一种抗体修饰的磁性亲和材料及制备和其应用

1.本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及基于抗体修饰的磁性亲和材料的分离不同肝细胞中线粒体的方法及其应用。
2.本发明提出的磁性亲和材料，可分离肝细胞lo2、huh7、hepg2匀质液中的线粒体。该材料在以线粒体为基础的研究领域有良好的应用前景。


背景技术：

3.线粒体是真核细胞中普遍存在的一种重要的细胞器，其在ca
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稳态调节、细胞能量代谢、生物合成、细胞死亡的调控中发挥关键作用。线粒体的功能异常与心肌病、神经退行性疾病、癌症等多种疾病的发生发展密切相关。综合分析线粒体在基因组、蛋白组、代谢组的变化有益于更好地理解线粒体的结构与功能间的关系。值得注意的是，线粒体在三羧酸循环、β-氧化、尿素循环等合成和分解过程中发挥着重要作用。基于线粒体在代谢中的中心作用，线粒体的代谢紊乱与许多生理、病理疾病的发生发展密切相关，深入理解线粒体在疾病发展中的代谢变化有利于线粒体疾病的诊断和治疗。
4.不可否认的是，获得结构完整、纯度高的线粒体是线粒体研究的先决条件。亚细胞分析兴起于20世纪50年代，随着研究某种细胞器的需求日益增加，各种策略在分析化学应运而生。离心是一种传统而可靠的分离线粒体的方法，其主要包括差速离心和密度梯度离心。差速离心是一种简单而快速的分析策略，它可以收集到大量完整的线粒体，但得到的线粒体往往也掺杂其它细胞器。作为一种更特异的分离方法，密度梯度法可以得到纯度更高的线粒体。然而，因多次重悬和上清转移操作造成的耗时、费力、低产量是密度梯度法不可避免的缺点，从而制约了后续的分析，尤其是当样本量有限时。
5.受益于技术的进步，满足不同需求的方法已被开发用于线粒体的分离。其中，一种由两个关键部件组成的离心装置被设计用于完整线粒体的快速分离。首先，当细胞通过离心力流经设计的微流控装置时被破坏，产生的细胞裂解液被收集在不锈钢容器中用于后续的差速离心。尽管设计的离心装置可以在30分钟内实现完整线粒体的分离，但是单纯依靠差速离心的原理分离到的线粒体的纯度是比较低的。此外，基于离心的差分迁移的微流控芯片被开发用于有效的区分少量生物样本中的线粒体和细胞核、细胞碎片。相较于细胞核和细胞碎片，线粒体的尺寸更小，故而，线粒体倾向于迁移到芯片的外部管道，而细胞核和细胞碎片则迁移到芯片的内部管道，从而实现它们的有效的分离。但对于少量生物样本中的线粒体的有限回收和其它尺寸相近的细胞器的潜在污染限制了该方法的实用性。
6.值得注意的是，因抗体与细胞器表面特定蛋白高且特异的亲和作用，细胞器的亲和纯化已广受关注。亲和纯化主要依赖于抗体对细胞器表面蛋白或与表面蛋白融合的表位标签的识别。例如，修饰tom22(线粒体外膜转运体的一个亚基)抗体的商品化的miltenyi免疫磁珠在优化条件下可以成功实现完整线粒体的纯化。但目前对于miltenyi磁珠的分离效率存在争议。此外，依靠融合在线粒体外膜上的ha表位标签获取高纯度的线粒体是近期表位标签纯化线粒体的代表工作。据此，链霉亲和素标签(strep)和绿色荧光蛋白标签(gfp)
也被融合到线粒体外膜蛋白上以实现某个细胞系中线粒体的亲和纯化。表位标签的纯化策略需要其专一的位于线粒体的外膜上且表现出适当的表达，因而，这对专业技能有一定的要求。相应地，表位标签纯化策略的普适性受到了限制。此外，包覆某种抗体的商业化磁珠的可得性也制约了后续构建的稳转细胞系的种类；同时，磁珠的粒径也影响了亲和纯化的效率。目前，一种通用、详细、高效的制备免疫磁珠的策略以实现线粒体的特异分离还尚未报道。


技术实现要素：

7.本发明针对线粒体相关研究的需求，建立了一种通用且可特异分离线粒体的基于抗体修饰的磁性复合材料分离肝细胞中线粒体的方法及其应用。
8.本发明的技术路线如下：
9.第一步，采用溶剂热法一步合成磁性氧化石墨烯复合基质材料magg：用0.08-0.32g的fecl3·
6h2o做铁源，0.015-0.06g的c6h5na3o7·
2h2o为稳定剂，加入15-60ml乙二醇溶解，0.015-0.06g的石墨烯为磁核生长的基质，冰浴(0-4℃)条件下超声1-3h，再加入0.35-1.4g的ch3co2na，搅拌0.5-1.0h，混合溶液转入反应釜中，160-220℃反应6-10h，产物依次用乙醇、水清洗，干燥，得到磁性氧化石墨烯复合基质材料magg；
10.第二步，采用多巴胺的氧化聚合合成聚多巴胺包覆的magg@pd：称取第一步制得的magg材料15-60mg分散在由30-120ml乙醇，15-60ml的10-20mm的tris-hcl缓冲液和20-90ml的h2o的混合液中，加入60-240mg的多巴胺，在25-60℃的条件下机械搅拌6-12h，产物利用磁铁固液分离，收集固体产物，依次用水、乙醇清洗，干燥，得到聚多巴胺包覆的magg@pd；
11.第三步，采用胺-邻苯二酚的加成反应合成亲和素包覆的magg@pd@avidin：取第二步制得的magg@pd材料0.02-1.5mg，加入含0.1-0.4mg亲和素avidin的100-400μl的tris-hcl溶液，4-37℃反应温度下振荡孵育2-12h，产物利用磁铁固液分离，收集固体产物，依次用tris-hcl buffer、pbs溶液清洗，得到亲和素包覆的magg@pd@avidin；
12.第四步，抗体tom20或igg的生物素化修饰：移取60-160μg的tom20抗体或igg，加入5-10μl的浓度为4-10mm的生物素化试剂ez-link sulfo-nhs-lc-lc-biotin(thermo scientific,21338)，4-37℃反应温度下振荡孵育0.5-2h，将生物素化的tom20抗体或igg移入pbs预洗的脱盐柱zeba spin desalting columns(thermo scientific,89889)中，离心脱盐后，收集流穿液，得到生物素修饰的抗体tom20或igg；
13.第五步，合成抗体tom20或igg修饰的磁性氧化石墨烯复合材料：取体积为100-500μl的质量为20-100μg的生物素化抗体tom20或igg，加入到质量为1-5mg的magg@pd@avidin中，4-25℃反应温度下振荡孵育0.5-2h，经pbs洗涤1-5次后，加入体积为500-1000μl的1-5mg/ml的bsa的pbs溶液，4-25℃反应温度下振荡孵育1-4h，产物利用磁铁固液分离，收集固体产物，得到magg@pd@avidin@tom20或magg@pd@avidin@igg。
14.由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：通过溶剂热法一步合成了磁性氧化石墨烯复合材料，利用多巴胺的氧化聚合在基质材料表面包覆聚多巴胺壳层，获得的材料可通过胺-邻苯二酚的加成反应在表面修饰亲和素，而亲和素修饰的基质材料可高效的偶联生物素化的抗体。该方法是一种操作简便、普适强的免疫亲和材料的制备策略，获得的亲和材料兼具外磁场可控、抗体固载量高的特点，在以线粒体为基础的研
究领域中有良好的实用价值和应用前景。
15.该材料集成了四氧化三铁的外磁场可控、石墨烯的大表面积、聚多巴胺对nh2的反应活性、抗体对线粒体外膜蛋白的高特异性识别等多种优势，可分离lo2、huh7、hepg2等细胞中的线粒体。该材料在以线粒体为基础的研究领域中具有良好的实用价值和应用前景。
附图说明：
16.图1是材料的制备流程图。
17.图2是材料分离细胞中的线粒体的流程示意图。
18.图3是材料制备过程中不同阶段的透射电镜图。(a)go，(b)magg，(c)magg@pd。从图中可以看到片层的氧化石墨烯上分散着fe3o4颗粒，且聚多巴胺包覆后，fe3o4表面出现一薄壳,相较go和magg，magg@pd呈现更不透明的特性。
19.图4是材料的多种表征图：(a)magg和magg@pd的红外光谱。聚多巴胺包覆后，magg的特征峰(1718cm-1
，羰基c＝o的伸缩振动吸收峰；1216cm-1
，环氧基c-o的伸缩振动峰；1085cm-1
，烷氧基c-o的伸缩振动峰)明显减弱，1219cm-1
的特征峰表明多巴胺的包覆。(b)magg@pd@avidin对生物素化的igg的固载量。从图中可以看出magg@pd@avidin对igg的固载量可达约570μg/mg。(c)与商品化的材料比较对igg的固载量。由图可知材料magg@pd@avidin对igg的固载量比商品化的高一个数量级。
20.图5是免疫印迹wb分析不同细胞器的特征蛋白。从图中可以看出经材料magg@pd@avidin@tom20分离后，线粒体的特征蛋白vdac和pdh-e1α被明显富集。
21.该方法不仅制备工艺简便、普适性强，还使得材料兼具外磁场可控、抗体固载量高的特点，该材料在以线粒体为基础的研究领域中有良好的实用价值和应用前景。
具体实施方式
22.通过具体实例对本发明基于抗体修饰的磁性亲和材料的分离肝细胞中线粒体的方法及其应用进行细致阐述。
23.实施例1.抗体修饰的磁性亲和材料的制备。
24.第一步，采用溶剂热法一步合成磁性氧化石墨烯复合基质材料magg:依次称取0.16g fecl3·
6h2o、0.03g二水合柠檬酸三钠、0.03g的石墨烯到100ml的烧杯中，加入30ml乙二醇溶解，冰浴条件下超声3h；再向烧杯中加入0.7g的乙酸钠，室温机械搅拌0.5h，将混合溶液转入反应釜中，在190℃下反应6h。待温度冷却至室温，磁铁收集材料，产物依次用乙醇、水清洗，真空干燥。
25.第二步，采用多巴胺的氧化聚合合成聚多巴胺包覆的magg@pd：称取第一步制得的magg材料30mg，超声分散在60ml乙醇、30ml的10mm的tris buffer、45ml水组成的混合溶液中，加入120mg的多巴胺，室温机械搅拌8h，产物用磁铁收集，水、乙醇清洗，真空干燥，得到聚多巴胺包覆的magg@pd。
26.第三步，采用胺-邻苯二酚的加成反应合成亲和素包覆的magg@pd@avidin：取第二步制得的magg@pd材料90μg，10mm的tris-hcl buffer洗三次，加入1.2ml的1mg/ml avidin的tris-hcl溶液，4℃反应温度下振荡孵育12h。磁铁收集材料，tris-hcl buffer、pbs清洗，得到亲和素修饰的magg@pd@avidin。
27.第四步，抗体tom20(线粒体外膜转运体的一个亚基)的生物素化修饰：移取60μg的tom20，加入5μl浓度为4mm的生物素化试剂ez-link sulfo-nhs-lc-lc-biotin，25℃反应温度下振荡孵育1h，待反应完成后，将生物素化的tom20抗体移入pbs预洗的脱盐柱zeba spin desalting columns中，1000g离心2min，收集流穿液，得到生物素修饰的抗体tom20。
28.第五步，合成抗体tom20修饰的磁性氧化石墨烯复合材料magg@pd@avidin@tom20：取第四步制得的生物素化抗体tom20，加入到2mg的magg@pd@avidin中，25℃反应温度下振荡孵育0.5h，经pbs洗涤三次后，加入1ml的1mg/ml的bsa的pbs溶液，25℃反应温度下振荡孵育1h，产物用磁铁收集，pbs清洗，得到magg@pd@avidin@tom20。合成示意图见图1。
29.实施例2.以生物化的igg为模型抗体评价基质材料magg@pd@avidin的固载容量。
30.(1)igg的生物素化：移取600μl的igg，加入22.3μl的10mm的生物素化试剂ez-link sulfo-nhs-lc-lc-biotin，25℃反应温度下振荡孵育1h，待反应完后，将生物素化的igg移入pbs预洗的脱盐柱zeba spin desalting columns中，1000g离心2min，收集流穿液，得到生物素修饰的igg。
31.(2)不同浓度的生物素化的igg修饰等量的基质材料magg@pd@avidin：将生物素化的igg分别稀释4倍、8倍、20倍、40倍、80倍、200倍、400倍，每个浓度点平行三次，各取140μl与15μg的magg@pd@avidin在25℃反应温度下振荡孵育0.5h，收集孵育后的igg溶液；材料经磁铁收集，pbs清洗后，分散在pbs中，4℃保存。
32.(3)bca蛋白定量法评价magg@pd@avidin对生物素化的igg的固载量：取(2)收集的孵育后的igg溶液，对于稀释8倍、20倍、40倍、80倍、200倍、400倍的生物素化的igg孵育后的溶液取20μl与200μl的bca工作液混合；对于稀释4倍的生物素化的igg孵育后的溶液取5μl，补加15μlpbs，并与200μl的bca工作液混合；对于生物素化的igg原液，取2μl，补加18μlpbs，并与200μl的bca工作液混合；37℃条件下放置30min，用酶标仪测定562nm波长处的吸光度。根据同批次的bsa的标准曲线和使用的样品体积计算每个样品中的生物素化的igg浓度。由相应的浓度计算材料magg@pd@avidin对生物素化的igg的固载量。具体结果见图4(b)和(c)。
33.实施例3.实施例1制备获得的材料magg@pd@avidin@tom20分离肝细胞lo2、huh7、hepg2中的线粒体。
34.(1)肝细胞lo2、huh7、hepg2的培养：lo2、huh7、hepg2均在dmem(含终体积浓度的10％fbs 1％pen/stre)的培养基中，37℃，含体积浓度5％co2的空气条件下，培养至90-100％的覆盖度。
35.(2)magg@pd@avidin@tom20分离肝细胞lo2、huh7、hepg2中的线粒体：lo2细胞先用10ml pbs洗两次，5ml胰酶(0.25％trypsin-edta)在37℃温度下消化5min,5mldmem(含终体积浓度的10％fbs 1％pen/stre)的培养基终止消化。800rpm离心3min，收集lo2细胞，并依次用0-4℃预冷的pbs、线粒体分离缓冲液(210mm甘露醇,70mm蔗糖,1mm edta,5mm tris,ph 7.5)洗涤。随后，lo2细胞重悬在3ml的0-4℃预冷的含有1mm pmsf的线粒体分离缓冲液中，并转入potter-elvejhem匀浆器中。匀浆器放置在冰上，通过推进potter-elvejhem匀浆器中的研杵垂直向下40次使得50％的细胞破碎。取出100μl的匀质液作为全细胞组分用于后续的分析，余下的匀浆液在1000g，4℃条件下离心5min共两次，以除去细胞核、细胞碎片和未破碎的细胞。随后，将收集的上清液在10000g，4℃条件下10min，得到的富含线粒体的沉
淀重悬在0-4℃预冷的线粒体分离缓冲液中，与1mg的magg@pd@avidin@tom20在4℃条件下振荡孵育0.5h。孵育完后，磁铁收集表面捕获线粒体的固体材料，并用线粒体分离缓冲液清洗材料三次。
36.细胞huh7、hepg2中线粒体的分离操作分别同上述lo2的分离操作。线粒体分离流程图见图2。
37.(3)对材料分离的线粒体进行特征蛋白的鉴定：取100μl的含有1mm的pmsf的ripa裂解液加入到(2)获得的1mg带有线粒体的材料或取出的100μl的全细胞组分中，移液枪抽吸混匀，冰上孵育15min。磁铁辅助或12000g离心条件下收集上清，取出少量上清bca法测蛋白浓度，其余上清加入sds-page蛋白上样缓冲液(5
×
)(beyotime,p0015)混匀，97℃变性10min。待冷却至室温后，材料分离的线粒体样本或全细胞组分等蛋白量上样，sds-page对蛋白进行分离。随后，将蛋白转膜至pvdf膜上。转膜完成后，5％脱脂牛奶(5g脱脂牛奶:100ml tbst)室温封闭1h，10ml的tbst(20mm tris-hcl,500mm nacl,0.05％tween-20,ph 7.5)洗膜三次，分别与5ml的体积比为1：1000(抗体：抗体稀释液(5g bsa 100ml pbs 20mgna3n))的兔抗-vdac、鼠抗-pdh-e1α、鼠抗-histone h3和鼠抗-actin在4℃条件下过夜孵育。tbst洗膜三次，再分别与5ml的5％脱脂牛奶配制的的体积比为1：5000的过氧化物辣根酶交联的二抗室温孵育1h，化学发光仪曝光。具体结果见图5。