一种复方苦参注射液的活性成分的含量及指纹图谱的检测方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种改进的复方苦参注射液的活性成分的含量及指纹图谱的检测方法。


背景技术：

2.复方苦参注射液是由苦参和白土苓2味中药经现代科学方法精制而成的中药注射液，收载于国家药品标准中，具有清热利湿，凉血解毒，散结止痛的功效，用于癌肿疼痛、出血。现代研究表明其具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、提高机体免疫力等多种药理作用，临床上广泛用于非小细胞肺癌、原发性肝癌、消化道癌及恶性胸腔积水等重症疾病的辅助治疗。
3.苦参的主要成分为生物碱和黄酮类化合物，现代研究表明，苦参生物碱具有多种药理作用，是复方苦参注射液的主要药效成分。而目前国内外关于白土苓的研究报道较少，关于其化学成分、质量研究、药理研究等方面的研究工作比较薄弱。
4.现有复方苦参注射液国家药品标准(ws
3-b-2752-97-2014)中分别收载了苦参碱与氧化苦参碱(苦参)，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷(白土苓)的hplc含量测定方法，其中前种方法样品制备操作相对繁琐，后种方法色谱柱利用度较低。同时，指纹图谱项检测条件中，对色谱柱损耗较大，且整个谱图峰形较差。这三个测定条件均对色谱柱有损害，并且耗时耗力。因此复方苦参注射液中的检测及指纹图谱方法有待改进和提高。
5.李华丽等“hplc-dad法同时测定苦参配方颗粒中6种生物碱成分的含量”公开了建立hplc-dad法同时测定苦参配方颗粒中氧化槐醇碱、氧化苦参碱、槐定碱、氧化槐果碱、苦参碱及槐果碱6种生物碱活性成分的含量。从其色谱条件来看，与国家药品标准中收载的指纹图谱色谱条件较为相似，以该条件考察复方苦参注射液时，色谱峰稍有拖尾，不适合复方苦参注射液测定。
6.因此，为了更加有效地控制复方苦参注射液的质量，有必要提供一种能够同时完成复方苦参注射液多种成分的含量测定与指纹图谱的检测方法，为复方苦参注射液中质量控制提供快速、高效的技术方法，减轻检验工作量。


技术实现要素：

7.针对以上技术现状，本发明提供一种改进的复方苦参注射液中的活性成分的含量及指纹图谱的检测方法，所述方法为采用高效液相色谱法进行检测，其中所述高效液相色谱条件包括：色谱柱为c
18
柱；所述活性成分包括苦参碱、氧化苦参碱、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷、槐果碱、氧化槐果碱和槐定碱、或/和番石榴酸。
8.本发明方法中，作为实施方案之一，所述色谱柱优选waters xselect csh
tm c
18
、techmate c
18-st、welch ultimate aq-c
18
、waters sunfire c
18
，更优选waters xselect csh
tm c
18
，规格为5μm，4.6mm
×
250mm。
9.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括流动相为：有机相为甲
醇、水相为磷酸盐缓冲液梯度洗脱；优选0.1％-0.34％磷酸二氢钾(磷酸调ph值至3.0)-甲醇梯度洗脱；更优选0.2％磷酸二氢钾(磷酸调ph值至3.0)-甲醇梯度洗脱。
10.本发明方法中，作为实施方案之一，磷酸调节磷酸二氢钾溶液ph值优选调节至2.9-3.1，更优选调节ph值至3.0。
11.本发明方法中，作为实施方案之一，所述梯度洗脱条件如下：
[0012][0013][0014]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中高效液相色谱条件包括柱温为28-32℃，优选30℃。
[0015]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中高效液相色谱条件包括流速为0.58-0.62ml/ml，优选0.6ml/min。
[0016]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中高效液相色谱条件包括检测波长为209-213nm，优选211nm。
[0017]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中高效液相色谱条件包括进样量为3-20μl，优选5-15μl，更优选8-12μl，最佳为10μl。
[0018]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中高效液相色谱条件包括空白溶液配制：磷酸调节磷酸二氢钾溶液的ph值至3.0，0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15的混合溶液，过滤即得。
[0019]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中高效液相色谱条件包括：
[0020]
对照品溶液配制：
[0021]
精密称取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品适量，加空白溶液制成每1ml含苦参碱0.33mg，氧化苦参碱0.85mg，氧化槐果碱0.25mg的混合对照品溶液ⅰ，摇匀，即得；精密称取槐果碱对照品，槐定碱对照品，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，加空白溶液制成每1ml含槐果碱0.09mg，槐定碱0.08mg，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷0.08mg的混合对照品溶液ⅱ，摇匀，即得；精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ2ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得；或
[0022]
精密称取番石榴酸对照品适量，加空白溶液制成每1ml含番石榴酸0.25mg的对照品储备液，摇匀，即得。精密量取对照品储备液2ml，置10ml量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
[0023]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述对照品溶液对照品的含量可以在以下范围：苦参碱优选范围为0.28-0.40mg，最佳范围为0.33mg；氧化苦参碱优选范围为0.72-1.06mg，最佳范围为0.85mg；氧化槐果碱优选范围为0.21-0.31mg，最佳范围为0.25mg；槐果碱、槐定碱、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷优选范围均为0.07-0.11mg，最佳分别为0.09mg，0.08mg，0.08mg。
[0024]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中高效液相色谱条件包括供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0025]
本发明方法中，作为实施方案之一，提供一种复方苦参注射液的活性成分含量的检测方法，所述方法包括采用高效液相色谱法进行检测，其中高效液相色谱条件包括：
[0026][0027][0028]
(1)空白溶液配制：磷酸调节磷酸二氢钾溶液的ph值至3.0，0.2％磷酸二氢钾溶液(磷酸调ph值至3.0)-甲醇＝85∶15的混合溶液，过滤即得；
[0029]
(2)对照品溶液配制：精密称取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品适量，加空白溶液制成每1ml含苦参碱0.33mg，氧化苦参碱0.85mg，氧化槐果碱0.25mg的混合对照品溶液ⅰ，摇匀，即得；精密称取槐果碱对照品，槐定碱对照品，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，加空白溶液制成每1ml含槐果碱0.09mg，槐定碱0.08mg，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷0.08mg的混合对照品溶液ⅱ，摇匀，即得；精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ2ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，可选择地，同法配制两份；
[0030]
(3)供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
[0031]
(4)将空白溶液、对照品溶液、供试品溶液按顺序注入液相色谱仪，记录色谱图，外标法计算含量。
[0032]
本发明方法中，作为实施方案之一，本发明所述复方苦参注射液的指纹图谱检测方法，包括：构建复方苦参注射液的含有苦参碱、氧化苦参碱、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷、槐果碱、氧化槐果碱、和槐定碱指纹图谱。
[0033]
本发明方法中，作为实施方案之一，本发明提供一种复方苦参注射液的指纹图谱检测方法，所述方法包括：
[0034]
所述方法包括采用高效液相色谱发进行检测，其中高效液相色谱条件包括：
[0035][0036][0037]
(1)空白溶液配制：磷酸调节磷酸二氢钾溶液的ph值至3.0，0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15的混合溶液，过滤即得；
[0038]
(2)对照品溶液配制：精密称取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品适量，加空白溶液制成每1ml含苦参碱0.33mg，氧化苦参碱0.85mg，氧化槐果碱0.25mg的混合对照品溶液ⅰ，摇匀，即得；精密称取槐果碱对照品，槐定碱对照品，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，加空白溶液制成每1ml含槐果碱0.09mg，槐定碱0.08mg，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷0.08mg的混合对照品溶液ⅱ，摇匀，即得；精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ2ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀；可选择地，同法配制两份；或
[0039]
精密称取番石榴酸对照品适量，加空白溶液制成每1ml含番石榴酸0.25mg的对照品储备液，摇匀，即得。精密量取对照品储备液2ml，置10ml量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
[0040]
(3)供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
[0041]
(4)按照空白溶液、对照品溶液、供试品溶液的顺序进样，构建复方苦参注射液的含有苦参碱、氧化苦参碱、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷、槐果碱、氧化槐果碱和槐定碱的指纹图谱。
[0042]
(5)检测：按照空白溶液、对照品溶液、供试品溶液的顺序进样，然后检测。
[0043]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(4)中的指纹图谱中具有10个共有特征峰，以7号峰-氧化苦参碱为参考：1号峰-槐胺碱的相对保留时间为0.442；2号峰-甲基氧化偶氮樱草糖苷的相对保留时间为0.603；3号峰-苦参碱相对保留时间为0.693；4号峰-槐果碱的相对保留时间为0.816；5号峰-槐定碱的相对保留时间为0.845；6号峰-氧化槐果碱的相对保留时间为0.941；7号峰-氧化苦参碱的相对保留时间为1.0；8号峰-番石榴酸相对保留时间为1.149；9号峰相对保留时间为1.639；10号峰三叶豆紫檀苷的相对保留时间为1.888。
[0044]
本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(4)按如下进样顺序，注入液相色谱仪，记录色谱图，外标法计算含量
[0045]
进样顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针3对照品2溶液2针4供试品溶液1针5对照品1溶液1针
[0046]
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括对照品溶液连续测试5次，峰面积rsd不得过3.0％，保留时间rsd不得过3.0％。
[0047]
本发明还提供根据前述任一所述方法构建的复方苦参注射液高效液相色谱指纹图谱，所述指纹图谱具有10个共有特征峰，以7号峰为参考，共有特征峰的相对保留时间分别为：1号峰相对保留时间为0.442；2号峰相对保留时间为0.603；3号峰相对保留时间为0.693；4号峰相对保留时间为0.816；5号峰相对保留时间为0.845；6号峰相对保留时间为0.941；7号峰相对保留时间为1.0；8号峰相对保留时间为1.149；9号峰相对保留时间为1.639；10号峰相对保留时间为1.888。
[0048]
本发明中，作为实施方案之一，以7号峰为参考，共有特征峰的相对峰面积分别为：1号峰相对峰面积为0.039；2号峰相对峰面积为0.068；3号峰相对峰面积为0.468；4号峰相对峰面积为0.184；5号峰相对峰面积为0.098；6号峰相对峰面积为0.425；7号峰相对峰面积为1.0；8号峰相对峰面积为0.224；9号峰相对峰面积为0.049；10号峰相对峰面积为0.058。
[0049]
本发明中，作为实施方案之一，1号峰为槐胺碱，2号峰为甲基氧化偶氮樱草糖苷，3号峰为苦参碱，4号峰为槐果碱，5号峰为槐定碱，6号峰为氧化槐果碱，7号峰为氧化苦参碱，8号峰为番石榴酸，9号峰为未知峰，10号峰为三叶豆紫檀苷。
[0050]
相对于现有复方苦参注射液的检测方法，本发明采用高效液相色谱法，能够同时测定复方苦参注射液中7种成分，并用该方法构建色谱指纹图谱，为复方苦参注射液中质量控制提供快速、高效的技术方法，减轻检验工作量。本发明方法将复方苦参注射液标准中的
三个条件合为一个条件进行检测，省时省力。
附图说明
[0051]
图1为实施例1中的空白与阴性样品结果图。
[0052]
图2-1～2-6为实施例1中6个指标成分线性图。
[0053]
图3为实施例2中的空白与阴性样品结果图。
[0054]
图4为实施例2中的番石榴酸线性图。
[0055]
图5-1为实施例3中的标准对照指纹图谱。
[0056]
图5-2为实施例3中的供试品叠加图谱。
[0057]
图6为实施例3中的重复性叠加图谱。
[0058]
图7为实施例3中的中间精密度叠加图谱。
[0059]
图8为实施例3中的稳定性指纹图。
[0060]
图9为实施例3中的两倍时间指纹图谱。
[0061]
图10-1为实施例3中的不同色谱柱指纹图谱。
[0062]
图10-2为实施例3中的不同仪器指纹图谱。
[0063]
图11为实施例3中的生产工艺关键点指纹图谱。
[0064]
图12-1～图12-4为实施例4中的不同色谱柱考察色谱图：图12-1为waters xselect csh
tm c
18
；图12-2为techmate c
18-st；图12-3为welch ultimate aq-c
18
；图12-4为waters sunfire c
18
。
[0065]
图13-1～图13-9为实施例4中的不同流动相系统考察色谱图：图13-1为乙腈：0.01m醋酸铵(9：1)，0.01m醋酸铵(ph调至8.0)，图13-2为甲醇-水；图13-3为甲醇-0.1％甲酸水；图13-4为甲醇-0.1％乙酸水；图13-5为甲醇-0.01％乙酸水；图13-6为甲醇-0.1％磷酸；图13-7为乙腈-水；图13-8为甲醇-0.01m乙酸铵；图13-9为甲醇-0.2％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)。
[0066]
图14-1～14-3为实施例4中的不同ph值考察色谱图：图14-1为甲醇-0.1％磷酸二氢钾(磷酸调ph为5.0)；图14-2为甲醇-0.1％磷酸二氢钾(磷酸调ph为4.0)；图14-3为甲醇-0.1％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)。
[0067]
图15-1～图15-4为实施例4中的磷酸二氢钾浓度考察色谱图：图15-1为甲醇-0.1％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)；图15-2为甲醇-0.34％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)；图15-3为甲醇-0.2％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)；图15-4为甲醇：磷酸二氢钾(ph＝3.0，磷酸二氢钾浓度分别为0.1％、0.2％、0.3％)叠加色谱图。
[0068]
图16-1～图16-3为实施例4中的梯度优化色谱图：图16-1为方法1，图16-2为方法2，图16-3为方法3。
[0069]
图17-1为实施例4中全波长扫描图；图17-2为实施例4中色谱峰紫外吸收波长图。
[0070]
图18-1～图18-3为实施例4中供试品溶液制备方法的优化的色谱图：图18-1为供试品(水制备)与空白溶液叠加图；图18-2为甲醇制备对照品，纯化水制备供试品叠加图；图18-3为空白溶液制备供试品与对照品叠加图。
具体实施方式
[0071]
以下实施例和试验例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
[0072]
仪器
[0073]
对照品
[0074]
[0075][0076]
实施例1供试品
[0077]
名称批号来源复方苦参注射液20181138山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181034山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181139山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181203山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181204山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181209山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181212山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181213山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181214山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181215山西振东制药股份有限公司
[0078]
实施例2供试品
[0079]
[0080][0081]
实施例3供试品
[0082]
名称批号来源复方苦参注射液20181138山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181034山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181139山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181203山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181204山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181209山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181212山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181213山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181214山西振东制药股份有限公司复方苦参注射液20181215山西振东制药股份有限公司
[0083]
试剂
[0084]
名称批号来源级别磷酸二氢钾018823mreadhplc磷酸0160318北京化工厂分析级甲醇10985407 902默克两合有限公司hplc
吐温8020151222南京威尔化工有限公司供注射用
[0085]
实施例1复方苦参注射液含量的检测方法
[0086]
1.包括色谱条件、样品配制、系统适用性要求、计算公式、限度要求方法描述
[0087][0088][0089]
2.验证具体内容
[0090]
2.1系统适用性
[0091]
(1)实验步骤
[0092]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0093]
对照品溶液配制：精密称取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品适量，加空白溶液制成每1ml含苦参碱0.33mg，氧化苦参碱0.85mg，氧化槐果碱0.25mg的混合对照品溶液ⅰ，摇匀，即得；精密称取槐果碱对照品，槐定碱对照品，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，加空白溶液制成每1ml含槐果碱0.09mg，槐定碱0.08mg，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷0.08mg的混合对照品溶液ⅱ，摇匀，即得。精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ2ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0094]
供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0095]
进样程序要求
[0096]
进样顺序
[0097]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品溶液5针(连续进针)3供试品溶液1针
[0098]
(2)结果报告
[0099]
对照品溶液连续进样5次的峰面积及保留时间的rsd值。
[0100]
表2.1-1对照品溶液峰面积及保留时间结果
[0101][0102]
表2.1-2系统适用性结果
[0103][0104]
(3)结论
[0105]
从结果中来看，对照品溶液连续进样5次，氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱峰面积测量值的rsd均小于2.0％，保留时间rsd均小于2.0％，槐果碱、槐定碱、甲基氧化偶氮甲醇
樱草糖苷峰面积测量值的rsd均小于3.0％，保留时间rsd均小于3.0％；六个指标成分的理论板数均大于3000，拖尾因子均小于2.0，符合要求。
[0106]
2.2专属性
[0107]
(1)实验步骤
[0108]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0109]
阴性样品溶液配制：精密量取单苦参注射液(野生及种植)、单白土苓注射液各1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为阴性样品溶液。
[0110]
0.25％吐温溶液配制：称定0.25g吐温80，加水溶解至100ml，摇匀，滤过，取续滤液作为0.25％吐温溶液。
[0111]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法。
[0112]
供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，备用。
[0113]
滤膜干扰样品配制：取供试品溶液，一份离心；一份滤过，弃去不同的体积(1ml、3ml、5ml、7ml、9ml)。
[0114]
进样程序要求
[0115]
进样顺序
[0116]
顺序样品针数1空白溶液1针2阴性样品溶液(单苦参)1针3阴性样品溶液(单白土苓)1针40.25％吐温80溶液1针5对照品溶液1针6供试品溶液-离心1针7供试品溶液-滤过1ml1针8供试品溶液-滤过3ml1针9供试品溶液-滤过5ml1针10供试品溶液-滤过7ml1针11供试品溶液-滤过9ml1针
[0117]
(2)结果报告，结果参见图1及下表。
[0118]
表2.2-1滤膜干扰实验结果(弃去不同体积相对于离心样品的面积百分比)
[0119][0120]
(3)结论
[0121]
从结果中来看，空白溶液、空白流动相、0.25％吐温80溶液对样品没有干扰，单苦
参阴性样品溶液(野生苦参及种植苦参)对甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷无干扰，单白土苓阴性样品溶液对生物碱无干扰。
[0122]
弃去不同体积后供试品溶液指标成分面积与离心供试品溶液指标成分面积的百分比相对含量在95.0％～105.0％之间，吸附可忽略不计。
[0123]
2.3线性和范围
[0124]
(1)实验步骤
[0125]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0126]
线性贮备液配制：精密称取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品适量，加空白溶液制成每1ml含苦参碱0.33mg，氧化苦参碱0.85mg，氧化槐果碱0.25mg的混合对照品溶液ⅰ，摇匀，即得；精密称取槐果碱对照品，槐定碱对照品，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，加空白溶液制成每1ml含槐果碱0.09mg，槐定碱0.08mg，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷0.08mg的混合对照品溶液ⅱ，摇匀，即得。
[0127]
25％对照品溶液：精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ各0.5ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0128]
50％对照品溶液：精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ各1ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0129]
100％对照品溶液：精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ各2ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0130]
150％对照品溶液：精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ各3ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0131]
200％对照品溶液：精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ各4ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0132]
进样程序要求
[0133]
进样顺序
[0134]
顺序样品针数1空白溶液1针2100％对照品溶液连续5针325％对照品溶液1针450％对照品溶液1针5100％对照品溶液1针6150％对照品溶液1针7200％对照品溶液1针8100％对照品溶液1针
[0135]
(2)结果报告
[0136]
各指标成分的回归方程与相关系数及线性图结果参见图2-1～图2-6。
[0137]
(3)结论
[0138]
甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷在0.00422mg/ml-0.03374mg/ml内呈线性；苦参碱在0.01627mg/ml-0.13013mg/ml内呈线性；槐果碱在0.0044mg/ml-0.03517mg/ml内呈线性；槐定碱在0.00438mg/ml-0.03505mg/ml内呈线性；氧化槐果碱在0.01252mg/ml-0.10016mg/ml
内呈线性；氧化苦参碱在0.04228mg/ml-0.33742mg/ml内呈线性。各成分的线性相关系数均大于等于0.999，符合标准。
[0139]
2.4灵敏度
[0140]
(1)实验步骤
[0141]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0142]
对照品溶液配制：精密称取甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，加空白溶液制成每1ml含0.085mg的对照品溶液。
[0143]
定量限及检测限溶液：用空白溶液分步稀释成信噪比(s/n)为10∶1时，作为定量限溶液，用空白溶液分步稀释成信噪比(s/n)为2～3时，作为检测限溶液。
[0144]
进样程序要求
[0145]
进样顺序
[0146]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针(连续测试)3定量限溶液6针4检测限溶液2针
[0147]
(2)结果报告
[0148]
表2.4-1定量限结果统计
[0149] 123456平均rsd(％)峰面积14189126991289313187142091390913514.334.97保留时间(min)15.40715.53015.45615.46115.39415.42315.4500.32
[0150]
表2.4-2灵敏度测试结果
[0151][0152]
(3)结论
[0153]
从结果中来看，定量限溶液连续进样后，峰保留时间rsd值小于2.0％，峰面积小于5.0％；定量限为8.09ng，检测限为2.43ng。
[0154]
2.5重复性
[0155]
(1)实验步骤
[0156]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0157]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法，同法配制两份。
[0158]
供试品溶液配制(6份)：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。平行操作6份。
[0159]
进样程序要求
[0160]
进样顺序
[0161]
顺序样品针数
1空白溶液1针2对照品1溶液5针(连续测试)3对照品2溶液2针4供试品-1溶液1针5供试品-2溶液1针6供试品-3溶液1针7供试品-4溶液1针8供试品-5溶液1针9供试品-6溶液1针10对照品1溶液1针
[0162]
(2)结果报告
[0163]
表2.5重复性测试结果
[0164][0165][0166]
(3)结论
[0167]
从结果中来看，6份供试品中苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱含量结果rsd均小于3.0％，槐果碱、槐定碱、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷含量结果rsd均小于4.0％，表明供试品重复性良好。
[0168]
2.6中间精密度
[0169]
(1)实验步骤
[0170]
照重复性测定方法，由不同的分析人员，使用不同的仪器、在不同的日期进行，平行配制相同批次6份供试品溶液，溶液配制及进样程序同重复性项下。
[0171]
(2)结果报告
[0172]
表2.6-1甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷中间精密度测试结果
[0173][0174]
表2.6-2苦参碱中间精密度测试结果
[0175][0176][0177]
表2.6-3槐果碱中间精密度测试结果
[0178]
[0179]
表2.6-4槐定碱中间精密度测试结果
[0180][0181][0182]
表2.6-5氧化槐果碱中间精密度测试结果
[0183][0184]
表2.6-6氧化苦参碱中间精密度测试结果
[0185][0186]
(3)结论
[0187]
从结果中可以看出，不同人员在不同日期用不同仪器对样品进行测试，12份供试品中苦参碱含量结果rsd为0.34％、氧化苦参碱含量结果rsd为2.12％、氧化槐果碱含量结果rsd为1.50％，均小于3.0％，槐果碱含量结果rsd为0.91％、槐定碱含量结果rsd为0.67％、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷含量结果rsd为1.18％，均小于4.0％，说明供试品中间精密度良好。
[0188]
2.7溶液稳定性
[0189]
(1)实验步骤
[0190]
空白溶剂配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0191]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法，同法配制两份。
[0192]
供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0193]
进样程序要求
[0194]
进样顺序
[0195]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针(连续测试)3对照品2溶液2针4供试品-0h1针5对照品-4h1针6供试品-4h1针7对照品-8h1针8供试品-8h1针9对照品-12h1针10供试品-12h1针11对照品-18h1针12供试品-18h1针
13对照品-24h1针14供试品-24h1针15对照品1溶液1针
[0196]
(2)结果报告
[0197]
表2.7溶液稳定性测试结果
[0198][0199][0200]
(3)结论
[0201]
从结果中来看对照品溶液与供试品溶液放置24小时，供试品中苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱含量结果rsd均小于3.0％，槐果碱、槐定碱、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷含量结果rsd均小于4.0％，表明供试品在24小时内稳定。
[0202]
计算各时间点指标成分面积与0小时指标成分面积的百分比，对照品和供试品溶液每个时间点的结果与初始结果相比，相对含量在
[0203]
98.0％～102.0％之间，溶液稳定性良好。
[0204]
2.8准确度
[0205]
(1)实验步骤
[0206]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0207]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法，同法配制两份。
[0208]
50％回收率溶液配制：精密量取复方苦参注射液0.5ml，置50ml量瓶中，分别加入混合对照品溶液ⅰ、ⅱ2.5ml后，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，作为50％回收率溶液(同法配制3份)。
[0209]
100％回收率溶液配制：精密量取复方苦参注射液0.5ml，置50ml量瓶中，分别加入混合对照品溶液ⅰ、ⅱ5ml后，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，作为100％回收率溶液(同法配制3份)。
[0210]
150％回收率溶液配制：精密量取复方苦参注射液0.5ml，置50ml量瓶中，分别加入混合对照品溶液ⅰ、ⅱ7.5ml后，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，作为150％回收率溶液(同法配制3份)。
[0211]
进样程序要求
[0212]
进样顺序
[0213]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针(连续测试)3对照品2溶液2针450％-1回收率溶液2针550％-2回收率溶液2针650％-3回收率溶液2针7100％-1回收率溶液2针8100％-2回收率溶液2针9100％-3回收率溶液2针10150％-1回收率溶液2针11150％-2回收率溶液2针12150％-3回收率溶液2针13对照品1溶液1针
[0214]
(2)结果报告
[0215]
回收率计算公式：
[0216]
表2.8-1甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷含量回收率测试结果
[0217][0218][0219]
表2.8-2苦参碱含量回收率测试结果
[0220][0221]
表2.8-3槐果碱含量回收率测试结果
[0222][0223]
表2.8-4槐定碱含量回收率测试结果
[0224][0225][0226]
表2.8-5氧化槐果碱含量回收率测试结果
[0227][0228]
表2.8-6氧化苦参碱含量回收率测试结果
[0229][0230]
(3)结论
[0231]
供试品中苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱回收率范围在92％～105％之间，9份回收率rsd值分别为0.93％、1.33％、1.01％，均小于4％；槐果碱、槐定碱、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷回收率范围在90.0％～108.0％之间，9份回收率rsd分别为2.01％、1.26％、1.90％，均小于5.0％，符合要求。
[0232]
2.9耐用性
[0233]
(1)实验步骤
[0234]
变动的色谱条件见下表。
[0235][0236]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0237]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法。
[0238]
供试品溶液配制：分别精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。同法制备两份。
[0239]
进样程序要求。(不同考察条件均按此进样顺序进样)
[0240]
进样顺序
[0241]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针3对照品2溶液2针4供试品-11针5供试品-21针6对照品1溶液1针
[0242]
注：对照品和供试品溶液在检测时间范围内稳定则不用重新配制，若溶液不稳定，改变色谱条件时，需要临用重新配制对照品及供试品溶液。
[0243]
(2)结果报告
[0244]
表2.9-1耐用性测试结果-1
[0245][0246]
表2.9-2耐用性测试结果-2
[0247][0248][0249]
(3)结论
[0250]
供试品溶液，不同条件下含量基本一致，各指标成分含量相对标准条件的含量在90％-110％之间。表明本品含量检测对柱温、波长、流动相ph、不同色谱柱型号等条件，耐用性良好。
[0251]
2.10样品测定
[0252]
(1)实验步骤
[0253]
空白溶剂配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0254]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法，同法配制两份。
[0255]
供试品溶液配制：精密量取各批次复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶
液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0256]
进样程序要求。
[0257]
进样顺序
[0258]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针3对照品2溶液2针4供试品-11针5供试品-21针6～12供试品-3～供试品-9每供试品1针13供试品-101针14对照品1溶液1针
[0259]
(2)结果报告
[0260]
表2.10含量测定结果
[0261][0262][0263]
实施例2复方苦参注射液中番石榴酸的检测
[0264]
1.色谱条件、样品配制、系统适用性要求、计算公式、限度要求等。
[0265]
方法描述
[0266][0267][0268]
2.验证内容
[0269]
2.1系统适用性
[0270]
(1)实验步骤
[0271]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0272]
对照品溶液配制：精密称取番石榴酸对照品适量，加空白溶液制成每1ml含番石榴
酸0.25mg的对照品储备液，摇匀。精密量取对照品储备液2ml，置10ml量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
[0273]
供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0274]
进样程序要求
[0275]
进样顺序
[0276]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品溶液5针(连续进针)3供试品溶液1针
[0277]
(2)结果报告
[0278]
对照品溶液连续进样5次的峰面积及保留时间的rsd值。
[0279]
表2.1-1对照品溶液峰面积及保留时间结果
[0280][0281]
表2.1-2系统适用性结果
[0282][0283]
(3)结论
[0284]
从结果中来看，对照品溶液连续进样5次，番石榴酸峰面积测量值的rsd均小于2.0％，保留时间rsd均小于2.0％，理论板数大于3000，拖尾因子均小于1.5，符合要求。
[0285]
2.2专属性
[0286]
(1)实验步骤
[0287]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0288]
阴性样品溶液配制：精密量取单苦参注射液(野生及种植)、单白土苓注射液各1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为阴性样品溶液。
[0289]
0.25％吐温溶液配制：称定0.25g吐温80，加水溶解至100ml，摇匀，滤过，取续滤液作为0.25％吐温溶液。
[0290]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法。
[0291]
供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，备用。
[0292]
滤膜干扰样品配制：取供试品溶液，一份离心；一份滤过，弃去不同的体积(1ml、3ml、5ml、7ml、9ml)。
[0293]
进样程序要求
[0294]
进样顺序
[0295]
顺序样品针数
1空白溶液1针2阴性样品溶液(单苦参)1针3阴性样品溶液(单白土苓)1针40.25％吐温80溶液1针5对照品溶液1针6供试品溶液-离心1针7供试品溶液-滤过1ml1针8供试品溶液-滤过3ml1针9供试品溶液-滤过5ml1针10供试品溶液-滤过7ml1针11供试品溶液-滤过9ml1针
[0296]
(2)结果报告
[0297]
参见图3及下表
[0298]
表2.2-1滤膜干扰实验结果
[0299]
(弃去不同体积相对于离心样品的面积百分比)
[0300][0301]
(3)结论
[0302]
从结果中来看，空白溶液、空白流动相、0.25％吐温80溶液对样品没有干扰，单白土苓阴性样品溶液对番石榴酸无干扰。
[0303]
弃去不同体积后供试品溶液指标成分面积与离心供试品溶液指标成分面积的百分比相对含量在98.0％～102.0％之间，吸附可忽略不计。
[0304]
2.3线性和范围
[0305]
(1)实验步骤
[0306]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0307]
线性贮备液配制：精密称取番石榴酸对照品适量，加空白溶液制成每1ml含番石榴酸0.25mg的对照品储备液，摇匀，即得。
[0308]
25％线性溶液：精密量取对照品储备液0.5ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0309]
50％线性溶液：精密量取对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0310]
100％线性溶液：精密量取对照品储备液2ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0311]
150％线性溶液：精密量取对照品储备液3ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0312]
200％线性溶液：精密量取对照品储备液4ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
[0313]
进样程序要求
[0314]
进样顺序
[0315]
顺序样品针数1空白溶液1针2100％对照品溶液连续5针325％对照品溶液1针450％对照品溶液1针5100％对照品溶液1针6150％对照品溶液1针7200％对照品溶液1针8100％对照品溶液1针
[0316]
(2)结果报告
[0317]
番石榴酸的回归方程与相关系数及线性图结果参见图4。
[0318]
(3)结论
[0319]
番石榴酸在0.0122mg/ml-0.0978mg/ml内呈线性；线性相关系数大于等于0.999，符合标准。
[0320]
2.4重复性
[0321]
(1)实验步骤
[0322]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0323]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法，同法配制两份。
[0324]
供试品溶液配制(6份)：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。平行操作6份。
[0325]
进样程序要求
[0326]
进样顺序
[0327]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针(连续测试)3对照品2溶液2针4供试品-1溶液1针5供试品-2溶液1针6供试品-3溶液1针7供试品-4溶液1针8供试品-5溶液1针
9供试品-6溶液1针10对照品1溶液1针
[0328]
(2)结果报告
[0329]
表2.4重复性测试结果
[0330]
/123456平均(％)rsd(％)番石榴酸(％)1.6251.6241.6181.6261.6411.6211.6260.50
[0331]
(3)结论
[0332]
从结果中来看，6份供试品中番石榴酸含量结果rsd小于3.0％，表明供试品重复性良好。
[0333]
2.5中间精密度
[0334]
(1)实验步骤
[0335]
照重复性测定方法，由不同的分析人员，使用不同的仪器、在不同的日期进行，平行配制相同批次6份供试品溶液，溶液配制及进样程序同重复性项下。
[0336]
(2)结果报告
[0337]
表2.5番石榴酸中间精密度测试结果
[0338][0339]
(3)结论
[0340]
从结果中可以看出，不同人员在不同日期用不同仪器对样品进行测试，12份供试品中番石榴酸含量结果rsd为0.65％，小于3.0％，说明供试品中间精密度良好。
[0341]
2.6溶液稳定性
[0342]
(1)实验步骤
[0343]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0344]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法，同法配制两份。
[0345]
供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0346]
进样程序要求
[0347]
进样顺序
[0348]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针(连续测试)3对照品2溶液2针4供试品-0h1针5对照品-4h1针6供试品-4h1针7对照品-8h1针8供试品-8h1针9对照品-12h1针10供试品-12h1针11对照品-18h1针12供试品-18h1针13对照品-24h1针14供试品-24h1针15对照品1溶液1针
[0349]
(2)结果报告
[0350]
表2.6溶液稳定性测试结果
[0351]
时间(h)048121824平均(％)rsd(％)番石榴酸含量(％)1.6061.6011.6031.6071.6001.6041.6040.17相对0h含量(％)/99.6999.85100.0999.6499.86//
[0352]
(3)结论
[0353]
从结果中来看供试品溶液放置24小时，供试品中番石榴酸含量结果rsd均小于3％，表明供试品在24小时内稳定。
[0354]
计算各时间点指标成分面积与0小时指标成分面积的百分比，对照品和供试品溶液每个时间点的结果与初始结果相比，相对含量在98.0％～102.0％之间，溶液稳定性良好。
[0355]
2.7准确度
[0356]
(1)实验步骤
[0357]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0358]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法，同法配制两份。
[0359]
50％回收率溶液配制：精密量取复方苦参注射液0.5ml，置50ml量瓶中，加入对照品储备液2ml后，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，作为50％回收率溶液(同法配制3份)。
[0360]
100％回收率溶液：精密量取复方苦参注射液0.5ml，置50ml量瓶中，加入对照品储备液4ml后，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，作为100％回收率溶液(同法配制3份)。
[0361]
150％回收率溶液：精密量取复方苦参注射液0.5ml，置50ml量瓶中，加入对照品储备液6ml后，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，作为150％回收率溶液(同法配制3份)。
[0362]
进样程序要求
[0363]
进样顺序
[0364]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针(连续测试)3对照品2溶液2针450％-1回收率溶液2针550％-2回收率溶液2针650％-3回收率溶液2针7100％-1回收率溶液2针8100％-2回收率溶液2针9100％-3回收率溶液2针10150％-1回收率溶液2针11150％-2回收率溶液2针12150％-3回收率溶液2针13对照品1溶液1针
[0365]
(2)结果报告
[0366]
回收率计算公式：
[0367]
表2.7番石榴酸含量回收率测试结果
[0368][0369]
(3)结论
[0370]
供试品中番石榴酸回收率范围在92％～105％之间，回收率rsd值为1.75％，小于4％，符合要求。
[0371]
2.8耐用性
[0372]
(1)实验步骤
[0373]
变动的色谱条件见下表。
[0374][0375]
空白溶液配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0376]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法。
[0377]
供试品溶液配制：分别精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。同法制备两份。
[0378]
进样程序要求。(不同考察条件均按此进样顺序进样)
[0379]
进样顺序
[0380]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针3对照品2溶液2针4供试品-11针5供试品-21针6对照品1溶液1针
[0381]
注：对照品和供试品溶液在检测时间范围内稳定则不用重新配制，若溶液不稳定，改变色谱条件时，需要临用重新配制对照品及供试品溶液。
[0382]
(2)结果报告
[0383]
表2.8-1含量耐用性测试结果
[0384]
/标准28℃32℃209nm213nm0.58ml/min0.62ml/min番石榴酸含量(％)1.5761.6161.5971.5731.5771.5731.588相对标准条件含量(％)/102.54101.3399.81100.0699.81100.76
[0385]
表2.8-2含量耐用性测试结果
[0386]
/标准色谱柱1色谱柱2标准0.15％0.25％ph2.9ph3.1番石榴酸含量(％)1.6281.6541.6191.5761.6421.6251.5651.688相对标准条件含量(％)/101.6099.45/104.19103.1199.30107.11
[0387]
(3)结论
[0388]
供试品溶液，不同条件下含量基本一致，各指标成分含量相对标准条件的含量在90％-110％之间。表明本品含量检测对柱温、波长、流动相ph、不同色谱柱型号等条件，耐用
性良好。
[0389]
2.9样品测定
[0390]
(1)实验步骤
[0391]
空白溶剂配制：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15混合溶液，过滤即得。
[0392]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法，同法配制两份。
[0393]
供试品溶液配制：精密量取各批次复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0394]
进样程序要求。
[0395]
进样顺序
[0396]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品1溶液5针3对照品2溶液2针4供试品-11针5供试品-21针6-12供试品-3～供试品-9每供试品1针13供试品-101针14对照品1溶液1针
[0397]
(2)结果报告
[0398]
表2.9番石榴酸含量测定结果
[0399]
批号番石榴酸批号番石榴酸批号番石榴酸201810341.626201812152.0722019040132.121201811382.020201904041.993201904142.074201811391.979201904051.715201805031.347201812032.194201904061.763201810102.005201812042.200201904072.166201811341.918201812091.798201904082.165201811072.016201812121.747201904092.177201812021.969201812131.847201904102.147
ꢀꢀ
201812141.877201904121.662
ꢀꢀ
[0400]
实施例3复方苦参注射液的有关成分的指纹图谱检测
[0401]
1.色谱条件、洗脱条件、样品配制等。
[0402]
方法描述
[0403][0404]
2.验证具体内容
[0405]
2.1系统适用性
[0406]
(1)实验步骤
[0407]
空白溶液配制：甲醇-0.2％磷酸二氢钾＝15∶85，过滤即得。
[0408]
对照品溶液配制：精密称取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品适量，加空白溶液制成每1ml含苦参碱0.33mg，氧化苦参碱0.85mg，氧化槐果碱0.25mg的混合对照品溶液ⅰ，摇匀，即得；精密称取槐果碱对照品，槐定碱对照品，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，加空白溶液制成每1ml含槐果碱0.09mg，槐定碱0.08mg，甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷0.08mg的混合对照品溶液ⅱ，摇匀，即得。精密量取混合对照品溶液ⅰ、ⅱ各2ml，置10ml量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
[0409]
供试品溶液：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇
匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0410]
进样顺序及要求见下表。
[0411]
进样顺序
[0412]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品溶液5针(连续进针)3供试品溶液1针4对照品溶液1针
[0413]
(2)结果报告
[0414]
对照品溶液连续进样5次的峰面积及保留时间的rsd值。
[0415]
表2.1-1对照品溶液峰面积及保留时间结果
[0416][0417]
表2.1-2系统适用性结果
[0418][0419][0420]
(3)结论
[0421]
从结果中来看，对照品溶液连续进样5次，氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱峰面积的rsd小于2.0％，保留时间rsd小于2.0％，槐果碱、槐定碱、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷峰面积的rsd小于3.0％，保留时间rsd小于3.0％；六个指标成分的理论板数大于3000，拖尾因子小于2.0，符合要求。
[0422]
2.2指纹图谱建立
[0423]
(1)实验步骤
[0424]
空白溶液：甲醇-0.2％磷酸二氢钾＝15∶85混合溶液，过滤即得。
[0425]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法。
[0426]
各批次供试品溶液：分别精密量取各批次复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0427]
进样顺序及要求见下表。
[0428]
进样顺序
[0429][0430][0431]
(2)结果报告
[0432]
以10批复方苦参注射液的色谱指纹图谱为基础，使用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版进行数据处理，将供试品1(s1)色谱峰作为参照图谱，采用中位数法，时间窗0.1，经多点校正后，进行全峰匹配，生成标准对照指纹图谱及共有模式。(参见图5-1～图5-2)
[0433][0434]
表2.2-1各批次指纹图谱与对照指纹相似度结果
[0435][0436]
表2.2-2各批次非共有峰结果
[0437][0438][0439]
(3)结论
[0440]
经与对照品比对，可以得出1号峰为槐胺碱，2号峰为甲基氧化偶氮樱草糖苷，3号峰为苦参碱，4号峰为槐果碱，5号峰为槐定碱，6号峰为氧化槐果碱，7号峰为氧化苦参碱，8号峰为番石榴酸，10号峰为三叶豆紫檀苷。
[0441]
从结果中来看，10批样品与对照指纹相似度大于0.9，非共有峰面积占比小于5.0％。
[0442]
2.3重复性
[0443]
(1)实验步骤
[0444]
空白溶液配制：甲醇-0.2％磷酸二氢钾＝15∶85，过滤即得。
[0445]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法。
[0446]
供试品溶液配制：精密量取同批号6份复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0447]
进样顺序及要求见下表。
[0448]
进样顺序
[0449]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品溶液5针(连续测试)3供试品-1溶液1针4供试品-2溶液1针5供试品-3溶液1针6供试品-4溶液1针7供试品-5溶液1针8供试品-6溶液1针9对照品溶液1针
[0450]
(2)结果报告
[0451]
以重复性色谱图谱为基础，使用与样品相同处理方法，采用《中药色谱指纹图谱相
似度评价系统》计算其相似度，并以7号峰(氧化苦参碱)为参考，计算相对保留时间与相对峰面积。(参见图6)
[0452]
表2.3-1重复性共有峰模式相似度结果
[0453][0454]
表2.3-2重复性共有峰相对保留时间结果
[0455][0456]
表2.3-3重复性共有峰相对峰面积结果
[0457][0458]
(3)结论
[0459]
从结果中来看，6份供试品中相似度大于0.99，各共有峰相对保留时间及相对峰面积rsd值小于3.0％，因此重复性良好。
[0460]
2.4中间精密度
[0461]
(1)实验步骤
[0462]
照重复性测定方法，分别于不同日期、不同分析人员、采用不同仪器，平行配制6份供试品溶液，溶液配制及进样程序与重复性相同，考察12份样品测定结果的精密度。
[0463]
(2)结果报告
[0464]
以中间精密度色谱图谱为基础，使用与样品相同处理方法，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算其相似度，并以7号峰(氧化苦参碱)为参考，计算相对保留时间与相对峰面积。(参见图7)
[0465]
表2.4-1中间精密度共有峰模式相似度结果
[0466][0467]
表2.4-2中间精密度共有峰相对保留时间结果
[0468][0469]
表2.4-3中间精密度共有峰相对峰面积结果
[0470][0471]
(3)结论
[0472]
从结果中来看，12份供试品相似度大于0.99，各共有峰相对保留时间rsd值均小于5％；甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷相对峰面积rsd值为5.72，其它共有峰的相对峰面积rsd值均小于5％，因此甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷峰面积受影响较大。
[0473]
2.5溶液稳定性及两倍时间图谱
[0474]
(1)实验步骤
[0475]
空白溶液配制：甲醇-0.2％磷酸二氢钾＝15∶85，过滤即得。
[0476]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法。
[0477]
供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0478]
进样顺序及要求如下表。
[0479]
进样顺序
[0480]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品溶液5针(连续测试)3供试品-0h1针4供试品-4h1针5供试品-8h1针6供试品-12h1针7供试品-18h1针8供试品-24h1针9供试品(两倍时间)1针10对照品溶液1针
[0481]
(2)结果报告
[0482]
以稳定性色谱图谱为基础，使用与样品相同处理方法，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算其相似度，并以7号峰(氧化苦参碱)为参考，计算相对保留时间与相对峰面积(参见图8-9)。
[0483]
表2.5-1稳定性共有峰模式相似度结果
[0484][0485][0486]
表2.5-2稳定性共有峰相对保留时间结果
[0487][0488]
表2.5-3稳定性共有峰相对峰面积结果
[0489][0490][0491]
(3)结论
[0492]
从结果中来看，供试品在24小时内相似度大于0.99，各共有峰的相对保留时间及峰面积rsd值均小于3.0％，因此供试品在24小时内稳定。两倍时间下色谱图谱未再出峰，结果良好。
[0493]
2.6耐用性
[0494]
(1)实验步骤
[0495]
空白溶液配制：甲醇-0.2％磷酸二氢钾＝15∶85，过滤即得。
[0496]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法。
[0497]
供试品溶液配制：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。同法制备2份。
[0498]
分别取上述溶液10μl在不同条件下注入液相色谱仪，进样顺序及要求见下表(不同考察条件均按此进样顺序进样)。
[0499]
进样顺序
[0500]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品溶液5针3供试品-11针4供试品-21针
[0501]
(3)结果报告
[0502]
表2.6-1色谱条件变动的参数
[0503][0504][0505]
(2)结论
[0506]
以耐用性色谱图谱(不同色谱柱、仪器)为基础，使用与样品相同处理方法，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算其相似度，并以7号峰(氧化苦参碱)为参考，计算相对保留时间与相对峰面积。
[0507]
不同色谱柱耐用性结果参见图10-1及下表
[0508]
表2.6-2不同色谱柱共有峰模式相似度结果
[0509]
[0510]
表2.6-3不同色谱柱共有峰相对保留时间结果
[0511][0512][0513]
表2.6-4不同色谱柱共有峰相对峰面积结果
[0514][0515]
不同仪器耐用性结果参见图10-2及下表
[0516]
表2.6-5不同仪器共有峰模式相似度结果
[0517][0518]
表2.6-6不同仪器共有峰相对保留时间结果
[0519][0520][0521]
表2.6-7不同仪器共有峰相对峰面积结果
[0522][0523]
(3)结论
[0524]
从结果中来看，不同色谱柱考察结果中，各共有峰相似度大于0.99，相对保留时间及相对峰面积rsd值均小于5.0％；不同仪器考察结果中，各共有峰相似度大于0.99，相对保留时间及相对峰面积的rsd值均小于5.0％，因此该方法耐用性较好。
[0525]
2.9生产工艺关键点考察
[0526]
(1)实验步骤
[0527]
空白溶液配制：甲醇-0.2％磷酸二氢钾＝15∶85，过滤即得。
[0528]
对照品溶液配制：参引2.1项下对照品溶液配制方法。
[0529]
供试品溶液配制：根据各关键点体积量，计算得取样量，其中关键点1取1ml至25ml量瓶中，关键点2与6为取5ml至50ml量瓶中，关键点4为取2ml至25ml量瓶中，关键点5为取1ml至100ml量瓶中，其余各关键点均为取1ml至50ml量瓶中，所有样品加空白溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0530]
进样顺序及要求如下表。
[0531]
进样顺序
[0532]
顺序样品针数1空白溶液1针2对照品溶液5针(连续测试)
3供试品-11针4供试品-21针5供试品-31针6供试品-41针7供试品-51针8供试品-61针9供试品-71针10供试品-81针11供试品-91针12供试品-101针13供试品-111针14供试品-121针15供试品-131针16供试品-141针17供试品-151针18供试品-161针19供试品-171针20供试品-181针21供试品-191针22供试品-201针23供试品-211针24供试品-221针25对照品溶液1针
[0533]
(2)结果报告
[0534]
(参见图11及下表)
[0535]
表2.9-1生产工艺共有峰模式相似度结果
[0536]
[0537][0538]
(3)结论
[0539]
从结果中来看，生产工艺各关键点相似度大于0.9，其中生产工艺关键点8-22(水沉药液-灭菌后样品)彼此间相似度大于0.98，表明各关键点相似度较高，但从图中来看，部分成分稍有损失。
[0540]
实施例4检测方法筛选
[0541]
1.不同色谱柱考察
[0542]
实验步骤：
[0543]
(1)色谱条件：流动相0.2％磷酸二氢钾溶液(磷酸调节ph至3.0)(a)-甲醇(b)梯度洗脱，0-10min，3％b；10-15min，3％-5％b；15-24min，5％-15％b；24-30min，15％b；30-55min，15％-85％b；55-75min，3％b。柱温30℃，流速0.6ml/min，波长211nm。
[0544]
(2)供试品制备：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液(0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，按上述色谱条件进样观察。
[0545]
分别考察色谱柱为
[0546]
(1)waters xselect csh
tm c
18
[0547]
实验结果见图12-1
[0548]
(2)techmate c
18-st
[0549]
实验结果见图12-2
[0550]
(3)welch ultimate aq-c
18
[0551]
实验结果见图12-3
[0552]
(4)waters sunfire c
18
[0553]
实验结果见图12-4
[0554]
综上，最佳色谱柱为waters xselect csh
tm c
18
(4.6mm
×
250mm，5μm)。
[0555]
2.不同流动相系统考察
[0556]
实验步骤：
[0557]
供试品制备：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液(0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，按下述色谱条件进样观察。
[0558]
2.1根据复方苦参注射液药品标准中指纹图谱条件，调整流动相梯度色谱条件：色谱柱：waters xselect csh
tm c
18
(4.6mm
×
250mm，5μm)检测波长：225nm进样量：10μl柱温：30℃流速：0.8ml/min
[0559]
流动相：乙腈：0.01m醋酸铵(9：1)，0.01m醋酸铵(ph调至8.0)梯度洗脱
[0560]
该方法是针对注射液药品标准中的指纹图谱条件进行调整梯度后考察
[0561][0562][0563]
实验结果见图13-1
[0564]
2.2其它方法
[0565]
色谱柱：waters xselect csh
tm c
18
(4.6mm
×
250mm，5μm)
[0566]
检测波长：211nm，柱温：30℃，流速：0.6ml/min，进样量：10μl
[0567]
分别考察流动相系统为：
[0568]
(1)甲醇-水：10％甲醇水至90％甲醇水，120min梯度洗脱
[0569]
实验结果见图13-2
[0570]
(2)甲醇-0.1％甲酸水：10％甲醇90％(0.1％甲酸水)至90％甲醇10％(0.1％甲酸水)，120min梯度洗脱
[0571]
实验结果见图13-3
[0572]
(3)甲醇-0.1％乙酸水：10％甲醇90％(0.1％乙酸水)至90％甲醇10％(0.1％乙酸水)，120min梯度洗脱
[0573]
实验结果见图13-4
[0574]
(4)甲醇-0.01％乙酸水：10％甲醇90％(0.01％乙酸水)至90％甲醇10％(0.01％乙酸水)，120min梯度洗脱
[0575]
实验结果见图13-5
[0576]
(5)甲醇-0.4％磷酸：10％甲醇90％(0.1％磷酸)至90％甲醇10％(0.1％磷酸)，120min梯度洗脱
[0577]
实验结果见图13-6
[0578]
(6)乙腈-水：10％乙腈水至90％乙腈水，120min梯度洗脱
[0579]
实验结果参见图13-7
[0580]
(7)甲醇-0.01m乙酸铵：10％甲醇90％(0.01m乙酸铵，ph调至4.0)至90％甲醇10％(0.01m乙酸铵，ph调至4.0)，120min梯度洗脱
[0581]
实验结果见图13-8
[0582]
(8)甲醇-0.2％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)：为本专利中最终确定的色谱条件，3％甲醇97％(0.2％磷酸二氢钾)梯度洗脱。
[0583]
实验结果见图13-9
[0584]
综上，以甲醇-0.2％磷酸二氢钾，磷酸调ph值为3，梯度洗脱为最佳条件。
[0585]
3.不同ph值考察
[0586]
实验步骤：
[0587]
供试品制备：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液(0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，按下述色谱条件进样观察。
[0588]
3.1色谱条件：
[0589]
色谱柱：waters xselect csh
tm c
18
(4.6mm
×
250mm，5μm)
[0590]
检测波长：211nm，柱温：30℃，流速：0.6ml/min，进样量：10μl
[0591]
分别考察磷酸二氢钾ph为：
[0592]
(1)甲醇-0.1％磷酸二氢钾(磷酸调ph为5.0)
[0593]
实验结果参见图14-1
[0594]
(2)甲醇-0.1％磷酸二氢钾(磷酸调ph为4.0)
[0595]
实验结果参见图14-2
[0596]
(3)甲醇-0.1％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)。
[0597]
实验结果参见图14-3
[0598]
3.2实验结果
[0599]
参见图14-1～14-3。
[0600]
综上，将磷酸二氢钾用磷酸调ph值为3时，条件最佳。
[0601]
4.磷酸二氢钾浓度的考察
[0602]
实验步骤：
[0603]
供试品制备：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液(0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，按下述色谱条件进样观察。
[0604]
色谱条件：
[0605]
色谱柱：waters xselect csh
tm c
18
(4.6mm
×
250mm，5μm)
[0606]
检测波长：211nm，柱温：30℃，流速：0.6ml/min，进样量：10μl
[0607]
分别考察磷酸二氢钾浓度为：
[0608]
(1)甲醇-0.1％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)
[0609]
实验结果参见图15-1
[0610]
(2)甲醇-0.34％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)
[0611]
实验结果参见图15-2
[0612]
(3)甲醇-0.2％磷酸二氢钾(磷酸调ph为3.0)
[0613]
实验结果参见图15-3
[0614]
不同磷酸二氢钾浓度结果叠加图参见图15-4。
[0615]
综上，0.2％磷酸二氢钾作为流动相条件最佳。
[0616]
5.梯度优化
[0617]
实验步骤：
[0618]
供试品制备：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液(0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，按下述色谱条件进样观察。
[0619]
色谱柱：waters xselect csh
tm c
18
(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相0.2％磷酸二氢钾溶液(磷酸调节ph至3.0)(a)-甲醇(b)梯度调整；检测波长：211nm，柱温：30℃，流速：0.6ml/min，进样量：10μl。
[0620]
实验方法
[0621]
分别考察洗脱梯度为：
[0622]
方法1：
[0623]
洗脱条件
[0624][0625]
实验结果见图16-1
[0626]
方法2：
[0627]
洗脱条件
[0628][0629]
实验结果见图16-2
[0630]
方法3：
[0631]
洗脱条件
[0632][0633]
实验结果见图16-3
[0634]
综上，方法3(图16-3)中峰的分离度最高，因此方法3的洗脱程序条件最佳。
[0635]
6.检测波长确认
[0636]
实验步骤：
[0637]
供试品制备：精密量取复方苦参注射液1ml，置50ml量瓶中，加空白溶液(0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇＝85∶15)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，按下述色谱条件进样观察。
[0638]
色谱柱：waters xselect csh
tm c
18
(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相0.2％磷酸二氢钾溶液(磷酸调节ph至3.0)(a)-甲醇(b)梯度洗脱；全波长扫描，柱温：30℃，流速：0.6ml/min，进样量：10μl。
[0639]
实验结果参见图17-1～17-2
[0640]
综上，从波长扫描结果来看，该条件下复方苦参注射液为末端吸收，综合各吸收峰及参考文献，选择211nm作为复方苦参注射液的检测波长。
[0641]
7.色谱条件的确定
[0642]
(1)色谱条件
[0643]
色谱柱：waters xselect csh
tm c
18
(5μm，4.6mm
×
250mm)
[0644]
流动相：0.2％磷酸二氢钾溶液(磷酸调节ph值至3.0)-甲醇梯度洗脱柱温：30℃
[0645]
流速：0.6ml/min
[0646]
检测波长：211nm
[0647]
进样体积：10μl
[0648]
梯度洗脱表
[0649][0650]
(2)测定法
[0651]
按确定的色谱条件，分别将对照品溶液及供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记
录色谱图。
[0652]
8.供试品溶液制备方法的优化与确认
[0653]
实验方法：同实施例4第7项分别考察：
[0654]
(1)供试品(水制备)与空白溶液
[0655]
实验结果见图18-1
[0656]
(2)甲醇制备对照品，纯化水制备供试品
[0657]
实验结果见图18-2
[0658]
(3)空白溶液制备供试品与对照品(空白溶液：0.2％磷酸二氢钾溶液-甲醇混合溶液)
[0659]
实验结果见图18-3
[0660]
综上，对照品采用空白溶液制备相对甲醇制备而言，峰形对称，基线平滑，因此采用空白溶液制备供试品与对照品。