，可以产生蛋白的片段。通过从编码多肽的核酸的一个末端(对于末端片段)或两个末端(对于内部片段)除去一个或多个核苷酸，可以生成多肽的内部或末端片段。通常，片段包含全长序列的至少10、20、30、40或50个连续氨基酸。然而，片段长度也可以是100或更多，200或更多，300或更多或400或更多的氨基酸。通过从n和c-末端中任一或两者添加或除去1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个氨基酸，可以容易地修饰片段。
69.如本文所用，术语“保守氨基酸取代”涉及天然氨基酸残基由非天然残基的取代，使得对在该位置处的氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性具有很少影响或无影响，并且不导致免疫原性减少。例如，这些可以是在以下组内的取代：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。对多肽序列的保守氨基酸修饰(和对编码核苷酸的相应修饰)可以产生具有与亲本多肽的功能和化学特征相似的功能和化学特征的多肽。
70.如本文所用，术语“缺失”是从蛋白序列除去一个或多个氨基酸残基。
71.如本文所用，术语“插入”是在蛋白序列中添加一个或多个非天然氨基酸残基。
72.如本文所用，提及“在氨基酸
…
之间”(例如“在氨基酸313-342之间”)是指从氨基酸序列的n-末端连续计数的氨基酸数目，例如“在seq id no.2的氨基酸313-342...之间”是指在seq id no.2的第313和第342氨基酸之间的氨基酸序列中的任何位置。
73.可以在参考序列的全长上或在查询序列的全长上计算对“序列同一性”的提及。序列比对工具包括，但不限于，clustal omega(www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk)muscle(www(.)ebi(.)ac(.)uk)或t-coffee(www(.)tcoffee(.)org)。在一个方面，使用的序列比对工具是clustal omega(www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk)。
74.发明陈述
75.spa抗原
76.野生型spa(葡萄球菌蛋白a)是一种细胞壁锚定的表面蛋白，其为肺部感染、败血病和脓肿发展的关键毒力因子，并且由大多数临床金黄色葡萄球菌分离株表达。野生型spa结合人igg的fc部分、含有vh3的b细胞受体、von willebrand因子的其a1结构域处以及tnf-α受体1。spa与b细胞受体的相互作用影响b细胞发育，其对适应性和先天性免疫应答具有影
响，而其与igg的fcγ的结合干扰多形核白细胞对葡萄球菌的调理吞噬性清除。成熟的spa的n-末端部分由四个或五个56-61个残基的ig-结合结构域构成，所述ig-结合结构域折叠成由短接头连接的三重螺旋束，并且以顺序e、d、a、b和c指定。这些结构域在氨基酸水平上展现～80％同一性，长度为56至61个残基，并且组织为串联重复区。c-末端区域由“xr”(高度重复但可变的八肽)和“xc”(邻接spa的细胞壁锚定结构的结构域)构成。
77.在nctc 8325菌株中，spa是saouhsc_00069，并且具有氨基酸序列seq id no:4(gi:88193885)。在newman菌株中，其为nwmn_0055(gi:151220267)。seq id no:4的有用片段是氨基酸37至325(seq id no:13)。该片段含有所有五个spa ig-结合结构域(其以顺序e、d、a、b、c从n-至c-末端自然排列，分别具有seq id no:14、15、16、17和18的序列)，并且包括spa的最暴露的结构域。它还降低抗原与人蛋白的相似性。其他有用的片段可以省略天然a、b、c、d和/或e结构域中的1、2、3或4个，以防止如果spa作为b细胞超抗原发挥功能可能发生的过度b细胞扩增。其他有用的片段可以仅包括天然a、b、c、d和/或e结构域中的1、2、3或4个，例如，仅包含spa(a)结构域但不包含b至e，或仅包含spa(d)结构域但不包含a、b、c或e等。因此，可用于本发明的spa抗原可以包括1、2、3、4或5个igg-结合结构域。
78.在一个实施方式中，本发明的spa抗原可以引发识别seq id no:13的抗体(例如，当施用于人时)和/或可以包含以下氨基酸序列：(a)与seq id no:13具有50％或更多同一性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多同一性)；和/或(b)包含seq id no:13或与seq id no:13至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的至少”n”个连续氨基酸的片段，其中”n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些spa抗原包括seq id no:13的变体。(b)的优选片段包含来自seq id no:13或与seq id no:13至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的表位。其他优选片段缺乏从seq id no:13的c-末端起的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或从seq id no:13的n-末端起的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，同时保留seq id no:13的至少一个表位。单独的igg-结合结构域可能是单独或组合的有用的免疫原。
79.如果抗原仅包括一种类型的spa结构域(例如仅spa(a)、spa(d)或spa(e)结构域)，则其可以在单一多肽链中包括多于一个拷贝的该结构域，例如多个spa(d)结构域。其也可以包括一种类型的spa结构域和另一种蛋白或多肽。因此，本发明的抗原可以是仅包含一种类型的spa结构域、如spa(d)结构域的融合蛋白。
80.可将本发明使用的spa抗原相对于seq id no:13进行突变，使得它们对人igg的fcγ部分和/或对含有vh3的人b细胞受体的fab部分的亲和性降低。这可以通过例如遵循wo2011/005341、wo12/003474和wo2015/144653中的指导来实现和评价。因此，野生型spa中的至少一个gln-gln二肽可以被突变(例如突变为lys-lys；其他可能的突变包括arg-arg、arg-lys、lys-arg、ala-ala、ser-ser、ser-thr、thr-thr等)和/或野生型spa中的至少一个asp-asp二肽可以被突变(例如突变为ala-ala；其他可能的突变包括lys-lys、arg-arg、lys-arg、arg-lys、his-his、val-val等)。这些用于突变的靶点序列是对应于seq id no:4的氨基酸43、44、70、71、96、97、104、105、131、132、162、163、189、190、220、221、247、248、
278、279、305和/或306的残基。
81.相对于seq id no:4，抗原内的单个结构域可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸处突变(例如，关于gln-gln和asp-asp序列，参见上文，而且参见wo2011/005341，其公开了结构域d的残基3和/或24处、结构域a的残基46和/或53处的突变等)。此类突变不应除去抗原引发识别seq id no:13的抗体的能力，而将减少或除去抗原与igg和/或其他人蛋白(如人血液蛋白)的结合，如上所示。在一个实施方式中，突变体spa抗原的序列包含在对应于seq id no:4的位置43、44、70、71、96、97、104、105、131、132、162、163、189、190、220、221、247、248、278、279、305和/或306的氨基酸处的至少1个、更具体地至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和甚至更具体地20个氨基酸中突变的seq id no:13或由其组成。上面提及了这些位置的有用取代。例如，spa结构域e可以在对应于seq id no:1的氨基酸残基43、44、70和/或71的位置处被突变(例如seq id no:19)。spa结构域d可以在对应于seq id no:4的氨基酸残基96、97、104、105、131和/或132的位置处突变(例如seq id no:20或24)。spa结构域a可以在对应于seq id no:4的氨基酸残基162、163、189和/或190的位置处被突变(例如seq id no:21)。spa结构域b可以在对应于seq id no:4的氨基酸残基220、221、247和/或248的位置处被突变(例如seq id no:22)。spa结构域c可以在对应于seq id no:4的氨基酸残基278、279、305和/或306的位置处被突变(例如seq id no:23)。认为对应于seq id no:4的位置43、44、96、97、104、105、162、163、220、221、278和/或279的位置处的突变减少或消除与人igg的fcγ部分的结合，而对应于seq id no:4的位置70、71、131、132、189、190、247、248、305和/或306的位置处的那些减少或消除与含有vh3的人b细胞受体的fab部分的结合。
82.因此，所述spa抗原优选地包含(a)spa结构域e、d、a、b或c的vh3-结合亚结构域中的一个或多个氨基酸取代，其破坏或减少与vh3的结合，和(b)spa结构域e、d、a、b或c的igg fc结合亚结构域中的一个或多个氨基酸取代，其破坏或减少与igg fc的结合。e/d、d/a、a/b和b/c结构域边界可以基于kim等,2014.vaccine 32:464-469中描述的结构域。
83.在一个实施方式中，所述spa抗原包含结构域e，所述结构域e在seq id no:14的氨基酸位置7和8处或在与seq id no:14至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域d，所述结构域d在seq id no:15的氨基酸位置12和13处或在与seq id no:15至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域a，所述结构域a在seq id no:16的位置9和10处或在与seq id no:16至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域b，所述结构域b在seq id no:17的位置氨基酸位置9和10处或在与seq id no:17至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代，和/或结构域c，所述结构域c在seq id no:18的位置氨基酸位置9和10处或在与seq id no:18至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代。优选地，所述氨基酸取代是赖氨酸取代谷氨酰胺，如例如seq id no:19-24中。在一个优选实施方式中，所述spa抗原进一步包含结构域d，其具有在seq id no:15的氨基酸位置4和5处的氨基酸取代，例如赖氨酸或精氨酸取代谷氨酰胺，例如kr(例如，seq id no:24或seq id no:25)。
no.1或seq id no:2的免疫原性片段和/或变体(例如seq id no 5-7)或与seq id no.1或seq id no:2至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的clfa抗原可以包含seq id no.2或seq id no:5-8的免疫原性片段，其包含全长序列的至少约15个、至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约100个、至少约300个或至少约400个连续的氨基酸残基，其中所述多肽能够引发对所述氨基酸序列特异性的免疫应答。
91.在一些实施方式中，本发明的clfa抗原可以包含clfa的亚结构域n1、n2和n3(seq id no:1)或与seq id no:1至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列(或由其组成)。在其他实施方式中，本发明的修饰的clfa抗原可以包含亚结构域n2和n3(seq id no:2)或与seq id no:2至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列(或由其组成)。
92.因此，本发明提供了clfa抗原，其包含seq id no.2的氨基酸序列或与seq id no.2至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列(例如seq id no.5)(或由其组成)。在一个实施方式中，所述clfa抗原包含糖基转移酶(例如pglb)的一个或多个共有序列，其选自：d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)，其中x和z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸。在一个实施方式中，所述共有序列是k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.28)，其中x是q(谷氨酰胺)且z是r(精氨酸)，例如k-d-q-n-r-t-k(seq id no.30)。在一个优选实施方式中，所述共有序列是k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)，其中x是q(谷氨酰胺)且z是a(丙氨酸)，例如k-d-q-n-a-t-k(seq id no.31)。所述clfa抗原可以另外通过出于克隆目的添加n-末端丝氨酸进行修饰，例如seq id no:7。所述clfa抗原可以进一步修饰以含有废除纤维蛋白原结合的突变，如下文所述，例如，seq id no 5-7。
93.在一个实施方式中，本发明的clfa抗原可以包含与seq id no.2至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其序列为seq id no.2的变体，其已通过缺失和/或添加和/或取代一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸)进行修饰。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在一个方面中，氨基酸取代是保守的。取代、缺失、添加或其任何组合可以组合在单一变体中，只要所述变体是免疫原性多肽。在一个实施方式中，本发明的clfa蛋白可以源自其中1至10、5至10、1至5、1至3、1至2或1个氨基酸被以任何组合取代、缺失或添加的变体。例如，本发明的clfa抗原可以源自作为seq id no.2的变体的氨基酸序列，因为其包含额外的n-末端丝氨酸(例如seq id no:7)。
94.在一个实施方式中，本发明包括片段和/或变体，其包含b-细胞或t-细胞表位。此类表位可以使用2d-结构预测的组合进行预测，例如使用psipred程序(来自david jones,brunel bioinformatics group,dept.biological sciences,brunel university,uxbridge ub8 3ph,uk)和基于由jameson和wolf(cabios 4:181-186[1988])描述的方法计算的抗原指数。
[0095]
在本发明的一个实施方式中，所述clfa氨基酸序列(例如，具有seq id no.2的氨基酸序列或与seq id no.2至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的clfa氨基酸序列)的一个或多个氨基酸(例如1-7个氨基酸，例如一个氨
no.3至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列(或由其组成)。
[0104]
在一个实施方式中，所述hla蛋白在seq id no.3的位置h48和g122处或在与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处包含氨基酸取代，其中所述取代分别是h至c和g至c(例如h48c和g122c，例如seq id no:10-12)。所述取代用于将二硫桥引入hla抗原，当重组产生时，其可以提高蛋白的稳定性和产率。
[0105]
因此，与缺乏二硫桥的hla、例如野生型或脱毒的hla(例如hla h35l，例如seq id no:8)相比，本发明的hla抗原可以表明降低的聚集趋势。例如，本发明的合适的修饰的hla抗原可以是表现出比野生型hla或hlah35l更少的聚集的蛋白(例如，如在western印迹上可检测到或经由色谱技术、例如imac或体积排阻色谱所测量)，如实施例中所述。例如，合适的修饰的hla抗原可以显示的聚集水平(如使用本文所述的任何方法所测定)为野生型、脱毒的(例如hlah35l)hla或其他交联的hla的聚集水平的0％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％或5％；约0％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％或5％；小于0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％或5％；《10％、《20％、《30％、《40％、《50％、《60％、《70％、《80％或《90％。例如，当使用体积排阻色谱法或imac时，代表单体hla的峰可以高于野生型hla或hlah35l或未经修饰以减少交联的其他hla，和/或代表聚集的hla的峰可以更低。
[0106]
与缺乏二硫桥的hla、例如野生型或脱毒的hla(例如hla h35l，例如seq id no:8)相比，本发明的hla抗原可以以更大的总产率产生。与缺乏二硫桥的hla、例如野生型或脱毒的hla(例如hla h35l，例如seq id no:8)相比，在总产率不更大的情况下，修饰的hla抗原可以以更大的hla单体的产率产生。例如，与野生型、脱毒的(例如hlah35l)hla或其他交联的hla的产率相比，修饰的hla抗原的产率可以增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、110％、120％、150％、200％或更多，或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、110％、120％、150％、200％或更多。蛋白产率可以如下所述测定。
[0107]
在一个实施方式中，本发明的hla抗原可以是seq id no.3或与seq id no.3至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的免疫原性片段和/或变体。在一个实施方式中，本发明的hla抗原可以包含seq id no.3或与seq id no.3至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的免疫原性片段，其包含全长序列的至少约15个、至少约20个、至少约40个或至少约60个连续的氨基酸残基，其中所述多肽能够引发对所述氨基酸序列特异性的免疫应答。
[0108]
在一个实施方式中，本发明的hla抗原可以源自与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其为seq id no.3的变体，其已通过缺失和/或添加和/或取代一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸)进行修饰。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在一个方面中，氨基酸取代是保守的。取代、缺失、添加或其任何组合可以组合在单一变体中，只要所述变体是免疫原性多肽。在一个实施方式中，本发明的修饰的hla抗原可以源自其中1至10、5至10、1至5、1至3、1至2或1个氨基酸被以任何组合取代、缺失或添加的变体。例如，本发明的修饰的hla蛋白可
以源自作为seq id no.3或8-11中的任一个的变体的氨基酸序列，因为其在n末端具有一个或两个额外的氨基酸，例如起始的n-末端s(例如seq id no.12)。修饰的hla抗原可以额外或可替代地具有在c末端的一个或多个额外的氨基酸，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸。此类额外的氨基酸可以包括有助于纯化的肽标签，并且包括例如gshrhr(例如seq id no:12)。
[0109]
在一个实施方式中，本发明包括片段和/或变体，其包含b-细胞或t-细胞表位。此类表位可以使用2d-结构预测的组合进行预测，例如使用psipred程序(来自david jones,brunel bioinformatics group,dept.biological sciences,brunel university,uxbridge ub8 3ph,uk)和基于由jameson和wolf(cabios 4:181-186[1988])描述的方法计算的抗原指数。
[0110]
因为hla是毒素，所以需要在其可以体内施用之前对其进行脱毒(即，当以适合于保护的剂量提供时，使其对哺乳动物、例如人无毒)。hla的细胞裂解活性可以通过突变参与孔形成的氨基酸残基而降低，如menzies和kernodle(menzies和kernodle,1994,infect immun 62,1843-1847)中所述。本发明的hla蛋白可以被遗传脱毒(即通过突变)。另外和/或可替代地，所述hla抗原可以通过例如与金黄色葡萄球菌荚膜多糖缀合来脱毒。遗传脱毒的序列可以除去不期望的活性，如形成脂质-双层穿透孔的能力、针对人红细胞及其他细胞的膜渗透、细胞裂解和细胞裂解活性，以便降低毒性，同时在施用于人后保留诱导抗hla保护和/或中和抗体的能力。例如，如本文所述，hla抗原可以这样改变，使得它是生物学无活性的，同时仍维持其免疫原性表位。
[0111]
本发明的hla抗原可以通过一个或多个点突变而被遗传脱毒。例如，参与孔形成的残基与hla的裂解活性有关。在一个方面中，本发明的修饰的hla抗原可以通过如下来脱毒：如menzies和kernodle(menzies和kernodle,1994,infect immun 62,1843-1847)中所述的氨基酸取代，例如用另一种氨基酸(诸如赖氨酸)取代h35、h48、h114和/或h259。例如，本发明的修饰的hla抗原可以包含选自根据seq id no.3的氨基酸序列的h35l、h114l或h259l(或与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的等同位置)的至少一个氨基酸取代。优选地，修饰的hla抗原包含取代h35l(例如，seq id no:8-12)。
[0112]
本文提及的氨基酸编号对应于seq id no.3中的氨基酸且如上所述，本领域技术人员可以通过比对确定与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的等同氨基酸位置。
[0113]
本发明的hla抗原的溶血活性可以通过例如在menzies和kernodle,1994,infect immun 62,1843-1847中描述的方法来测定和表征。可以使用体外溶血测定法来测量修饰的hla抗原相对于野生型hla的溶血(例如，细胞裂解)活性。溶血抑制测定法可用于测量针对本发明的修饰的hla抗原产生的抗血清抑制通过hla的溶血的能力，并且(通常)比较抗-(修饰的hla)抗血清与抗-(野生型hla)抗血清。例如，本发明的合适的修饰的hla抗原可以是表现出比野生型hla更低的溶血活性的抗原(例如，经由体外溶血测定法测量)。例如，合适的修饰的hla抗原可以具有的比活性(如使用体外溶血测定法所测定)为野生型hla的比活性的约(独立参考以下值中的每一个)0％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％或《10％。本发明的合适的修饰的hla抗原也可以是这样的抗原，其在施用于宿主后，引起宿主产生抑制通过野生型hla的溶血的抗体(例如，经由溶血抑制测定
法)，是免疫原性的(例如，诱导产生针对野生型hla的抗体)，和/或是保护性的(例如，诱导免疫应答，所述免疫应答针对感染保护宿主或限制已经存在的感染)。可以如实施例中所述使用测定法。
[0114]
在本发明的一个实施方式中，修饰的hla氨基酸序列(例如，具有seq id no.3的氨基酸序列或与seq id no.3至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的hla氨基酸序列，例如seq id no:8或seq id no:10)的一个或多个氨基酸(例如1-7个氨基酸，例如一个氨基酸)已经被糖基转移酶(例如pglb)的d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)或k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)(例如k-d-q-n-r-t-k(seq id no.30))共有序列取代。例如，hla氨基酸序列(例如seq id no.3)中的单个氨基酸可以被d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)或k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)(例如k-d-q-n-r-t-k(seq id no.30))共有序列(例如seq id no:9或seq id no:11-12)替代。或者，hla氨基酸序列(例如seq id no.3或与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的hla氨基酸序列)中的2、3、4、5、6或7个氨基酸可以被d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)或k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)(例如k-d-q-n-r-t-k(seq id no.30))共有序列替代。
[0115]
在一个实施方式中，选自d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)(例如k-d-q-n-r-t-k(seq id no.30))的共有序列在对应于seq id no.3的氨基酸k131的位置处或在与seq id no.1至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列(例如seq id no:9和11-12))中的等同位置中被添加或取代。在一个优选实施方式中，所述共有序列取代对应于seq id no:3的k131的氨基酸。
[0116]
选自：d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)的共有序列的引入使得hla抗原能够被糖基化。因此，本发明还提供了本发明的hla抗原，其被糖基化。在具体实施方式中，将共有序列引入hla氨基酸序列的特定区域，例如所述蛋白的表面结构，在所述蛋白的n或c末端，和/或通过二硫桥稳定的环中。在本发明的一个方面中，共有序列的位置提供改进的糖基化，例如增加的产率。
[0117]
可通过(例如)以下方式来完成此类糖基化位点的引入：将新氨基酸添加至抗原的一级结构(即，完全或部分地添加糖基化位点)，或突变抗原中的现有氨基酸以生成糖基化位点(即，不向抗原添加氨基酸，但突变抗原的所选氨基酸以形成糖基化位点)。本领域技术人员应认识到，可使用本领域中已知的方法(例如包括修饰编码抗原的核酸序列的重组方法)来容易地修饰抗原的氨基酸序列。
[0118]
在一个实施方式中，所述hla蛋白可以进一步的修饰在于所述氨基酸序列包含选自以下的一个或多个共有序列：d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)，其中x和z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸(例如seq id no.30)。可通过插入用于克隆目的的n-末端丝氨酸和/或丙氨酸来修饰这些序列，如本文所述。所述序列可以被进一步修饰以含有脱毒突变，如本文所述的脱毒突变中的任何一种或全部。优选的脱毒突变是seq id no 3的h35l。
[0119]
因此，在一个实施方式中，本发明提供了具有如下氨基酸序列的hla蛋白，所述氨基酸序列包含选自：d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)(其中x和z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸)的一个或多个共有序列，其已被重组引入
seq id no.3的hla氨基酸序列或与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的hla氨基酸序列(例如seq id no 9或10)中。
[0120]
在一个优选实施方式中，本发明的hla蛋白包含seq id no.11的氨基酸序列(或由其组成)。在一个实施方式中，本发明的修饰的hla抗原包含具有n-末端丝氨酸和/或丙氨酸(即在n-末端添加的s残基)的seq id no.3或8-11中任一个的氨基酸序列(或由其组成)。在一个实施方式中，本发明的修饰的hla抗原包含seq id no.12的氨基酸序列(或由其组成)。
[0121]
在一个实施方式中，本发明的hla抗原进一步包含"肽标签"或"标签"，即允许分离和/或鉴定修饰的hla抗原的氨基酸序列。例如，向本发明的修饰的hla抗原添加标签可用于纯化该抗原且因此纯化包含标记的修饰的hla抗原的缀合物疫苗。可用于本文中的示例性标签包括但不限于组氨酸(his)标签。在一个实施方式中，所述标签是六组氨酸标签。在另一个实施方式中，所述标签是hr标签，例如hrhr标签。在某些实施方式中，本文使用的标签是可除去的，例如一旦不再需要它们(例如在已纯化抗原之后)，就通过化学剂或通过酶促方式除去。任选地，所述肽标签位于氨基酸序列的c-末端。任选地，所述肽标签包含在氨基酸序列的c-末端的六个组氨酸残基。任选地，所述肽标签包含在氨基酸序列的c-末端的四个hr残基(hrhr)。所述肽标签可以包含或前置一个、两个或更多个额外的氨基酸残基，例如丙氨酸、丝氨酸和/或甘氨酸残基，例如gs。在一个方面中，本发明的修饰的hla抗原包含与seq id no.3的序列至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列(或由其组成)，所述氨基酸序列包含d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)共有序列(其中x和z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸)(例如k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)或k-d-q-n-r-t-k(seq id no.30))和选自h35l、h48c和g122c的至少一个氨基酸取代以及在该氨基酸序列的c-末端的gshrhr肽标签。任选地，本发明的修饰的hla抗原与seq id no.3或9-12具有至少97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
[0122]
在一个实施方式中，在所述成熟蛋白的n-末端处添加丝氨酸和/或丙氨酸残基，例如sa或s，优选s(例如seq id no:12)。此类一个或多个残基具有导致前导序列的更有效切割的优点。
[0123]
在一个方面中，本发明的hla抗原包含与seq id no.3的序列至少97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列(或由其组成)，所述氨基酸序列包含氨基酸取代g122至c、h48至c和h35至l，取代对应于seq id no:3的位置k131的氨基酸的k-d-q-n-r-t-k(seq id no.30))，在氨基酸序列(例如seq id no:11或seq id no:12)的c-末端处的hrhr标签(seq id no:32)。
[0124]
在一个优选实施方式中，所述hla蛋白包含seq id no:11的氨基酸序列(或由其组成)。在一个优选实施方式中，所述hla蛋白包含seq id no:12的氨基酸序列(或由其组成)。
[0125]
多糖抗原
[0126]
75％的金黄色葡萄球菌菌株表达型5或型8荚膜多糖，因此包含cp5和cp8的疫苗可能会提供针对大多数循环金黄色葡萄球菌菌株的保护。
[0127]
因此，本发明的组合物包含来自金黄色葡萄球菌的细菌荚膜糖。来自金黄色葡萄球菌的细菌荚膜糖可以选自金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜糖。
[0128]
在本发明的一个实施方式中，所述抗原是来自金黄色葡萄球菌的细菌荚膜糖的重复单元。在本发明的一个实施方式中，所述抗原包含来自金黄色葡萄球菌血清型5或8的细
菌荚膜糖的重复单元。
[0129]
在本发明的一个实施方式中，所述抗原包含来自金黄色葡萄球菌血清型8的细菌荚膜糖的重复单元。在该实施方式中，所述抗原包含：
[0130][0131]
在本发明的一个实施方式中，所述抗原包含来自金黄色葡萄球菌血清型5的细菌荚膜糖的重复单元。在本发明的该实施方式中，所述抗原包含：
[0132][0133]
在一个实施方式中，所述抗原是多糖。在一个实施方式中，所述抗原包含两个或更多个单糖，例如3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多个单糖。在一个实施方式中，所述抗原是含有不超过20、15、12、10、9或8个单糖的多糖。
[0134]
在一个实施方式中，将所述荚膜多糖抗原缀合至载体蛋白。下面描述了本发明的缀合物。
[0135]
缀合物
[0136]
本发明还提供了缀合物(例如生物缀合物)，其包含与载体蛋白连接、例如共价连接的如本文所述的荚膜糖(或由其组成)。在一个实施方式中，所述载体蛋白是本发明的hla蛋白。在一个实施方式中，所述蛋白是本发明的clfa蛋白。
[0137]
在一个实施方式中，所述载体蛋白通过使用化学缀合方法可获得的化学键共价连接至所述多糖抗原(即，所述缀合物通过化学缀合产生)。
[0138]
在一个实施方式中，所述化学缀合方法选自碳二亚胺化学法、还原性胺化、氰化化学法(例如cdap化学法)、马来酰亚胺化学法、酰肼化学法、酯化学法和n-羟基琥珀酰亚胺化学法。缀合物可以通过直接还原胺化方法进行制备，如us200710184072(hausdorff)、us 4365170(jennings)和us 4673574(anderson)中描述的。其他方法在ep-0-161-188、ep-208375和ep-0-477508中描述。或者，缀合方法可以依赖使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(cdap)的糖活化，以形成氰酸酯。此类缀合物在pct公开申请wo 93/15760uniformed services university以及wo 95/08348和wo 96/29094中描述。还参见chu c.等，infect.immunity,1983 245 256。
[0139]
通常，在修饰的clfa蛋白上的以下类型的化学基团可以用于偶联/缀合：
[0140]
a)羧基(例如经由天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方式中，该基团直接连接至糖上的氨基或用碳二亚胺化学法例如edac连接至接头上的氨基。
[0141]
b)氨基(例如经由赖氨酸)。在一个实施方式中，该基团直接连接至糖上的羧基或用碳二亚胺化学法例如edac连接至接头上的羧基。在另一个实施方式中，该基团直接连接至糖上由cdap或cnbr活化的羟基或者连接至接头上的此类基团；连接至具有醛基的糖或接头；连接至具有琥珀酰亚胺酯基团的糖或接头。
[0142]
c)巯基(例如经由半胱氨酸)。在一个实施方式中，该基团由马来酰亚胺化学法连接至溴或氯乙酰化的糖或者接头。在一个实施方式中，该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。
[0143]
d)羟基(例如经由酪氨酸)。在一个实施方式中，该基团由用双重氮联苯胺活化/修饰。
[0144]
e)咪唑基(例如经由组氨酸)。在一个实施方式中，该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。
[0145]
f)胍基(例如经由精氨酸)。
[0146]
g)吲哚基(例如经由色氨酸)。
[0147]
在糖上，通常，以下基团能够用于偶联：oh、cooh或nh2。醛基能够在不同处理后生成，所述处理如：高碘酸盐、酸水解、过氧化氢等。
[0148]
直接偶联方法：
[0149]
糖-oh cnbr或cdap
‑‑‑‑‑
》氰酸酯 nh
2-蛋白
‑‑‑‑
》缀合物
[0150]
糖-醛 nh
2-蛋白
‑‑‑‑
》希夫碱 nacnbh3
‑‑‑‑
》缀合物
[0151]
糖-cooh nh
2-蛋白 edac
‑‑‑‑
》缀合物
[0152]
糖-nh2 cooh-蛋白 edac
‑‑‑‑
》缀合物
[0153]
经由间隔物(接头)的间接偶联方法：
[0154]
糖-oh cnbr或cdap
‑‑‑
》氰酸酯 nh2‑‑‑‑
nh2‑‑‑‑
》糖
‑‑‑‑
nh2 cooh-蛋白 edac
‑‑‑‑‑
》缀合物
[0155]
糖-oh cnbr或cdap
‑‑‑‑
》氰酸酯 nh2‑‑‑‑‑
sh
‑‑‑‑‑
》糖
‑‑‑‑
sh sh-蛋白(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或通过例如spdp修饰蛋白的氨基后获得)
‑‑‑‑‑
》糖-s-s-蛋白
[0156]
糖-oh cnbr或cdap
‑‑‑
》氰酸酯 nh2‑‑‑‑
sh
‑‑‑‑‑‑‑
》糖
‑‑‑‑
sh 马来酰亚胺-蛋白(氨基的修饰)
‑‑‑‑
》缀合物
[0157]
糖-oh cnbr或cdap
‑‑‑
》氰酸酯 nh2‑‑‑‑‑
sh
‑‑‑
》糖-sh 卤代乙酰化-蛋白
‑‑‑‑
》缀合物
[0158]
糖-cooh edac nh2‑‑‑‑‑
nh2‑‑‑
》糖
‑‑‑‑‑‑
nh2 edac cooh-蛋白
‑‑‑‑
》缀合物
[0159]
糖-cooh edac nh2‑‑‑‑
sh
‑‑‑‑‑
》糖
‑‑‑‑
sh sh-蛋白(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或通过例如spdp修饰蛋白的氨基后获得)
‑‑‑‑‑
》糖-s-s-蛋白
[0160]
糖-cooh edac nh2‑‑‑‑
sh
‑‑‑‑‑
》糖
‑‑‑‑
sh 马来酰亚胺-蛋白(氨基的修饰)
‑‑‑‑
》缀合物
[0161]
糖-cooh edac nh2‑‑‑‑
sh
‑‑‑
》糖-sh 卤代乙酰化-蛋白
‑‑‑‑
》缀合物
[0162]
糖-醛 nh2‑‑‑‑‑
nh2‑‑‑‑
》糖
‑‑‑
nh2 edac cooh-蛋白
‑‑‑‑
》缀合物
[0163]
注：可以使用任何合适的碳二亚胺代替上述edac。
[0164]
在一个实施方式中，抗原直接连接至载体蛋白。
[0165]
在一个实施方式中，抗原经由接头附接至载体蛋白。任选地，接头选自具有4-12个碳原子的接头、双官能接头、在末端含有1或2个反应性氨基的接头、b-丙酰胺基、硝基苯基-乙胺、卤代酰基卤化物、6-氨基己酸和adh。活化的糖因此可以与载体蛋白上的氨基直接偶联或经由间隔物(接头)基团偶联。例如，间隔物可以是胱胺或半胱胺，以获得硫醇化多糖，其可以经由硫醚键偶联至载体，所述硫醚键在与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如使用gmbs(4-马来酰亚胺基丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯))或卤代乙酰化的载体蛋白(例如使用
siab((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯)或sia(碘乙酸琥珀酰亚胺基酯)或sbap(琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰胺)丙酸酯))反应后获得。在一个实施方式中，氰酸酯(任选通过cdap化学法制备)与己二胺或adh(己二酸二酰肼)偶联，并且经由在蛋白载体上的羧基，使用碳二亚胺(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edac或edc))化学法，使氨基衍生的糖缀合至载体蛋白。此类缀合物描述于pct公开申请wo 93/15760 uniformed services university以及wo 95/08348和wo 96/29094。
[0166]
在一个实施方式中，所述抗原与之连接的载体蛋白上的氨基酸残基不是天冬酰胺残基，并且在这种情况下，缀合物通常通过化学缀合产生。在一个实施方式中，所述抗原与之连接的载体蛋白上的氨基酸残基选自：ala、arg、asp、cys、gly、glu、gln、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr和val。任选地，所述氨基酸是：含有末端胺基团的氨基酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸或色氨酸。任选地，所述抗原共价连接至载体蛋白上的氨基酸，所述氨基酸选自：天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸。
[0167]
在一个实施方式中，所述抗原与载体蛋白上的氨基酸连接，所述氨基酸选自天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸(例如天冬酰胺)。在一个实施方式中，所述抗原与之连接的载体蛋白上的氨基酸残基是天冬酰胺残基。在一个实施方式中，所述抗原与之连接的载体蛋白上的氨基酸残基是d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)共有序列的一部分(例如d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)共有序列中的天冬酰胺)。
[0168]
本发明提供了包含与金黄色葡萄球菌荚膜糖(例如荚膜多糖)连接的如本文所述的clfa或hla蛋白的生物缀合物。在一个具体实施方式中，所述生物缀合物包含如本文所述的clfa或hla蛋白和选自金黄色葡萄球菌血清型cp5或cp8的荚膜糖(例如荚膜多糖)的抗原。在一个实施方式中，所述生物缀合物包含本发明的clfa抗原和来自金黄色葡萄球菌血清型cp8的荚膜糖(例如荚膜多糖)的抗原。在一个实施方式中，所述生物缀合物包含本发明的hla抗原和来自金黄色葡萄球菌血清型cp5的荚膜糖(例如荚膜多糖)的抗原。
[0169]
使用宿主细胞产生生物缀合物的方法例如描述于wo 2003/074687、wo 2006/119987和wo2011/138361中。
[0170]
生物缀合物可以在宿主细胞中产生，所述宿主细胞包含：一种或多种编码糖基转移酶的核酸；编码寡糖基转移酶的核酸；编码本发明的多肽的核酸；和任选地编码聚合酶的核酸(例如wzy)。
[0171]
可用于产生本发明的生物缀合物的宿主细胞包括古生菌(archea)、原核宿主细胞和真核宿主细胞。用于产生本发明的生物缀合物的示例性原核宿主细胞不限于埃希氏杆菌属(escherichia)物种、志贺氏菌属(shigella)物种、克雷伯氏菌属(klebsiella)物种、黄单胞菌属(xhantomonas)物种、沙门氏菌属(salmonella)物种、耶尔森菌属(yersinia)物种、乳球菌属(lactococcus)物种、乳杆菌属(lactobacillus)物种、假单胞菌属(pseudomonas)物种、棒状杆菌属(corynebacterium)物种、链霉菌属(streptomyces)物种、链球菌属(streptococcus)物种、葡萄球菌属(staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(bacillus)物种和梭状芽孢杆菌属(clostridium)物种。在一个具体实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
[0172]
在一个实施方式中，用于产生本发明的生物缀合物的宿主细胞进行工程改造以包含异源性核酸，例如编码一种或多种载体蛋白的异源性核酸和/或编码一种或多种蛋白的异源性核酸(例如编码一种或多种蛋白的基因)。在一个具体实施方式中，可将编码参与糖基化途径(例如，原核和/或真核糖基化途径)的蛋白的异源性核酸引入宿主细胞中。此类核酸可编码蛋白，包括但不限于寡糖基转移酶、差向异构酶、翻转酶、聚合酶和/或糖基转移酶。可使用方法(诸如电穿孔、通过热休克的化学转化、自然转化、噬菌体转导和接合)将异源性核酸(例如，编码载体蛋白的核酸和/或编码其他蛋白(例如参与糖基化的蛋白)的核酸)引入宿主细胞中。在具体实施方案中，使用质粒将异源性核酸引入宿主细胞中，例如，通过质粒(例如表达载体)使异源性核酸表达于宿主细胞中。在另一个具体实施方式中，使用国际专利申请号pct/ep2013/068737(公开为wo 14/037585)中描述的插入方法将异源性核酸引入宿主细胞中。
[0173]
可将额外修饰引入(例如，使用重组技术)宿主细胞中。例如，编码形成可能竞争或干扰糖基化途径(例如，竞争或干扰一种或多种重组引入宿主细胞中的参与糖基化的异源性基因)的部分的蛋白的宿主细胞核酸(例如基因)可在宿主细胞背景(基因组)中以使其失活/功能失调的方式缺失或修饰(即，缺失/修饰的宿主细胞核酸不编码功能蛋白或无论如何不编码任何蛋白)。当核酸从宿主细胞的基因组缺失时，其可以由所需序列(例如可用于糖蛋白产生的序列)代替。
[0174]
可在宿主细胞中缺失(和在一些情况下被其他所需核酸序列代替)的示例性基因包括参与糖脂生物合成的宿主细胞的基因，如waal(参见例如，feldman等，2005,pnas usa 102：3016-3021)、脂质a核心生物合成簇(waa)、半乳糖簇(gal)、阿拉伯糖簇(ara)、可拉酸(colonic acid)簇(wc)、荚膜多糖簇、十一异戊烯醇-焦磷酸酯生物合成基因(例如，upps(焦磷酸十一异戊烯基酯合酶)、uppp(十一异戊烯基二磷酸酶))、und-p再循环基因、参与核苷酸活化的糖生物合成的代谢酶、肠杆菌普通抗原簇和原噬菌体o抗原修饰簇(如gtrabs簇)。
[0175]
这种修饰的原核宿主细胞包含编码能够产生包含与本发明的多肽附接的抗原(例如糖抗原)的生物缀合物的酶的核酸。此类宿主细胞可以天然地表达对糖抗原的产生特异性的核酸，或者可以制备宿主细胞以表达此类核酸，即在某些实施方式中，所述核酸对于宿主细胞是异源的。对于糖抗原产生具有特异性的所述核酸中的一种或多种对于宿主细胞可以是异源的并且整合至宿主细胞的基因组中。所述宿主细胞可以包含编码在蛋白的n-糖基化中有活性的额外酶的核酸，例如，所述宿主细胞进一步包含编码寡糖基转移酶的核酸和/或编码其他糖基转移酶的一种或多种核酸。
[0176]
包含荚膜多糖基因簇的核酸序列可插入宿主细胞中。例如，插入宿主细胞中的荚膜多糖基因簇可以是来自葡萄球菌菌株(例如，金黄色葡萄球菌)的荚膜多糖基因簇，如下所述。
[0177]
宿主细胞包含和/或可被修饰为包含这样的核酸，其编码能够产生杂合多糖的遗传机制(例如，糖基转移酶、翻转酶、聚合酶和/或寡糖基转移酶)，以及能够将抗原与本发明的多肽连接的遗传机制。
[0178]
金黄色葡萄球菌荚膜多糖通过保守途径被组装在细菌膜载体脂质焦磷酸十一异戊烯基酯上，所述保守途径与革兰氏阴性细菌中的o多糖合成的聚合酶依赖性途径共享同
源性。o抗原组装是通过将糖磷酸酯从dp-供体转移至磷酸十一异戊烯基酯而引发的。通过不同糖基转移酶的依次作用，脂质连接的o抗原在内膜的细胞质侧组装。然后将糖脂翻转至周质空间并聚合。通过用寡糖基转移酶pglb替代o抗原连接酶waal，可以将聚合的o抗原转移至蛋白载体而不是脂质a核心。
[0179]
所述宿主细胞进一步包含编码产生多糖重复单元的糖基转移酶的核酸。优选地，所述重复单元在还原末端不包含己糖，且所述多糖重复单元源自在还原末端包含己糖的供体多糖重复单元。
[0180]
所述宿主细胞可以包含编码将己糖单糖衍生物组装至焦磷酸十一异戊烯基酯(und-pp)上的糖基转移酶的核酸。在一个方面中，所述将己糖单糖衍生物组装至und-pp上的糖基转移酶与所述宿主细胞异源和/或与编码糖基转移酶的基因中的一种或多种异源。所述糖基转移酶可以源自例如埃希氏杆菌属物种、志贺氏菌属(shigella)物种、克雷伯氏菌属(klebsiella)物种、黄单胞菌属(xhantomonas)物种、沙门氏菌属(salmonella)物种、耶尔森菌属(yersinia)物种、气单胞菌属(aeromonas)物种、弗朗西斯氏菌属(francisella)物种、螺杆菌属(helicobacter)物种、变形杆菌属(proteus)物种、乳球菌属(lactococcus)物种、乳杆菌属(lactobacillus)物种、假单胞菌属(pseudomonas)物种、棒状杆菌属(corynebacterium)物种、链霉菌属(streptomyces)物种、链球菌属(streptococcus)物种、肠球菌属(enterococcus)物种、葡萄球菌属(staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(bacillus)物种、梭状芽孢杆菌属(clostridium)物种、李斯特菌属(listeria)物种或弯曲杆菌属(campylobacter)物种。通常，所述将己糖单糖衍生物组装至und-pp上的糖基转移酶是weca，任选地来自大肠杆菌(weca可以将glcnac从udp-glcnac组装至undp上)。所述己糖单糖可以选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖醇、岩藻糖和甘露糖(例如半乳糖)。
[0181]
所述宿主细胞可以包含编码能够将单糖添加至组装在und-pp上的己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶的核酸。例如，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶可以是来自鲍氏志贺氏菌(shigella boyedii)的半乳糖基转移酶(wfed)；来自大肠杆菌o28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbey)；或来自大肠杆菌o167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdk)。galf-转移酶，如wfdk和wbey，可以将galf(呋喃半乳糖)从udp-galf转移至-glcnac-p-p-十一异戊烯基。优选地，所述能够将单糖添加至所述己糖单糖衍生物的一种或多种糖基转移酶是来自大肠杆菌o28的半乳糖呋喃糖基转移酶(wbey)和来自大肠杆菌o167的半乳糖呋喃糖基转移酶(wfdk)。
[0182]
所述宿主细胞可以包含编码将供体多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶的核酸。所述将供体寡糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶可以包含能够将存在于所述供体多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖添加至己糖单糖衍生物的糖基转移酶。示例性糖基转移酶包括半乳糖基转移酶(wcip)，例如来自大肠杆菌o21的wcip。
[0183]
所述将供体多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶包含能够将邻近于存在于所述供体多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的单糖添加至存在于所述供体多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖的糖基转移酶。示例性糖基转移酶包括葡糖基转移酶(wciq)，例如来自大肠杆菌o21的wciq。
[0184]
所述宿主细胞可以包含糖基转移酶，其用于合成选自金黄色葡萄球菌cp5或cp8基因簇的多糖的重复单元。金黄色葡萄球菌cp5和cp8具有与绿脓杆菌(p.aeruginosa)o11抗原合成基因相似的结构，因此这些基因可以与大肠杆菌单糖合成基因组合以合成焦磷酸十一异戊烯基酯连接的由重复三糖单元组成的cp5或cp8聚合物。
[0185]
足以合成cp5或cp8糖的重复单元的糖基转移酶包含来自金黄色葡萄球菌cp5或cp8的caph、capi、capj和/或capk。任选地，所述宿主细胞还包含来自金黄色葡萄球菌cp5或cp8的capd、cape、capf、capg、capl、capm、capn、capo、capp。或者，所述宿主细胞还包含来自绿脓杆菌o11的wbjb、wbjc、wbjd、wbje、wbjf、wbjl、wbpm、wzz和/或wzx以及来自大肠杆菌o16的wecb、wecc。
[0186]
足以合成cp5糖的重复单元的糖基转移酶包含来自金黄色葡萄球菌cp5的caph、capi、capj和/或capk。任选地，所述宿主细胞还包含来自金黄色葡萄球菌cp5的capd、cape、capf、capg、capl、capm、capn、capo、capp。或者，所述宿主细胞还包含来自绿脓杆菌o11的wbjb、wbjc、wbjd、wbje、wbjf、wbjl、wbpm、wzz和/或wzx以及来自大肠杆菌o16的wecb、wecc。
[0187]
所述宿主细胞可以包含将供体多糖重复单元组装至己糖单糖衍生物上的糖基转移酶，其包含能够将存在于所述供体多糖的第一重复单元的还原末端的己糖单糖添加至己糖单糖衍生物的糖基转移酶。
[0188]
n-连接的蛋白糖基化-将碳水化合物分子添加至靶蛋白的多肽链中的天冬酰胺残基-通过酶促的寡糖基转移酶复合体(ost)完成，所述寡糖基转移酶复合体(ost)负责将来自脂质载体(磷酸多萜醇)的预装配寡糖转移至在内质网中的新生蛋白保守序列asn-x-ser/thr(其中x是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)内的天冬酰胺残基。
[0189]
已经显示，一种细菌，食物传染病原体空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)，也可以将其蛋白n-糖基化(wacker等，science.2002；298(5599):1790-3)，这是由于其拥有其自身的糖基化机制的事实。负责该反应的机制由被称为“pgl”的簇编码(用于蛋白糖基化)。
[0190]
可以将空肠弯曲杆菌糖基化机制转移至大肠杆菌，以允许由大肠杆菌细胞表达的重组蛋白的糖基化。先前的研究已表明如何生成可进行n-糖基化的大肠杆菌菌株(参见，例如，wacker等，science.2002；298(5599):1790-3；nita-lazar等，glycobiology.2005；15(4):361-7；feldman等，proc natl acad sci u s a.2005；102(8):3016-21；kowarik等，embo j.2006；25(9):1957-66；wacker等，proc natl acad sci u s a.2006；103(18):7088-93；国际专利申请公开号wo2003/074687、wo2006/119987、wo 2009/104074和wo/2011/06261和wo2011/138361)。具有优化的特性的pglb突变体描述于wo2016/107818中。优选的突变体是pglb
cuon311v-k482r-d483h-a669v
。
[0191]
寡糖基转移酶将脂质-连接的寡糖转移至包含n-糖基化共有基序(例如asn-x-ser(thr)，其中x可以是除pro外的任何氨基酸；或asp(glu)-x-asn-z-ser(thr)，其中x和z独立地选自除pro外的任何天然氨基酸)的新生多肽链的天冬酰胺残基(参见wo 2006/119987)。参见例如，wo 2003/074687和wo 2006/119987。
[0192]
所述宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸。编码寡糖基转移酶的核酸可对宿主细胞是天然的，或可使用遗传方法引入宿主细胞中，如上文所述。优选地，寡糖基转移酶是来自弯曲杆菌(campylobacter)、具体地空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)的寡糖基转移酶(即pglb；参见例如wacker等，2002,science 298：1790-1793；还参见例如ncbi基因
id：3231775,uniprot登录号o86154)。
[0193]
因此，金黄色葡萄球菌荚膜多糖的生物缀合物可以在原核宿主细胞中产生，所述原核宿主细胞包含：(i)源自来自金黄色葡萄球菌的荚膜多糖簇的糖基转移酶，其中所述糖基转移酶被整合至所述宿主细胞的基因组中；(ii)编码寡糖基转移酶(例如，来自空肠弯曲杆菌的pglb)的核酸，其中所述编码寡糖基转移酶的核酸是质粒携带的和/或被整合至宿主细胞的基因组中；和(iii)本发明的多肽，其中所述多肽是质粒携带的或被整合至宿主细胞的基因组中。所述宿主细胞的waal基因可以被功能失活或缺失，例如，被编码寡糖基转移酶的核酸，例如，被空肠弯曲杆菌pglb替代。
[0194]
为了产生荚膜糖的多糖和寡糖，将聚合酶(例如，wzy)引入宿主细胞(即，聚合酶与宿主细胞异源)。为了产生金黄色葡萄球菌cp5和cp8，引入宿主细胞的聚合酶是来自金黄色葡萄球菌cp5或cp8(cap5j/cap8i)的荚膜多糖基因簇的wzy基因。
[0195]
最后，将翻转酶(wzx或同源物)引入所述宿主细胞(即，翻转酶与宿主细胞异源)。翻转酶将野生型重复单元和/或其相应的工程改造(杂合)重复单元从胞浆转运至宿主细胞(例如，大肠杆菌)的周质中。因此，宿主细胞可以包含编码翻转酶(wzx)的核酸。优选地，将金黄色葡萄球菌的荚膜多糖生物合成途径的翻转酶引入宿主细胞。引入所述宿主细胞的翻转酶可以是来自金黄色葡萄球菌cp5或cp8的荚膜多糖基因簇的capk基因。可以引入所述宿主细胞的其他翻转酶例如来自空肠弯曲杆菌(例如，pglk)。
[0196]
本发明的生物缀合物例如通过色谱法(例如，离子交换、阳离子交换、阴离子交换、亲和性和大小分级柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过任何其他用于纯化蛋白的标准技术来纯化。参见例如，saraswat等，2013,biomed.res.int.id#312709(p.1-18)；还参见wo 2009/104074中描述的方法。此外，生物缀合物可以与本文所述的或本领域以其他方式已知的异源多肽序列融合以促进纯化。例如，hla蛋白可并入肽标签，如用于通过阳离子交换进行纯化的hrhr标签(例如，seq id no:12)。用于纯化特定生物缀合物的实际条件将部分取决于合成策略和因素诸如生物缀合物的净电荷、疏水性和/或亲水性，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
[0197]
本发明的一个进一步方面是用于产生生物缀合物的方法，所述生物缀合物包含与糖连接的clfa或hla抗原(或由其组成)，所述方法包括(i)在适合于产生蛋白的条件下(和任选地在适合于产生糖的条件下)培养本发明的宿主细胞，和(ii)分离由所述宿主细胞产生的生物缀合物。
[0198]
本发明的一个进一步方面是通过本发明的方法产生的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含与clfa或hla抗原连接的金黄色葡萄球菌多糖。
[0199]
免疫原性组合物和疫苗
[0200]
本发明的免疫原性组合物可以在施用于受试者之前被制备成药物组合物。根据一个方面，本发明提供了包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。
[0201]
本发明还提供了包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体的疫苗。还提供了与如本文所述的本发明的免疫原性组合物和疫苗一起使用的佐剂组合物，所述组合物包含佐剂和药学上可接受的赋形剂或载体。
[0202]
药学上可接受的赋形剂和载体可以由本领域技术人员选择。例如，所述药学上可
接受的赋形剂或载体可以包括缓冲液，诸如tris(三甲胺)，磷酸盐(例如，磷酸钠)，乙酸盐，硼酸盐(例如，硼酸钠)，柠檬酸盐，甘氨酸，组氨酸和琥珀酸盐(例如，琥珀酸钠)，合适地，氯化钠，组氨酸，磷酸钠或琥珀酸钠。所述药学上可接受的赋形剂可以包括盐，例如氯化钠、氯化钾或氯化镁。任选地，所述药学上可接受的赋形剂包含至少一种稳定溶解度和/或稳定性的组分。增溶剂/稳定剂的实例包括去污剂，例如月桂肌氨酸和/或聚山梨醇酯(例如，tween
tm 80)。稳定剂的实例还包括泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407)。所述药学上可接受的赋形剂可以包括非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯-80(tween
tm 80)、聚山梨醇酯-60(tween
tm 60)、聚山梨醇酯-40(tween
tm 40)和聚山梨醇酯-20(tween
tm 20)或聚氧乙烯烷基醚(适合地，聚山梨醇酯-80)。替代的增溶剂/稳定剂包括精氨酸和玻璃形成多元醇(如蔗糖、海藻糖等)。药物赋形剂可以是防腐剂，例如苯酚、2-苯氧基乙醇或硫柳汞。其他药学上可接受的赋形剂包括糖(例如，乳糖、蔗糖)和蛋白(例如，明胶和白蛋白)。药学上可接受的载体包括水、盐水溶液、水性右旋糖和甘油溶液。许多药学上可接受的赋形剂和载体描述于例如remington”s pharmaceutical sciences,e.w.martin,mack publishing co.easton,pa,第5版(975)。
[0203]
在一个实施方式中，赋形剂在聚山梨醇酯-80(cas no 90,5-65-6)，也称为tween
tm 80、poe(20)山梨糖醇单油酸酯、聚乙二醇山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯中。
[0204]
本发明的免疫原性组合物可以以液体形式，例如水溶液，或以固体形式，例如冻干(冷冻干燥)形式。在一个实施方式中，疫苗抗原是冻干的，佐剂以水溶液形式提供。疫苗抗原可以在使用前用含有佐剂的溶液重构。
[0205]
在一个实施方式中，所述组合物包含缓冲液。鉴于组合物的组分和用于施用于受试者的必要适合性，调节液体制备物的ph。合适地，液体混合物的ph为至少4，至少5，至少5.5，至少5.8，至少6。液体混合物的ph可以为小于9，小于8，小于7.5或小于7。在其他实施方式中，液体混合物的ph为4至9，5至8，诸如5.5至8。
[0206]
适当的缓冲液可以选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和tris。在一个实施方式中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液，诸如na/na2po4、na/k2po4或k/k2po4。
[0207]
所述缓冲液可以以至少6mm、至少10mm或至少40mm的量存在于液体混合物中。所述缓冲液可以以小于100mm、小于60mm或小于40mm的量存在于液体混合物中。
[0208]
在一个实施方式中，本发明的组合物具有药学上可接受的重量摩尔渗透压浓度，以避免细胞变形或裂解。药学上可接受的重量摩尔渗透压浓度将通常意味着溶液将具有近似等渗或轻度高渗的重量摩尔渗透压浓度。合适地，本发明的组合物当重构时将具有250至750mosm/kg范围内的重量摩尔渗透压浓度，例如，重量摩尔渗透压浓度可以在250至550mosm/kg的范围内，如280至500mosm/kg的范围内。
[0209]
可以根据本领域中已知的技术，如通过使用商业上获得的渗压计，例如从advanced instruments inc.(usa)可获得的model 2020测量重量摩尔渗透压浓度。
[0210]“等渗剂”是生理上耐受的并赋予制剂合适涨度(tonicity)以防止跨越与制剂接
触的细胞膜的水的净流动的化合物。在一些实施方式中，用于组合物中的等渗剂是盐(或盐的混合物)。然而，在其他实施方式中，所述组合物包含非离子等渗剂，并且组合物中的氯化钠的浓度小于100mm，如小于80mm，例如小于50mm，如小于40mm，小于30mm，且特别是小于20mm。组合物中的离子强度可以小于100mm，如小于80mm，例如小于50mm，如小于40mm或小于30mm。
[0211]
在一个特定实施方式中，所述非离子等渗剂是多元醇，如山梨醇。山梨醇的浓度可以是例如约3％至约15％(w/v)，如约4％至约10％(w/v)。包含免疫活性皂苷级分和tlr4激动剂的佐剂(其中等渗剂是盐或多元醇)已描述于wo2012/080369中。
[0212]
在一个实施方式中，本发明的组合物额外包含一种或多种盐，例如氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸单钠和铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝、alum(硫酸钾铝)或此类铝盐的混合物)。在其他实施方式中，本发明的组合物不包含盐。
[0213]
本发明还提供了制备本发明的免疫原性组合物或疫苗的方法，其包括将本发明的抗原与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。
[0214]
免疫原性组合物包含免疫有效量的本发明的蛋白或缀合物(例如，生物缀合物)以及任何其他组分。“免疫有效量”意味着将该量作为单一剂量或作为系列的一部分施用给个体对治疗或预防有效。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、期望的保护程度、疫苗制剂和其他相关因素而不同。预计该量将落入可以通过常规试验确定的相对宽的范围。
[0215]
疫苗制剂通常描述于vaccine design(“the subunit and adjuvant approach”(编辑powell m.f.&newman m.j.)(1995)plenum press new york)。fullerton,美国专利4,235,877描述了脂质体内的包封。
[0216]
本发明的免疫原性组合物和疫苗可与施用说明一起包括于容器、包装或分配器中。本发明提供了试剂盒，其包含：(i)第一容器，其包含本发明的免疫原性组合物或疫苗；和(ii)第二容器，其包含如本文所述的佐剂。
[0217]
佐剂
[0218]
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含佐剂，或与佐剂组合施用。与本发明的免疫原性组合物组合施用的佐剂可在施用所述免疫原性组合物或疫苗之前、同时或之后施用。在一个实施方式中，在施用前，所述佐剂与免疫原性组合物混合。
[0219]
佐剂可通过几种机制增强免疫应答，包括，例如，淋巴细胞募集、刺激b和/或t细胞和刺激巨噬细胞。在一个实施方式中，将佐剂选择为th1或th2类型应答、优选th1类型应答的优选诱导物。高水平的th1类型细胞因子趋于促进诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的th2类型细胞因子趋于促进诱导针对抗原的体液免疫应答。重要的是要记住，th1和th2型免疫应答的区别并不是绝对的。事实上，个体将支持被描述为主要是th1或主要是th2的免疫应答。然而，通常方便的是考虑根据由mosmann和coffman在鼠cd4 ve t细胞克隆中所述的细胞因子家族(mosmann,t.r.和coffman,r.l.(1989)th1 and th2 cells:different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.annual review of immunology,7,p145-173)。传统上，th1型应答与由t淋巴细胞产生inf-γ和il-2细胞因子相关。其他通常与th1型免疫应答的诱导直接相关的细胞因子不是由t细胞产生的，如il-12。相反，th2型应答与il-4、il-5、il-6、il-10的分泌有关。
促进主要是th1应答的合适的佐剂系统包括：单磷酰脂质a或其衍生物，特别是3-脱-o-酰化单磷酰脂质a(3d-mpl)(对于其制备参见gb 2220211 a)；mpl，例如脂质体中的3d-mpl和皂苷qs21，例如包含胆固醇和dpoc的脂质体；和单磷酰脂质a，例如3-脱-o-酰化单磷酰脂质a、连同铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳剂的组合。在此类组合中，所述抗原和3d-mpl可以包含在相同的微粒结构中，允许更有效递送抗原性和免疫刺激性信号。研究已显示3d-mpl能够进一步增强明矾吸附的抗原的免疫原性(thoelen等，vaccine(1998)16:708-14；ep 689454-b1)。
[0220]
在一个实施方式中，所述佐剂包含tlr4激动剂和免疫活性皂苷两者。在一个实施方式中，所述tlr4激动剂是脂多糖。合适地，所述皂苷包含源自皂皮树(quillaja saponaria molina)的树皮的皂苷的活性级分，如qs21。合适地，所述脂多糖是脂质-a衍生物，如3d-mpl。在一个具体实施方式中，所述脂多糖是3d-mpl，且所述免疫活性皂苷是qs21。在一个实施方式中，所述佐剂组合物在脂质体制剂中包含脂多糖和免疫活性皂苷。合适地，在该实施方式的一种形式中，所述佐剂基本上由3d-mpl和qs21与任选地甾醇组成，所述甾醇优选为胆固醇。
[0221]
脂质体大小可以从30nm至几μm变化，这取决于磷脂组成和用于其制备的方法。在本发明的具体实施方式中，脂质体大小将在50nm至500nm的范围内，且在进一步的实施方式中，在50nm至200nm的范围内。最佳地，脂质体应当是稳定的并且具有～100nm的直径以允许通过过滤进行除菌。
[0222]
可用于本发明中的其他tlr4激动剂包括吡喃葡糖基脂质佐剂(gla)，如描述于wo2008/153541或wo2009/143457，或文献文章coler rn等(2011)development and characterization of synthetic glucopyranosyl lipid adjuvant system as a vaccine adjuvant.plos one 6(1):e16333.doi:10.1371/journal.pone.0016333和arias ma等(2012)glucopyranosyl lipid adjuvant(gla),a synthetic tlr4 agonist,promotes potent systemic and mucosal responses to intranasal immunization with hivgp140.plos one 7(7):e41144.doi:10.1371/journal.pone.0041144。wo2008/153541或wo2009/143457通过引用并入本文，用于定义可用于本发明中的tlr4激动剂的目的。
[0223]
可以通过从革兰氏阴性细菌的深粗糙突变菌株提取的lps的酸水解获得的4
’‑
单磷酰脂质a(mpl)，其保留lps的佐剂特性，同时证明毒性减少超过1000倍(由鸡胚卵中的致死剂量测量)(johnson等，1987 rev.infect.dis.9 suppl:s512-s516)。lps通常在中等强度的无机酸溶液(例如，0.1m hcl)中回流近似30分钟的时段。该过程导致在1位的去磷酸化，和在6’位的去糖化(decarbohydration)，产生mpl。
[0224]
可以通过mpl的温和碱水解获得的3-o-脱酰基单磷酰脂质a(3d-mpl)具有进一步减少的毒性，同时也维持佐剂性。参见us4,912,094(ribi immunochemicals)。碱水解通常在有机溶剂，如氯仿/甲醇的混合物中通过用弱碱的水溶液，如ph 10.5的0.5m碳酸钠饱和而进行。关于制备3d-mpl的进一步信息可从例如us4,912,094和wo02/078637(corixa corporation)获得。
[0225]
quillaja皂苷是从皂皮树(quillaja saponaria)的树皮提取的三萜糖苷的混合物。粗皂苷已经广泛用作兽医佐剂。quil-a是quillaja皂苷材料的部分纯化的水性提取物。
quil a是分离自南美树皂皮树(quillaja saponaria molina)的皂苷制备物，并且首次由dalsgaard等人于1974描述为具有佐剂活性(“saponin adjuvants”,archiv.f
ü
r die gesamte virusforschung，vol.44,springer verlag,berlin,p.243-254)。quil a的纯化片段已通过hplc分离，其保留佐剂活性，而没有与quil a相关的毒性(ep 0362278)，例如qs7和qs21(也被称为qa7和qa21)。qs-21是一种源自皂皮树(quillaja saponaria molina)的树皮的天然皂苷，其诱导cd8 细胞毒性t细胞(ctl)、th1细胞和占优势的igg2a抗体应答，并且是本发明的上下文中的优选皂苷。qs21是quil a的hplc纯化的无毒级分，并且其生产方法(作为qa21)公开于美国专利号5,057,540。优选地，所述佐剂含有基本上纯的形式的qs21，也就是说，qs21是至少90％纯的，例如，至少95％纯的或至少98％纯的。
[0226]
先前已经公开了含有脂多糖和quillaja皂苷的组合的佐剂，例如，在ep0671948中。该专利证明了当脂多糖(3d-mpl)与quillaja皂苷(qs21)组合时的强协同作用。在佐剂组合物中采用脂多糖和quillaja皂苷的组合作为免疫刺激剂，可以实现良好的佐剂特性，甚至当免疫刺激剂在人剂量中以小量存在时也是如此，如wo2007/068907中所述。
[0227]
在一个具体实施方式中，qs21在其反应原性较低的组合物中提供，其中其例如被外源甾醇、如胆固醇淬灭。存在其中qs21被外源胆固醇淬灭的反应原性较低的组合物的几种特定形式。在一个具体实施方式中，皂苷/甾醇呈脂质体结构的形式(wo 96/33739，实施例1)。在该实施方式中，脂质体合适地含有中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温下合适地是非晶体，所述磷脂酰胆碱例如蛋黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)或二月桂基磷脂酰胆碱。所述脂质体还可以含有有限量的带电脂质，其增加由饱和脂质构成的脂质体的脂质体-皂苷结构的稳定性。在这些情况下，带电脂质的量合适地为脂质体组合物的1-20％w/w，优选5-10％w/w。此类带电脂质的合适实例包括磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸。合适地，中性脂质体将含有小于5％w/w带电脂质，如小于3％w/w或小于1％w/w带电脂质。甾醇与磷脂的比率为1-50％(mol/mol)，合适地20-25％。
[0228]
合适的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个具体实施方式中，所述佐剂组合物包含胆固醇作为甾醇。这些甾醇是本领域中众所周知的，例如在merck index，第11版，第341页中公开了胆固醇作为在动物脂肪中发现的天然存在的甾醇。
[0229]
在活性皂苷级分是qs21的情况下，qs21：甾醇的比率通常为约1:100至1:1(w/w)，合适地1:10至1:1(w/w)，且优选地1:5至1:1(w/w)。合适地，存在过量的甾醇，qs21：甾醇的比率为至少1:2(w/w)。在一个实施方式中，qs21：甾醇的比率为1:5(w/w)。所述甾醇合适地是胆固醇。
[0230]
3d-mpl由glaxosmithkline biologicals n.a.以名称mpl销售，并且在整个文件中称为mpl或3d-mpl。参见，例如，美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3d-mpl主要促进具有ifn-g(th1)表型的cd4 t细胞应答。3d-mpl可以根据gb 2220211 a中公开的方法生产。化学上，其为3-脱酰基单磷酰脂质a与3、4、5或6个酰化链的混合物。优选地，在本发明的组合物中，使用小颗粒3d-mpl。小颗粒3d-mpl具有的粒径使得其可以通过0.22μm过滤器进行无菌过滤。此类制备物描述于wo 94/21292中。
[0231]
合适的佐剂组合物是那些，其中最初在没有mpl的条件下制备脂质体(如wo 96/33739中的描述)，且然后添加mpl，合适地作为小于100nm颗粒的小颗粒或容易通过0.22μm
dopc、250μg胆固醇和50μg 3d-mpl，每个值都近似以每疫苗剂量给出]，qs21[50μg/剂]，磷酸盐nacl缓冲液和水，至0.5ml的体积。
[0242]
as01e佐剂包含与as01b相同的成分，但浓度较低，其量是500μg dopc，125μg胆固醇，25μg 3d-mpl和25μg qs21，磷酸盐nacl缓冲液和水，至0.5ml的体积。
[0243]
在一个优选实施方式中，用于本发明中的佐剂是as01e。
[0244]
施用方法
[0245]
在一个方面中，本发明的免疫原性组合物或疫苗通过肌肉内递送途径进行施用。肌肉内施用可以是对于大腿或上臂。注射通常经由针(例如，皮下针)。典型肌肉内剂量为0.5ml，如下所述。
[0246]
剂量
[0247]
免疫原性组合物中实现所需治疗或生物学效果所需的蛋白质抗原的量将取决于许多因素，例如施用方式、接受者以及所治疗病症的类型和严重程度，并且将最终由主治医师或兽医酌情决定。每种蛋白抗原的含量将通常在1-200μg、合适地1-100μg、合适地5-50μg的范围内。每种糖抗原的含量将通常在0.1-50μg、合适地0.1-10μg、合适地1-5μg的范围内。
[0248]
该剂量可以作为单位剂量施用于受试者(例如，人)。本文提及的“单位剂量”指人剂量。在一个实施方式中，本发明提供了一种以单位剂量形式的免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物可以以单位剂量向患者施用，范围在0.1至1ml之间，例如，0.5ml。提及0.5ml将被理解为包括正态方差，例如，0.5ml /-0.05ml。同样，本文提及的剂量应理解为包括正态方差，例如，10％、5％或者向上或向下舍入到最接近的小数点。
[0249]
在一个实施方式中，本发明提供了免疫原性组合物，其包含110-130μg/ml的每种蛋白抗原spa、hla和clfa。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含以固体形式(例如，冷冻干燥形式)的每单位剂量55-65μg的每种蛋白抗原spa、hla和clfa。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含以固体形式(例如，冷冻干燥形式)的每单位剂量60μg的每种蛋白抗原spa、hla和clfa。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含以固体形式(例如，冷冻干燥形式)的72μg的每种蛋白抗原spa、hla和clfa。
[0250]
在一个实施方式中，所述组合物包含每单位剂量约5-50μg的每种糖cp5和cp8，例如约5-20μg，例如约10μg，优选地约8μg。在一个实施方式中，所述组合物包含每单位剂量5-50μg的每种糖cp5和cp8，例如5-20μg，例如10μg，优选地8μg。
[0251]
固体形式(例如，冷冻干燥)的本发明的免疫原性组合物可以在疫苗施用之前重构。固体形式(例如，冷冻干燥)的本发明的免疫原性组合物可以使用注射用水(wfi)和/或佐剂(例如，as01e)在施用之前重构。因此，本发明的免疫原性组合物可以进一步包含佐剂，例如，as01e。在另一个实施方式中，每0.5ml剂量的免疫原性组合物包含60μg spa、10μg 60μg hla和60μg clfa以及佐剂(例如，as01e)。在一个优选实施方式中，所述剂量包含25μg3d-mpl和25μg qs2。
[0252]
选择每个免疫原性组合物或疫苗剂量中缀合物抗原的量，作为在典型疫苗中诱导免疫保护应答而没有显著不利副作用的量。该量将根据使用的特定免疫原及其呈现方式而有所不同。每种蛋白抗原的量通常将在1-200μg范围内，适宜地1-100μg，适宜地5-50μg。每种糖抗原的量将通常在0.1-50μg范围内，适宜地0.1-10μg，适宜地1-5μg。
[0253]
对于液体疫苗，适合人使用的剂量通常在0.25至1.5ml之间，但对于皮肤施用，可
以使用0.05ml至0.2ml之间的较小体积。在一个实施方式中，人剂量是0.5ml。在一个进一步的实施方式中，人剂量高于0.5ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1ml。在一个进一步的实施方式中，人剂量在1ml至1.5ml之间。在另一个实施方式中，特别是当所述免疫原性组合物用于儿科人群时，人剂量可以低于0.5ml，如0.25至0.5ml之间。在一个优选实施方式中，液体剂量是0.5ml。
[0254]
在所述免疫原性组合物含有包含3d-mpl和qs21的佐剂的情况下，qs21和3d-mpl优选以每人剂量的免疫原性组合物中相同的最终浓度存在。在一个实施方式中，人剂量的免疫原性组合物包含约25μg，例如20-30μg，合适地21-29μg或22至28μg或23至27μg或24至26μg或25μg的水平的3d-mpl。在一个实施方式中，人剂量的免疫原性组合物包含约25μg，例如20-30μg，合适地21-29μg或22至28μg或23至27μg或24至26μg或25μg的水平的qs21。在一个优选实施方式中，人剂量的免疫原性组合物包含最终水平为25μg的3d-mpl和25μg的qs2。在另一个实施方式中，人剂量的免疫原性组合物包含最终水平为50μg的3d-mpl和50μg的qs21。
[0255]
在所述免疫原性组合物用于与包含3d-mpl和qs21的佐剂组合物联合使用的情况下，qs21和3d-mpl优选以每人剂量的佐剂组合物中相同的最终浓度存在。在一个实施方式中，人剂量的佐剂组合物包含约25μg，例如20-30μg，合适地21-29μg或22至28μg或23至27μg或24至26μg或25μg的水平的3d-mpl。在一个实施方式中，佐剂组合物的体积适用于人剂量，所述人剂量的佐剂组合物包含约25μg，例如20-30μg，合适地21-29μg或22至28μg或23至27μg或24至26μg或25μg的水平的qs21。在一个优选实施方式中，人剂量的佐剂组合物包含最终水平为25μg的3d-mpl和25μg的qs21。在另一个实施方式中，人剂量的佐剂组合物包含最终水平为50μg的3d-mpl和50μg的qs21。
[0256]
在佐剂是待与液体形式的抗原组合物进行联合的液体形式的情况下，佐剂组合物将是人剂量合适的体积，其为人剂量的预计最终体积的约一半，例如，对于0.7ml的预计人剂量，其为360μl体积，或者对于0.5ml的预计人剂量，其为250μl体积。当与抗原组合物联合时，将佐剂组合物稀释以提供最终人剂量的疫苗。此类剂量的最终体积当然将根据佐剂组合物的初始体积和添加至佐剂组合物中的抗原组合物的体积而有所不同。在一个替代的实施方式中，液体佐剂用于重构冻干的抗原组合物。在该实施方式中，佐剂组合物的人剂量合适的体积近似等于人剂量的最终体积。将液体佐剂组合物添加至含有冻干的抗原组合物的瓶中。最终的人剂量可以是0.5至1.5ml不等。在一个具体实施方式中，人剂量是0.5ml。
[0257]
呈现
[0258]
在某些实施方式中，免疫原性组合物包含在容器内，所述容器指例如瓶(vial)或注射器，包括预充式注射器。在某些实施方式中，容器是硅化的。
[0259]
当本发明的免疫原性组合物存在于瓶中时，其优选由玻璃或塑料材料制成。优选在将组合物加入其中之前对瓶进行灭菌。瓶可以包含单剂量疫苗，也可以包含一剂以上(“多剂量”瓶)，例如，10剂。当使用多剂量瓶时，应在严格无菌条件下用无菌针头和注射器取出每剂，注意避免污染瓶内容物。优选的瓶由无色玻璃制成。瓶可以具有适合的盖子(例如，luer锁)，使得预充式注射器可以插入到盖子中，注射器的内容物可以被排出到瓶中(例如，以在其中重构冻干材料)，并且可以将瓶的内容物抽回到注射器中。在从瓶取下注射器后，然后可以连接针头并且可以将组合物施用于患者。帽优选位于密封件或盖内，使得在可
以接触帽之前必须移除密封件或盖。
[0260]
本发明的免疫原性组合物可以适于通过适当途径施用，例如，通过肌内途径。
[0261]
在另一个实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，其包含(i)第一容器(例如，瓶)，其包含本发明的免疫原性组合物，任选地以固体形式(例如，冷冻干燥的)和(ii)第二容器(例如，预充式注射器)，其包含佐剂，例如，as01e。第二容器的内容物可用于在施用前重构第一容器中的免疫原性组合物。
[0262]
在另一个实施方式中，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗包含本发明的免疫原性组合物。
[0263]
预防和治疗用途
[0264]
本发明提供了治疗和/或预防受试者的细菌感染的方法，其包括向所述受试者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。在一个具体实施方式中，本发明的免疫原性组合物用于预防葡萄球菌细菌感染受试者(例如，人受试者)。金黄色葡萄球菌感染各种哺乳动物(包括牛、狗、马和猪)，但用于本发明使用的优选的受试者是人。
[0265]
在一个具体实施方式中，本发明的免疫原性组合物用于治疗或预防葡萄球菌属物种、特别是金黄色葡萄球菌的感染。例如，本发明的免疫原性组合物可用于针对金黄色葡萄球菌感染(包括医院感染)进行预防。
[0266]
还提供了诱导受试者中针对葡萄球菌细菌、特别是金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。在一个实施方式中，所述受试者在施用时具有细菌感染。在另一个实施方式中，所述受试者在施用时不具有细菌感染。本发明的免疫原性组合物或疫苗可用于诱导针对葡萄球菌属物种、特别是金黄色葡萄球菌的免疫应答。
[0267]
还提供了诱导受试者中针对葡萄球菌细菌、特别是金黄色葡萄球菌的调理吞噬性抗体的产生的方法，其包括向所述受试者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。在一个实施方式中，所述受试者在施用时具有细菌感染。在另一个实施方式中，所述受试者在施用时不具有细菌感染。
[0268]
还提供了诱导受试者中能够中和或降低葡萄球菌hla、clfa和/或spa的活性的抗体的产生的方法，其包括向所述受试者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。所述hla活性可以是裂解人红细胞(溶血)的能力。所述clfa活性可以是结合人纤维蛋白原的能力。所述spa活性可以是结合免疫球蛋白(ig)的fcγ和vh3-型b细胞受体的fab部分的能力。
[0269]
还提供了针对葡萄球菌感染、特别是金黄色葡萄球菌感染免疫人宿主的方法，其包括向所述宿主施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。
[0270]
还提供了诱导受试者中对葡萄球菌细菌、特别是金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。
[0271]
还提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗和/或预防疾病的方法中，例如用于治疗或预防由葡萄球菌感染、特别是金黄色葡萄球菌感染引起的疾病的方法中。
[0272]
还提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗，其用于制备用于治疗或预防由葡萄球菌感染、特别是金黄色葡萄球菌感染引起的疾病的药物。
[0273]
还提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防疾病的方法中，例如用于治疗或预防由葡萄球菌感染、特别是金黄色葡萄球菌
感染引起的疾病的方法中。
[0274]
还提供了用于治疗或预防葡萄球菌感染、特别是金黄色葡萄球菌感染的药物，其包含本发明的免疫原性组合物或疫苗。
[0275]
还提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗，其用于诱导受试者中针对葡萄球菌细菌、特别是金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法中。
[0276]
还提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗，其用于诱导受试者中针对葡萄球菌细菌、特别是金黄色葡萄球菌的调理吞噬性抗体的产生的方法中。
[0277]
还提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗，其用于诱导受试者中能够中和或降低葡萄球菌hla、clfa和/或spa的活性的抗体的产生的方法，其包括向所述受试者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。所述hla活性可以是裂解人红细胞(溶血)的能力。所述clfa活性可以是结合人纤维蛋白原的能力。所述spa活性可以是结合免疫球蛋白(ig)的fcγ和vh3-型b细胞受体的fab部分的能力。
[0278]
在本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请都通过引用并入本文。
[0279]
本发明的各方面概述于随后编号的段落中：
[0280]
1.一种免疫原性组合物，其包含
[0281]
a.clfa抗原，
[0282]
b.hla抗原，
[0283]
c.spa抗原，和
[0284]
d.葡萄球菌荚膜多糖；
[0285]
其中所述组合物是固体形式。
[0286]
2.根据段落1所述的组合物，其中所述组合物是冷冻干燥的。
[0287]
3.根据段落1或段落2所述的组合物，其中所述组合物包含填充剂(bulking agent)，任选地糖。
[0288]
4.根据段落3所述的组合物，其中所述填充剂是蔗糖。
[0289]
5.根据段落4所述的组合物，其中蔗糖以每单位剂量15-25mg，任选地每单位剂量21mg存在。
[0290]
6.根据段落1至5中任一项所述的组合物，其还包含表面活性剂，任选地聚山梨醇酯，任选地聚山梨醇酯80。
[0291]
7.根据段落1至6中任一项所述的组合物，其中聚山梨醇酯以每单位剂量50-100μg，任选地每单位剂量80μg存在。
[0292]
8.根据段落1至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中spa、hla和/或clfa以每单位剂量50-100μg，任选地每单位剂量60μg存在。
[0293]
9.一种免疫原性组合物，其包含clfa抗原、hla抗原、spa抗原、葡萄球菌荚膜多糖、蔗糖和聚山梨醇酯80。
[0294]
10.根据段落9所述的免疫原性组合物，其中蔗糖以每单位剂量15-25mg，任选地每单位剂量21mg存在；聚山梨醇酯80以每单位剂量50-100μg，任选地每单位剂量80μg存在；和/或其中spa、hla和/或clfa以每单位剂量50-100μg，任选地每单位剂量60μg存在。
[0295]
11.根据段落9或段落10所述的免疫原性组合物，其是液体形式。
[0296]
12.根据段落9至11中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂，任选地
as01e。
[0297]
13.根据段落9至12中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷和脂多糖。
[0298]
14.根据段落9至13中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂在脂质体制剂中包含皂苷、脂多糖。
[0299]
15.根据段落9至14中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含甾醇。
[0300]
16.根据段落9至15中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷是源自皂皮树(quillaja saponaria molina)的树皮的免疫活性皂苷级分。
[0301]
17.根据段落16所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷是qs21。
[0302]
18.根据段落9至17中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述脂多糖是脂质a衍生物。
[0303]
19.根据段落18所述的免疫原性组合物，其中所述脂多糖是3d-mpl。
[0304]
20.根据段落11至19中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述甾醇是胆固醇。
[0305]
21.根据段落11至20中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含每人剂量25μg水平的qs21。
[0306]
22.根据段落11至21中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含每人剂量25μg水平的3d-mpl。
[0307]
23.根据段落1至22中任一项所述的组合物，其中所述荚膜多糖与载体蛋白缀合。
[0308]
24.根据段落1至23中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖是金黄色葡萄球菌血清型5和/或型8荚膜多糖。
[0309]
25.根据段落1至24中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖与段落1的抗原(a)-(c)之一缀合。
[0310]
26.根据段落1至26中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖和型8荚膜多糖。
[0311]
27.根据段落1至26中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含与hla抗原缀合的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖和/或与clfa抗原缀合的型8荚膜多糖。
[0312]
28.根据段落1至27中任一项所述的免疫原性组合物，其中
[0313]
a.所述clfa抗原是包含seq id no.2的氨基酸序列或与seq id no.2至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的clfa蛋白，或其免疫原性片段；
[0314]
b.所述hla抗原是具有seq id no.3的氨基酸序列或与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的hla蛋白，或其免疫原性片段；和/或
[0315]
c.所述spa抗原是具有seq id no.13或seq id no:26的氨基酸序列或与seq id no.13或seq id no:26至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的spa蛋白，或其免疫原性片段。
[0316]
29.根据段落1至28中任一项所述的组合物，其中所述clfa抗原包含根据seq id no.2的氨基酸序列的选自p116至s和y118至a(或与seq id no.2至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的等同位置)的至少一个氨基酸取
代，任选地包含seq id no 5-7或32中的任一序列。
[0317]
30.根据段落28或段落29所述的免疫原性组合物，其中所述clfa抗原包含选自以下的一个或多个pglb共有序列：d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)，其中x和z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸。
[0318]
31.根据段落30所述的免疫原性组合物，其中所述共有序列已经添加在seq id no:2的氨基酸残基313-342之间的一个或多个氨基酸处，或取代seq id no:2的氨基酸残基313-342之间的一个或多个氨基酸，任选地取代位置i337处，或与seq id no.2至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处的氨基酸。
[0319]
32.根据段落30或段落31所述的免疫原性组合物，其中x是q(谷氨酰胺)且z是a(丙氨酸)(例如，k-d-q-n-a-t-k，seq id no:31)。
[0320]
33.根据段落32所述的免疫原性组合物，其中所述clfa抗原包含seq id no:7或seq id no:32的序列或由其组成。
[0321]
34.根据段落1至33中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述hla抗原在seq id no.3的位置h35处或在与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代任选地是h至l。
[0322]
35.根据段落1至34中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述hla抗原包含选自以下的一个或多个pglb共有序列：d/e-x-n-z-s/t(seq id no.28)和k-d/e-x-n-z-s/t-k(seq id no.29)，其中x和z独立地是除脯氨酸外的任何氨基酸。
[0323]
36.根据段落35所述的免疫原性组合物，其中所述共有序列已经添加在seq id no.3的氨基酸序列或与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的一个或多个氨基酸处，或取代seq id no.3的氨基酸序列或与seq id no.3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的一个或多个氨基酸。
[0324]
37.根据段落36所述的免疫原性组合物，其中所述共有序列已经取代seq id no:3的seq id no.3的位置k131处或与seq id no:3至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处的氨基酸。
[0325]
38.根据段落35至37中任一项所述的免疫原性组合物，其中x是q(谷氨酰胺)且z是r(精氨酸)(例如，k-d-q-n-r-t-k(seq id no 30)。
[0326]
39.根据段落38所述的免疫原性组合物，其中所述hla抗原包含seq id no:11或seq id no 12的序列或由其组成。
[0327]
40.根据段落1至39中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述spa抗原包含：(a)结构域e、d、a、b或c的vh3-结合亚结构域中的一个或多个氨基酸取代，其破坏或减少与vh3的结合，和(b)结构域e、d、a、b或c的igg fc结合亚结构域中的一个或多个氨基酸取代，其破坏或减少与igg fc的结合。
[0328]
41.根据段落1至40中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述spa抗原包含：(i)结构域e，所述结构域e在seq id no:14的氨基酸位置34和35处或在与seq id no:14至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具
有氨基酸取代；结构域d，所述结构域d在seq id no:15的氨基酸位置39和40处或在与seq id no:15至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域a，所述结构域a在seq id no:16的位置36和37处或在与seq id no:16至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域b，所述结构域b在seq id no:17的位置氨基酸位置36和37处或在与seq id no:17至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代，和/或结构域c，所述结构域c在seq id no:18的位置氨基酸位置36和37处或在与seq id no:18至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；和/或(ii)包含：结构域e，所述结构域e在seq id no:14的氨基酸位置7和8处或在与seq id no:14至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域d，所述结构域d在seq id no:15的氨基酸位置12和13处或在与seq id no:15至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域a，所述结构域a在seq id no:16的位置9和10处或在与seq id no:16至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代；结构域b，所述结构域b在seq id no:17的位置氨基酸位置9和10处或在与seq id no:17至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代，和/或结构域c，所述结构域c在seq id no:18的位置氨基酸位置9和10处或在与seq id no:18至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代。
[0329]
42.根据段落41所述的免疫原性组合物，其中所述氨基酸取代是赖氨酸取代谷氨酰胺和/或丙氨酸取代天冬氨酸。
[0330]
43.根据段落1至42中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述spa抗原包含结构域d，所述结构域d在seq id no:15的氨基酸位置4和5处或在与seq id no:15至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置处具有氨基酸取代。
[0331]
44.根据段落43所述的免疫原性组合物，其中所述氨基酸取代是谷氨酰胺至赖氨酸和/或谷氨酰胺至精氨酸，例如，qq至kr。
[0332]
45.根据段落1至44中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述spa抗原包含seq id no:19-23、26或27的氨基酸序列，或与seq id no:19-23、26或27至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
[0333]
46.根据段落1至45中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含：(i)包含seq id no:7或seq id no:32的氨基酸序列的clfa抗原；(ii)包含seq id no:11或seq id no:12的氨基酸序列的hla抗原；(iii)包含seq id no:27的氨基酸序列的spa抗原；(iv)金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖，和(v)金黄色葡萄球菌血清型型8荚膜多糖。
[0334]
47.根据段落46所述的免疫原性组合物，其中所述clfa抗原与金黄色葡萄球菌血清型型8荚膜多糖缀合，且所述hla抗原与金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖缀合。
[0335]
48.根据段落47所述的免疫原性组合物，其中所述clfa-cp8和hla-cp5缀合物是生物缀合物。
[0336]
49.根据段落1至48中任一项所述的免疫原性组合物，所述组合物包含佐剂。
[0337]
50.根据段落49所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是如段落12至20中任一项所定义的。
[0338]
51.根据段落49或段落50所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含每人剂量25μg水平的qs21。
[0339]
52.根据段落49或段落50所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含每人剂量25μg水平的3d-mpl。
[0340]
53.一种疫苗，其包含根据段落1至52中任一项所述的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体。
[0341]
54.根据段落1至52中任一项所述的免疫原性组合物，或者根据段落53所述的疫苗，其用于预防或治疗葡萄球菌感染的方法中，其中所述组合物与佐剂组合施用。
[0342]
55.根据段落55使用的免疫原性组合物或疫苗，其中所述免疫原性组合物在施用于受试者之前与所述佐剂混合。
[0343]
56.根据段落54或段落55使用的免疫原性组合物或疫苗，其中所述佐剂是如段落12至22中任一项所定义的。
[0344]
57.根据段落56使用的免疫原性组合物或疫苗，其中所述佐剂包含每人剂量25μg水平的3d-mpl和每人剂量25μg水平的qs21。
[0345]
58.一种试剂盒，其包含(i)第一容器，所述第一容器包含段落1至52中任一项所述的免疫原性组合物，或者段落53所述的疫苗；和(ii)第二容器，所述第二容器包含佐剂。
[0346]
59.根据段落58所述的试剂盒，其中在所述第一容器中的所述免疫原性组合物是固体形式(例如，冷冻干燥的)。
[0347]
60.根据段落58或段落59所述的试剂盒，其中所述佐剂是在水溶液中。
[0348]
61.根据段落58至60中任一项所述的试剂盒，其中所述第一容器是瓶(vial)。
[0349]
62.根据段落58至61中任一项所述的试剂盒，其中所述第二容器是预充式注射器。
[0350]
63.根据段落58至62中任一项所述的试剂盒，其中所述佐剂是如段落12至22中任一项所定义的。
[0351]
64.根据段落63所述的试剂盒，其中所述佐剂包含每人剂量25μg水平的3d-mpl和每人剂量25μg水平的qs21。
[0352]
65.一种预防或治疗葡萄球菌感染的方法，其包括向有需要的受试者施用根据段落1至52中任一项所述的免疫原性组合物或者根据段落53所述的疫苗。
[0353]
66.根据段落65所述的方法，其还包括向所述受试者施用佐剂。
[0354]
67.根据段落66所述的方法，其中所述佐剂与所述免疫原性组合物同时施用。
[0355]
68.根据段落66或段落67所述的方法，其中所述佐剂是如段落12至22中任一项所定义的。
[0356]
69.一种预防或治疗葡萄球菌感染的方法，其包括向有需要的受试者施用根据段落1至52中任一项所述的免疫原性组合物或者根据段落53所述的疫苗。
[0357]
70.一种制备根据段落1至53中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗的方法，其包括将抗原和任选地佐剂与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。
[0358]
实施例
[0359]
实施例1：疫苗组合物和制剂
[0360]
疫苗组分
[0361]
使用以质粒转化的大肠杆菌细胞的分批进料发酵产生与含有一个糖基化位点、h35l/h48c/g122c突变和c-末端hrhr标签的hla
mut
(seq id no:12，使用flgl信号序列表达)连接的含有6至20个重复单元的cp5的生物缀合物，所述质粒编码金黄色葡萄球菌荚膜多糖cp5，携带在位置131处的糖基化位点和c-末端组氨酸-精氨酸-组氨酸-精氨酸标签的金黄色葡萄球菌载体蛋白hla
h35l-h48c-g122c
，和空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶pglb
cuon311v-k482r-d483h-a669v
。
[0362]
通过用编码clfa
mut
的质粒转化的并且表达pglb
cuon311v-k482r-d483h-a669v
和金黄色葡萄球菌cp8(w3110 waal::pglb
cuon311v-k482r-d483h-a669v
；o16::o11_wbjb-wbpm；δrmlb-wecg；weca-wzze::cp8_p2636(ccw)_cat)的大肠杆菌细胞的分批进料发酵产生与包含具有一个糖基化位点的clfa n2/n3结构域和p116s/y118a突变的clfa
mut
(seq id no:7)连接的包含5至16个重复单元的cp8的生物缀合物。
[0363]
测试生物缀合物在不同制剂中的稳定性。通过应用一部分上表中报告的分析组长达3个月在-80℃(长期)、 4℃(中间)和 25℃测试每个批次的三种不同制剂的稳定性，以评估关于蛋白和多糖稳定性的含量、纯度、聚集、降解。
[0364]
cp5-hla和cp8-clfa生物缀合物在4℃和-80℃下稳定至少3个月，并且在25℃下稳定长达3个月。
[0365]
spa变体(spa
kr-kkaa
，在本文中指示为spa
mut
，且包含seq id no:27的序列，描述于wo2015/144653中)，其包含igg结合部分(igg结合结构域edabc)，其携带在五个igbd各自中的四个关键残基处的氨基酸取代(谷氨酰胺和天冬氨酸分别变为2个赖氨酸和2个丙氨酸)(其高度损害igg和igm结合)，以及对应于igg结合部分的q70和q71(全长蛋白的q96和q97)的两个额外的免疫球蛋白结合残基，其分别突变为赖氨酸70和精氨酸71(k70和r71)。通过表面等离振子共振实验显示，spa
mut
对人igg和igm没有可检测的亲和性，使该分子对于疫苗使用更安全。通过细菌分批发酵使用商业的大肠杆菌bl21(de3)菌株以重组形式表达spa
mut
。
[0366]
通过使用sds-page和se-uplc进行加速稳定性研究，用于分析在四种合适的制剂缓冲液中在4℃、rt和37℃下储存3、10和30天后的蛋白。
[0367]
spa
mut
在4℃下稳定长达3个月，在25℃下稳定长达10天，且在37℃下稳定长达4天。然而，在4℃下3个月和6个月后，可以感到sds-page中降解条带的强度略有增加。
[0368]
疫苗制剂
[0369]
用于小鼠免疫研究的制剂在未佐剂化和用as01e(在脂质体组合物中的3d-mpl qs21，如上所述)和alum/tlr7(吸附至aloh的tlr7激动剂，如wo2011/027222，实施例20，wo2012/031140和bagnoli等，pnas,2015,112:3680-3685中所述)佐剂化的情况下制备。基于蛋白含量，将三种组分(cp5-hla、cp8-clfa、spa
mut
)以对于每种组分200μg/ml的浓度(相对于最终高剂量，两倍浓缩，在此称为2x)配制于相同瓶中。为了获得最终的不同制剂，在免疫前，通过床侧混合方法，用制剂缓冲液(10mm nah2po4，150mm nacl ph 6.5)或佐剂重构具有三种混合组分的瓶2x(相比于佐剂最终剂量，浓缩两倍)。高蛋白剂量通过如下达到：用相等体积的as01b(与as01e相比，浓缩两倍)或alum/tlr7(浓缩两倍，20μg/剂量的alum/tlr7)
或者可替代地制剂缓冲液(对于未佐剂化组)重构一个体积的瓶2x，以具有100μg/ml(等同于10μg/100μl)的期望的最终蛋白浓度。反而，中等和低蛋白剂量通过如下获得：用制剂缓冲液分别1:10和1:20预稀释瓶2x的步骤，然后用相等体积的as01b(2x)或alum/tlr7(2x)最终重构，以达到10μg/ml(等同于1μg/100μl)和1μg/ml(等同于0.1μg/100μl)的最终浓度。配制缓冲液用作对照组的稀释剂。进行相容性研究以评估对于具有混合物2x的瓶和用佐剂或安慰剂的重构过程之后的制剂的短期稳定性(在2-8℃储存条件下长达24小时)。通过评估以下参数，应用扩展的分析组来表征制剂：
[0370]
1.物理-化学(目视检查、ph和重量摩尔渗透压浓度)
[0371]
2.抗原身份(每种单一组分、蛋白和糖两者的western印迹)
[0372]
3.总蛋白含量(μbca)
[0373]
4.无菌性(通过板生长的微生物污染)
[0374]
5.as01粒径(dls)
[0375]
6.alum/tlr7回收率(rp-hplc)
[0376]
对于考虑用于在临床前研究中评估的抗原/佐剂或安慰剂组合没有观察到主要不相容性。
[0377]
实施例2：小鼠和预先暴露于用as01e或alum/tlr7佐剂化的疫苗的兔中的免疫原性
[0378]
疫苗制剂用于免疫不同的动物物种：
[0379]
i)未处理小鼠，以研究对疫苗组分具有特异性的igg和t细胞应答两者的体内诱导。在这些研究中，在不同的免疫剂量下在未佐剂化或用as01e或alum/tlr7佐剂化的情况下测试疫苗。
[0380]
ii)金黄色葡萄球菌预先暴露的兔，以评估其中存在预先存在水平的对疫苗组分具有特异性的igg的模型中对疫苗的应答。在该研究中，疫苗在不同的剂量下在用as01e佐剂化或未佐剂化的情况下进行测试。由于兔细胞上缺乏激动剂受体，不能在该模型中使用alum/tlr7佐剂。
[0381]
通过如下评价特异性免疫应答：
[0382]
a)在接种疫苗后的不同时间点，在小鼠和兔免疫血清两者中，通过luminex技术测量抗原特异性igg。
[0383]
b)评估在免疫小鼠的脾脏中对疫苗抗原具有特异性的cd4 t细胞的存在。
[0384]
c)测量小鼠和兔血清中存在的抗体中和两种蛋白组分(野生型hla和clfa抗原)的生物学活性的能力。
[0385]
所述研究的概览呈现于表1中。
[0386]
[0387][0388]
小鼠的免疫
[0389]
通过im途径，分开28天，向五周龄的雌性小鼠给予两个剂量的100μl缓冲液或测试
制剂(每个后腿四头肌中50μl)。在第一次注射前(第0天)，第一次注射后1周、2周和4周(1wp1、2wp1、4wp1)以及第二次注射后1、2、4、8、12和16周(1wp2、2wp2、4wp2、8wp2、12wp2、6wp2)采集血液样品。重复实验3次以评价实验变异性。对每个组的合并样品进行统计分析。该研究的概览与三次实验中使用的小鼠总数显示于表2中。
[0390]
表2：用于测定免疫小鼠中的igg滴度的研究设计
[0391][0392]
疫苗特异性igg的评价
[0393]
评价小鼠和兔中的疫苗-特异性igg的血清学分析基于通过luminex技术的多重测定。该技术已用于测量来自用针对金黄色葡萄球菌的疫苗免疫的受试者的人血清中的抗体(raedler等人,clin vaccine immuno 2009,16:739-49)。
[0394]
该测定使用用三种sa重组蛋白(spa
mut
、clfa
mut
、hla
mut
)和两种不同血清型的荚膜多糖(cp5和cp8)包被的磁珠同时(5-重)分析五种抗原。使用n-羟基磺基琥珀酰亚胺-增强的碳二亚胺(edc)-介导的缀合化学法，将蛋白抗原共价缀合至微球的游离羧基基团。cp5和cp8使用生物素-酰肼(bh)和edc进行生物素化，纯化且随后与链霉抗生物素蛋白珠粒缀合。
[0395]
通过合并在第2次注射后第12天从用hla
h35r
clfa
mut
cp5-tt cp8-tt spa
mut-10μg/alum/tlr7免疫的5只小鼠收集的超免疫血清，制备五价标准血清。为五价标准品分配100rlu/ml的任意滴度。
[0396]
根据以下标准相应地设置测定：
[0397]
通过比较通过单重设置相比于多重设置获得的信号，未观察到五种抗原之间的交叉反应性。
[0398]
通过多重预吸附研究证实测定的特异性。
[0399]
测定的测定内和测定间可重复性(％cv分别为《10％和20％)。
[0400]
用标准和测试血清获得的5pl mfi曲线的线性范围内的线性评价：r2值》0.9。
[0401]
将每种抗原的检测下限(llod，参见下表)确定为来自空白样品的平均rlu。
[0402]
定量下限(lloq，参见下表)：可以使用1:1000的最低所需稀释度(mdr)以可接受的准确度(掺入实验中cv《20％)确定的较低滴度。
[0403][0404]
对于样品测试，独立地制备多达五种递增的稀释液，且装载至具有足够量的偶联微球的96孔板上。测试每种稀释液的两次重复。
[0405]
抗原特异性抗体通过抗小鼠igg藻红蛋白-标记的二抗揭示，并使用luminex 200 reader测量mfi。
[0406]
在不同的时间点对于每组使用三次实验进行分析。为了评价每种抗原和剂量在实验间的生物学变异性，应用2-向混合anova(“组”和“实验”作为固定效应，且“个体小鼠”作为随机效应)。没有观察到显著的组-实验相互作用，除了在剂量0.1μg下的clfa
mut
和hla
mut
，其p-值＝0.001。
[0407]
对小鼠研究的总体结果(图1，对于0.1μg剂量未显示数据)表明：所有疫苗组分在小鼠中都是免疫原性的。对照组(10、11和12)未显示针对五种抗原中任一种的可检测抗体。类似地，在免疫前血清中没有测量到可检测的igg，除了hla
mut
抗原，其14％的估计滴度略高于lloq。
[0408]
对于没有佐剂的疫苗的应答总是不如对具有佐剂的疫苗的应答。
[0409]
在有或没有佐剂的所有组中都观察到显著的剂量效应(应用单向anova，并且使用tukey“honest显著性差异”，对于多重比较进行调整)。具体而言：
[0410]
没有佐剂：对于所有抗原，在第2次免疫后，0.1μg《1μg《10μg(p-值《0.01 tukey后检验)。
[0411]
as01e：在任何时间点，对于clfa
mut
、hla
mut
和spa
mut
，0.1μg《1μg《10μg(p-值《0.05tukey后检验)；对于cp8，0.02μg《0.2μg≤2μg(基于多糖的剂量)(p-值《0.05tukey后检验)。对于cp5，在第2次免疫后，0.02μg＝0.2μg》2μg(p-值《0.0001tukey后检验)。
[0412]
alum/tlr7：在任何时间点，对于clfa
mut
和spa
mut
，0.1μg《1μg≥10μg(p-值《0.05tukey后检验)。对于cp5，在第2次免疫后，0.02μg＝0.2μg》2μg(基于多糖)(p-值《0.05tukey后检验)，而对于cp8，在任何时间点，0.02μg《0.2μg》2μg(p-值《0.05tukey后检验)，最后对于hla
mut
，0.1μg《1μg≤10μg。
[0413]
为了获得最高的igg滴度，需要两次免疫(p-值《0.01tukey后检验)。
[0414]
预先暴露的兔的选择和研究设计
[0415]
通过elisa筛选总共350只兔，以在血清中测量预先存在的针对疫苗中存在的三种蛋白抗原和两种多糖的抗体。elisa分析显示，在1/100稀释度下，吸光度a
450nm
＝0.2是测量igg应答的检测限值，并且所有兔对至少一种抗原呈阳性。
[0416]
为了根据表3中显示的研究设计分配兔组，进行了84只兔的选择。
[0417]
表3：兔的研究设计
[0418][0419]
#
as01e佐剂由2.5μg mpl、tlr4活化剂和12.5μg qs-21(皂皮树(quillaja saponaria molina)，级分21)构成，其增加向apc的抗原呈递。
[0420]
基于抗原的数目，将350只兔分为5个亚组或层，其中elisa结果》0.2a
450nm
(即，对于5、4、3、2或≤1种抗原，elisa》0.2)。选择两层(
‘
对于5种抗原阳性’或
‘
对于4种抗原阳性’)各自中的所有兔(总n＝35)以包括在研究中，并随机分配至7个实验组(每组总共n＝5)。从
‘
对于3种抗原阳性’层取其他需要的兔(n＝102)，其中应用进一步的选择标准。在
‘
对于3种抗原阳性’层中，仅对于clfa阳性的兔(n＝64)被认为符合研究条件，并且这些中，仅对于hla和spa抗原两者具有四分位范围内的elisa结果的兔被认为符合研究条件(n＝51)。随机选择51只兔中的49只，并分配至7个研究组之一(每组总共n＝7)。
[0421]
兔的免疫
[0422]
使用上述相同的床侧混合方法，用于根据抗原最终剂量和注射体积，使用适当的浓度和稀释步骤，制备待在预先暴露的兔中测试的疫苗制剂。
[0423]
通过im途径，在第1天和第29天，分开28天，向预先暴露的兔(12-14周龄的雄性)给予两个剂量的单独的制剂缓冲液(对照组)或六种测试疫苗制剂之一。在第1次注射前(第0天)，第一次注射后1周、2周和4周(1wp1、2wp1、4wp1)，以及第二次注射后2周和5周(2wp2、5wp2)采集血液样品。
[0424]
疫苗特异性igg的评价
[0425]
用于测定兔中的疫苗-特异性igg的测定是上述luminex 5-plex。兔测定是以96孔形式开发的。
[0426]
通过合并针对所有5种抗原的超免疫单价兔多克隆血清来制备五价标准血清。为五价标准品分配所有抗原的50000rlu/ml的任意滴度。
[0427]
根据以上报告的标准设置测定。测定了测定间重复性(％cv《15％)。线性评价得到r2值》0.9。下面报告loq和loq。
[0428][0429]
对于样品测试，自动制备8份连续的3倍稀释液(从1:100开始)，并装载至具有足够量的偶联微球的单个96孔板上。抗原特异性抗体通过抗兔fab2 igg揭示。使用luminex flexmap 3d reader测量藻红蛋白标记的二抗和mfi。通过估计从5pl曲线获得的所有有效个体滴度的中值来测定每种样品/抗原的igg滴度。
[0430]
在第1次接种疫苗后4周和第2次接种疫苗后2周的抗-clfa
mut
、-hla
mut
、-cp5、-cp8和-spa
mut
的几何平均滴度(gmt)显示，所有七个组中从接种疫苗前的统计学显著的增加(图3)。在第2次接种疫苗后2周的抗体滴度高于第1次接种疫苗后。在第2次接种疫苗后2周，对于所有抗原，所有接种疫苗组都显示与缓冲液对照组相比统计学显著更高的抗体应答，除了hla
mut
，其抗体滴度在任何时间点都与缓冲液对照组相似。在第2次接种疫苗后，佐剂化和非佐剂化者之间的gmt没有显示显著性差异。
[0431]
实施例3：功能性抗体的分析
[0432]
针对能够中和野生型hla和clfa活性的功能性抗体的存在在体外测试从免疫的小鼠和兔获得的血清。
[0433]
hla活性的抑制-小鼠
[0434]
在改良先前描述的方法(bagnoli等，pnas 2015,112:3680-3685)的情况下实施的体外的基于红血细胞(rbc)的溶血中和测定中评估疫苗-特异性抗体抑制hla-诱导的溶血的能力。使用三份10份血清的合并物(其各自来自每个免疫组的三个不同的重复实验)进行α溶血素中和测定。测定中和滴度，计算有效稀释度(ed
50
)，所述有效稀释度(ed
50
)被定义为将hla的毒性中和50％的血清的稀释度。
[0435]
对于每个组，在每个时间点，通过经由中和曲线的非线性回归估计四参数对数(4pl)的拐点参数来评估ed
50
。
[0436]
获得的结果显示于图4a中并且表明：
[0437]
在没有佐剂的情况下且在0.1μg佐剂化组中未检测到功能性抗体(数据未显示)。
[0438]
在两次免疫后，用1或10μg剂量，使用两种佐剂均观察到hla中和。
[0439]
与用1μg的制剂相比，用10μg的制剂诱导统计学显著更高的中和滴度(p≤0.05wilcoxon检验)。
[0440]
clfa活性的抑制-小鼠
[0441]
开发clfa结合抑制测定以评估疫苗是否引发能够抑制clfa活性的功能性抗体。该测定是抗体抑制clfa与纤维蛋白原结合能力的基于elisa的测量。如果抗体有效结合clfa，则与纤维蛋白原的相互作用被抑制。血清滴度被定义为得到血纤蛋白原结合的50％降低的血清稀释度的倒数(ed
50
)。四参数对数(4pl)非线性回归模型用于抑制曲线的曲线-拟合分析，并且通过估计4pl拐点来评估ed
50
。
[0442]
clfa结合测定已应用于疫苗制剂在未处理小鼠中引发的血清。
[0443]
分析在以下免疫时间点收集的血清：第一次免疫后4周(4wp1)；和第二次免疫后1-2-4-8-12-16周(1wp2、2wp2、...)。
[0444]
获得的结果显示于图5a中。
[0445]
合并来自每组的血清(各自10只小鼠)，并在不同的时间点测量每种合并物的中和滴度(ed
50
)。在不同的时间点，对于每组，对三次独立的小鼠免疫实验进行分析。结果显示于图5a中，其中每个点代表三次独立实验的中值；条的上端和下端分别代表最大值和最小值。
[0446]
获得的结果表明：
[0447]
在0.1μg剂量下且在佐剂不存在的情况下，未测量到clfa中和(数据未显示)。
[0448]
使用两种佐剂，用1或10μg均观察到clfa中和
[0449]
与用1μg的制剂相比，用10μg剂量(称为clfa含量)的制剂诱导统计学显著更高的
中和滴度。(p值wilcoxon检验≤0.05)
[0450]
在10μg剂量下，as01e在1w和2wp2时优于alum/tlr7(p值wilcoxon检验≤0.05)
[0451]
使用先前针对小鼠血清描述的测定，针对能够中和野生型hla和clfa活性的功能性抗体的存在体外测试从免疫兔获得的血清。
[0452]
hla活性的抑制-兔
[0453]
处理兔，如表3中所报告。所有动物都在第1次注射前(第0天)，第一次注射后1周、2周和4周(1wp1、2wp1、4wp1)以及第二次注射后2周和5周(2wp2、5wp2)进行采血。在上述不同的时间点对单个样品血清进行中和测定。
[0454]
描述性地概述在每个时间点的几何平均滴度，包括95％置信区间(ci)。gmt和95％ci通过逆转换置信限值来计算，所述置信限值是基于student t分布针对对数转换滴度的平均值计算的(图4b)。虚线代表为测量每份兔血清而建立的最小所需稀释度。
[0455]
滴度vs.免疫前：
[0456]
基于对数转换的滴度计算在每个接种疫苗后时间点相对于接种疫苗前的几何平均倍数升高。使用student配对t检验分析前后对数转换滴度之间的差异。
[0457]
在2wp1时，蛋白含量≥10ug的所有组都诱导与免疫前相比更高的滴度(所有p值《0.017)。
[0458]
在2wp2时：所有免疫组都诱导与免疫前相比更高的滴度(所有p值《0.005)
[0459]
滴度vs.缓冲液组：
[0460]
使用welch student t检验进行在每个时间点的免疫组和缓冲液之间的配对比较。
[0461]
在2wp1时，仅佐剂化的50ug剂量诱导与缓冲液组相比更高的滴度(所有p值《0.003)
[0462]
在2wp2时，所有免疫组(不包括未佐剂化的1ug剂量)诱导与缓冲液相比更高的滴度(所有p值《0.013)
[0463]
第1次免疫后vs.第2次免疫后：
[0464]
在50μg、10μg as01e、50μg as01e中，在2wp1和2wp2之间观察到显著性差异(p值welch student t检验《0.025)。
[0465]
clfa活性的抑制-兔
[0466]
将clfa结合抑制测定应用于疫苗制剂在预先暴露的兔中引发的血清。通过经由抑制曲线的非线性回归估计四参数对数(4pl)的拐点参数来测定滴度。
[0467]
分析在以下免疫时间点收集的血清：免疫前，第一次免疫后4周(4wp1)，第二次免疫后2周(2wp2)。
[0468]
收集来自每组的血清(各自12只兔)，并在不同的时间点测量每个个体兔的中和滴度(ed
50
)。
[0469]
描述性地概述在每个时间点的几何平均滴度，包括95％置信区间(ci)。gmt和95％ci通过逆转换置信限值来计算，所述置信限值是基于student t分布针对对数转换滴度的平均值计算的(图5b)。
[0470]
用兔血清获得的中和结果显示于图5b中并且表明：
[0471]
免疫前、4wp1和缓冲液组血清中无抗clfa功能活性。
[0472]
需要两个剂量来诱导clfa中和活性。
[0473]
具有佐剂的10ug剂量与没有或有佐剂的50ug剂量表现一样好。
[0474]
总体中和滴度比小鼠血清中测量的那些低得多。
[0475]
实施例4：接种疫苗的小鼠中cd4 t-细胞应答对比疫苗蛋白
[0476]
病原体-特异性cd4 t细胞在触发宿主针对sa的免疫应答中的潜在作用得到充分描述。因此，还测试了用alum/tlr7或as01e佐剂化的疫苗在小鼠中诱导t细胞应答的能力。
[0477]
具体而言，研究的目的是：
[0478]
查看用疫苗免疫小鼠是否可以引发针对疫苗蛋白的t-细胞应答(量级)。
[0479]
研究应答的th1、th2或th17极化(质量)。
[0480]
评估疫苗制剂中包含佐剂是否改进量级和/或影响t细胞应答的质量。
[0481]
比较as01和alum/tlr7佐剂的t-细胞应答的量级和质量。
[0482]
为此目的，在第1天和第29天，通过im途径，向五周龄的balb/c雌性小鼠给予两次免疫(每个后腿四头肌中50μl)。单独或与alum/tlr7或as01e佐剂一起给予由10μg或1μg(基于蛋白)的每种组分组成的两剂制剂，疫苗-10和疫苗-1。用单独的pbs、alum/tlr7或as01e注射对照组。重复实验3次以评估实验变异性。研究的概览与3次实验中使用的小鼠的总数显示于表4中。
[0483]
表4：用于测定免疫小鼠中的t细胞应答的研究设计
[0484][0485]
通过对脾细胞进行细胞内细胞因子染色(ics)评估疫苗-特异性cd4 t-细胞应答的诱导，所述脾细胞从在第二次免疫后12天(d12p2)的单只小鼠分离，且然后在体外用单独或与每种疫苗蛋白(hla
mut
和clfa
mut
，以10μg/ml；spa
mut
，以1μg/ml)一起的抗cd28和抗cd49d mab(各自2μg/ml)在37℃下处理16h。添加5μg/ml布雷菲德菌素a，用于最后孵育4h。然后将细胞用活/死nearir(invitrogen)染色，固定并用cytofix/cytoperm(bd)透化，在perm/wash缓冲液(bd)中洗涤，与抗cd16/cd32 fc封闭剂(bd)在rt下孵育20min，并用以下mab在rt下染色20min，所述mab抗：
[0486]
cd3-bv605、cd4-bv510、cd8-pe-cf594、cd44-v450、ifnγ-bv785、il-2-pe cy5、tnf-af488、il-17a-pe cy7、il-4-percp efluor710和il-13-percp efluor710，在perm/wash缓冲液中洗涤两次，并悬浮于pbs中。
[0487]
在lsrii流式细胞仪(bd biosciences)上采集样品，并使用flowjo软件
(treestar)分析cd4 t-细胞应答。
[0488]
根据门控策略鉴定产生il-2、tnf、il-4/il-13、ifn-γ或il-17a的cd4

cd44
高
t细胞。
[0489]
通过测量响应于用疫苗蛋白的体外刺激产生分析的细胞因子中的至少一种的cd4

cd44
高
t细胞的频率(％)(cd4

cd44
高
t细胞≥1种细胞因子

)，计算t细胞应答的量级。
[0490]
通过测量产生：ifn-γ而非il-4/il-13(≥ifn-γ

，th1)，il-4/il-13而非ifn-γ(≥il-4/il-13

，th2)或至少il-17a(≥il-17a

，th17)的cd4

cd44
高
t细胞的频率(％)，评估cd4 t细胞应答的质量(th1、th2或th17极化)。
[0491]
应用布尔门分析，并从刺激的细胞的应答中减去培养基处理的细胞的应答。
[0492]
为了分析结果，在log
10 cd4

cd44
高
百分比上拟合双向anova，包括组(9组)、实验(3次实验)和相互作用组*实验作为固定效应，并使用异质方差模型(在各组之间不假设相同方差)。该模型用于估计组几何平均值及其95％ci，以及几何平均值比及其95％ci。
[0493]
如果几何平均值比的95％ci不包括1，则高于2倍的几何平均值比被认为显著性差异(p＜0.05)。
[0494]
获得的结果在图2中说明，其中指示统计学显著性差异。其可以如下概述：
[0495]
与对照组相比，需要在疫苗制剂中包括佐剂以获得显著更高频率的疫苗-特异性t细胞。
[0496]
对于每种蛋白抗原，as01优于alum/tlr7。
[0497]
只有用as01佐剂化的疫苗诱导对每种抗原具有特异性的产生ifn-γ(指示th1极化)的cd4
t-细胞，而用alum/tlr7佐剂化的疫苗仅以显著更低的频率诱导spa
mut-特异性th1。
[0498]
只有用as01佐剂化的疫苗测量到非常低频率的th2和th17。
[0499]
用1或10μg的非佐剂化疫苗免疫后，未观察到t-细胞应答的量级和质量的重大差异。
[0500]
实施例5：动物模型：皮肤感染模型中的保护
[0501]
在金黄色葡萄球菌感染的小鼠模型中实施实验，以评估5ag/as01e疫苗(包含spa
mut
、clfa
mut-cp8生物缀合物和hla
mut-cp5生物缀合物，其用as01e佐剂化)在体内针对金黄色葡萄球菌感染保护中的效力。实验还比较5ag/as01e疫苗与缺乏spa的4ag/as01e疫苗，并将5ag疫苗中的佐剂as01e的作用与用氢氧化铝(al(oh)3)佐剂化的5ag疫苗进行比较。使用的小鼠模型是皮肤感染模型和肾脓肿模型(见实施例6)。
[0502]
研究设计和方案
[0503]
使用5-周龄雌性的cd1小鼠。
[0504]
在皮肤模型中依次进行3次相同研究(sa-5ag-10、sa-5ag-11、sa-5ag-12)。每组由10只小鼠构成，因此在每个模型中每组测试总共30只小鼠。
[0505]
小鼠接受不同的疫苗制剂之一或pbs的两次肌肉内(im，每只爪子30μl)注射，其分开一个月(在第0天和第30天)给予。
[0506]
在最后一次注射后3周(第51天)，使用皮下(sc，皮肤模型)感染途径用适当的亚致死剂量的usa300细菌感染小鼠。接种50μl的sa usa 300(理论3x107cfu/小鼠)。
[0507]
在皮肤模型中，在感染后5天测量相关病变面积，然后在感染后7天收集，匀浆并测
定cfu值。
[0508]
表5：用金黄色葡萄球菌菌株usa300的皮肤模型的研究设计
[0509][0510]
im：肌肉内；sc：皮下；as01e含有2.5μg/剂量的mpl和2.5μg/剂量的qs21；al(oh)3：氢氧化铝。*基于蛋白。
[0511]
表6：皮肤模型治疗的时间表
[0512]
天数程序-1接种疫苗前血液样品收集0第一次接种疫苗30第二次接种疫苗50第二次接种疫苗后血液样品收集51皮下感染(usa300)56病变面积定量58处死小鼠，收集皮肤病变区域并测定cfu
[0513]
材料和方法
[0514]
制备细菌等分试样用于储存在-80℃
[0515]
将20ml新鲜的胰蛋白酶大豆培养液(tsb)(在使用前在37℃下预温热过夜或至少1h)与0.3ml解冻的细菌(旧储备物)在50ml一次性管中混合。初始od
600nm
为0.03，且细菌生长直至od
600nm
＝0.55。将2ml这种细菌悬浮液等分在冷冻瓶中，并储存在-80℃。
[0516]
生长条件
[0517]
将如上所述制备的来自-80℃冰箱的细菌(金黄色葡萄球菌usa300)的储备物在37℃的水浴中解冻10min。将20ml新鲜的胰蛋白酶大豆培养液(tsb)(在使用前在37℃下预温热过夜或至少1h)与0.3ml解冻的细菌混合。初始od
600nm
为0.03，且细菌在50ml一次性管中生长。将细菌在37℃、150rpm搅拌下孵育约2.0小时，直至最终od
600nm
为0.6，然后在4500rpm、4℃下离心10分钟。除去上清液，并将沉淀重悬浮于等体积的pbs中，并再次在4500rpm、4℃下离心10分钟。再次除去上清液，并将细菌沉淀重悬浮于2ml pbs中(约5x109cfu/ml)。此时，进行最终稀释以达到50μl中的3x107cfu/小鼠的细菌浓度。稀释100μl最终细菌悬浮液，并将10-5
和10-6
稀释液铺板至胰蛋白酶大豆琼脂(tsa)板上以计数cfu。使用金黄色葡萄球菌皮下感染的体内模型
[0518]
感染前一天，使用电动剃须刀和脱毛膏将麻醉的小鼠(唑拉西泮 tiletamina/甲苯噻嗪)在背侧位置剃毛。在37℃下通过水轻轻地除去脱毛膏。将如前所述制备的细菌皮下(50μl/动物)接种至用唑拉西泮 tiletamina/甲苯噻嗪麻醉的小鼠中。每天使用专门的评分表追踪动物的疾病临床症状。在感染后第5天用数码相机拍摄病变的照片以确定尺寸。感染后七天，处死小鼠，并使用圆形解剖刀(8mm)移取具有病变的皮肤；对于较大的病变，使用剪刀以确保回收整个病变。将移取的皮肤匀浆用于cfu计数。制备十倍稀释液，直至10-8
，并且将10μl斑点(一式两份)铺板至tsa板上。
[0519]
模型的读出
[0520]
·
在第5天的皮肤病变面积：通过imagej软件测量，以mm2表示。
[0521]
·
感染后每天登记的临床评分。
[0522]
·
感染后第7天的cfu计数(表示为cfu/样品)。
[0523]
结果
[0524]
5ag as01e疫苗在预防皮肤病变和减少cfu计数中是有效的。
[0525]
在皮肤感染后5天，用5ag as01e接种疫苗的小鼠无一表现出皮肤病变。用5ag al(oh)3接种疫苗的小鼠中的17％(5/30)表现出皮肤病变，而用4ag as01e和pbs接种疫苗的小鼠中的60％(18/30)和100％(30/30)分别显示皮肤病变。结果显示于表7-9中。
[0526]
在感染后7天，没有spa抗原的sa疫苗制剂(sa-4ag as01e)中的cfu gm比具有spa的sa疫苗制剂(sa-5ag as01e)中高几乎3-倍(2.84倍)，且差异是统计学显著的(两个疫苗组之间的cfu gm疫苗组比率的95％ci不包括值1)(表7和表8)。
[0527]
用as01e或al(oh)3佐剂化的两种sa-5ag疫苗制剂之间皮肤中的活细菌的水平存在差异，但差异不是统计学显著的。用al(oh)3作为佐剂的sa-5ag疫苗制剂[sa-5ag al(oh)3]中的cfu gm比用as01e作为佐剂的疫苗sa-5ag疫苗制剂(sa-5ag as01e)高1.6倍，并且cfu gm疫苗组比率的95％ci包括值1(表7和表8)。
[0528]
在单独的pbs组中，感染后7天皮肤中的活细菌的水平显著高于在评估的任何疫苗制剂中观察到的水平。pbs组中的cfu gm比疫苗制剂中观察到的cfu gm高40.32-至114.48-倍(表7和表8)。
[0529]
使用二-样品中值测试(two-sample median test)进行的两组的中值的探索性成对比较显示，在有和没有spa的疫苗制剂之间(p《0.0001)以及具有as01e和al(oh)3的sa-5ag疫苗制剂之间(p＝0.0206)的显著性差异。
[0530]
表7皮肤模型-用金黄色葡萄球菌菌株usa 300感染后4天的cfu几何平均值和95％ci
[0531][0532]
表8皮肤模型-用金黄色葡萄球菌菌株usa 300感染后4天的cfu gm疫苗组比率和
95％ci
[0533][0534]
*当gm比率的95％ci不包括值1(即，相等的gm)时，则差异是统计学显著的。具体而言，如果两组之间的gm比率的95％ci-下限为》1，则第一组分被认为统计学上显著性高于组合物的第二组分。反之亦然，如果两组之间的gm比率的95％ci-上限为《1，则第一组分被认为统计学上显著性低于组合物的第二组分。符号ν指示统计学显著性的比较。
[0535]
表9皮肤模型-按组的病变面积的平均值、中值、最小值、最大值*
[0536][0537]
*为了分析的目的，没有病变面积被设置为0.1。
[0538]
也可以在未显示任何皮肤病变的小鼠中测量到cfu，因为细菌也存在于皮下脓肿中。在两种疫苗制剂(其中小鼠的一个子集未显示病变，且该组中的剩余小鼠显示病变(即，5ag al(oh)3组和4ag as01e组))中，皮肤中的平均值和中值cfu计数在没有病变面积的小鼠中低于具有病变的小鼠中。对于每个疫苗组，按病变面积的存在或不存在的cfu计数的描述性统计学(平均值、中值、最小值、最大值)显示于表10中。
[0539]
表10皮肤模型-cfu计数的平均值、中值、最小值、最大值
[0540][0541]
实施例6：动物模型：肾脓肿模型中的保护
[0542]
在作为全身感染的模型的肾脓肿小鼠模型中实施实验，以评估5ag/as01e疫苗在针对金黄色葡萄球菌感染体内保护中的效力，如上文实施例5中所述。
[0543]
方案和研究设计
[0544]
使用5周龄的雌性cd1小鼠。
[0545]
依次进行三次实验(sa-5ag-7、sa-5ag-8、sa-5ag-9)。每组由12只小鼠构成，因此测试了总共36只小鼠。
[0546]
小鼠接受不同的疫苗制剂之一或pbs的两次肌肉内(im，每只爪子30μl)注射，其分开一个月(在第0天和第30天)给予。
[0547]
在最后一次注射后3周(第51天)，使用静脉内(iv，肾脓肿模型)感染途径，用适当的亚致死剂量的usa300细菌感染小鼠。
[0548]
接种100μl sa usa 300(理论1x107cfu/小鼠)菌株。
[0549]
感染的小鼠在感染后4天处死，收集肾脏，匀浆并计数cfu数。
[0550]
表11：使用金黄色葡萄球菌菌株usa300的脓肿模型的研究设计
[0551][0552][0553]
im：肌肉内；iv：静脉内；as01e含有2.5μg/剂量的mpl和2.5μg/剂量的qs21；al(oh)3：氢氧化铝。
[0554]
*基于蛋白。
[0555]
表12：脓肿模型治疗的时间表
[0556]
天数程序-1接种疫苗前血液样品收集0第一次接种疫苗30第二次接种疫苗50第二次接种疫苗后血液样品收集51静脉内感染(1x107)55感染4天后处死小鼠，收集肾脏并进行cfu计数
[0557]
材料和方法
[0558]
制备细菌等分试样
[0559]
将20ml新鲜的胰蛋白酶大豆培养液(tsb)(在使用前在37℃下预温热过夜或至少
1h)与0.3ml解冻的细菌(旧储备物)在50ml一次性管中混合。初始od
600nm
为0.03，且细菌生长直至od
600nm
＝0.55。将2ml这种细菌悬浮液等分在冷冻瓶中，并储存在-80℃。
[0560]
生长条件
[0561]
将如上所述制备的来自-80℃冰箱的细菌(金黄色葡萄球菌usa300)的储备物在37℃的水浴中解冻10min。将20ml新鲜的胰蛋白酶大豆培养液(tsb)(在使用前在37℃下预温热过夜或至少1h)与0.3ml解冻的细菌混合。初始od
600nm
为0.03，且细菌在50ml一次性管中生长。将细菌在37℃、150rpm搅拌下孵育约2.0小时，以达到0.6的最终od
600nm
。将细菌在4500rpm、4℃下离心10分钟。除去上清液，并将沉淀重悬浮于等体积的pbs中，并再次在4500rpm、4℃下离心10分钟。再次除去上清液，并将细菌沉淀重悬浮于2ml pbs中(约5x109cfu/ml)。此时，进行最终稀释以达到100μl中的1x107cfu/小鼠的细菌浓度。稀释100μl最终细菌悬浮液，并将10-5
和10-6
稀释液铺板至胰蛋白酶大豆琼脂(tsa)板上以计数cfu。使用金黄色葡萄球菌皮下感染的体内模型
[0562]
将小鼠使用红外线灯温热，以使尾静脉膨胀。将如上所述制备的细菌静脉内(100μl/动物)接种至尾静脉中。每天使用专门的评分表追踪动物的疾病的临床症状。感染后四天，处死小鼠并回收肾脏。将取出的肾脏匀浆用于cfu计数(2ml pbs)。制备十倍稀释液直至10-8
，并将10μl斑点(一式两份)铺板至tsa板上。
[0563]
模型的读取
[0564]
·
感染后每天登记临床评分。
[0565]
·
在感染后第4天进行cfu计数(表示为cfu/样品)。
[0566]
结果
[0567]
与对照相比，5ag as01e疫苗在减少细菌感染中高度有效。如通过cfu几何平均值(gm)所测量，在没有spa抗原的疫苗制剂(sa-4ag as01e)中的感染后4天收集的肾脏中的活细菌的水平比具有spa的sa疫苗制剂(sa-5ag as01e)中高6.6倍，并且差异是统计学显著的。在具有al(oh)3作为佐剂的sa-5ag疫苗制剂[sa-5ag al(oh)3]中的cfu gm比具有as01e作为佐剂的sa-5ag疫苗制剂(sa-5ag as01e)中高几乎2倍(1.78倍)，但这种差异不是统计学显著的。在单独的pbs组中，感染后4天肾脏中的活细菌的水平比研究中评估的任何gsk sa疫苗制剂中观察到的水平高至少4倍。结果显示于表13中。
[0568]
表13：肾脓肿模型-使用金黄色葡萄球菌菌株usa 300感染后4天的cfu几何平均值和95％ci
[0569][0570]
*cfu gm是未经调整的gm。
[0571]
疫苗制剂
[0572]
由于某些疫苗组分在水溶液中长期储存后稳定性降低，将疫苗抗原冻干以长期储
存，以便在施用前用含有佐剂的水溶液重构。
[0573]
实施例7：疫苗组分的冻干-赋形剂的选择
[0574]
对于抗原冻干过程，在单价制剂上测试了填充剂赋形剂的添加，以筛选用于该过程的最佳赋形剂并评价赋形剂添加对分析方法的潜在影响。测试了浓度为3％的甘露醇和浓度为5％的蔗糖，这得到了发明人在这些基质中使用类似疫苗的经验的支持。如表14中报告的，以相对于目标20％以上的浓度制备单价制剂。这是基于冻干过程之前的0.5ml填充体积和0.6ml冻干后的佐剂重构体积计算得出的，这将允许向患者递送0.5ml含有目标剂量(即，60μg/剂量蛋白)的药品。
[0575]
组分浓度抗原组分120ug/ml磷酸钾缓冲液，ph 6.58.3mm甘露醇2.5％
[0576]
a)
[0577]
组分浓度抗原组分120ug/ml磷酸钾缓冲液，ph 6.58.3mm蔗糖4％
[0578]
b)
[0579]
每种单价制剂在去毒和高压灭菌玻璃瓶中制备，首先加入适当体积的对应于10mm kpi ph 6.5的“缓冲液a”，然后根据其整体浓度计算抗原量，最后加入对应于10mm kpi ph 6.5 6％甘露醇或10％蔗糖的“缓冲液b”，使得最终组合物含有3％甘露醇或5％蔗糖。在添加抗原整体后，让制剂搅拌2-5min，并在制剂制备结束时加入“缓冲液b”后再搅拌10-15min。表15报告了简化的通用制剂组成方案。
[0580]
表15：单组分整体制剂的组成a)含有甘露醇b)含有蔗糖a)
[0581]
组分浓度抗原组分144ug/ml磷酸钾缓冲液，ph 6.510mm甘露醇3％
[0582]
b)
[0583]
组分浓度抗原组分144ug/ml磷酸钾缓冲液，ph 6.510mm蔗糖5％
[0584]
为了验证填充剂赋形剂和冻干步骤对主要抗原cqa的影响，应用以下分析组来表征每种单组分药品(见表16)。
[0585]
表16：表明对单价冻干产品的潜在稳定性进行考察的cqa列表
[0586]
coa分析工具外观目测检查
纯度rp-uplc聚集se-hplc蛋白含量微bca测定热分析微cal dsc总糖haec-padmw质谱
[0587]
目测检查
[0588]
对生产的冻干瓶进行目测检查，以验证饼外观(cake appearance)中是否存在主要临界点。所出现的饼如所预期的，没有发现重大缺陷。
[0589]
产品纯度
[0590]
产品纯度通过rp-uplc通过比较每个单价制剂的冻干前产品和冻干产品的纯度来验证。在表17中报告了结果。纯度以主峰面积相对于总免疫的百分比计算。然而，通过假设冻干前产品的主峰面积对应于100％来估计单价冻干产品相对于冻干前产品的回收率。两种测试基质的冻干前产品和冻干产品的spa和cp5-hla纯度始终为100％。对于在蔗糖基质中的cp8-clfa产品，观察到蛋白纯度从93％略微下降到92％，但对于分析方法的cv％，这种差异可以忽略不计，相反，在甘露醇基质中观察到cp8-clfa冻干产品的cv％略有下降，从93％下降到86％。相对于冻干前制剂，冻干产品的主峰回收率始终低于100％。通过比较两种不同的基质，甘露醇基质中单组分的回收率略低于蔗糖基质中的相同产品。
[0591]
表17：在5％蔗糖磷酸钾缓冲基质和3％甘露醇磷酸钾缓冲基质中，每种单价冻干前和冻干产品的主峰面积、主峰面积占总峰％(纯度)和主峰回收率％。
[0592][0593]
a)在5％蔗糖基质中的单一组分冻干前和冻干产品
[0594][0595]
b)在3％甘露醇基质中的单一组分冻干前和冻干产品
[0596]
聚集百分比
[0597]
通过se-hplc确定聚集百分比。相对于主峰cp8-clfa。单组分冻干前和冻干药品计
算的聚集百分比报告在表18中。对于含有甘露醇的基质中的单价冻干产品，观察到聚集百分比增加可达20％。而相反的是，在蔗糖kpi缓冲基质中没有观察到单价的聚集体形成。针对cp5-hla单价产品的聚集百分比报告在表19中。如对cp8-clfa观察到的，基质组合物中甘露醇的存在导致冻干产品中相对于冻干前形式的聚集百分比增加。另一方面，在含有甘露醇或蔗糖的基质中，没有观察到spa冻干产品的聚集百分比(相对于主峰计算的聚集百分比见表20)。
[0598]
表18：针对不同cp8-clfa单价冻干产品的聚集％
[0599][0600][0601]
表19：针对不同cp5-hla单价产品的聚集％。报告的数据是2个分析样品的平均值
[0602]
cp5-hla单价样品主峰面积％聚集形式面积％冻干前甘露醇95.594.41冻干甘露醇87.8312.16冻干前蔗糖97.072.93冻干蔗糖95.964.04
[0603]
表20：针对不同spa单价产品的聚集％。报告的数据是2个分析样品的平均值
[0604]
spa单价样品主峰面积％聚集形式面积％冻干前甘露醇1000冻干甘露醇1000冻干前蔗糖1000冻干蔗糖1000
[0605]
蛋白含量
[0606]
冻干单价药品中的蛋白含量通过微bca测定法测定。结果报告在表21a和b中。冻干前样品以10μg/ml的浓度稀释，冻干样品用0.6ml水重新悬浮，瓶标称浓度为120μg/ml，然后稀释至10μg/ml。根据稀释因子计算每个样品的浓度。冻干前和冻干样品之间的理论比值预计为1.20。所获得的结果与理论浓度一致。
[0607]
表21：针对a)在甘露醇基质中的单价和b)蔗糖基质的微bca结果。报告的数量表示两次重复的平均值
[0608][0609]
a)甘露醇kpi基质
[0610][0611]
b)蔗糖kpi基质
[0612]
热稳定性
[0613]
对5％蔗糖kpi基质中的单组分冻干产品进行dsc微cal分析。由于se-hplc分析表明存在聚集峰，因而未对甘露醇基质中的冻干产物进行分析。基本上，只分析了以下样本：
[0614]
cp8-clfa单组分冻干(批号stsuc01/17)
[0615]
cp5-hla单组分冻干(批号cp5_蔗糖01_17)
[0616]
spa单组分冻干(批号spa_蔗糖01_17)
[0617]
基于之前的分析，获得可靠热图的最小样品浓度定义为针对这两种生物缀合物为500μg/ml和针对spa为1000μg/ml。为了在最终浓度为500μg/ml的情况下获得1200μl的体积(分析重复2次，每次500μl)，用总体积为1200μl的milliq水重新配制9瓶每种生物偶联物。对于spa单组分冻干产品，18个瓶用1200μl of milliq水重构，最终浓度为1000μg/ml。作为参照缓冲液，用相同体积的milliq水重构相同数量的装有安慰剂缓冲液(10mm kpi 5％蔗糖，ph 6,5，批号plsuc04/17)的冻干液瓶。由于抗原浓度低(144μg/ml)，无法分析冻干前样品。图40报告了两种生物缀合物的热图，没有显示spa的数据，因为信号的低强度阻止了良好的参照缓冲液的扣除。为了了解冻干过程是否会引起生物缀合物热行为的变化，将热图与未经过任何冻融循环的药品材料(ds)整体图进行了比较。tm和tm起始值表明冻干不会对生物缀合物的热稳定性造成负面影响(见表22)。
[0618]
表22：两种生物缀合物单价冻干cp5-hla和cp8-clfa(单价冻干产品)以及ds整体(未应用冻融循环)的tm和tm初始值
[0619][0620][0621]
单价冻干产品上的质谱
[0622]
在hla-cp5的冻干前和冻干单价药品中评价二硫键的存在，进行肽图分析，然后进行质谱分析。简言之，将在蔗糖和甘露醇中配制的dp在非还原缓冲液中重构和变性并使用胰蛋白酶消化。通过lc-ms/ms分析获得的胰蛋白酶混合物，并使用peaks软件通过数据库检
索进行hla的肽图谱。在所有分析样品中都确认了对应于通过二硫键交联的胰蛋白酶肽的离子。
[0623]
赋形剂筛选的结论
[0624]
从在含有蔗糖或甘露醇的两种不同基质中应用冻干工艺后查询抗原cqa所进行的分析中，可以看出，制剂中3％甘露醇的存在导致冻干产品相对于冻干前形式的聚集百分比增加。没有观察到对其他考察的cqa的显著影响。因此，选择蔗糖作为用于疫苗产品的赋形剂。
[0625]
观察到冻干饼的分布不均匀，这可能是由于液体排列在瓶底部。由于配制的原液和硅化玻璃壁之间的表面相互作用，因而填充的瓶显示出液体的不均匀分布。
[0626]
众所周知，粘合强度是饼收缩的重要因素，因此在冻干过程中也会开裂，对饼的形态有决定性的影响。为了更好地理解这一现象，通过改变瓶填充体积(从0.5ml到0.7ml)重复冻干。饼均匀性没有改善，超过10％的瓶中表面出现明显开裂。
[0627]
考虑到饼均匀性被认为是冻干药品的一个关键方面，为了改善饼的外观，测试了使用非硅化瓶的方法，以及在制剂中添加吐温80作为表面活性剂。
[0628]
当使用非硅化瓶时，观察到轻微收缩。当小规模使用硅化瓶时，没有观察到破裂的饼。
[0629]
吐温80在冻干药品中的存在产生具有均匀外观的优美的饼。当使用硅化玻璃瓶时，添加吐温80有助于疫苗在重构后的回收。如果没有吐温(w/o)，死体积会集中在瓶底部。相反，使用吐温(w/)时，玻璃壁上仅残留一些液滴。通过称重用0.6ml水重构后提取的体积来评估不同配置的可提取量。因此得出结论，吐温80应包含在最终制剂中。
[0630]
结论
[0631]
基于单组分制剂获得的结果，三组分组合物疫苗制剂的选择如下：
[0632][0633]
当根据方案重构和使用时(即，在0.6ml中重构以施用0.5ml剂量)，这对应于每0.5ml剂量的最终量：
[0634]
[0635]
使用佐剂的冻干抗原的重构
[0636]
在如下所述的水溶液中用as01e重构的重构疫苗中，每0.5ml剂量大约包含：
[0637]-60μg spa
[0638]-60μg cp5-hla(蛋白)
[0639]-60μg cp8-clfa(蛋白)
[0640]-80μg聚山梨醇酯80
[0641]-21mg蔗糖
[0642]-18mm磷酸钾/钠盐
[0643]-150mm氯化钠
[0644]-25μg mpl
[0645]-25μg qs-21
[0646]-500μg dopc
[0647]-125μg胆固醇
[0648]-注射用水
[0649]
已经定义了适当的程序，以保证用正确体积的佐剂/稀释剂系统重构疫苗，并且可以获得0.5ml的注射目标剂量。已设计重构和注射程序，以保证针对目标剂量定义的所有配置的剂量注射。该程序意味着使用两种不同的针头，一种用于重构/抽取步骤，另一种用于向受试者注射。
[0650]
使用as01e佐剂(sa 5ag全剂量佐剂)在瓶中重构冻干的金黄色葡萄球菌疫苗的程序。
[0651][0652]
为了防止产品在使用过程中受到污染，需要在重构和抽取过程中遵循标准的污染预防措施。
[0653]
程序
[0654]
取1瓶as01e(双-剂量)佐剂和1瓶冻干金黄色葡萄球菌并取下翻盖；
[0655]
取1ml无菌一次性注射器并安装21gx1
1/2”针头；
[0656]
将注射器插入as01e佐剂瓶中，倒置瓶并抽取0.8ml佐剂体积；
[0657]
从as01e佐剂瓶中取下注射器，去除所有气泡并将注射器柱塞设置为0.6ml；
[0658]
使用同一针头，取出冻干瓶，保持瓶直立，将注射器插入瓶的橡胶塞中，缓慢喷出as01e佐剂，重构冻干产品；
[0659]
在不将注射器从瓶中取出的情况下，轻轻摇晃并等待不少于10分钟，以确保冻干
产品完全溶解；重构疫苗呈白色乳白色溶液；
[0660]
倒置瓶并抽取全部体积的重构疫苗；
[0661]
从瓶中取下注射器并通过稍微向后拉活塞杆从针头中回收液体。注意不要将活塞从注射器筒中拔出；
[0662]
弃去21gx1
1/2”针头并插入23gx1”针头用于注射；
[0663]
注意除去注射器中的所有气泡，将注射器柱塞设置为0.5ml，然后注射重构疫苗。
[0664]
金黄色葡萄球菌重构疫苗的使用中稳定性
[0665]
立即评估以及在25℃下孵育4小时后评估重构疫苗的使用中稳定性，以支持临床研究中的使用中条件。在临床药品批次上产生释放时的使用中稳定性数据。用as01e和盐水重构并储存4小时的重构疫苗结果显示出与重构后立即获得的结果相似的值。当在25℃下储存4小时，对重构产品没有影响。还立即评估以及在25℃下孵育6小时后评估使用佐剂as01e或盐水重构的冻干毒理学药品的使用中稳定性。结果显示与重构后立即获得的结果相似的值。在释放时评估，当在25℃下储存6小时对重构产品没有影响。
[0666]
序列表
[0667]
seq id no:1-野生型clfan1n2n3
[0668][0669]
seq id no:2-野生型clfan2n3
[0670][0671]
seq id no:3-成熟的野生型hla
[0672][0673]
seq id no:4-野生型spa。加下划线的是可以被突变以分别降低fcγ和vh3结合的qq和dd残基
[0674][0675]
seq id no:5-clfa n2n3 p116s/y118a
[0676][0677]
seq id no:6-clfa n2n3 p116s/y118a，其中pglb共有序列(kdqnatk，加下划线)取代残基i337
[0678][0679]
seq id no:7-clfa n2n3 p116s/y118a，其中pglb共有序列(kdqnatk，加下划线)取代残基i337和n-末端s
[0680][0681]
seq id no:8-成熟的hla h35l
[0682][0683]
seq id no:9-成熟的hla h35l，其中pglb共有序列(kdqnrtk)取代残基k131
[0684][0685]
seq id no:10-成熟的hla h35l/h48c/g122c
[0686][0687]
seq id no:11-成熟的hla h35l/h48c/g122c，其中pglb共有序列(kdqnrtk)取代残基k131
[0688][0689]
seq id no:12-hla h35l/h48c/g122c，具有n-末端s、c-末端gshrhr和kdqnrtk取代残基k131
[0690][0691]
seq id no:13-spa igg结合部分(结构域e、d、a、b、c)。加下划线的是可以被突变以分别减少fcγ和vh3结合的qq和dd残基
[0692][0693]
seq id no:14-spa e结构域。加下划线的是可以被突变以分别减少fcγ和vh3结合的qq和dd残基
[0694][0695]
seq id no:15-spa d结构域。加下划线的是可以被突变以分别减少fcγ和vh3结合的qq和dd残基
[0696][0697]
seq id no:16-spa a结构域。加下划线的是可以被突变以分别减少fcγ和vh3结合的qq和dd残基
[0698][0699]
seq id no:17-spa b结构域。加下划线的是可以被突变以分别减少fcγ和vh3结合的qq和dd残基
[0700][0701]
seq id no:18-spa c结构域。加下划线的是可以被突变以分别减少fcγ和vh3结合的qq和dd残基
[0702][0703]
seq id no:19-spa e结构域，具有位置7和8处的qq-kk取代和位置34和35处的dd-aa取代
[0704][0705]
seq id no:20-spa d结构域，具有位置12和13处的qq-kk取代和位置39和40处的dd-aa取代
[0706][0707]
seq id no:21-spa a结构域，具有位置9和108处的qq-kk取代和位置36和37处的dd-aa取代
[0708][0709]
seq id no:22-spa b结构域，具有位置9和10处的qq-kk取代和位置36和37处的dd-aa取代
[0710][0711]
seq id no:23-spa c结构域，具有位置9和10处的qq-kk取代和位置36和37处的dd-aa取代
[0712][0713]
seq id no:24-spa d结构域，具有位置4和5处的qq-kr取代、位置12和13处的qq-kk取代和位置39和40处的dd-aa取代
[0714][0715]
seq id no:25-spa d结构域，具有位置4和5处的qq-kr取代
[0716][0717]
seq id no:26-具有seq id no 19-23的取代的spa igg结合部分(edabc结构域)(spa
kkaa
)
[0718][0719]
seq id no:27-具有seq id no 19和21-24的取代的spa igg结合部分(edabc结构域)(spa
kkaa-kr
)
[0720][0721]
seq id no:28-pglb共有序列
[0722][0723]
seq id no:29-pglb共有序列
[0724][0725]
seq id no:30-pglb共有序列
[0726][0727]
seq id no:31-pglb共有序列
[0728][0729]
seq id no:32-clfan2n3p116s/y118a，具有i337处的(加下划线)、n-末端s、c-末端gs
[0730]