黄柏炭纳米颗粒的制备及其应用

1.本发明涉及医药领域，具体涉及黄柏炭纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点) 的制备及其应用。


背景技术：

2.黄柏炭具有千年的应用历史和确切的临床疗效，除了熟知的止血作用之外，其抗炎作用、抗感染等作用也为历代医学学者所关注，典型的临床表现为对皮肤病例如疮、疖子、痈等的治疗。但是遗憾的是，至今也未能阐释其关键物质基础和药效作用机制，影响了黄柏炭的临床应用发展。
3.银屑病为一类常见的、易复发的鳞屑丘疹性皮肤病，其对人类的身心健康产生严重的危害，目前没有根治该病的药物及方法。近年来，银屑病的治疗方式虽然取得了一定的进展，但是临床暴露的诸多问题包括药物副作用、价格高等却限制了这些药物的应用。
4.因此，寻找一种安全高效、价格合适的药物成为一种迫切的需求。黄柏炭碳点是从黄柏炭中发现的一种全新的纳米材料，前期细胞实验研究证明其具有抗炎活性。由于银屑病是一种慢性炎症性疾病，因此研究该碳点对于银屑病的治疗作用具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.术语界定：
6.黄柏炭纳米颗粒：是从黄柏炭中提取出来的一类粒径大小在纳米级别的颗粒，又可以称为黄柏炭纳米粒子、黄柏炭碳量子点、黄柏炭碳点。
7.本发明从黄柏炭中提取分离出碳点(纳米颗粒/纳米粒子)，并首次发现了黄柏炭碳点具有显著的治疗银屑病的生物效应。具有进一步开发利用的价值。
8.黄柏炭及其纳米颗粒在制备治疗皮肤性疾病组合物中的用途。所述的皮肤性疾病为接触性皮炎、湿疹、荨麻疹、变应性皮肤血管炎、药物性皮炎任意一种。
9.所述的皮肤性疾病为银屑病。
10.所述的组合物含有或不含有药学上可用的辅料。
11.所述的组合物为药物、保健品、食品中的任意一种，所述的组合物可制备成临床上可接受的口服制剂；进一步优选的，所述临床上可接受的口服制剂为丸剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂或液体口服制剂中的一种或多种；更优选的，所述口服制剂为颗粒剂。
12.具体而言，本发明的技术方案是这样的。
13.本发明涉及从黄柏炭中提取分离纯化出纳米颗粒(纳米粒子/碳量子点/碳点)的方法，具体包括以下步骤：马弗炉煅烧法制备黄柏炭，用溶剂从黄柏炭中提取出碳点，分离纯化包括透析、超滤、离心、萃取等技术方法，得到高纯度的碳点。
14.进一步的：
15.(1)马弗炉升温流程：马弗炉煅烧法制备黄柏炭，用溶剂从黄柏炭中提取出碳点，备用；
16.(2)黄柏炭碳点纯化步骤：以去离子水为溶剂，加热提取，浓缩后用分子量大于1000da的透析袋透析，或者超滤，经高速离心、萃取分离步骤(1)的碳点得到黄柏炭碳点。
17.更进一步的：
18.马弗炉升温流程如下：升温至60-80℃，升温过程时长5min，于60-80℃维持15-35min；继而升温至350-450℃，升温过程时长10-30min并维持0.5-1.5h，待温度降至室温后打开炉门，并将坩埚取出，坩埚中产物即为黄柏炭(pccc)。
19.黄柏炭碳点纯化步骤如下：将pcc以10倍量的去离子水水浴煎煮3次 (100℃)后，以0.22μm微孔滤膜过滤并浓缩。然后以去离子水为透析介质，将该浓缩液以1000d透析膜透析7天，取出袋内溶液，即为黄柏炭碳点。
20.本发明还提供了黄柏炭碳点的生物活性及其在医药领域中的应用。黄柏炭中的碳点对难愈性银屑病有明确治疗作用，并具有缓解炎症的活性。
21.黄柏炭碳点透射电镜测量粒径＜10nm，主要由c、o和n等元素构成；本发明还涉及此纳米颗粒在医药领域的应用，主要用于缓解银屑病症状以及抗炎活性。
附图说明
22.图1.a黄柏炭碳点低分辨透射电镜图，内部为粒径分布图；b黄柏炭碳点高分辨透射电镜图，内部为放大图；c黄柏炭碳点紫外吸收光谱图；d黄柏炭碳点荧光光谱图。
23.图2.a黄柏炭碳点的红外光谱图；b黄柏炭碳点的xps全扫描图谱；c黄柏炭碳点的c 1s图；d黄柏炭碳点的o 1s图；e黄柏炭碳点的n 1s 图。
24.图3.黄柏炭碳点对于咪喹莫特(imiquimod，imq)致小鼠(a-f)背部(a-f 为背部皮肤放大图)和(a)～f))耳部银屑病样皮损的影响研究。动物分为6 组：对照组(control)、模型组(imq)、阳性药组(methotrexate，mtx)、不同剂量的黄柏炭碳点给药组[高(h)、中(m)、低(l)]。
[0025]
图4.黄柏炭碳点对于咪喹莫特(imiquimod，imq)致小鼠(a-d)背部和(e～h) 耳部银屑病样皮损的pasi评分、(i)脾指数、(j)脾体积和(k)小鼠体重的影响研究。动物分为6组：对照组(control)、模型组(imq)、阳性药组 (methotrexate，mtx)、不同剂量的黄柏炭碳点给药组[高(h)、中(m)、低 (l)]。
[0026]
图5.黄柏炭碳点对于咪喹莫特(imiquimod，imq)致小鼠血清前炎症因子(a) tnf-α、(b)il-6和(c)il-17a水平的影响研究。
具体实施方式
[0027]
下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028]
实施例1：黄柏炭碳点的制备
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采用购置的同一批次的黄柏饮片粉碎称量后装入坩埚。用铝箔纸覆盖坩埚口，盖紧盖子，放于马弗炉中炭化。
[0030]
马弗炉升温流程如下：从室温升至70℃，升温过程时长5min，于70℃维持 25min；继而从70℃升至400℃，升温过程时长20min并维持1h。然后待温度降至室温后打开马弗炉
的炉门，并将坩埚取出，坩埚中产物即为黄柏炭(pccc)。
[0031]
黄柏炭碳点纯化步骤如下：将pcc以10倍量的去离子水水浴煎煮3次 (100℃)后，以0.22μm微孔滤膜过滤并浓缩。然后以去离子水为透析介质，将该浓缩液以1000d透析膜透析7天，取出袋内溶液，即为黄柏炭碳点。
[0032]
实施例2.黄柏炭碳点缓解银屑病作用研究
[0033]
1.实验动物
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本实验采用spf级雄性balb/c小鼠(体重22.0～25.0g)为实验对象，并于温度(24.0
±
1.0)℃、相对湿度55-65％条件下适应性饲养3天后将背部2
×
2cm 区域毛发剃光，此期间保证动物能够自由饮水、进食。动物实验由北京中医药大学动物实验伦理委员会批准(伦理号bucm-4-2018101601-4006)。
[0035]
2.实验动物给药、造模和取材
[0036]
将动物称重后按照随机数字表分为6组：正常组、模型组、阳性组以及高、中、低剂量的黄柏炭碳点给药组，每组10只。实验期间，除正常组外，其余所有组动物均每日于背部剃毛处涂抹62.5mg 5％的咪喹莫特，连续造模7天，建立银屑病样皮损小鼠模型。药物干预与造模同时进行。其中正常组和模型组给与生理盐水，阳性组给与甲氨蝶呤。在造模期间每天监测并记录小鼠体重以及背部皮损处的pasi评分(红斑、磷屑、凸起及总分)。在造模后的第8天，对小鼠进行眼球取血以检测其中的前炎症因子水平(tnf-α、il-6和il-17a)，取出小鼠脾脏以记录脾指数。
[0037]
3.黄柏炭碳点的物理化学性质表征
[0038]
3.1黄柏炭碳点透射电镜图、紫外吸收光谱、图荧光光谱图
[0039]
采用电镜技术(高、低分辨电镜)、光学技术(紫光可见光分析技术)、以及x光电子能谱技术表征并分析黄柏炭碳点的形貌特征、官能团变化等物理化学特征。
[0040]
黄柏炭碳点的低分辨透射图中显示该纳米粒子为近球形，于水中具有良好的分散性，其粒径大小在0.5nm～3.6nm之间，且晶格间距为0.22nm。另外光谱研究表明，黄柏炭碳点于270nm和350nm处具有较为显著的吸收，表明该碳点结构中存在π-π*和n-π*跃迁。其荧光图谱显示黄柏炭碳点具有显著荧光，最大激发和发射波长分别在330nm和445nm，量子产率为5.63％。
[0041]
3.2黄柏炭碳点的红外光谱(ftir)及x射线光电子能谱图(xps)
[0042]
红外图谱显示黄柏炭碳点含有羟基、羧基、氨基等多种活性基团，该结果也进一步被xps图谱所证实。根据图2(a)显示，峰位顶点位于284.7ev、399.7 ev和531.8ev处分别对应c1s、n1s和o1s，并且这三种元素所占比例分别 67.61％、24.19％和3.81％。进一步扫描获取的高分辨c1s、n1s和o1s谱图显示c-c/c＝c，c-o，o＝n/c＝o等化学键合的存在，验证了该碳点中羟基、氨基、羧基等活性基团的存在。
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3.3黄柏炭碳点对银屑病样小鼠皮肤外观影响
[0044]
图3显示了不同分组动物皮肤和耳部牛皮癣样皮损的典型症状表现。与对照组动物相比，仅仅imq涂抹的小鼠的皮肤和耳部上出现了红斑，浸润，增厚和鳞屑等症状，这些现象表明该模型的成功建立。用mtx或不同剂量的pcc-cd 治疗后，皮肤和耳朵的牛皮癣样外观可以被明显改善，表明黄柏炭碳点对imq 诱导的牛皮癣炎症具有保护作用。
[0045]
3.4黄柏炭碳点对银屑病样小鼠pasi评分的影响
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pasi评分(包括红斑，浸润，鳞屑和累积评分)是临床上初步评价银屑病严重程度的重要指标之一。图4.a-d可以看出，imq造模后第二天开始，动物逐渐开始出现轻微的红斑、鳞屑症状，并随着造模时间的延长，其症状逐渐加重，同样的情况也可以在耳朵上观察到。图4.e-h显示的是造模第7天小鼠的耳朵银屑病样症状，典型的红斑，浸润，鳞屑均可以于模型组小鼠耳朵上观察到。但是经过黄柏炭碳点干预之后，皮肤和耳朵的pasi评分出现了明显的降低，其中中剂量给药组效果最佳。另外，imq干预的小鼠解剖后可观察到脾体积增大(图4.j)的现象，进一步称重分析可知道其脾指数(图4.i)显著升高、体重(图4.k)降低，黄柏炭碳点干预后能够大幅度缓解这种病态改变。
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3.5黄柏炭碳点对于咪喹莫特(imiquimod，imq)致小鼠血清前炎症因子的影响
[0048]
研究表明，前炎症因子在银屑病的发展和改善进程中均发挥着十分重要的作用，结合临床银屑病人血清指标，选择了tnf-α、il-6和il-17a进行检测。图5显示，经过imq连续7天造模，小鼠血清的中的这三种前炎症因子水平均出现了显著的升高，黄柏炭碳点干预后可缓解这种现象，且中剂量cds的效果最佳。